CN114250322B - 用于检测水貂圆环病毒和水貂阿留申病毒的双重荧光定量pcr试剂盒 - Google Patents
用于检测水貂圆环病毒和水貂阿留申病毒的双重荧光定量pcr试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
用于检测水貂圆环病毒和水貂阿留申病毒的双重荧光定量PCR试剂盒，涉及病毒检测领域，包括引物、探针、2X TaqMan Fast qPCR预混液、ddH2O、阳性质控品和阴性质控品；MiCV‑F：AGGGCCTTTGGGCATCATTG；MiCV‑R：CCCGCCTGCAAACTGAAGAA；AMDV‑F：GGAAGAAGAAGGTTGGC；AMDV‑R：AACTGTTGGTTGGTATGAG；MiCV‑P：ACGGAGTTGCTGCAGATGCCACGGT；AMDV‑P：TGCTGCTTCAGGCACACA。该试剂盒能同时检测水貂圆环病毒和水貂阿留申病毒，特异性强、敏感性高和可重复性好。
Description
技术领域
本发明涉及水貂圆环病毒和水貂阿留申病毒检测技术领域，具体涉及一种用于检测水貂圆环病毒和水貂阿留申病毒的双重荧光定量PCR试剂盒。
背景技术
水貂阿留申病和圆环病毒病在水貂群中流行较为普遍。其中，水貂阿留申病(Aleutianmink disease，AMD)是由水貂阿留申病毒(Aleutian Mink Disease Virus，AMDV)引起的一种慢性、病毒性的传染病。AMDV分布在世界各地的水貂养殖国家。该病的流行给水貂养殖业带来巨大的损失，严重影响了水貂养殖业的发展。据不完全统计，在中国主要的水貂繁殖地区，AMDV感染率约为40～70％。AMDV可通过血液，唾液，粪便和尿液的直接或间接接触感染。AMDV根据感染宿主基因型、年龄及病毒株的不同，对宿主所表现的临床症状也不同。在成年貂中，AMDV引起浆细胞增多症，幼貂感染AMDV后的症状主要为上呼吸道感染，为急速发展病症。由于AMDV致病机制复杂，目前尚无有效疫苗来防控该病。当前防疫该病的主要方法是检疫淘汰，但无法从根本上杜绝该病的发生。因此，建立快速有效的检测方法对于降低该病所造成的经济损失显得尤为重要。目前，常用的实验室检测方法有血清学方法、病毒学和分子生物学诊断。对流免疫电泳(CIEP)通常被认为是检测AMDV的金标准。CIEP是基于电泳后免疫复合物的形成，但CIEP的结果是主观的，需要一定经验的，通常会导致假阳性的读数。ELISA是检测AMDV抗体的常用方法，可以同时检测多个样品，但在感染早期使用该方法，常会出现假阴性的结果。此外，PCR方法已用于检测AMDV感染。该技术可以比CIEP和ELISA更早地识别病毒感染，但是当病毒复制受到限制时，PCR方法可能无法在长期受感染的水貂中检测到病毒。
水貂圆环病毒(mink circovirus，MiCV)是近年来被发现的一种新型圆环病毒，MiCV感染水貂后会使患病貂出现腹泻、嗜睡、厌食、精神倦怠、被毛粗乱等症状。目前我国水貂养殖的主要分布地区有山东、河北和东北等地，我国大部分养貂地区已经发现有水貂患有此病，MiCV感染率已达到44～63％，对养貂业产生了极大的威胁，严重影响了貂场的经济效益。目前，针对水貂圆环病毒的预防和治疗尚未有人研发出有效的疫苗和药物，同时针对水貂圆环病毒尚无细胞培养系统可用于病毒分离鉴定，并且水貂圆环病毒的致病机制尚不清楚，另外，随着疾病的流行，水貂圆环病毒基因组也在不断发生着变异，为水貂圆环病毒的有效预防和治疗增加了一定难度。因此，如何快速且有效的针对水貂圆环病毒进行检测以降低该病所造成的经济损失显得尤为重要。在病毒检测方面，主要采用常规PCR方法、重组酶聚合酶扩增(RPA)方法、间接酶联免疫吸附法和荧光定量PCR方法等。虽然这些方法都可应用在水貂圆环病毒检测上，但是检测后的效果并不理想。
目前，关于水貂阿留申病毒(Aleutian Mink Disease Virus，AMDV)和水貂圆环病毒(mink circovirus，MiCV)的检测都是单独分开进行的，单独分开检测方式存在操作繁琐、成本高的缺点。
发明内容
针对水貂群中流行较为普遍的水貂阿留申病和圆环病毒病给水貂场带来的巨大经济损失，本发明的目的是提供一种用于检测水貂圆环病毒和水貂阿留申病毒的双重荧光定量PCR试剂盒。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
