CN104531903A - 一种快速检测水貂阿留申病病毒的双重pcr方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种快速检测水貂阿留申病病毒的双重PCR方法，是分别合成AMDV非结构蛋白NS1基因片段的特异性引物SEQ.ID.NO 1和SEQ.ID.NO 2，AMDV结构蛋白VP2基因片段的特异性引物SEQ.ID.NO 3和SEQ.ID.NO 4，以上述两对引物为双重引物，以AMDV的DNA为模板，在同一反应体系中进行PCR反应，可完成对AMDV的快速检测。本发明根据PCR技术原理，根据AMDV的特点，建立了检测AMDV的双重PCR检测方法，其简单、快速、特异性好、灵敏度高，可以用于AMDV的快速检测。

Description

一种快速检测水貂阿留申病病毒的双重PCR方法
(一)技术领域
本发明所涉及的是一种用于快速检测水貂阿留申病病毒的双重PCR方法，属于病毒分子生物学领域。
(二)背景技术
水貂阿留申病(Aleutian mink disease,AMD)是由水貂阿留申病病毒(Aleutian mink disease parvovirus,AMDV)引起的水貂的一种慢性消耗性、超敏感性和自身免疫性疾病，以终生毒血症、全身淋巴细胞增殖、血清γ-球蛋白增多、肾小球肾炎、动脉血管炎和肝炎以及持续性病毒血症为特征的一种慢性病毒病。本病在世界各养貂国家均有发生，所有品系的水貂均能感染，具有阿留申基因型的水貂死亡率可达30％。本病还能使母貂空怀率和仔貂死亡率显著升高，公貂的交配能力下降，还能影响发育而使毛皮品质低下，同时造成动物机体抵抗力下降，易于继发或混合感染其他疾病，造成经济损失，是世界公认的养貂的重大疫病之一。目前本病尚无适用的疫苗可作特异性预防，也无良好的治疗方法，主要的防控措施是检疫淘汰。水貂慢性传染性疾病,主要侵害水貂的免疫系统,以浆细胞弥漫性增生和持续性病毒血症为特征。近年来，AMD在有水貂饲养的国家普遍存在,AMD导致水貂的繁殖力和毛皮质量严重下降,对养貂业造成不可弥补的经济损失。
目前在实际生产中，主要采用碘凝集试验(IAT)、对流免疫电泳法(CIEP)等方法对阿留申病毒鉴定，费事费力而且会起因其他干扰因素出现假阳性，对于多重感染的鉴定难以进行。双重PCR方法在检测多种病原微生物感染时具有省时省力、简单快速、敏感高、特异强等优点，已在多种病毒的鉴定与检测中得到了广泛应用。但PCR方法鉴定的基础是依据病原的基因型来进行的，目前的研究表明，AMDV基因组有两个大的开放阅读框架LORF和RORF，负责编码病毒的相关蛋白，其中RORF编码结构蛋白VP1和VP2，LORF主要编码非结构蛋白NS1和NS2。VP1蛋白在协助病毒产生感染性方面起着重要作用，VP2蛋白是该病毒的主要免疫原性抗原,能体外中和病毒，NS1和NS2对病毒在宿主细胞中的复制起重要的调节作用。因此可以通过结构蛋白和非结构蛋白设计两对引物对AMDV进行检测。目前，在我国水貂群中AMD普遍存在，应用双重PCR方法检测AMDV的方法还没有建立，所建立的检测水貂阿留申病病毒的双重PCR方法具有省时省力、特异性强、敏感性高的高通量检测方法，为该病的检疫提供一种新的检测方法。
(三)发明内容
本发明提供了一种快速检测水貂阿留申病毒的双重PCR方法。本发明设计并筛选了新的特异性引物，优化了反应过程中的各种参数，建立了检测AMDV的双重PCR方法，特异性更强、敏感性更高，可以快速准确地进行AMDV的检测。
一种快速检测AMDV的双重PCR方法，包括以下步骤：
A、通过对GenBank上已发表的AMDV的基因序列进行比对，选择在AMDV的非结构蛋白NS1基因的保守区与结构蛋白VP2基因的保守区，分别设计一对针对NS1基因片段的特异性引物SEQ.ID.NO 1/SEQ.ID.NO 2和一对针对VP2基因片段的特异性引物SEQ.ID.NO 3/SEQ.ID.NO 4。
