CN115927754A

CN115927754A - 检测猴痘病毒、麻疹病毒和风疹病毒的引物探针组合物、试剂盒及其制备方法

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Publication number: CN115927754A
Application number: CN202211314955.5A
Authority: CN
Inventors: 杨帆; 侯洁; 田永帅; 刘嘉男; 刘万建; 宋金玲; 左雪梅; 孟继鸿
Original assignee: Qingdao Hightop Biotech Co ltd; Shandong Kanghua Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Qingdao Hightop Biotech Co ltd; Shandong Kanghua Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2022-10-26
Filing date: 2022-10-26
Publication date: 2023-04-07

Abstract

本发明提供了检测猴痘病毒、麻疹病毒和风疹病毒的引物探针组合物、试剂盒及其制备方法，引物探针组合物：包括用于检测猴痘病毒的引物和探针，序列如SEQ ID NO.1‑3所示；用于检测麻疹病毒的引物和探针，序列如SEQ ID NO.4‑6所示；用于检测风疹病毒的引物和探针，序列如SEQ ID NO.7‑9所示；内标引物和内标探针，序列如SEQ ID NO.10‑12所示。可同时检测猴痘病毒、麻疹病毒和风疹病毒，并具有良好的灵敏性和特异性。

Description

检测猴痘病毒、麻疹病毒和风疹病毒的引物探针组合物、试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及检测猴痘病毒、麻疹病毒和风疹病毒的引物探针组合物、试剂盒及其制备方法。

背景技术

猴痘是由猴痘病毒( Monkeypox virus, MPXV)感染所致的一种病毒性人兽共患病，临床表现主要为发热、皮疹、淋巴结肿大。其既往主要发生在中非和西非，病死率为1%-10%，通过接种疫苗可获得有效保护。由于在1980年消灭了天花并随后停止接种天花疫苗，猴痘已成为公共卫生领域最重要的正痘病毒。2022年5月初以来，已有20多个非流行国家发现多例猴痘病例，且已出现人际传播。

猴痘病毒是全长约为197kb的双链DNA病毒，属于痘病毒科正痘病毒属，该病毒很容易人工培养，在人、猴、鼠、兔等来源的细胞和鸡胚绒毛尿囊膜中都能很好地生长并引起细胞病变。猴痘病毒的形态与其它正痘病毒一致，外形为圆角砖形或卵圆形，大小为200nm×250nm，外周为30nm的外膜，环绕匀质的核心体。猴痘病毒与天花病毒、痘苗病毒和牛痘病毒是正痘病毒中对人类致病的4种病毒，它们都含有可溶性抗原、核蛋白抗原和红细胞凝集素，抗原性质基本相同，彼此之间有交叉免疫性。猴痘病毒存在西非和刚果盆地两个分支，两者具有明确的流行病学和临床转归差异，西非分支猴痘患者的病死率约为3.6%，刚果盆地支猴痘患者病死率可达10.6%。2022年5月以来的猴痘疫情经测序分析，病毒属于西非分支。

猴痘病毒经黏膜和破损皮肤侵入人体。主要通过接触感染动物的呼吸道分泌物、病变渗出物、血液、其它体液，或被感染动物咬伤、抓伤而感染。人与人之间主要通过密切接触传播，亦可在长时间近距离接触时通过飞沫传播，接触病毒污染的物品也有可能感染。病毒还可通过胎盘从孕妇传播给胎儿。

猴痘病毒耐干燥和低温，在土壤、痂皮和衣被上可生存数月。该病毒对热敏感，加热至56℃30分钟或60℃10分钟即可灭活，紫外线和一般消毒剂均可使之灭活，对次氯酸钠、氯二甲酚、戊二醛、甲醛和多聚甲醛等敏感。

麻疹病毒( measles virus, MV)是麻疹的病原体，分类上属于副粘病毒科麻疹病毒属。麻疹病毒为球形或丝形，直径约120nm～250nm，核心为单负链RNA，不分节段，基因组全长约16kb，基因组有N、P、M、F、H、L 6个基因，分别编码6个结构和功能蛋白：核蛋白（NP）、磷酸化蛋白（P）、M蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素蛋白（H）和依赖RNA的RNA聚合酶（L）。

