CN114317817A - 一种用于检测水貂圆环病毒的荧光定量pcr引物组和荧光定量pcr试剂盒 - Google Patents
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Abstract
一种用于检测水貂圆环病毒的荧光定量PCR引物组和荧光定量PCR试剂盒，涉及水貂圆环病毒检测领域，包括：MiCV荧光定量PCR反应液、阳性质控品和阴性质控品；MiCV荧光定量PCR反应液包括上下游引物、TB
Premix Ex TaqTMII和ddH2O；上游引物：5'‑AGGGCCTTTGGGCATCATTG‑3'；下游引物：5'‑CCCGCCTGCAAACTGAAGAA‑3'。本发明根据水貂圆环病毒的Cap基因保守序列设计引物，通过反应体系和条件优化建立了基于SYBR Green II的实时荧光定量PCR技术并组装试剂盒，该试剂盒具有稳定性好、敏感性和特异性较高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及水貂圆环病毒检测技术领域，具体涉及一种用于检测水貂圆环病毒的荧光定量PCR引物组和荧光定量PCR试剂盒。
背景技术
水貂圆环病毒(Mink circovirus，MiCV)是近年来被发现的新型圆环病毒，病毒感染水貂后可引起水貂出现食欲不佳、精神倦怠、被毛粗乱和腹泻等症状，且容易引起其他疾病的混合感染。大部分患病水貂可自然康复，康复后消瘦或生长迟缓，除了本身生长不良及貂皮质量明显降低以外，还会影响其产仔数，所生仔貂个体也较小。在病程后期，约7～8％患病水貂粪便从白痢逐渐变为黄痢、红痢，出现脓样(胶胨样)便，继而转变为黑色血便，口鼻苍白，最终甚至死亡。水貂圆环病毒病一般在8～10月份为多发，且可在不同年龄的貂之间相互传播，在我国的流行范围较广且呈逐年增加的趋势。已有流行病学研究结果表明，该病在黑龙江省的阳性率为30.30％，吉林省阳性率为38.46％，山东省的阳性率为52.88％，辽宁省阳性率为58.46％，河北省的阳性率为67.90％。MiCV对养貂业产生了巨大威胁，严重危害了貂场的经济效益。
目前，对于水貂圆环病毒的研究较少，其致病机制尚不明确，也没有有效的疫苗和药物。因此，建立一种快速有效的检测方法对于疾病防治和流行病学监测具有重要意义。目前，针对MiCV尚无细胞培养系统可用于病毒分离鉴定，迄今为止，建立的用于检测MiCV的方法主要包括常规PCR方法、重组酶聚合酶扩增(RPA)方法、间接酶联免疫吸附法和荧光定量PCR方法等。荧光定量PCR检测方法具有高度特异性、灵敏性、可重复性和定量性等特点，可快速测定不同组织样品中的病毒，该技术已被证明可以诊断多种家畜病毒性的疾病，并已成为兽医病毒学和疾病控制方面的重要工具。
发明内容
随着疾病的流行，MiCV基因组不断发生变异，为提高检测的准确性，本发明参考实验室近年来分离的MiCV全基因组序列和GenBank登陆的全部MiCV基因组序列，选择保守区域设计合成特异性引物，通过反应条件优化，建立用于MiCV检测的荧光定量PCR检测方法，并组装试剂盒，为MiCV的防控提供技术支持。
本发明的目的是提供一种用于检测水貂圆环病毒的荧光定量PCR引物组和荧光定量PCR试剂盒，以弥补荧光定量PCR在检测水貂圆环病毒中的应用空白。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
本发明的一种用于检测水貂圆环病毒的荧光定量PCR引物组，引物信息如下：
上游引物MiCV-F：5'-AGGGCCTTTGGGCATCATTG-3'；
下游引物MiCV-R：5'-CCCGCCTGCAAACTGAAGAA-3'。
本发明的一种用于检测水貂圆环病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒的反应总体系包括：MiCV荧光定量PCR反应液、阳性质控品和阴性质控品；所述MiCV荧光定量PCR反应液包括上游引物、下游引物、TB
Premix Ex TaqTMII和ddH2O；
所述上游引物MiCV-F：5'-AGGGCCTTTGGGCATCATTG-3'；
所述下游引物MiCV-R：5'-CCCGCCTGCAAACTGAAGAA-3'。
3、根据权利要求2所述的一种用于检测水貂圆环病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，在每个反应总体系中，所述MiCV荧光定量PCR反应液的总用量为22μL；其中，所述上游引物用量为1μL，所述下游引物用量为1μL，所述TB
Premix Ex TaqTMII用量为12.5μL，所述ddH2O用量为7.5μL。
作为优选的实施方式，所述上游引物浓度为10μmol/L。
作为优选的实施方式，所述下游引物浓度为10μmol/L。
作为优选的实施方式，所述阳性质控品为含有水貂圆环病毒Cap基因保守序列的pMD18-T载体质粒。
