CN104726616A - 一种快速检测水貂病毒性肠炎病毒的双重pcr方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种快速检测水貂病毒性肠炎病毒的双重PCR方法，包括：分别合成MEV非结构蛋白NS1基因片段的特异性引物SEQ.ID.NO 1和SEQ.ID.NO 2，MEV结构蛋白VP2基因片段的特异性引物SEQ.ID.NO 3和SEQ.ID.NO 4，以上述两对引物为双重引物，以MEV的DNA为模板，在同一反应体系中进行PCR反应，可完成对MEV的快速检测。本发明根据PCR技术原理，根据MEV的特点，建立了检测MEV的双重PCR检测方法，其简单、快速、特异性好、灵敏度高，可以用于MEV的快速检测。

Description

一种快速检测水貂病毒性肠炎病毒的双重PCR方法
(一)技术领域
本发明涉及一种快速检测水貂病毒性肠炎病毒的双重PCR方法，属于病毒分子生物学领域。
(二)背景技术
水貂病毒性肠炎病毒(Mink enteritis virus，MEV)可引起水貂病毒性肠炎(Mink viral enteritis)，水貂病毒性肠炎是一种急性、高度接触性传染疾病，该病以腹泻为主要特征，具有较高的发病率和死亡率，是世界公认的危害水貂养殖业的重要病毒性传染病之一，严重妨碍了养貂业的健康发展。因此，及时快速检测水貂病毒性肠炎病毒，在生产实践中具有重要的作用，对水貂病毒性肠炎的预防具有重大意义。
目前在实际生产中，检测水貂病毒性肠炎病毒常用的方法有间接免疫荧光技术、琼扩试验、血凝/血凝抑制试验以及ELISA等，这些方法存在或敏感性不高、或特异性不强等缺点。随着分子生物学和生物试剂的不断发展和改善，PCR检测方法已经成为病毒检测的重要技术。因此可以针对MEV的结构蛋白(VP2)和非结构蛋白(NS1)设计两对引物，建立PCR方法对MEV进行检测。目前，在我国水貂群中MEV普遍存在，应用双重PCR方法检测MEV的方法还没有建立，所建立的检测MEV的双重PCR方法具有省时省力、特异性强、敏感性高的高通量检测方法，为MEV的检疫提供一种新的检测方法。
(三)发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种快速检测水貂病毒性肠炎病毒的双重PCR方法，是一种用于非疾病诊断目的的快速检测方法，主要涉及一组用于快速检测水貂病毒性肠炎病毒的特异性引物。本发明设计并筛选了新的特异性引物，优化了反应过程中的各种参数，建立了检测MEV的双重PCR方法，特异性更强、敏感性更高，可以快速准确地进行MEV的检测。
一组用于快速检测水貂病毒性肠炎病毒的特异性引物，是通过对GenBank上已发表的MEV的基因序列进行比对，选择在MEV的非结构蛋白NS1基因的保守区与结构蛋白VP2基因的保守区，分别设计一对针对NS1基因片段的特异性引物SEQ.ID.NO 1/SEQ.ID.NO 2和一对针对VP2基因片段的特异性引物SEQ.ID.NO 3/SEQ.ID.NO 4。
SEQ.ID.NO 1：5’-GGTTAGCTAAACATGGTTATG-3’；
SEQ.ID.NO 2：5’-GAGTCAGAGGAGTTAGAACG-3’；
SEQ.ID.NO 3：5’-CTTTGCCTCAATCTGAAGGAGT-3’；
SEQ.ID.NO 4：5’-GAATTGGATTCCAAGTATGAGAT-3’。
所有引物以无菌ddH2O(Rnase free)配成20pmol/μl的浓度备用。
上述引物的使用方法如下：
A、以MEV DNA为模板进行PCR反应。反应体系为：17.3μl ddH2O(Rnase free)，2.5μl Buffer，2μldNTPs(10.0mM)，SEQ.ID.NO 1和SEQ.ID.NO 2各1.0μl，SEQ.ID.NO 3和SEQ.ID.NO 4各1.0μl，1μl DNA模板，0.2μl Taq酶。PCR反应条件为：95℃ 5min；94℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 1min，32个循环；72℃ 10min。
B、对步骤A得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测：
如果同时扩增出了191bp和824bp的产物，则该样品为阳性，样品中含有MEV；如果只扩增出扩增出191bp或824bp的产物，则该样品可疑；如果未扩增出191bp和824bp的产物，则该样品不含有MEV。
本发明的双重PCR方法最低可检测到102个拷贝MEV的病毒DNA，表明本方法具有很高的灵敏性。
用建立的双重PCR方法对威海、诸城、菏泽、临沂、大连等地30个水貂养殖场场送检的72只MEV分离呈阳性的水貂器官组织进行检测，结果发现所有样品的检测结果与病毒分离培养检测结果符合率为100％，说明本发明建立的双重PCR方法适合于MEV的快速检测。