SEQ.ID.NO 1：5’-AACACCGCCACTGAGGAC-3’；
SEQ.ID.NO 2：5’-CGTTACCAGCAGCAAAGT-3’；
SEQ.ID.NO 3：5’-ACGCATCTACCAAGCAAT-3’；
SEQ.ID.NO 4：5’-AGGAGGTAGCCCTAAGCA-3’。
所有引物以无菌ddH2O(Rnase free)配成20pmol/μl的浓度备用。
B、以AMDV DNA为模板进行PCR反应。反应体系为：15.3μl ddH2O(Rnase free)，2.5μl Buffer，2μldNTPs(10.0mM)，SEQ.ID.NO 1和SEQ.ID.NO 2各1.0μl，SEQ.ID.NO 3和SEQ.ID.NO 4各1.0μl，1μl DNA模板，0.2μl Taq酶。PCR反应条件为：95℃ 5min；95℃ 40s，50℃ 40s，72℃ 40s，32个循环；72℃ 10min。
C、对步骤B得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测：
如果同时扩增出了568bp和412bp的产物，则该样品为阳性，样品中含有AMDV；如果未扩增出568bp和412bp的产物，则该样品不含有AMDV。
本发明的双重PCR方法最低可检测到102个拷贝AMDV的病毒DNA，表明本方法具有很高的灵敏性。
用建立的双重PCR方法对山东、河北、东北等地24个貂场送检的52只AMDV分离呈阳性的水貂器官组织进行检测，结果发现所有样品的检测结果与病毒分离培养检测结果符合率为100％，说明本发明建立的双重PCR方法适合于AMDV的快速检测。
(四)附图说明
图1单重PCR的特异性检测结果
M，DNA Marker DL2000；用SEQ.ID.NO 1/SEQ.ID.NO 2分别扩增，1.AMDV，2.貂犬瘟热病毒，3.貂细小病毒，4.健康水貂脾脏组织；用SEQ.ID.NO 3/SEQ.ID.NO 4分别扩增，5.AMDV，6.貂犬瘟热病毒，7.貂细小病毒，8.健康水貂脾脏组织。
说明本专利所设计引物SEQ.ID.NO 1/SEQ.ID.NO 2只能扩增出AMDV的NS1基因片段，而对貂犬瘟热病毒、貂细小病毒、健康水貂脾脏组织扩增阴性；SEQ.ID.NO 3/SEQ.ID.NO 4只能扩增出AMDV的VP2基因片段，而对貂犬瘟热病毒、貂细小病毒、健康水貂脾脏组织扩增阴性。结果表明SEQ.ID.NO 1/SEQ.ID.NO 2与SEQ.ID.NO 3/SEQ.ID.NO 4具有很强的特异性。
图2双重PCR的特异性检测结果
M，DNA Marker DL2000；1.用引物SEQ.ID.NO 1/SEQ.ID.NO 2与引物SEQ.ID.NO 3/SEQ.ID.NO 4双重PCR扩增AMDV；2,用引物SEQ.ID.NO 1/SEQ.ID.NO 2扩增AMDV；3,用引物SEQ.ID.NO 3/SEQ.ID.NO 4扩增AMDV；用引物SEQ.ID.NO 1/SEQ.ID.NO 2与引物SEQ.ID.NO 3/SEQ.ID.NO 4双重PCR分别扩增，4.貂犬瘟热病毒，5.貂细小病毒，6.绿脓杆菌感染的水貂肺脏，7.双球菌，8.克雷伯氏菌，9.巴氏杆菌，10.大肠杆菌，11.健康水貂脾脏组织。
用SEQ.ID.NO 1/SEQ.ID.NO 2与SEQ.ID.NO 3/SEQ.ID.NO 4两对引物建立的检测AMDV的双重PCR方法只能扩增出AMDV的NS1基因片段与VP2基因片段，而对貂犬瘟热病毒、貂细小病毒、绿脓杆菌感染的水貂肺脏、双球菌、克雷伯氏菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、健康水貂脾脏组织等扩增阴性。结果表明用SEQ.ID.NO 1/SEQ.ID.NO 2与SEQ.ID.NO 3/SEQ.ID.NO 4两对引物建立的检测AMDV的双重PCR方法具有很强的特异性。