麻疹病毒抗原性较稳定，只有一个血清型，但近年来的研究证明，麻疹病毒抗原也有小的变异。根据核苷酸序列不同，世界上流行株可分为8个不同的基因组，15个基因型。

麻疹是儿童最常见的急性呼吸道传染病之一，其传染性很强，临床上以发热、上呼吸道炎症、眼结膜炎等症状为主，且以皮肤出现红色斑丘疹和颊粘膜上有麻疹粘膜斑及疹退后遗留色素沉着伴糠麸样脱屑为特征。另外发现亚急性硬化性全脑炎( subacute sclerosing panencephalitits，SSPE)与麻疹病毒有关。

风疹病毒( rubella virus,RV)是披膜病毒科风疹病毒属的唯一成员，是临床上常见的呼吸道感染，引起出疹性疾病(有时也无症状)的病原体之一，人是其唯一宿主。孕妇，特别是妊娠早期的孕妇感染风疹病毒可导致胎儿先天性风疹综合征( congenital rubel lasyndrome, CRS)。目前对其预防仅限于接种RV减毒活疫苗，并取得一定成效。在发达国家，风疹已几乎被实施疫苗计划免疫所消灭，只是在未免疫人群中仍有少数发生。但在免疫项目开展不好的国家，风疹仍在流行。另据报道，在许多国家免疫后的人群仍有一部分保持着对RV的敏感性，我国虽已有减毒活疫苗问世，但尚未将此列入高危人群的计划免疫范畴。

风疹病毒是单正链RNA病毒，属于披膜病毒科，是限于人类的病毒。电镜下多呈不规则球形，直径50～70nm的核心，基因组为单股正链RNA，长度为9757个核苷酸。风疹病毒的抗原结构相当稳定，现知只有一个血清型。

风疹病毒有4种结构蛋白，它们分别是膜糖蛋白E1、E2a、E2b和核壳蛋白C。E1、E2a、E2b结构相似，均为糖蛋白，位于病毒颗粒的包膜上。其中E2a、E2b由同一基因编码，多肽组成相同，两者分子量的差异因糖基侧链不同而致。C蛋白不含糖基侧链，与RNA相连，包绕病毒基因共同组成核衣壳。E1的多肽部分由412~481个氨基酸残基组成，富含脯氨酸和半胱氨酸。作为抗原，E1较E2具有较好的免疫原性，能刺激产生针对各决定簇的单克隆抗体，相应单抗能抑制RV的凝血功能，并表现出中和活性。此外，RV感染可产生特异性免疫球蛋白lgG、IgM、IgA，它们均具有致病意义和诊断价值。

以PCR扩增及测序为主要手段的分子生物学技术目前已取代病原分离作为直接诊断依据。PCR技术包括常规PCR、巢式PCR和实时荧光定量PCR。（1）常规PCR。通常选用属、群或种特异基因进行扩增。（2）巢式PCR。（3）实时荧光定量PCR。这是目前检测病原体最快速、准确、特异、灵敏的核酸检测技术。如根据F3L基因序列设计引物和探针建立了猴痘病毒的荧光定量PCR检测技术。

然而，由于目前的检测技术还不够成熟，通过传统PCR和琼脂糖凝胶电泳的检测方法可以涵盖所有的猴痘病毒、麻疹病毒或风疹病毒，但是操作繁琐，不适应于大量样本的检测。现有的定量PCR检测试剂盒仅能检测猴痘病毒、麻疹病毒或风疹病毒的部分种属，灵敏性和特异性较差，且未有检测方法将猴痘病毒、麻疹病毒及风疹病毒同时检测。

发明内容

针对以上技术问题，本发明提供检测猴痘病毒、麻疹病毒和风疹病毒的引物探针组合物、试剂盒及其制备方法，并达到以下技术目的：可同时检测猴痘病毒、麻疹病毒和风疹病毒，并具有良好的灵敏性和特异性。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

检测猴痘病毒、麻疹病毒和风疹病毒的引物探针组合物，包括用于检测猴痘病毒的引物、用于检测猴痘病毒的探针、用于检测麻疹病毒的引物、用于检测麻疹病毒的探针、用于检测风疹病毒的引物、用于检测风疹病毒的探针、内标引物和内标探针。