(四)附图说明
图1单重PCR的特异性检测结果
M，DNA Marker DL2000；用SEQ.ID.NO 1/SEQ.ID.NO 2分别扩增：1.MEV，2.貂犬瘟热病毒，3.水貂阿留申病病毒，4.健康水貂脾脏组织；用SEQ.ID.NO 3/SEQ.ID.NO 4分别扩增，5.MEV，6.貂犬瘟热病毒，7.水貂阿留申病病毒，8.健康水貂脾脏组织。
图1说明本专利所设计引物SEQ.ID.NO 1/SEQ.ID.NO 2只能扩增出MEV的NS1基因片段，而对貂犬瘟热病毒、水貂阿留申病病毒、健康水貂脾脏组织扩增阴性；SEQ.ID.NO 3/SEQ.ID.NO 4只能扩增出MEV的VP2基因片段，而对貂犬瘟热病毒、水貂阿留申病病毒、健康水貂脾脏组织扩增阴性。结果表明SEQ.ID.NO 1/SEQ.ID.NO 2与SEQ.ID.NO 3/SEQ.ID.NO 4具有很强的特异性。
图2双重PCR的特异性检测结果
M，DNA Marker DL2000；1.用引物SEQ.ID.NO 1/SEQ.ID.NO 2与引物SEQ.ID.NO 3/SEQ.ID.NO 4双重PCR扩增MEV；2,用引物SEQ.ID.NO 1/SEQ.ID.NO 2扩增MEV；3,用引物SEQ.ID.NO 3/SEQ.ID.NO4扩增MEV；用引物SEQ.ID.NO 1/SEQ.ID.NO 2与引物SEQ.ID.NO 3/SEQ.ID.NO 4双重PCR分别扩增，4.貂犬瘟热病毒，5.水貂阿留申病病毒，6.绿脓杆菌感染的水貂肺脏，7.双球菌，8.克雷伯氏菌，9.巴氏杆菌，10.大肠杆菌，11.健康水貂脾脏组织。
用SEQ.ID.NO 1/SEQ.ID.NO 2与SEQ.ID.NO 3/SEQ.ID.NO 4两对引物建立的检测MEV的双重PCR方法只能扩增出MEV的NS1基因片段与VP2基因片段，而对貂犬瘟热病毒、水貂阿留申病病毒、绿脓杆菌感染的水貂肺脏、双球菌、克雷伯氏菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、健康水貂脾脏组织等扩增阴性。结果表明用SEQ.ID.NO 1/SEQ.ID.NO 2与SEQ.ID.NO 3/SEQ.ID.NO 4两对引物建立的检测MEV的双重PCR方法具有很强的特异性。
图3双重PCR针对MEV感染水貂脾脏总DNA的敏感性检测结果
M，DNA Marker DL2000；所提组织病料模板DNA的浓度对应组织病料的量分别是，1.1mg/μL，2.100ng/μL，3.10ng/μL，4.1ng/μL，5.100pg/μL，6.10pg/μL，7.1pg/μL。结果表明，所建立双重PCR方法与单重PCR的敏感度一致，最低可检测到10pg/μL的组织总DNA。
图4双重PCR针对MEV的DNA模板的敏感性检测结果
M，DNA Marker DL2000；M,DL2000；1-11,分别为1010-100拷贝的MEV的DNA模板。结果表明，所建立检测MEV的双重PCR方法最低可检测到102个拷贝的病毒DNA。
(五)具体实施方式
1引物设计
通过对参考GenBank上已发表的MEV序列进行比对，选择在NS1基因的保守区和VP2基因的保守区分别设计一对针对NS1基因片段的特异性引物SEQ.ID.NO1/SEQ.ID.NO 2和一对针对VP2基因片段的特异性引物SEQ.ID.NO3/SEQ.ID.NO 4，利用下面所述2与3中的方法对病毒样品进行扩增。
SEQ.ID.NO 1：5’-GGTTAGCTAAACATGGTTATG-3’；
SEQ.ID.NO 2：5’-GAGTCAGAGGAGTTAGAACG-3’；
SEQ.ID.NO 3：5’-CTTTGCCTCAATCTGAAGGAGT-3’；
SEQ.ID.NO 4：5’-GAATTGGATTCCAAGTATGAGAT-3’。
NS1基因片段引物扩增片段大小为191bp，VP2基因片段引物扩增片段大小为824bp。所有引物以无菌ddH2O(Rnase free)配成20pmol/μl的浓度备用。
2单一PCR
(1)单重PCR扩增反应体系：反应总体系为25μl，包括17.3μl ddH2O(Rnase free)，2.5μl Buffer，2μl dNTPs(10.0mM)，SEQ.ID.NO 1和SEQ.ID.NO 2各1.0μl，SEQ.ID.NO 3和SEQ.ID.NO 4各1.0μl，1μlDNA模板，0.2μl Taq酶。PCR反应条件为：95℃ 5min；94℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 1min，32个循环；72℃ 10min。