本发明的用于检测水貂圆环病毒和水貂阿留申病毒的引物和探针序列，引物和探针信息如下：
上游引物MiCV-F：AGGGCCTTTGGGCATCATTG；
下游引物MiCV-R：CCCGCCTGCAAACTGAAGAA；
上游引物AMDV-F：GGAAGAAGAAGGTTGGC；
下游引物AMDV-R：AACTGTTGGTTGGTATGAG；
探针MiCV-P：ACGGAGTTGCTGCAGATGCCACGGT；
探针AMDV-P：TGCTGCTTCAGGCACACA；
所述探针MiCV-P的5'端为荧光基团标记，所述探针MiCV-P的3'端为荧光淬灭基团标记；
所述探针AMDV-P的5'端为荧光基团标记，所述探针MiCV-P的3'端为荧光淬灭基团标记。
作为优选的实施方式，所述荧光基团为FAM或ROX；所述荧光淬灭基团为TAMR或BHQ2。
本发明的用于检测水貂圆环病毒和水貂阿留申病毒的双重荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒的反应总体系包括：双重荧光定量PCR反应液、阳性质控品和阴性质控品；所述双重荧光定量PCR反应液包括上游引物、下游引物、探针、2X TaqMan Fast qPCR预混液和ddH2O；
上游引物MiCV-F：AGGGCCTTTGGGCATCATTG；
下游引物MiCV-R：CCCGCCTGCAAACTGAAGAA；
上游引物AMDV-F：GGAAGAAGAAGGTTGGC；
下游引物AMDV-R：AACTGTTGGTTGGTATGAG；
探针MiCV-P：ACGGAGTTGCTGCAGATGCCACGGT；
探针AMDV-P：TGCTGCTTCAGGCACACA；
所述探针MiCV-P的5'端为荧光基团标记，所述探针MiCV-P的3'端为荧光淬灭基团标记；
所述探针AMDV-P的5'端为荧光基团标记，所述探针MiCV-P的3'端为荧光淬灭基团标记。
作为优选的实施方式，所述荧光基团为FAM或ROX；所述荧光淬灭基团为TAMR或BHQ2。
作为优选的实施方式，该试剂盒的反应总体系为18μL，其中，上游引物MiCV-F为0.8μL，上游引物AMDV-F为0.8μL，下游引物MiCV-R为0.8μL，下游引物AMDV-R为0.8μL，探针MiCV-P为0.4μL，探针AMDV-P为0.8μL，2X TaqMan Fast qPCR预混液为10μL，ddH2O为3.6μL。
作为优选的实施方式，该试剂盒的反应总体系中，上游引物MiCV-F浓度为10μmol/L，上游引物AMDV-F浓度为10μmol/L，下游引物MiCV-R浓度为10μmol/L，下游引物AMDV-R浓度为10μmol/L，探针MiCV-P浓度为10μmol/L，探针AMDV-P浓度为10μmol/L。
作为优选的实施方式，所述阳性质控品为含有水貂圆环病毒Cap基因保守序列的pMD18-T载体质粒与含有水貂阿留申病毒VP2基因保守序列的pMD18-T载体质粒的混合品。
作为优选的实施方式，所述含有水貂圆环病毒Cap基因保守序列的pMD18-T载体质粒的浓度为1×106个拷贝/μL。
作为优选的实施方式，所述含有水貂阿留申病毒VP2基因保守序列的pMD18-T载体质粒的浓度为1×106个拷贝/μL。
作为优选的实施方式，所述阴性质控品为DEPC水。
本发明的有益效果是：
本发明的用于检测水貂圆环病毒和水貂阿留申病毒的双重荧光定量PCR试剂盒，主要由双重荧光定量PCR反应液、阳性质控品和阴性质控品；所述双重荧光定量PCR反应液包括上游引物、下游引物、探针、2X TaqMan Fast qPCR预混液和ddH2O组成；上游引物MiCV-F：AGGGCCTTTGGGCATCATTG；下游引物MiCV-R：CCCGCCTGCAAACTGAAGAA；上游引物AMDV-F：GGAAGAAGAAGGTTGGC；下游引物AMDV-R：AACTGTTGGTTGGTATGAG；探针MiCV-P：ACGGAGTTGCTGCAGATGCCACGGT；探针AMDV-P：TGCTGCTTCAGGCACACA；所述探针MiCV-P的5'端为荧光基团标记，所述探针MiCV-P的3'端为荧光淬灭基团标记；所述探针AMDV-P的5'端为荧光基团标记，所述探针MiCV-P的3'端为荧光淬灭基团标记。