用于检测猴痘病毒的引物具有如SEQ ID NO .1和SEQ ID NO .2所示的核苷酸序列；用于检测猴痘病毒的探针具有如SEQ ID NO .3所示的核苷酸序列；用于检测麻疹病毒的引物具有如SEQ ID NO .4和SEQ ID NO .5所示的核苷酸序列；用于检测麻疹病毒的探针具有如SEQ ID NO .6所示的核苷酸序列；用于检测风疹病毒的引物具有如SEQ ID NO .7和SEQ ID NO .8所示的核苷酸序列；用于检测风疹病毒的探针具有如SEQID NO .9所示的核苷酸序列；内标引物具有如SEQ ID NO .10和SEQ ID NO .11所示的核苷酸序列；内标探针具有如SEQ ID NO .12所示的核苷酸序列。

所述SEQ ID NO .1：序列为5’-ttccgacgatactcctcctc-3’；

所述SEQ ID NO .2：序列为5’-tcatctattatagcatcagcatcag-3’；

所述SEQ ID NO .3：序列为5’-ccgtgtatcagcatccattgtcgtag-3’；探针使用的报告基团为FAM荧光基团，猝灭基团为BHQ1基团；

所述SEQ ID NO .4：序列为5’-tcaggctgttagaggttgttc-3’；

所述SEQ ID NO .5：序列为5’-ctactgcttggatcatcatgtg-3’；

所述SEQ ID NO .6：序列为5’-aagtattggtccgcctcatcctcc-3’；探针使用的报告基团为ROX荧光基团，猝灭基团为BHQ2基团；

所述SEQ ID NO .7：序列为5’-tcaagttccatacagagaccag-3’；

所述SEQ ID NO .8：序列为5’-cggtgtaattcataatgtactcaac-3’；

所述SEQ ID NO .9：序列为5’-accgtctggcaactctccgtt-3’；探针使用的报告基团为CY5荧光基团，猝灭基团为BHQ1基团；

所述SEQ ID NO .10：序列为5’-agatttggacctgcgagcg-3’；

所述SEQ ID NO .11：序列为5’-gagcggctgtctccacaagt-3’；

所述SEQ ID NO.12：序列为5’-ttctgacctgaaggctctgcgcg-3’；探针使用的报告基团为VIC荧光基团，猝灭基团为BHQ1基团。

一种检测猴痘病毒、麻疹病毒和风疹病毒的试剂盒，所述试剂盒包括具有如SEQID NO .1- SEQ ID NO .12所示核苷酸序列的引物探针组合、PCR扩增缓冲液、酶混合液、阳性对照和阴性对照。

所述阳性对照为4×10⁵copies/mL的猴痘病毒质粒、4×10⁵copies/mL的麻疹病毒质粒、4×10⁵copies/mL的风疹病毒质粒和4×10⁵copies/mL的内标质粒按照1：1：1：1的体积比混合的质粒混合液。

一种检测猴痘病毒、麻疹病毒和风疹病毒的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、设计引物探针组合：针对猴痘病毒的F3L基因设计用于检测猴痘病毒的上游引物MPXV-F、下游引物MPXV-R、探针MPXV-P，所述上游引物MPXV-F的序列如SEQ ID NO .1所示，所述下游引物MPXV-R的序列如 SEQ ID NO .2所示，所述探针MPXV-P的序列如SEQ IDNO .3所示；针对麻疹病毒的N基因设计用于检测麻疹病毒的上游引物MV-F、下游引物MV-R、探针MV-P，所述上游引物MV-F的序列如SEQ ID NO .4所示，所述下游引物MV-R的序列如SEQID NO .5所示，所述探针MV-P的序列如SEQ ID NO .6所示；针对风疹病毒的E1基因设计用于检测风疹病毒的上游引物RV-F、下游引物RV-R、探针RV-P，所述上游引物RV-F的序列如SEQ ID NO .7所示，所述下游引物RV-R的序列如SEQ ID NO .8所示，所述探针RV-P的序列如SEQ ID NO .9所示；针对人RNasP基因设计内标的上游引物IC-F、下游引物IC-R、探针IC-P，所述上游引物IC-F的序列如SEQ ID NO .10所示，所述下游引物IC-R的序列如SEQ ID NO.11所示，所述探针IC-P的序列如SEQ ID NO .12所示。

步骤2、重组质粒的合成；

将各个引物和探针的靶序列人工连接到pUC57载体上，形成重组质粒。即，将引物MPXV-F、引物MPXV-R、探针MPXV-P的靶序列人工连接到pUC57载体上，形成猴痘病毒重组质粒；将引物MV-F、引物MV-R、探针MV-P的靶序列人工连接到pUC57载体上，形成麻疹病毒重组质粒；将引物RV-F、引物RV-R、探针RV-P的靶序列人工连接到pUC57载体上，形成风疹病毒重组质粒；将引物IC-F、引物IC-R、探针IC-P的靶序列人工连接到pUC57载体上，形成内标重组质粒。