图3双重PCR针对AMDV感染水貂脾脏总DNA的敏感性检测结果
M，DNA Marker DL2000；所提组织病料模板DNA的浓度对应组织病料的量分别是，1.1mg/μL，2.100ng/μL，3.10ng/μL，4.1ng/μL，5.100pg/μL，6.10pg/μL，7.1pg/μL。结果表明，所建立双重PCR方法与单重PCR的敏感度一致，最低可检测到10pg/μL的组织总DNA。
图4双重PCR针对AMDV的DNA模板的敏感性检测结果
M，DNA Marker DL2000；M,DL2000；1-11,分别为1010-100拷贝的AMDV的DNA模板。结果表明，所建立检测AMDV的双重PCR方法最低可检测到102个拷贝的病毒DNA。
(五)具体实施方式
1引物设计
通过对参考GenBank上已发表的AMDV序列进行比对，选择在NS1基因的保守区和VP2基因的保守区分别设计一对针对NS1基因片段的特异性引物SEQ.ID.NO 1/SEQ.ID.NO 2和一对针对VP2基因片段的特异性引物与SEQ.ID.NO 3/SEQ.ID.NO 4，利用常规方法对病毒样品进行扩增。
SEQ.ID.NO 1：5’-AACACCGCCACTGAGGAC-3’，
SEQ.ID.NO 2：5’-CGTTACCAGCAGCAAAGT-3’，
SEQ.ID.NO 3：5’-ACGCATCTACCAAGCAAT-3’，
SEQ.ID.NO 4：5’-AGGAGGTAGCCCTAAGCA-3’。
NS1基因片段引物扩增片段大小为568bp，VP2基因片段引物扩增片段大小为412bp。所有引物以无菌ddH2O(Rnase free)配成20pmol/μl的浓度备用。
2单一PCR
(1)单重PCR：反应总体系为25μl，包括17.3μl ddH2O(Rnase free)，2.5μl 10×PCR Buffer，2.0μl dNTPs(10.0mM)，NS 1或VP 2上下游引物各1.0μl，1.0μl DNA模板，0.2μl Taq酶。PCR反应程序均为：95℃5min；95℃ 40s，50℃ 40s，72℃ 40s，32个循环；72℃ 10min。
(2)分别用引物SEQ.ID.NO 1/SEQ.ID.NO 2与引物SEQ.ID.NO 3/SEQ.ID.NO 4对AMDV、貂犬瘟热病毒、貂细小病毒、健康水貂脾脏组织，进行上述单重PCR扩增，以检测引物的特异性。将PCR产物与DNA电泳上样缓冲液混合，在1％浓度的琼脂糖凝胶中，以7～10V/cm电压在1×TAE中进行电泳，在紫外灯下观察结果并用凝胶成像仪观察，照相。结果表明，引物SEQ.ID.NO 1/SEQ.ID.NO 2只能扩增出AMDV的NS1基因片段，PCR产物大小为568bp，而对其他模板扩增阴性；引物SEQ.ID.NO 3/SEQ.ID.NO4只能扩增出AMDV的VP2基因片段，PCR产物大小为412bp，而对其他模板扩增阴性(见图1)。结果表明，引物SEQ.ID.NO 1/SEQ.ID.NO 2与引物SEQ.ID.NO 3/SEQ.ID.NO 4具有很强的特异性，只能分别针对AMDV进行特异性扩增。
4双重PCR条件的优化
在单重PCR的基础上，对引物、dNTPs、Buffer的浓度，及退火温度等参数进行优化，得到双重PCR最佳反应体系和反应程序。