作为优选的实施方式，所述阳性质控品浓度为1×106个拷贝/μL。
作为优选的实施方式，所述阴性质控品为DEPC水。
本发明的有益效果是：
本发明根据水貂圆环病毒(MiCV)的Cap基因保守序列设计引物，通过反应体系和反应条件的优化，建立了基于SYBR Green II的实时荧光定量PCR技术并组装试剂盒，通过所构建的上下游引物以及所组装的荧光定量PCR试剂盒，能够实时、快速测定MiCV，该试剂盒不但稳定性好，而且具有较高的敏感性和特异性，可为水貂圆环病毒(MiCV)的诊断及流行病学调查提供更大的技术支持。
附图说明
图1为实施例2中Cap基因的PCR扩增结果。图中，M：DL 2000bp DNA Marker；1：Cap基因PCR扩增片段；2：阴性对照。
图2为实施例3中引物浓度优化结果。图中，a～e(由左至右)分别表示引物终浓度依次为400nM、500nM、300nM、200nM和100nM的优化结果。
图3为实施例3中退火温度优化结果。图中，a～f(由左至右)分别表示退火温度依次为57℃、58℃、56℃、55℃、59℃和60℃的优化结果。
图4为实施例3中重组阳性质粒扩增曲线。图中，a～f(由左至右)分别表示模板浓度依次为1.0×106拷贝/μL、1.0×105拷贝/μL、1.0×104拷贝/μL、1.0×103拷贝/μL、1.0×102拷贝/μL和1.0×101拷贝/μL。
图5为实施例3中荧光定量PCR标准曲线。
图6为实施例3中荧光定量PCR熔解曲线。
图7为实施例3中荧光定量PCR特异性扩增曲线。
图8为实施例3中荧光定量PCR敏感性扩增曲线。图中，a～e(由左至右)分别表示模板浓度依次为1.0×105拷贝/μL、1.0×104拷贝/μL、1.0×103拷贝/μL、1.0×102拷贝/μL、1.0×101拷贝/μL、1.0×100拷贝/μL的敏感性扩增曲线。
图9为普通PCR敏感性试验结果。图中，M：DL 2000bp DNAMarker；1-6：1.0×105拷贝/μL～1.0×100拷贝/μL的重组阳性质粒；7：阴性对照。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1荧光定量PCR引物的设计与合成
从GenBank中获取全部MiCV毒株的Cap基因序列，使用DNAMAN软件进行比对，用Premier 5软件针对保守区域设计1对荧光定量PCR引物和1对普通PCR引物(见表1)，并送至生物公司进行合成。
表1引物信息
a位置：引物位置代表了MiCV内核苷酸的起始位置和结束位置(参考GenBank中MK561562的序列位置)。
实施例2重组阳性质粒标准品的制备
根据商品化病毒基因组提取试剂盒的说明书进行操作，从水貂圆环病毒阳性样品(MiCV HB3株，病毒全基因组GenBank登录号为MK561562)中提取病毒DNA，并以MiCV-Cap-F和MiCV-Cap-R作为上下游引物进行PCR扩增。PCR反应体系为25μL：Ex Taq DNA聚合酶12.5μL(5U/μL)，上下游引物各0.5μL(10μmol/L)，DNA模板1μL，ddH2O 10.5μL。PCR反应条件：98℃10s，55℃30s，72℃1min，30个循环。同时设立阴性对照，经琼脂糖凝胶电泳检测获得大小约为684bp的目的条带，如图1所示。将目的条带回收后与pMD18-T载体通过基因扩增仪16℃连接过夜。反应体系如下(10μL)：PCR回收产物4μL，pMD18-T载体1μL，SolutionⅠ5μL。然后将连接产物转化至DH5α感受态细胞中进行培养，提取质粒进行测序，测序正确获得重组阳性质粒即pMD18-T载体质粒。通过酶标仪来测定重组阳性质粒的浓度，结果显示其浓度为210.47ng/μL，OD260/280值为1.80。使用样品拷贝数计算公式来换算阳性标准品的拷贝数。计算公式如下：样品拷贝数＝[浓度(ng/μL)×阿佛加德罗常数(NA)×10-9]/(660×重组质粒DNA碱基数)，经计算其拷贝数为5.68×1010拷贝/μL。
实施例3检测MiCV的实时荧光定量PCR检测方法的建立
1、引物浓度、退火温度的优化
将引物(MiCV-F和MiCV-R)分别稀释为2.5μmol/L、5μmol/L、7.5μmol/L、10μmol/L和12.5μmol/L，以重组阳性质粒作为模板，进行荧光定量PCR反应。PCR反应体系为25μL：重组阳性质粒1μL，不同浓度的上游引物(MiCV-F)1μL(反应体系中的终浓度分别为100nM、200nM、300nM、400nM和500nM)，不同浓度的下游引物(MiCV-R)1μL(反应体系中的终浓度分别为100nM、200nM、300nM、400nM和500nM)，TB