步骤3、构建qPCR扩增反应体系；

以重组质粒为模板，进行qPCR扩增反应，猴痘病毒重组质粒、麻疹病毒重组质粒和风疹病毒重组质粒的梯度浓度为1.0×10⁸- 1.0×10⁴copies/mL，内标重组质粒的浓度为1.0×10⁵copies/mL。

qPCR扩增反应的25μL反应体系为：

qPCR扩增反应条件为：温度50℃，时间 10min，循环1次；温度95℃，时间 5min，循环1次；之后扩增45个循环，每个循环95℃变性15s，60℃退火延伸30s。

步骤4、建立标准曲线

通过重组质粒的Ct值和各个梯度浓度建立标准曲线，根据标准曲线和待测样本的Ct值得到待测样本中猴痘病毒或麻疹病毒的拷贝数。

本发明的有益效果：

（1）目前检测猴痘病毒、麻疹病毒和风疹病毒为单独或双重检测，暂无可同时检测这三种病原体的检测试剂盒，本发明的检测试剂盒可以同时检测猴痘病毒、麻疹病毒和风疹病毒，检测时间为1.5 h，克服了现有技术中所存在的对猴痘病毒、麻疹病毒和风疹病毒的检测采用单通道荧光PCR方法或者荧光PCR所具有的敏感性低、反应时间长等缺陷。

（2）本发明的检测试剂盒可稳定检出1.0×10³copies/mL含量的猴痘病毒、麻疹病毒或风疹病毒核酸，灵敏性高，且该方法能特异的检测猴痘病毒、麻疹病毒及风疹病毒，与其他相关病原体无交叉反应，特异性显著。

（3）本发明的qPCR方法在闭管状态下进行扩增产物检测，避免了扩增产物污染而致的假阳性；PCR后无需后续处理，操作更简单快速，安全无污染；同时提供用于监测反应体系内抑制情况的引物，提高检测结果准确性。因此，本发明所述的检测方法特异性强、敏感性高、快速、安全，对样本中含微量猴痘病毒、麻疹病毒和风疹病毒基因组的检测效果良好，可用于猴痘病毒、麻疹病毒和风疹病毒的实验室检测和分子流行病学调查。

附图说明

附图1为实施例3中猴痘病毒重组质粒的梯度浓度qPCR扩增标准曲线图；

附图2为实施例3中猴痘病毒重组质粒的梯度浓度qPCR扩增曲线图；

附图3为实施例3中麻疹病毒重组质粒的梯度浓度qPCR扩增标准曲线图；

附图4为实施例3中麻疹病毒重组质粒的梯度浓度qPCR扩增曲线图；

附图5为实施例3中风疹病毒重组质粒的梯度浓度qPCR扩增标准曲线图；

附图6为实施例3中风疹病毒重组质粒的梯度浓度qPCR扩增曲线图；

附图7为实施例3中内标重组质粒的qPCR扩增曲线图；

附图8为实施例5中本发明试剂盒检测猴痘病毒的特异性检测结果图；

附图9为实施例5中本发明试剂盒检测麻疹病毒的特异性检测结果图；

附图10为实施例5中本发明试剂盒检测风疹病毒的特异性检测结果图。

具体实施方式

下面结合实例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

实施例1检测猴痘病毒、麻疹病毒和风疹病毒的引物探针组合物

猴痘病毒，即Monkey pox virus；麻疹病毒，即Measles virus；风疹病毒，即Rubella virus。

SEQ ID NO .1：用于检测猴痘病毒的上游引物，序列为5’-ttccgacgatactcctcctc-3’；

SEQ ID NO .2：用于检测猴痘病毒的下游引物，序列为5’-tcatctattatagcatcagcatcag-3’；

SEQ ID NO .3：用于检测猴痘病毒的探针，序列为5’-ccgtgtatcagcatccattgtcgtag-3’；探针使用的报告基团为FAM荧光基团，猝灭基团为BHQ1基团；

SEQ ID NO .4：用于检测麻疹病毒的上游引物，序列为5’-tcaggctgttagaggttgttc-3’；

SEQ ID NO .5：用于检测麻疹病毒的下游引物，序列为5’-ctactgcttggatcatcatgtg-3’；

SEQ ID NO .6：用于检测麻疹病毒的探针，序列为5’-aagtattggtccgcctcatcctcc-3’；探针使用的报告基团为ROX荧光基团，猝灭基团为BHQ2基团；