本发明的用于检测水貂圆环病毒和水貂阿留申病毒的双重荧光定量PCR试剂盒，能够同时实现水貂圆环病毒和水貂阿留申病毒的双重荧光定量PCR检测，为这两种疾病的快速检测提供了技术支持，对于防控水貂圆环病和水貂阿留申病具有重要意义。
本发明的用于检测水貂圆环病毒和水貂阿留申病毒的双重荧光定量PCR试剂盒，经过试验证实其具有特异性强、敏感性高和可重复性好的特点。
附图说明
图1为实施例2中Cap基因PCR扩增结果。图中，M：DL 2000bp DNA Marker；1：Cap基因PCR扩增片段；2：阴性对照。
图2为实施例2中VP2基因PCR扩增结果。图中，M：DL 2000bp DNA Marker；1：VP2基因PCR扩增片段；2：阴性对照。
图3为实施例3中引物和探针浓度优化结果。其中，A：FAM通道MiCV Ct值最小为10.48，对应的引物终浓度为400nM，探针终浓度为200nM，Ct值最大为16.19，对应的引物终浓度为100nM，探针终浓度为500nM；B：ROX通道AMDV Ct值最小为11.31，对应的引物终浓度为400nM，探针终浓度为400nM，Ct值最大为15.65，对应的引物终浓度为100nM，探针终浓度为100nM。
图4为实施例3中退火温度优化结果。其中，A：FAM通道MiCV退火温度依次为57℃、58℃、56℃、55℃、59℃和60℃，对应Ct值为12.89、13.31、13.45、13.60、13.73和14.03；B：ROX通道AMDV退火温度依次为57℃、56℃、59℃、58℃、60℃和55℃，对应Ct值为13.11、13.27、13.48、13.78、13.93、14.04。
图5为实施例3中重组阳性质粒扩增曲线。其中，A：FAM通道MiCV；B：ROX通道AMDV；模板浓度依次为1.0×106拷贝/μL、1.0×105拷贝/μL、1.0×104拷贝/μL、1.0×103拷贝/μL、1.0×102拷贝/μL、1.0×101拷贝/μL和阴性对照。
图6为实施例3中荧光定量PCR标准曲线。
图7为实施例3中特异性试验结果。其中，A：FAM通道检测MiCV；B：ROX通道检测AMDV；模板依次为MiCV和AMDV混合质粒、PCV-2、MEV、CDV、PRV。
图8为实施例3中重组阳性质粒敏感性扩增曲线。其中，A：FAM通道检测MiCV；B：ROX通道检测AMDV；模板浓度依次为1.0×105拷贝/μL、1.0×104拷贝/μL、1.0×103拷贝/μL、1.0×102拷贝/μL、1.0×101拷贝/μL、1.0×100拷贝/μL和阴性对照。
图9为实施例3中重组阳性质粒普通PCR敏感性试验。其中，A：MiCV扩增电泳图；B：AMDV扩增电泳图；图中，M：DL 2000bp DNAMarker；1-6：1.0×105拷贝/μL～1.0×100拷贝/μL的混合重组阳性质粒；7：阴性对照。
图10为实施例3中样品DNA敏感性扩增曲线。其中，A：FAM通道检测MiCV；B：ROX通道检测AMDV；模板DNA浓度依次为2.38×102pg/μL、2.38×101pg/μL、2.38×100pg/μL、2.38×10-1pg/μL、2.38×10-2pg/μL、2.38×10-3pg/μL和阴性对照。
图11为实施例3中阳性样品DNA普通PCR敏感性试验。其中，A：MiCV扩增结果；B：AMDV扩增结果；图中，M：DL 2000bp DNA Marker；1-6：2.38×102pg/μL～2.38×10-3pg/μL的阳性样品DNA；7：阴性对照。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1双重荧光定量PCR引物的设计与合成
从GenBank中分别获取全部MiCV毒株的Cap基因和全部AMDV毒株的VP2基因序列，使用DNAMAN进行比对，用Premier 5软件针对MiCV、AMDV的保守区域分别设计1对荧光定量PCR引物、1对普通PCR引物和探针(见表1)，并送至生物公司进行合成。
表1引物信息
a位置：引物位置分别代表了MiCV、AMDV内核苷酸的起始位置和结束位置(分别参考GenBank中MK561562和KU513985的序列位置)。
探针MiCV-P的5'端标记的是荧光基团，如FAM(6-羧基荧光素)和ROX等，3'端标记的是荧光淬灭基团，如TAMR(6-羧基四甲基若丹明)和BHQ2等。
探针AMDV-P的5'端标记的是荧光基团，如FAM(6-羧基荧光素)和RO X等，3'端标记的是荧光淬灭基团，如TAMR(6-羧基四甲基若丹明)和BHQ2等。