Premix Ex TaqTMII 12.5μL，ddH2O9.5μL。PCR反应程序：95℃30s；45个循环：95℃5s，55℃30s，对引物的浓度进行优化。结果显示，引物终浓度分别为500nM、400nM、300nM、200nM和100nM时，其对应的Ct值分别为9.60、8.84、9.88、9.97和10.82，因此，确定最优引物终浓度为400nM(稀释使用浓度为10μmol/L)，如图2所示。
用上述反应体系，以重组阳性质粒作为模板进行荧光定量PCR反应，反应程序为95℃30s；45个循环：95℃5s，55℃～60℃30s。确定最佳退火温度。结果显示，退火温度分别为55℃、56℃、57℃、58℃、59℃和60℃时，其对应的CT值分别为9.77、9.48、9.17、9.25、9.87和10.04，因此，确定最佳退火温度为57℃，如图3所示。
2、标准曲线建立
将重组阳性质粒进行10倍倍比稀释，设置6个稀释梯度(1.0×101拷贝/μL～1.0×106拷贝/μL)，将其作为模板，每个稀释度设3次重复，按照优化后的反应体系和条件进行荧光定量PCR扩增，生成循环阈值(Ct值)，以Ct值为纵坐标，以模板浓度的对数值为横坐标构建荧光定量PCR标准曲线。结果如图4、图5所示，标准方程为y＝-3.63x+37.82，其斜率为-3.63，截距为37.82，相关系数为0.9983，由此说明，该实时荧光定量PCR检测方法在稀释范围内有很好的线性关系。标准品扩增产物的熔解曲线均出现单一波峰，无引物二聚体及非特异峰，熔解温度为82℃，如图6所示，由此说明，该实时荧光定量PCR检测方法无非特异性扩增。
3、荧光定量PCR特异性试验
以水貂圆环病毒(MiCV)、水貂阿留申病毒(AMDV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、水貂肠炎病毒(MEV)、犬瘟热病毒(CDV)和猪伪狂犬病毒(PRV)作为模板，进行荧光定量PCR反应，结果只有水貂圆环病毒(MiCV)能够扩增出特异性曲线，其余病毒均无特异性扩增，如图7所示，结果表明该实时荧光定量PCR检测方法特异性良好。
4、荧光定量PCR敏感性试验
将重组阳性质粒进行10倍倍比稀释(从1.0×100拷贝/μL～1.0×105拷贝/μL)，以其为模板，进行荧光定量PCR反应和普通PCR反应，比较其敏感性。结果显示，荧光定量PCR检测到的最小拷贝数为101拷贝/μL，如图8所示，而普通PCR检测到的最小拷贝数为103拷贝/μL，如图9所示，结果表明该荧光定量PCR检测方法敏感性良好。
5、荧光定量PCR重复性试验
分别使用浓度为1.0×102拷贝/μL、1.0×104拷贝/μL和1.0×106拷贝/μL的重组阳性质粒为模板，在相同条件下进行3次实验作为批间重复性检测，同时进行每个浓度一式三份的批内重复性检验。通过将每个测试样品的标准偏差(SD)除以平均值，计算出批间变异系数和批内变异系数(CV)，对其进行重复性评价。结果表明，批内CV的范围为0.14％～0.39％，批间CV的范围为0.64％～0.81％，均小于1％(见表2)，结果表明该荧光定量PCR检测方法重复性良好。
表2批内与批间重复性试验
6、结果判定
判读结果时，通过对扩增曲线进行分析，当Ct值≤35并且扩增曲线呈S型时，判定为MiCV阳性；当无Ct值时，判定为MiCV阴性；当Ct值＞35时，检测灰区，重新检测2次，仍大于35时判定为阴性。
实施例4用于检测水貂圆环病毒(MiCV)的荧光定量PCR试剂盒的组装及使用方法
荧光定量PCR试剂盒的组成如下：
1、MiCV荧光定量PCR反应液：1.0ml/管。每个反应体系均包括上游引物1μL(10μmol/L)，下游引物1μL(10μmol/L)，TB
Premix Ex TaqTMII 12.5μL，ddH2O 7.5μL，共22μL。
| 引物名称 | 引物序列(5'to3') |
| 上游引物MiCV-F | AGGGCCTTTGGGCATCATTG |
| 下游引物MiCV-R | CCCGCCTGCAAACTGAAGAA |
2、阳性质控品：含有水貂圆环病毒Cap基因保守序列的pMD18-T载体质粒(实施例2中的重组阳性质粒标准品)(浓度为1×106个拷贝/μL)，100μL/管。
3、阴性质控品：DEPC水，200μL/管。
荧光定量PCR试剂盒的使用方法如下：
1、病毒DNA的提取
使用商品化的病毒核酸提取试剂盒提取待检样品中的病毒DNA，按试剂盒说明书方法进行操作。
2、荧光定量PCR扩增
取出MiCV荧光定量PCR反应液，室温融化并颠倒混匀，分别向各PCR反应管中加入22μL PCR反应液，再分别向设定的PCR反应管中加入提取的待检样本DNA、阴性质控品和稀释好的阳性质控品各3μL，盖紧管盖，置于荧光PCR仪上，设定反应程序如下：95℃30s；45个循环：95℃5s，57℃30s。
实施例5临床样品检测
用组装的MiCV荧光定量PCR试剂盒和常规PCR方法对临床采集的116份组织样品进行MiCV的检测。结果显示，MiCV荧光定量PCR试剂盒检测出43份样品呈MiCV阳性，检出率为37.1％，而常规PCR方法检测出35份样品呈MiCV阳性，检出率为30.2％。