SEQ ID NO .7：用于检测风疹病毒的上游引物，序列为5’-tcaagttccatacagagaccag-3’；

SEQ ID NO .8：用于检测风疹病毒的下游引物，序列为5’-cggtgtaattcataatgtactcaac-3’；

SEQ ID NO .9：用于检测风疹病毒的探针，序列为5’-accgtctggcaactctccgtt-3’；探针使用的报告基团为CY5荧光基团，猝灭基团为BHQ1基团；

SEQ ID NO .10：内标上游引物，序列为5’-agatttggacctgcgagcg-3’；

SEQ ID NO .11：内标下游引物，序列为5’-gagcggctgtctccacaagt-3’；

SEQ ID NO .12：内标探针，序列为5’-ttctgacctgaaggctctgcgcg-3’；探针使用的报告基团为VIC荧光基团，猝灭基团为BHQ1基团。

实施例2检测猴痘病毒、麻疹病毒和风疹病毒的试剂盒

包括检测猴痘病毒、麻疹病毒和风疹病毒的引物探针组合物、PCR扩增缓冲液、酶混合液、阳性对照、阴性对照；

检测猴痘病毒、麻疹病毒和风疹病毒的引物探针组合物：序列SEQ ID NO .1- SEQID NO .12（具体如实施例1所示）；各引物、探针的工作浓度为10 µM。

PCR扩增缓冲液：购自翌圣生物科技（上海）股份有限公司，型号：13775。

酶混合液包括逆转录酶、Taq酶，酶混合液购自翌圣生物科技（上海）股份有限公司，型号：13775。

阳性对照为4×10⁵copies/mL的猴痘病毒质粒、4×10⁵copies/mL的麻疹病毒质粒、4×10⁵copies/mL的风疹病毒质粒和4×10⁵copies/mL的内标质粒按照1：1：1：1的体积比混合的质粒混合液；

阴性对照为DEPC水。

实施例3检测试剂盒的制备方法

步骤1、设计引物探针组合

针对猴痘病毒及麻疹病毒的基因保守序列，通过NCBI Blast验证，设计合成以下引物探针：

（1）引物MPXV-F：针对猴痘病毒的F3L基因设计用于检测猴痘病毒的上游引物，序列如SEQ ID NO .1所示；

（2）引物MPXV-R：针对猴痘病毒的F3L基因设计用于检测猴痘病毒的下游引物，序列如SEQ ID NO .2所示；

（3）探针MPXV-P：针对猴痘病毒的F3L基因设计用于检测猴痘病毒的探针，序列如SEQ ID NO .3所示；

（4）引物MV-F：针对麻疹病毒的N基因设计用于检测麻疹病毒的上游引物，序列如SEQ ID NO .4所示；

（5）引物MV-R：针对麻疹病毒的N基因设计用于检测麻疹病毒的下游引物，序列如SEQ ID NO .5所示；

（6）探针MV-P：针对麻疹病毒的N基因设计用于检测麻疹病毒的探针，序列如SEQID NO .6所示；

（7）引物RV-F：针对风疹病毒的E1基因设计用于检测风疹病毒的上游引物，序列如SEQ ID NO .7所示；

（8）引物RV-R：针对风疹病毒的E1基因设计用于检测风疹病毒的下游引物，序列如SEQ ID NO .8所示；

（9）探针RV-P：针对风疹病毒的E1基因设计用于检测风疹病毒的探针，序列如SEQID NO .9所示；

（10）引物IC-F：针对人RNasP基因设计内标上游引物，序列如SEQ ID NO .10所示；

（11）引物IC-R：针对人RNasP基因设计内标下游引物，序列如SEQ ID NO .11所示；

（12）探针IC-P：针对人RNasP基因设计内标探针，序列如SEQ ID NO .12所示。

步骤2、重组质粒的合成

将引物MPXV-F、引物MPXV-R、探针MPXV-P的靶序列人工连接到pUC57载体（由生工生物合成）上，形成猴痘病毒重组质粒。

将引物MV-F、引物MV-R、探针MV-P的靶序列人工连接到pUC57载体（由生工生物合成）上，形成麻疹病毒重组质粒。

将引物RV-F、引物RV-R、探针RV-P的靶序列人工连接到pUC57载体（由生工生物合成）上，形成风疹病毒重组质粒。

将引物IC-F、引物IC-R、探针IC-P的靶序列人工连接到pUC57载体（由生工生物合成）上，形成内标重组质粒。

分别将上述四种重组质粒的干粉用TE缓冲液重悬后用Qubit测定浓度，并将上述四种重组质粒均稀释至1.0×10⁸copies/mL、1.0×10⁷copies/mL、1.0×10⁶copies/mL、4×10⁵copies/mL、1.0×10⁵copies/mL、1.0×10⁴copies/mL、1.0×10³copies/mL，-80℃保存备用。

