CN113186312A

CN113186312A - 一种区分布鲁氏菌a19疫苗株与野毒株的分子标记

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Publication number: CN113186312A
Application number: CN202110486871.9A
Authority: CN
Inventors: 孙明军; 刘蒙达; 樊晓旭; 孙翔翔; 邵卫星; 田莉莉; 孙淑芳; 范伟兴
Original assignee: CHINA ANIMAL HEALTH AND EPIDEMIOLOGY CENTER
Current assignee: CHINA ANIMAL HEALTH AND EPIDEMIOLOGY CENTER
Priority date: 2021-05-03
Filing date: 2021-05-03
Publication date: 2021-07-30
Anticipated expiration: 2041-05-03
Also published as: CN113186312B

Abstract

本发明提供了一种可区分布鲁氏菌A19疫苗株与国内流行野毒株的分子标记，以及检测该标记的的荧光定量PCR引物、探针及检测方法。所提供的分子标记，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1。本发明还提供一种用于区分布鲁氏菌A19疫苗与国内流行野毒株的引物对，用于扩增在中国流行的布鲁氏菌野毒株的特异性核酸片段。本发明提供一种可区分布鲁氏菌A19疫苗和国内流行野毒株的引物、探针及检测方法，对我国布病防控具有重要的现实意义。

Description

一种区分布鲁氏菌A19疫苗株与野毒株的分子标记

技术领域

本发明属于病原体分子检测技术领域，具体涉及一种可区分布鲁氏菌 A19(或S19)疫苗与国内流行野毒株的分子标记，以及检测该分子标记的荧光定量PCR引物、探针及检测方法。

背景技术

布鲁氏菌病(以下简称布病)是一种由布鲁氏菌引起的重要的人兽共患传染病,是国际动物卫生组织(OIE)规定必须通报的动物疫病，该病对我国养殖业、食品安全与人类健康构成重大威胁，在实施免疫的同时，还需要执行检疫-扑杀措施，以剔除免疫失败而被布鲁氏菌野毒株感染的动物。因此，对免疫动物和自然感染动物的鉴别需求越来越迫切，由于价值高和饲养周期长的原因，牛用A19疫苗(国外称S19)和野毒株的鉴别需求更为迫切。

目前，布病免疫动物和自然感染动物的鉴别还存在一些瓶颈，主要表现在以下几个方面：1.没有成熟有效的血清学鉴别方法，尽管有个别的鉴别诊断试剂在使用(如天然半抗原NH，西班牙)，但该技术的使用要受到免疫窗口期和动物个体差异的限制，不能做到完全的鉴别区分；2.我国当前流行的布鲁氏菌野毒株的种型比较复杂，至少有4个种布鲁氏菌(羊种、牛种、猪种和犬种)在流行，用病原分离鉴定来区分疫苗与所有的野毒株存在较大的困，而且还需要生物安全三级实验室，耗时耗力，极大限制了该方法的应用； 3.虽然某些技术(如基于SNP的荧光定量PCR)可在分子水平上对疫苗和野毒株进行区分，但该方法技术要求高，特异性和重复性不足，限制了该技术的推广。

荧光定量PCR是目前最广泛使用的病原学诊断方法之一，具有较高的敏感性和特异性，与其他的分子检测方法(RAA、LAMP)相比，技术更成熟，稳定性更高，更易于推广。

发明内容

本发明提供了一种可区分布鲁氏菌A19(或S19)疫苗株与国内流行野毒株的分子标记，以及检测该标记的的荧光定量PCR引物、探针及检测方法。

本发明首先提供一种可区分布鲁氏菌A19(或S19)疫苗与国内流行野毒株的分子标记，所述的分子标记，其核苷酸序列如下：

GCATATGTAACAGCCGGGATTCAAACGTCAAATTCAATCCACTAGAACGCCTTTCGGAAGGT CAGATTAAGCCGAAACGGCCCCAGCCGCTCATGCTCGCCAGACTTCAATGGTAGAATACCGTGATA GAAAAGCCGCGACGGCCCGCCCCAGACAACCA(SEQ ID NO:1)；