(2)分别用引物SEQ.ID.NO 1/SEQ.ID.NO 2与引物SEQ.ID.NO 3/SEQ.ID.NO 4对MEV、貂犬瘟热病毒、水貂阿留申病病毒、健康水貂脾脏组织进行上述单重PCR扩增，以检测引物的特异性。分别将上述PCR产物与DNA电泳上样缓冲液混合，在1％浓度的琼脂糖凝胶中，以7～10V/cm电压在1×TAE中进行电泳，在紫外灯下观察结果并用凝胶成像仪观察，照相。结果表明，引物SEQ.ID.NO 1/SEQ.ID.NO 2只能扩增出MEV的NS1基因片段，PCR产物大小为191bp，而对其他模板扩增阴性；引物SEQ.ID.NO 3/SEQ.ID.NO 4只能扩增出MEV的VP2基因片段，PCR产物大小为824bp，而对其他病毒模板扩增阴性(见图1)。结果表明，引物SEQ.ID.NO 1/SEQ.ID.NO 2与引物SEQ.ID.NO 3/SEQ.ID.NO 4具有很强的特异性，只能分别针对MEV进行特异性扩增。
3双重PCR条件的优化
在单重PCR的基础上，对引物、dNTPs、Buffer的浓度，及退火温度等参数进行优化，得到双重PCR最佳反应体系和反应程序。
双重PCR：以病毒DNA为模板，反应总体积为25μl，最佳反应体系为：15.3μl ddH2O(Rnase free)，2.5μl Buffer，2.0μl dNTP Mixture(10.0mM)，SEQ.ID.NO 1和SEQ.ID.NO 2各1.0μl，SEQ.ID.NO 3和SEQ.ID.NO 4各1.0μl，1.0μl DNA模板，0.2μl Taq酶。
PCR反应程序为：95℃ 5min；94℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 1min，32个循环；72℃ 10min。
4特异性试验
以MEV、貂犬瘟热、水貂阿留申病病毒，绿脓杆菌感染的水貂肺脏、双球菌、克雷伯氏菌、巴氏杆菌、大肠杆菌的菌株为模板分别用上述3中优化的条件进行双重PCR反应。对双重PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果可知，建立的双重PCR方法只能特异性的针对MEV进行扩增，对其他水貂常发病的病原扩增为阴性，可作为特异性鉴定MEV的快速方法(见图2)。
5敏感性试验
提取感染水貂脾脏组织总DNA，所提DNA的浓度对应病料组织的量是1mg/μL，将所提DNA进行10×梯度稀释，分别用来作为模板，进行单重和双重PCR对MEV的检测灵敏度测定。结果可知，所建立双重PCR方法与单一PCR的敏感度一致，最低可检测到10pg/μL的组织总DNA(见图3)。
用紫外分光光度计分别对本实验室构建的含有MEV的NS1基因片段与VP2基因片段的质粒进行260nm/280nmOD值的测定，计算出纯度和含量，并将含有NS1基因片段质粒与含有VP2基因片段质粒的浓度均调整1010拷贝/μL，然后分别对两种质粒进行10×梯度稀释释(即1010-100个拷贝)，取每个稀释度分别进行双重PCR反应。结果表明，所建立检测MEV的双重PCR方法最低可检测到102个拷贝的病毒DNA(见图4)。
6临床样本检测
用建立的双重PCR方法对威海、诸城、菏泽、临沂、大连等地30个水貂养殖场场送检的72只分离到MEV的水貂组织进行检测，结果发现所有样品的检测结果与病毒分离培养检测结果符合率为100％，说明本发明建立的双重PCR方法适合于MEV的快速检测。

Claims (1)

1.一组用于快速检测水貂病毒性肠炎病毒的特异性引物，其特征在于选择在MEV的非结构蛋白NS1基因的保守区与结构蛋白VP2基因的保守区，分别设计一对针对NS1基因片段的特异性引物SEQ.ID.NO 1/SEQ.ID.NO 2和一对针对VP2基因片段的特异性引物SEQ.ID.NO 3/SEQ.ID.NO 4；
SEQ.ID.NO 1：5’-GGTTAGCTAAACATGGTTATG-3’；
SEQ.ID.NO 2：5’-GAGTCAGAGGAGTTAGAACG-3’；
SEQ.ID.NO 3：5’-CTTTGCCTCAATCTGAAGGAGT-3’；
SEQ.ID.NO 4：5’-GAATTGGATTCCAAGTATGAGAT-3’；
上述引物的使用方法如下：
A、以MEV DNA为模板进行PCR反应；反应体系为：17.3μl ddH2O(Rnase free)，2.5μl Buffer，2μldNTPs(10.0mM)，SEQ.ID.NO 1和SEQ.ID.NO 2各1.0μl，SEQ.ID.NO 3和SEQ.ID.NO 4各1.0μl，1μl DNA模板，0.2μl Taq酶；PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s，53℃30s，72℃1min，32个循环；72℃10min；
B、对步骤A得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测：
如果同时扩增出了191bp和824bp的产物，则该样品为阳性，样品中含有MEV。
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