步骤3、配制阳性对照和阴性对照

将4×10⁵copies/mL的猴痘病毒质粒、4×10⁵copies/mL的麻疹病毒质粒、4×10⁵copies/mL的风疹病毒质粒和4×10⁵copies/mL的内标质粒按照1：1：1：1的体积比混合，振荡混匀后即为阳性对照。

阴性对照为DEPC水。

步骤4、构建qPCR扩增反应体系

以步骤2制备的猴痘病毒重组质粒、麻疹病毒重组质粒、风疹病毒重组质粒、内标重组质粒为模板，分别进行qPCR扩增反应，其中，所述猴痘病毒重组质粒、麻疹病毒重组质粒和风疹病毒重组质粒的梯度浓度为1.0×10⁸~ 1.0×10⁴copies/mL，内标重组质粒的浓度为1.0×10⁵copies/mL，每个梯度浓度重复2次。

qPCR扩增反应的25μL反应体系为：

10 x Hifair® V Lyo-Enzyme Mix为反应酶；4 x Hifair® V Lyo-Buffer为反应Buffer。

qPCR扩增反应条件为：在qPCR仪（SLAN-96S、ABI 7500）中进行扩增，温度50℃，时间 10min，循环1次；温度95℃，时间 5min，循环1次；之后扩增45个循环，每个循环95℃变性15s，60℃退火延伸30s。

qPCR扩增反应中采集信号，反应结束得到qPCR产物的Ct值，即PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值。

结果判定：

当FAM通道Ct值＜40时代表生物样品中含有猴痘病毒，为猴痘病毒阳性；当ROX通道Ct值＜40时代表生物样品中含有麻疹病毒，为麻疹病毒阳性；当CY5通道Ct值＜40时代表生物样品中含有风疹病毒，为风疹病毒阳性；当Ct值≥40代表生物样品中不含有猴痘病毒、麻疹病毒或风疹病毒，为猴痘病毒、麻疹病毒或风疹病毒阴性；VIC通道Ct值不做要求。

步骤5、建立标准曲线

通过步骤3获得的猴痘病毒重组质粒、麻疹病毒重组质粒、风疹病毒重组质粒、内标重组质粒的Ct值和各个梯度浓度建立标准曲线，通过标准曲线和待测样品的Ct值得到待测样品中猴痘病毒、麻疹病毒或风疹病毒的拷贝数。

标准曲线：

（1）以猴痘病毒1.0×10⁸~ 1.0×10⁴copies/mL重组质粒为模板，每个浓度梯度重复2次，建立的标准曲线，如附图1所示。猴痘病毒梯度浓度重组质粒扩增曲线如附图2所示。

附图1-2显示1.0×10⁸~ 1.0×10⁴copies/mL猴痘病毒重组质粒均能扩增，根据各梯度浓度扩增Ct值计算得出线性回归方程为Ct=-3.46Log(Conc)+36.763，扩增效率为94.559%，R²= 0 .999，表明在1.0×10⁸~ 1.0×10⁴copies/mL范围内具有良好的线性关系。

（2）以麻疹病毒1.0×10⁸~ 1.0×10⁴copies/mL重组质粒为模板，每个浓度梯度重复2次，建立的标准曲线，如附图3所示。麻疹病毒梯度浓度重组质粒扩增曲线如附图4所示。

附图3-4显示1.0×10⁸~ 1.0×10⁴copies/mL麻疹病毒重组质粒均能扩增，根据各梯度浓度扩增Ct值计算得出线性回归方程为Ct=-3.365Log(Conc)+36.149，扩增效率为98.221%，R²= 1，表明在1.0×10⁸~ 1.0×10⁴copies/mL范围内具有良好的线性关系。

（3）以风疹病毒1.0×10⁸~ 1.0×10⁴copies/mL重组质粒为模板，每个浓度梯度重复2次，建立的标准曲线，如附图5所示。风疹病毒梯度浓度重组质粒扩增曲线如附图6所示。