实施例2重组阳性质粒标准品的制备
根据商品化病毒基因组提取试剂盒的说明书进行操作，从水貂圆环病毒阳性样品(MiCV HB3株，病毒全基因组GenBank登录号为MK561562)和水貂阿留申病毒阳性样品(AMDVG株，病毒全基因组GenBank登录号为KU513985)中分别提取病毒DNA，并以MiCV-Cap-F、MiCV-Cap-R和AMDV-VP2-F、AMDV-VP2-R分别作为引物进行PCR扩增。
PCR反应体系：Ex Taq DNA聚合酶12.5μL(5U/μL)，上下游引物各0.5μL(10μmol/L)，DNA模板1μL，ddH2O 10.5μL。
PCR反应条件：98℃10s，55℃30s，72℃1min，30个循环，同时设立阴性对照，经琼脂糖凝胶电泳检测分别获得大小约为684bp的目的条带(图1)和530bp的目的条带(图2)。
将目的条带回收后与pMD18-T载体通过基因扩增仪16℃连接过夜。反应体系如下(10μL)：PCR回收产物4μL，pMD18-T 1μL，SolutionⅠ5μL。然后将连接产物转化至DH5α感受态细胞中进行培养，提取质粒进行测序，测序正确获得重组阳性质粒即含有水貂圆环病毒Cap基因保守序列的pMD18-T载体质粒和含有水貂阿留申病毒VP2基因保守序列的pMD18-T载体质粒。通过酶标仪来测定重组阳性质粒的浓度，结果显示MiCV阳性质粒和AMDV阳性质粒的浓度分别为210.47ng/μL和247.067ng/μL，OD260/280值分别为1.80和1.81。使用样品拷贝数计算公式来换算阳性标准品的拷贝数。计算公式如下：样品拷贝数＝[浓度(ng/μL)×阿佛加德罗常数(NA)×10-9]/(660×重组质粒DNA碱基数)，经计算MiCV阳性质粒拷贝数为5.68×1010拷贝/μL，AMDV阳性质粒拷贝数为7.00×1010拷贝/μL。
实施例3基于Taqman探针的MiCV和AMDV双重荧光定量PCR检测方法的建立
1、引物和探针浓度、退火温度的优化
将引物(MiCV-F、MiCV-R和AMDV-F、AMDV-R)分别稀释为2μmol/L、4μmol/L、6μmol/L、8μmol/L和10μmol/L，将探针MiCV-P和探针AMDV-P分别稀释为2μmol/L、4μmol/L、6μmol/L、8μmol/L和10μmol/L，以重组阳性质粒作为模板，按棋盘法进行荧光定量PCR反应。PCR反应体系为20μL：重组阳性质粒2μL，不同浓度的上游引物(MiCV-F、AMDV-F)各1μL(反应体系中的终浓度分别为100nM、200nM、300nM、400nM和500nM)，不同浓度的下游引物(MiCV-R、AMDV-R)各1μL(反应体系中的终浓度分别为100nM、200nM、300nM、400nM和500nM)，不同浓度的探针(MiCV-P、AMDV-P)各1μL(反应体系中的终浓度分别为100nM、200nM、300nM、400nM和500nM)，2X TaqMan Fast qPCR预混液10μL，ddH2O 2μL。PCR反应程序：95℃3min；45个循环：95℃10s，55℃40s，对引物和探针的浓度进行优化。
结果显示，当MiCV引物浓度为400nM、探针MiCV-P浓度为200nM、AMDV引物浓度为400nM、探针AMDV-P浓度为400nM时，FAM通道Ct值最小为10.48，ROX通道Ct值最小为11.99。因此，确定MiCV引物的最优浓度为400nM，探针MiCV-P的最优浓度为200nM，AMDV引物的最优浓度为400nM，探针AMDV-P的最优浓度为400nM，如图3所示。
用上述反应体系，以重组阳性质粒作为模板进行荧光定量PCR反应，反应程序为95℃3min；45个循环：95℃10s，55℃～60℃40s，确定最佳退火温度。结果显示，当退火温度分别为55℃、56℃、57℃、58℃、59℃和60℃时，其对应的FAM通道的CT值分别为13.60、13.45、12.89、13.31、13.73、14.03，ROX通道的CT值分别为14.04、13.27、13.11、13.78、13.48、13.93。因此，确定最佳退火温度为57℃，如图4所示。
2、标准曲线建立