本发明还提供一种用于区分布鲁氏菌A19(或S19)疫苗与国内流行野毒株的引物对，用于扩增在中国流行的布鲁氏菌野毒株的特异性核酸片段，所述的引物对用于扩增序列为SEQ ID NO：1；所述引物对包含有：

上游引物：5′-CGGGATTCAAACGTCAAA-3′(SEQ ID NO：2)；

下游引物：5′-GGCTTTTCTATCACGGTATTC-3′(SEQ ID NO：3)；

本发明还提供用于检测上述引物扩增产物的探针，序列如下：

5′-TCAATCCACTAGAACGCC-3′(SEQ ID NO：4)；

所述探针采用荧光报告基团和MGB(Minor Groove Binder)基团进行修饰，荧光报告基团修饰在探针序列5′端,MGB基团修饰在探针序列3′端。进一步，所述荧光报告基团为FAM、HEX、TET、JOE或VIC；优选地，所述荧光报告基团为FAM。

上述的引物和探针可用于制备布鲁氏菌A19(或S19)疫苗与中国野毒株的荧光定量PCR鉴别诊断试剂盒。

所述的试剂盒，还包含有用于检测布鲁氏菌A19(或S19)疫苗株的引物组和/或探针。

本发明提供一种可区分布鲁氏菌A19疫苗和国内流行菌株(野毒株)的引物、探针及检测方法，对我国布病防控具有重要的现实意义。

附图说明

图1：布鲁氏菌野毒株与A19疫苗株差异位点的序列比较图(Bc-1)；

图2：59株布鲁氏菌野毒株荧光定量PCR扩增结果图；

图3：Rev1、M5、S2和A19疫苗株荧光定量PCR扩增结果图；

图4：Bc-1位点荧光定量PCR扩增反应体系的灵敏度检测图(XJ18)；

图5：Bc-1位点荧光定量PCR标准曲线的绘制图(XJ18)；

图6：A19疫苗株与野毒株双重荧光PCR反应体系的灵敏性检测图；

图7：A19疫苗株和野毒株双重荧光PCR鉴别诊断结果图(烟台奶样)。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。如无特别说明，本发明所涉及的布鲁氏菌均为我国当前使用的疫苗株或流行的野毒株。

实施例1布鲁氏菌A19疫苗株与中国野毒株基因组差异片段的选择和引物、探针设计

对A19疫苗基因组序列和67个中国野毒株(羊种菌48株、牛种菌14株、猪种菌2株、犬种菌3株)的基因组序列进行同源性分析，筛选出在一个在所有中国流行菌株基因组中高度保守而在A19疫苗基因组中发生了突变的位点 Bc-1，该位点位于布鲁氏菌II号染色体，其所在的核苷酸片段的序列如下：

GCATATGTAACAGCCGGGATTCAAACGTCAAATTCAATCCACTAGAACGCCTTTCGGAAGGTCAGA TTAAGCCGAAACGGCCCCAGCCGCTCATGCTCGCCAGACTTCAATGGTAGAATACCGTGATAGAAAAGCCGCGACGGCCCGCCCCAGACAACCA。

相比于其他野生病毒株，A19疫苗株在前40个碱基中存在25个碱基突变的差异变化(图1)。

利用AlleleID 6软件设计针对上述序列的引物和探针，由于目标片段较短，优先设计合适的MGB引物和探针。经过软件分析，获得了一对针对上述序列的特异性引物和MGB探针，引物所扩增的序列为：

CGGGATTCAAACGTCAAATTCAATCCACTAGAACGCCTTTCGGAAGGTCAGATTAAGCCGA AACGGCCCCAGCCGCTCATGCTCGCCAGACTTCAATGGTAGAATACCGTGATAGAAAAGCC；