本发明公开了一种用于检测水貂圆环病毒的荧光定量PCR引物组和荧光定量PCR试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
序列表
<110> 吉林农业大学
<120> 一种用于检测水貂圆环病毒的荧光定量PcR引物组和荧光定量PcR试剂盒
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工(DNA)
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<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工(DNA)
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Claims (8)
1.一种用于检测水貂圆环病毒的荧光定量PCR引物组，其特征在于，引物信息如下：
上游引物MiCV-F：5'-AGGGCCTTTGGGCATCATTG-3'；
下游引物MiCV-R：5'-CCCGCCTGCAAACTGAAGAA-3'。
2.一种用于检测水貂圆环病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，该试剂盒的反应总体系包括：MiCV荧光定量PCR反应液、阳性质控品和阴性质控品；所述MiCV荧光定量PCR反应液包括上游引物、下游引物、TB
Premix ExTaqTM II和ddH2O；
所述上游引物MiCV-F：5'-AGGGCCTTTGGGCATCATTG-3'；
所述下游引物MiCV-R：5'-CCCGCCTGCAAACTGAAGAA-3'。
3.根据权利要求2所述的一种用于检测水貂圆环病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，在每个反应总体系中，所述MiCV荧光定量PCR反应液的总用量为22μL；其中，所述上游引物用量为1μL，所述下游引物用量为1μL，所述TB
Premix Ex TaqTM II用量为12.5μL，所述ddH2O用量为7.5μL。
4.根据权利要求2或3所述的一种用于检测水貂圆环病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述上游引物浓度为10μmol/L。
5.根据权利要求2或3所述的一种用于检测水貂圆环病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述所述下游引物浓度为10μmol/L。
6.根据权利要求2所述的一种用于检测水貂圆环病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品为含有水貂圆环病毒Cap基因保守序列的pMD18-T载体质粒。
7.根据权利要求2或6所述的一种用于检测水貂圆环病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品浓度为1×106个拷贝/μL。
8.根据权利要求2所述的一种用于检测水貂圆环病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述阴性质控品为DEPC水。
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| CN202111393674.9A CN114317817A (zh) | 2021-11-23 | 2021-11-23 | 一种用于检测水貂圆环病毒的荧光定量pcr引物组和荧光定量pcr试剂盒 |
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| CN202111393674.9A CN114317817A (zh) | 2021-11-23 | 2021-11-23 | 一种用于检测水貂圆环病毒的荧光定量pcr引物组和荧光定量pcr试剂盒 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN116083646A (zh) * | 2022-11-04 | 2023-05-09 | 青岛农业大学 | 用于检测鸡圆环病毒的实时荧光定量pcr引物、试剂盒与应用 |
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- 2021-11-23 CN CN202111393674.9A patent/CN114317817A/zh active Pending
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