附图5-6显示1.0×10⁸~ 1.0×10⁴copies/mL风疹病毒重组质粒均能扩增，根据各梯度浓度扩增Ct值计算得出线性回归方程为Ct=-3.448Log(Conc)+36.078，扩增效率为95.014%，R²= 0 .999，表明在1.0×10⁸~ 1.0×10⁴copies/mL范围内具有良好的线性关系。

（4）在步骤（1）（2）（3）的扩增过程中，向体系里添加1.0×10⁵copies/mL内标重组质粒，内标扩增情况如附图7所示，各个反应体系均能正常扩增，说明反应体系内无抑制情况。

实施例4试剂盒检测限的检测

采用实施例3制备的试剂盒，分别以猴痘病毒1.0×10³copies/mL重组质粒、麻疹病毒 1.0×10³copies/mL重组质粒和风疹病毒 1.0×10³copies/mL重组质粒为模板，进行qPCR扩增反应，在扩增过程中，向体系里添加1.0×10⁵copies/mL内标重组质粒，qPCR扩增反应体系和扩增反应条件如实施例3中所示，重复20次，检测本发明的检测限。猴痘病毒重组质粒、麻疹病毒重组质粒和风疹病毒重组质粒的qPCR扩增反应的检测结果如表1所示；

表1猴痘病毒重组质粒和麻疹病毒重组质粒qPCR扩增检测结果

注：若无检测Ct值，检测内容显示Undetermined。

经计算，猴痘病毒、麻疹病毒和风疹病毒的阳性检出率均为100%，且Ct值的变异系数CV均不超过5%。

说明，本发明检测猴痘病毒重组质粒、麻疹病毒重组质粒和风疹病毒重组质粒的检测限可以低至1.0×10³copies/mL。

实施例5试剂盒特异性的检测

采集天花病毒、牛痘病毒、痘苗病毒、水痘病毒、EB病毒、基孔肯雅病毒、登革热病毒、猴痘病毒（MPXV）、麻疹病毒（MV）、风疹病毒（RV）的核酸作为模板（即待检样本），分别采用本发明试剂盒进行qPCR扩增反应。待检样本分别标记为：样本1：阴性对照、样本2：天花病毒、样本3：牛痘病毒、样本4：痘苗病毒、样本5：水痘病毒、样本6：EB病毒、样本7：基孔肯雅病毒、样本8：登革热病毒、样本9：猴痘病毒（MPXV）、样本10：麻疹病毒（MV）、样本11：风疹病毒（RV）、样本12：阳性对照。

其中待检样本2-8浓度为1.0×10⁵copies/mL，待检样本9-11浓度为1.0×10³copies/mL。采用实施例3制备的试剂盒对上述待检样本1-12进行检测，qPCR扩增反应体系和扩增反应条件如实施例3中所示。

每个样本检测重复2次，检测结果如附图8-10所示。

附图8为采用本发明试剂盒检测猴痘病毒的特异性检测结果图，图中曲线为待检样本在FAM通道起峰情况；从附图8可以看出，样本9、12有起峰；样本1-8、10、11均未起峰；即模板为样本9（猴痘病毒）时FAM通道起峰，与阳性对照中猴痘病毒通道一致，也就是说，猴痘病毒阳性。

附图9为采用本发明试剂盒检测麻疹病毒的特异性检测结果图，图中曲线为待检样本在ROX通道起峰情况；从附图9可以看出，样本10、12有起峰；样本1-9、11均未起峰；即模板为样本10（麻疹病毒）时ROX通道起峰，与阳性对照中麻疹病毒通道一致，也就是说，麻疹病毒阳性。

附图10为采用本发明试剂盒检测风疹病毒的特异性检测结果图，图中曲线为待检样本在CY5通道起峰情况；从附图10可以看出，样本11、12有起峰；样本1-10均未起峰；即模板为样本11（风疹病毒）时CY5通道起峰，与阳性对照中风疹病毒通道一致，也就是说，风疹病毒阳性。

模板为天花病毒、牛痘病毒、痘苗病毒、水痘病毒、EB病毒、基孔肯雅病毒、登革热病毒及阴性对照时FAM、ROX及CY5通道均未起峰，均为阴性。

由附图8-10可知，目标病原体（猴痘病毒、麻疹病毒、风疹病毒）与干扰病原体进行荧光定量PCR，猴痘病毒、麻疹病毒、风疹病毒各自对应的通道有扩增曲线，其他病原体均未出现扩增曲线，可见，本发明试剂盒检测猴痘病毒、麻疹病毒、风疹病毒具有显著的特异性。