上游引物Bc-F:CGGGATTCAAACGTCAAA；

下游引物Bc-R：GGCTTTTCTATCACGGTATTC；

MGB探针Bc-P：TCAATCCACTAGAACGCC。

根据实时荧光PCR仪的性能，探针的荧光修饰基团可选择为FAM、 Texared、VIC或Cy3等，本探针优先选择FAM。

如图1所示，上述引物扩增序列在牛种、羊种、猪种和犬种布鲁氏菌中国野毒株的同源性在99.18％以上，仅有1个碱基突变，但该突变在设计引物和探针序列以外，不会影响所有种类野毒株的扩增。该序列与其他细菌的基因序列没有交叉。

实施例2用于扩增Bc-1位点的引物和探针的实验室验证

1.DNA样品的准备

布鲁氏菌中国流行菌株的基因组DNA均由本实验室(中国动物卫生与流行病学中心人兽共患病监测室)保存和提供。包括羊种流行菌株38株、牛种流行菌株15株、猪种布鲁氏菌2株、犬种布鲁氏菌4株，以及布鲁氏菌A19、Rev1、M5、S2疫苗株。DNA样品浓度在20-80μg之间。

2.引物和探针的合成和修饰。引物和探针由艾科瑞生物工程有限公司合成，探针5’端用FAM基团修饰，3’端用MGB修饰。引物和探针用无Rnase 和Dnase的双蒸水进行溶解，稀释成10μM的工作浓度。

3.反应体系的配制和反应条件。实时荧光定量PCR的反应体系为25μL，包括2×Premix预混反应液12.5μL、上下游引物各0.5μL、探针0.25μ L、DNA模板1μL、无Rnase和Dnase的双蒸水10.25μL。上述反应体系充分混匀后，置QuantStudio 3荧光定量PCR仪上，按照下列条件运行：95℃ 预热5min；然后95℃10s,60℃30s,共40个循环。以双蒸水作为阴性对照。

4.结果判定。阴性对照无扩增，检测样品如果出现标准的S型扩增曲线，且Ct值小于和等于35，则样品为阳性。

结果显示，59株中国野毒株的DNA均被有效扩增，Ct值范围在11～25 之间(图2)。Rev1、M5、S2疫苗株的DNA也被扩增出来，Ct值分别为17、 19和24，但A19疫苗株的DNA没有扩增(图3)。以上结果证明，本发明设计的引物和探针可有效扩增所有在国内流行的布鲁氏菌野毒株以及当前国内正在使用的Rev1、M5、S2疫苗株，但不能识别A19疫苗株。除S2疫苗株偶尔用于牛的免疫，Rev1和M5疫苗从未在牛上使用，因此，本发明的引物探针需要在已知免疫背景的条件下使用。

实施例3用于扩增Bc-1位点的引物和探针的灵敏度分析

1.DNA标准品的准备

以羊种布鲁氏菌中国流行株XJ18(中国动物卫生与流行病学中心人兽共患病监测室生物安全三级实验室保存)制备DNA标准品。XJ18菌株经液体培养，灭活，回收菌体，用细菌基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司)纯化基因组DNA，用数字PCR技术对基因组DNA含量进行精确测定(致准生物科技有限公司)。然后，将XJ18菌株的基因组稀释为1×10⁵copies/μL溶液，并10倍梯度稀释，最后制备成含1×10⁵copies/μl～1copies/μL 的标准品备用。阴性质控品为ddH2O或纯化水。

2.引物、探针的合成以及PCR反应同实施例2中的2、3部分。每个样品稀释度做3个重复，并绘制标准曲线。

3.检测结果：不同拷贝数的XJ18基因组DNA荧光定量PCR检测的结果如表1所示。含量为1×10⁵copies/μL的标准品对应的Ct值为19.5，经10 倍连续稀释为含1拷贝的溶液后，其对应的Ct值为35.3。从扩增图和标准曲线上看(图4和图5)，含10拷贝以上的样品检测的重复性较好，但含1 拷贝的样品的重复性稍差。结合以上数据，本发明设计的引物和探针检测最低限定为1～10个拷贝，Ct值≤35为阳性。