将重组阳性质粒进行10倍倍比稀释，设置6个稀释梯度(1.0×101拷贝/μL～1.0×106拷贝/μL)，将其作为模板，每个稀释度设3次重复，按照优化后的反应体系和条件进行荧光定量PCR扩增，生成循环阈值(Ct值)，以Ct值为纵坐标，以模板浓度的对数值为横坐标构建标准曲线。结果如图5、图6所示，MiCV标准方程为y＝-3.44x+40.94，其斜率为-3.44，截距为40.94，相关系数为0.9984，扩增效率为0.95；AMDV标准方程为y＝-3.58x+41.65，其斜率为-3.58，截距为41.65，相关系数为0.9974，扩增效率为0.90，由此说明，该双重实时荧光定量PCR检测方法在稀释范围内有很好的线性关系。
3、双重荧光定量PCR特异性试验
以水貂圆环病毒(MiCV)和水貂阿留申病毒(AMDV)混合质粒、猪圆环病毒2型(PCV-2)、水貂肠炎病毒(MEV)、犬瘟热病毒(CDV)、猪伪狂犬病毒(PRV)为模板，每个模板设置三个重复，进行荧光定量PCR反应。结果表明，MiCV和AMDV混合质粒分别在FAM和ROX通道出现扩增曲线，而PCV-2、MEV、CDV、PRV和ddH2O均未出现任何扩增曲线，如图7所示，结果表明该双重实时荧光定量PCR检测方法特异性良好。
4、双重荧光定量PCR敏感性试验
将水貂圆环病毒(MiCV)和水貂阿留申病毒(AMDV)混合质粒进行10倍倍比稀释(从1.0×100拷贝/μL～1.0×105拷贝/μL)，以其为模板，进行荧光定量PCR反应和普通PCR反应，比较其敏感性。结果显示，荧光定量PCR检测到的MiCV和AMDV最小拷贝数皆为101拷贝/μL如图8所示，而普通PCR检测到的MiCV和AMDV最小拷贝数为103拷贝/μL，如图9所示，结果表明该双重实时荧光定量PCR检测方法敏感性良好。
将MiCV和AMDV检测均为阳性的临床样品提取DNA，并进行10倍倍比稀释(从2.38×102pg/μL～2.38×10-3pg/μL)，以其为模板，进行荧光定量PCR反应和普通PCR反应，比较其敏感性。结果显示，荧光定量PCR检测到的基因最小拷贝数皆为2.38×10-2pg/μL，如图10所示，而普通PCR检测到的基因最小拷贝数皆为2.38×101pg/μL，如图11所示，结果表明该双重实时荧光定量PCR检测方法敏感性良好。
5、双重荧光定量PCR重复性试验
分别使用浓度为1.0×102拷贝/μL、1.0×104拷贝/μL和1.0×106拷贝/μL的重组阳性质粒为模板，在相同条件下进行3次实验作为批间重复性检测，同时进行每个浓度一式三份的批内重复性检验。通过将每个测试样品的标准偏差(SD)除以平均值，计算出批间变异系数和批内变异系数(CV)，对其进行重复性评价。结果表明，批内CV的范围为0.34％～0.71％，批间CV的范围为0.96％～1.23％，均小于1.5％(见表2)，结果表明该双重实时荧光定量PCR检测方法重复性良好。
表2批内与批间重复性试验
6、结果判定
判读结果时，通过对扩增曲线进行分析，当FAM通道Ct值≤35并且扩增曲线呈S型时，判定为MiCV阳性；当无Ct值时，判定为MiCV阴性；当Ct值＞35时，检测灰区，重新检测2次，仍大于35时判定为MiCV阴性。
当ROX通道Ct值≤35并且扩增曲线呈S型时，判定为AMDV阳性；无Ct值时，判定为AMDV阴性；Ct值＞35时，检测灰区，重新检测2次，仍大于35时判定为AMDV阴性。
实施例4用于检测水貂圆环病毒和水貂阿留申病毒的双重荧光定量PCR试剂盒的组装及使用方法
一、试剂盒的组成如下：
1、双重荧光定量PCR反应液：1.0ml/管。每个反应体系均包括MiCV上游引物(MiCV-F)0.8μL(10μmol/L)、AMDV上游引物(AMDV-F)0.8μL(10μmol/L)，MiCV下游引物(MiCV-R)0.8μL(10μmol/L)、AMDV下游引物(AMDV-R)0.8μL(10μmol/L)，探针(MiCV-P)0.4μL(10μmol/L)，探针(AMDV-P)0.8μL(10μmol/L)，2X TaqMan Fast qPCR预混液10μL，ddH2O 3.6μL，共18μL。
| 引物名称 | 引物序列(5'to3') |
| 上游引物MiCV-F | AGGGCCTTTGGGCATCATTG |
| 下游引物MiCV-R | CCCGCCTGCAAACTGAAGAA |
| 上游引物AMDV-F | GGAAGAAGAAGGTTGGC |
| 下游引物AMDV-R | AACTGTTGGTTGGTATGAG |