需要说明的是，以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。凡采用同等替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均应包含在本发明的保护范围内。

Claims

1.检测猴痘病毒、麻疹病毒和风疹病毒的引物探针组合物，其特征在于：包括用于检测猴痘病毒的引物、用于检测猴痘病毒的探针、用于检测麻疹病毒的引物、用于检测麻疹病毒的探针、用于检测风疹病毒的引物、用于检测风疹病毒的探针、内标引物和内标探针；

所述用于检测猴痘病毒的引物具有如SEQ ID NO .1和SEQ ID NO .2所示的核苷酸序列；所述用于检测猴痘病毒的探针具有如SEQ ID NO .3所示的核苷酸序列；所述用于检测麻疹病毒的引物具有如SEQ ID NO .4和SEQ ID NO .5所示的核苷酸序列；所述用于检测麻疹病毒的探针具有如SEQ ID NO .6所示的核苷酸序列；所述用于检测风疹病毒的引物具有如SEQ ID NO .7和SEQ ID NO .8所示的核苷酸序列；所述用于检测风疹病毒的探针具有如SEQ ID NO .9所示的核苷酸序列；所述内标引物具有如SEQ ID NO .10和SEQ ID NO .11所示的核苷酸序列；所述内标探针具有如SEQ ID NO .12所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的检测猴痘病毒、麻疹病毒和风疹病毒的引物探针组合物，其特征在于：所述用于检测猴痘病毒的探针：报告基团为FAM荧光基团，猝灭基团为BHQ1基团；所述用于检测麻疹病毒的探针：报告基团为ROX荧光基团，猝灭基团为BHQ2基团；所述用于检测风疹病毒的探针：报告基团为CY5荧光基团，猝灭基团为BHQ1基团；所述内标探针：报告基团为VIC荧光基团，猝灭基团为BHQ1基团。

3.检测猴痘病毒、麻疹病毒和风疹病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括具有如SEQ ID NO .1- SEQ ID NO .12所示核苷酸序列的引物探针组合、PCR扩增缓冲液、酶混合液、阳性对照和阴性对照。

4.根据权利要求3所述的检测猴痘病毒、麻疹病毒和风疹病毒的试剂盒，其特征在于：阳性对照为4×10⁵ copies/mL的猴痘病毒质粒、4×10⁵ copies/mL的麻疹病毒质粒、4×10⁵copies/mL的风疹病毒质粒和4×10⁵ copies/mL的内标质粒按照1：1：1：1的体积比混合的质粒混合液。

5.检测猴痘病毒、麻疹病毒和风疹病毒的试剂盒的制备方法，其特征在于：包括设计引物探针组合：针对猴痘病毒的F3L基因设计用于检测猴痘病毒的上游引物、下游引物和探针；针对麻疹病毒的N基因设计用于检测麻疹病毒的上游引物、下游引物和探针；针对风疹病毒的E1基因设计用于检测风疹病毒的上游引物、下游引物和探针；针对人RNasP基因设计内标的上游引物、下游引物和探针。

6.根据权利要求5所述的检测猴痘病毒、麻疹病毒和风疹病毒的试剂盒的制备方法，其特征在于：所述制备方法还包括构建qPCR扩增反应体系；所述构建qPCR扩增反应体系：以重组质粒为模板，进行qPCR扩增反应，猴痘病毒重组质粒、麻疹病毒重组质粒、风疹病毒重组质粒的梯度浓度为1.0×10⁸- 1.0×10⁴copies/mL，内标重组质粒的浓度为1.0×10⁵copies/mL。

7.根据权利要求5所述的检测猴痘病毒、麻疹病毒和风疹病毒的试剂盒的制备方法，其特征在于：所述构建qPCR扩增反应体系：qPCR扩增反应的25μL反应体系为：

。

8.根据权利要求5所述的检测猴痘病毒、麻疹病毒和风疹病毒的试剂盒的制备方法，其特征在于：所述构建qPCR扩增反应体系：qPCR扩增反应条件为：温度50℃，时间 10min，循环1次；温度95℃，时间 5min，循环1次；之后扩增45个循环，每个循环95℃变性15s，60℃退火延伸30s。