表1：不同拷贝数的XJ18 DNA荧光定量PCR检测结果表

样品号	基因组DNA拷贝数	平均Ct值
			1	1×10<sup>5</sup>	19.5
2	1×10<sup>4</sup>	22.6
			3	1×10<sup>3</sup>	26.4
4	1×10<sup>2</sup>	29.3
			5	10	32.2
6	1	35.3

实施例4布鲁氏菌A19疫苗和中国流行菌株的实时荧光定量PCR鉴别试剂盒的组装。

本发明的目的是用于布鲁氏菌A19疫苗和中国流行菌株的鉴别，实时荧光定量PCR鉴别试剂盒的组装可通过以下方式实施。

1.阳性对照品的制备。以羊种布鲁氏菌中国流行株XJ18和A19疫苗株制备DNA阳性对照品。细菌基因组DNA纯化后，用数字PCR技术对其含量进行精确测定。将阳性对照品稀释为1×10³copies/μL溶液，其Ct值为26。阴性对照品为ddH2O或纯化水。

2.引物和探针制备。根据已公开发表的布鲁氏菌荧光PCR检测引物和探针以及本实验室验证，William等设计的针对牛种布鲁氏菌的特异性引物 (BA-F:GCGGCTTTTCTATCACGGTATTC；BA-R:CATGCGCTATGATCTGGTTACG)和探针 (BA-P：CGCTCATGCTCGCCAGACTTCAATG)可扩增A19疫苗的基因组DNA，但对中国流行菌株和Rev1、M5、S2疫苗株的DNA均不能扩增。因此，利用William 设计的引物和探针，结合本发明所述的MGB引物和探针制备双重荧光PCR检测试剂盒，具有完全的鉴别A19疫苗和国内其他菌株的作用。为了与本发明所述探针的荧光标记物相区别，BA-P探针荧光修饰基团优选为VIC，淬灭基团优选为BHQ1。荧光PCR结果判定和解读见表2。

表2：布鲁氏菌A19疫苗和中国野毒株双重荧光PCR结果和判定表

引物、探针合成以后稀释成10μM的工作浓度，反应体系为25μL，包括2×Premix预混反应液12.5μL、两对引物各0.5μL、两个探针各0.25μ L、DNA模板1μL、无Rnase和Dnase的双蒸水9μL。上述反应体系充分混匀后，置QuantStudio 3荧光定量PCR仪上，按照下列条件运行：95℃预热5min；然后95℃10s,60℃30s,共40个循环。荧光检测通道选择 FAM和VIC。

3.检测试剂盒敏感性和特异性试验。按照实施例3所述方法，将XJ18菌株和A19疫苗株DNA连续10倍稀释，制成含1×105copies/μl～1copies/ μL的样品液，分别取1μL加入到上述配制好的反应体系中，PCR扩增后分析试剂盒的敏感性。按实施例2方法，用布鲁氏菌流行菌株、疫苗株及其他细菌(大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌和人苍白杆菌)的基因组DNA，分别取1μL加入到上述配制好的反应体系中，对测试剂盒的特异性进行检测。

结果如图6所示，A19和XJ18的DNA在双重荧光PCR反应体系中扩增效果良好，两对引物探针无交叉反应，而且1个拷贝的基因组的Ct值均在35 左右，具有很高的敏感性。特异性检测结果显示，该反应体系可正确区分A19 疫苗株和国内流行菌株及其他疫苗株，不能扩增大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌和人苍白杆菌的基因组，具有很高的特异性(100％)。