| 探针MiCV-P | 荧光基团-ACGGAGTTGCTGCAGATGCCACGGT-荧光淬灭基团 |
| 探针AMDV-P | 荧光基团-TGCTGCTTCAGGCACACA-荧光淬灭基团 |
2、阳性质控品：含有水貂圆环病毒Cap基因保守序列的pMD18-T载体质粒(浓度为1×106个拷贝/μL)和含有水貂阿留申病毒VP2基因保守序列的pMD18-T载体质粒(浓度为1×106个拷贝/μL)混合品，100μL/管。
3、阴性质控品：DEPC水，200μL/管。
二、双重荧光定量PCR试剂盒的使用方法如下：
1、病毒DNA的提取
使用商品化的病毒核酸提取试剂盒提取待检样品中的病毒DNA，按试剂盒说明书方法进行操作。
2、双重荧光定量PCR扩增
取出双重荧光定量PCR反应液，室温融化并颠倒混匀，分别向各PCR反应管中加入18μLPCR反应液，再分别向设定的PCR反应管中加入提取的待检样本DNA、阴性质控品和稀释好的阳性质控品各2μL，盖紧管盖，置于荧光PCR仪上，设定反应程序如下：95℃3min；45个循环：95℃10s，57℃40s。
实施例5临床样品检测
用组装的双重荧光定量PCR试剂盒和常规PCR方法对临床采集的116份组织样品进行MiCV和AMDV的检测。结果显示，双重荧光定量PCR试剂盒检测出44份样品呈MiCV阳性，检出率为37.9％；79份样品呈AMDV阳性，检出率为68.1％。而常规PCR方法检测出35份样品呈MiCV阳性，检出率为30.2％；67份样品呈AMDV阳性，检出率为57.8％。
本发明公开了一种用于检测水貂圆环病毒和水貂阿留申病毒的双重荧光定量PCR试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
序列表
<110> 吉林农业大学
<120> 用于检测水貂圆环病毒和水貂阿留申病毒的双重荧光定量PcR试剂盒
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工(primer)
<400> 1
agggcctttg ggcatcattg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工(primer)
<400> 2
cccgcctgca aactgaagaa 20
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工(primer)
<400> 3
ggaagaagaa ggttggc 17
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工(primer)
<400> 4
aactgttggt tggtatgag 19
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工(primer)
<400> 5
acggagttgc tgcagatgcc acggt 25
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工(primer)
<400> 6
tgctgcttca ggcacaca 18
Claims (7)
1.用于检测水貂圆环病毒和水貂阿留申病毒的双重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，该试剂盒的反应总体系包括：双重荧光定量PCR反应液、阳性质控品和阴性质控品；所述双重荧光定量PCR反应液包括上游引物MiCV-F、下游引物MiCV-R、上游引物AMDV-F、下游引物AMDV-R、探针MiCV-P、探针AMDV-P、2X TaqMan Fast qPCR预混液和ddH2O；
上游引物MiCV-F：AGGGCCTTTGGGCATCATTG；
下游引物MiCV-R：CCCGCCTGCAAACTGAAGAA；
上游引物AMDV-F：GGAAGAAGAAGGTTGGC；
下游引物AMDV-R：AACTGTTGGTTGGTATGAG；
探针MiCV-P：ACGGAGTTGCTGCAGATGCCACGGT；
探针AMDV-P：TGCTGCTTCAGGCACACA；
所述探针MiCV-P的5'端为荧光基团FAM标记，所述探针MiCV-P的3'端为荧光淬灭基团TAMR标记；
所述探针AMDV-P的5'端为荧光基团ROX标记，所述探针AMDV-P的3'端为荧光淬灭基团BHQ2标记；