双重PCR：以病毒DNA为模板，反应总体积为25μl，最佳反应体系为：15.3μl ddH2O(Rnase free)，2.5μl 10×PCR Buffer，2.0μl dNTP Mixture(10.0mM)，NS1引物各1.0μl，VP 2引物各1.0μl，1.0μl DNA模板，0.2μl Taq酶。
PCR反应程序为：95℃ 5min；95℃ 40s，50℃.40s，72℃ 40s，32个循环；72℃ 10min。
5特异性试验
AMDV、貂犬瘟热、貂病毒性肠炎，伪狂犬病病毒、双球菌、克雷伯氏菌、巴氏杆菌、大肠杆菌的菌株为模板分别用上述优化的条件进行双重PCR反应。对双重PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果可知，建立的双重PCR方法只能特异性的针对AMDV进行扩增，对其他水貂常发病的病原扩增为阴性，可作为特异性鉴定AMDV的快速方法(见图2)。
6敏感性试验
提取感染水貂脾脏组织总DNA，所提DNA的浓度对应病料组织的量是1mg/μL，将所提DNA进行10×梯度稀释，分别用来作为模板，进行单重和双重PCR对AMDV的检测灵敏度测定。结果可知，所建立双重PCR方法与单一PCR的敏感度一致，最低可检测到10pg/μL的组织总DNA(见图3)。
用紫外分光光度计分别对本实验室构建的含有AMDV的NS1基因片段与VP2基因片段的质粒进行260nm/280nmOD值的测定，计算出纯度和含量，并将含有NS1基因片段质粒与含有VP2基因片段质粒的浓度均调整1010拷贝/μL，然后分别对两种质粒进行10×梯度稀释释(即1010-100个拷贝)，取每个稀释度分别进行双重PCR反应。结果表明，所建立检测AMDV的双重PCR方法最低可检测到102个拷贝的病毒DNA(见图4)。
7临床样本检测
用建立的双重PCR方法对山东、河北、东北等地24个水貂养殖场场送检的52只分离到AMDV的水貂组织进行检测，结果发现所有样品的检测结果与病毒分离培养检测结果符合率为100％，说明本发明建立的双重PCR方法适合于AMDV的快速检测。

Claims (1)

1.一种用于快速检测水貂阿留申病病毒AMDV的特异性引物，其特征在于是通过对GenBank上已发表的AMDV的序列进行比对，选择在AMDV的非结构蛋白NS1基因的保守区与结构蛋白VP2基因的保守区，分别设计一对针对NS1基因片段的特异性引物SEQ.ID.NO 1/SEQ.ID.NO 2和一对针对VP2基因片段的特异性引物SEQ.ID.NO 3/SEQ.ID.NO 4；
SEQ.ID.NO 1：5’-AACACCGCCACTGAGGAC-3’，
SEQ.ID.NO 2：5’-CGTTACCAGCAGCAAAGT-3’，
SEQ.ID.NO 3：5’-ACGCATCTACCAAGCAAT-3’，
SEQ.ID.NO 4：5’-AGGAGGTAGCCCTAAGCA-3’；
所有引物以无菌ddH2O配成20pmol/μl的浓度备用；
上述引物的使用方法如下：
A、常规方法提取待测水貂组织DNA作为模板；反应体系为：15.3μl ddH2O，2.5μl Buffer，2μl dNTPs(10.0mM)，SEQ.ID.NO 1和SEQ.ID.NO 2各1.0μl，SEQ.ID.NO 3和SEQ.ID.NO 4各1.0μl，1μl DNA模板，0.2μl Taq酶；PCR反应条件为：95℃5min；95℃40s，50℃40s，72℃40s，32个循环；72℃10min；
B、对步骤A得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；
如果同时扩增出了568bp和412bp的产物，则该样品为阳性，样品中含有AMDV；如果未扩增出568bp和412bp的产物，则该样品不含有AMDV。
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