4.检测试剂盒重复性试验。配制3个批次的反应体系，每个批次用阳性对照品重复检测6次，记录检测结果，分别计算均值和变异系数(CV值)， CV值需满足<10％。

表3：双重荧光PCR反应体系重复性实验结果表

结果如表3所示，双重荧光PCR反应体系的批内变异系数在0.51％～1.15％之间，小于10％，表明建立双重荧光PCR鉴别试剂盒具有良好的重复性。

实施例5布鲁氏菌A19疫苗和中国流行菌株的实时荧光定量PCR鉴别试剂盒的临床应用。

1.引物、探针、阳性和阴性对照品参见实施例4中的内容。

2.检测样品准备。样品为A19疫苗免疫奶牛的奶样，共计10份，由烟台市动物疫病预防控制中心提供。取1ml奶样转移至2mL离心管中，加入等体积的生理盐水，混合均匀，12000转/分钟，离心10分钟，弃去上层液体，用无菌棉签将脂肪层涂抹干净。剩余的沉淀按照细菌基因组提取试剂盒 (天根生化科技有限公司)的方法提取DNA。液体中加入鲜奶样品等体积的生理盐水，混合均匀，13000转/分钟、4℃离心10分钟，弃去脂肪层和上层液体，得沉淀

3.按照实施例4的方法制备反应体系，为了提高检测灵敏度DNA模板添加量为5μL，用5μL双蒸水补足体积至25μL。反应体系充分混匀后，置QuantStudio 3荧光定量PCR仪上，按照实施例4的反应条件进行PCR扩增。

检测结果如图7所示：结果显示有6个样本的VIC检测通道出现阳性信号，而FAM通道无信号，表明样品中只有A19疫苗的核酸，与样品来源动物的免疫背景一致。其余4个样品没有任何扩增信号，表明该样品中无任何布鲁氏菌的核酸。考虑到A19疫苗为弱毒株，能被动物体完全清除，其奶样中未检出A19疫苗的核酸属于正常现象。

综上，利用本发明制备所得的引物和探针可用于牛布鲁氏病的病原学检测，最重要的功能是可以区分A19疫苗和野毒株感染，具有特异性强、重复性好、灵敏度高的优点。尽管国内主要使用A19疫苗对牛进行免疫，但个别牛场仍使用S2疫苗，因此，利用本发明进行A19疫苗和野毒株的鉴别诊断还需在已知免疫背景的条件下进行。所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

序列表

<110> 中国动物卫生与流行病学中心

<120> 一种区分布鲁氏菌A19疫苗株与野毒株的分子标记

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 160

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcatatgtaa cagccgggat tcaaacgtca aattcaatcc actagaacgc ctttcggaag 60

gtcagattaa gccgaaacgg ccccagccgc tcatgctcgc cagacttcaa tggtagaata 120

ccgtgataga aaagccgcga cggcccgccc cagacaacca 160

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgggattcaa acgtcaaa 18

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggcttttcta tcacggtatt c 21

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcaatccact agaacgcc 18

Claims

1.一种可区分布鲁氏菌A19疫苗株与野毒株的分子标记，其特征在于，所述的分子标记的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

2.一种用于区分布鲁氏菌A19疫苗株与野毒株的引物对，其特征在于，所述的引物对用于检测核苷酸序列为SEQ ID NO:1的核酸片段。

3.如权利要求2所述的引物对，其特征在于，所述的引物对包含有核苷酸序列为SEQ IDNO：2的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID NO：3的下游引物。

4.一种探针，其特征在于，所述的探针用于检测权利要求2所述的引物对的扩增产物。

5.如权利要求4所述的探针，其特征在于，所述的探针的核苷酸序列为SEQ ID NO：4。

6.如权利要求4或5所述的探针，其特征在于，所述的探针采用荧光报告基团和MGB基团进行修饰。

7.如权利要求4或5所述的探针，其特征在于，所述的荧光报告基团修饰在探针序列5′端,MGB基团修饰在探针序列3′端。

8.如权利要求7所述的探针，其特征在于，所述的荧光报告基团为FAM、HEX、TET、JOE或VIC。

9.一种布鲁氏菌A19疫苗株与野毒株的荧光定量PCR鉴别诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包含有权利要求2所述的引物对和权利要求4所述的探针。

10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包含有用于检测布鲁氏菌A19疫苗株的引物组和/或探针。