该双重荧光定量PCR试剂盒的使用方法如下：
(1)病毒DNA的提取
使用商品化的病毒核酸提取试剂盒提取待检样品中的病毒DNA，按试剂盒说明书方法进行操作；
(2)双重荧光定量PCR扩增
取出双重荧光定量PCR反应液，室温融化并颠倒混匀，分别向各PCR反应管中加入18μLPCR反应液，再分别向设定的PCR反应管中加入提取的待检样本DNA、阴性质控品和稀释好的阳性质控品各2μL，盖紧管盖，置于荧光PCR仪上，设定反应程序如下：95℃3min；45个循环：95℃10s，57℃40s。
2.根据权利要求1所述的用于检测水貂圆环病毒和水貂阿留申病毒的双重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，该试剂盒的反应总体系为18μL，其中，上游引物MiCV-F为0.8μL，上游引物AMDV-F为0.8μL，下游引物MiCV-R为0.8μL，下游引物AMDV-R为0.8μL，探针MiCV-P为0.4μL，探针AMDV-P为0.8μL，2X TaqMan Fast qPCR预混液为10μL，ddH2O为3.6μL。
3.根据权利要求2所述的用于检测水貂圆环病毒和水貂阿留申病毒的双重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，该试剂盒的反应总体系中，上游引物MiCV-F浓度为10μmol/L，上游引物AMDV-F浓度为10μmol/L，下游引物MiCV-R浓度为10μmol/L，下游引物AMDV-R浓度为10μmol/L，探针MiCV-P浓度为10μmol/L，探针AMDV-P浓度为10μmol/L。
4.根据权利要求1所述的用于检测水貂圆环病毒和水貂阿留申病毒的双重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品为含有水貂圆环病毒Cap基因保守序列的pMD18-T载体质粒与含有水貂阿留申病毒VP2基因保守序列的pMD18-T载体质粒的混合品。
5.根据权利要求4所述的用于检测水貂圆环病毒和水貂阿留申病毒的双重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述含有水貂圆环病毒Cap基因保守序列的pMD18-T载体质粒的浓度为1×106个拷贝/μL。
6.根据权利要求4所述的用于检测水貂圆环病毒和水貂阿留申病毒的双重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述含有水貂阿留申病毒VP2基因保守序列的pMD18-T载体质粒的浓度为1×106个拷贝/μL。
7.根据权利要求1所述的用于检测水貂圆环病毒和水貂阿留申病毒的双重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述阴性质控品为DEPC水。
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| CN112391501A (zh) * | 2020-12-14 | 2021-02-23 | 中国农业科学院特产研究所 | 鉴别水貂犬瘟热病毒、水貂细小病毒、水貂阿留申病毒及伪狂犬病毒的四重pcr引物组 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| "Application of Real-Time Quantitative PCR to Detect Mink Cirovirus in Naturally and Experimentally Infected Minks";Xingyang Cui等;《Frontiers in Microbiology》;第9卷(第937期);1-8 * |
| "检测动物产品中水貂阿留申病毒和犬细小病毒复合PCR方法的建立和应用";杜雄伟等;《中国动物免疫》;第29卷(第8期);43-45 * |
| 易继财.《基因工程原理与实验》.中国农业大学出版社,2020,77-78. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114250322A (zh) | 2022-03-29 |
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