CN116656845A - 诊断布鲁氏菌疫苗免疫与自然感染的三重荧光定量pcr检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

诊断布鲁氏菌疫苗免疫与自然感染的三重荧光定量pcr检测试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种诊断布鲁氏菌疫苗免疫与自然感染的三重荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法。所述试剂盒含有SEQ ID No.1～SEQ ID No.6所示的引物及SEQ ID No.7～SE Q ID No.9所示的TaqMan探针。本发明的方法能特异性区分疫苗免疫病原核酸和自然感染病原核酸，同时具有灵敏度高、特异性强、操作便捷等优点，适合对背景清楚的临床样本(鼻/肛拭子、牛奶、可能污染的饲料或饲草等)直接检测，重点用于免疫净化场临床样品的监测，为布鲁氏菌病准确诊断和及时防控提供技术支持。

Description

诊断布鲁氏菌疫苗免疫与自然感染的三重荧光定量PCR检测 试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及一种布鲁氏菌疫苗免疫与自然感染的三重TaqMan荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法，属于兽医微生物学诊断领域。
背景技术
布鲁氏菌病(布病)是由布鲁氏菌(Brucella)引起的一种重要人畜共患病，被世界动物卫生组织(WOAH)列为法定必须通报的疫病，我国属于优先防制的重大动物疫病。家畜感染布病后生殖系统受到严重侵害，雌性动物表现大量流产、不孕和死胎等，雄性动物出现睾丸炎。人则表现为间隙发热、多汗、关节痛、神经痛及肝、脾肿大等症状。近年来，人畜布病发病率高位流行，给养殖业和公共卫生安全造成严重损失。在布病严重流行的情况下，对牛羊等易感家畜进行大规模免疫是控制布病的最有效手段。牛种布鲁氏菌A19株、猪种布鲁氏菌S2株疫苗是我国应用最为广泛的疫苗，两者批签发总量约占全国98％。
布鲁氏菌是一种革兰氏阴性的兼性厌氧菌，根据表型分为光滑型(S)和粗糙型(R)。该菌宿主较为广泛，能感染猪、牛、犬和沙林鼠等动物，可分为6个经典种19个生物亚型，分别为羊种(B.melitensis)、牛种(B.abortus)、猪种(B.suis)、绵羊附睾种(B.ovis)、沙漠森林野鼠种(B.neotomae)和犬种(B.canis)。不同种布鲁氏菌的基因组同源性在90％以上。其基因组约3.3Mb，编码3200～3400个基因，均由2条独立且完整的环状DNA染色体组成，大小分别为2.1Mb和1.2Mb。
血清学方法是当前诊断动物布病的主要方法，其主要基于检测抗布鲁氏菌脂多糖(LPS)抗体。我国最常用的动物布病疫苗株(S2、A19)与野毒感染株都属于光滑型菌株，均诱导机体产生抗脂多糖抗体，因而无法通过现有血清学方法区分疫苗免疫和自然感染。此外，布鲁氏菌以胞内寄生为主，检测抗体局限大。因此从病原学上实现免疫与自然感染菌株检测是较为可行的策略。
对临床样本病原性核酸检测也是快速诊断疫病的有效方法。通过比较基因组学，能获得布鲁氏菌强弱毒菌差异信息，再运用布鲁氏菌全物种比较，获得鉴别诊断标识，为从病原学上区分疫苗免疫与自然感染提供可能。如杨博涵(2020)从布鲁氏菌A19疫苗株和野毒株2308的差异部分，共计碱基缺失28处，增添30处，其中共有24个序列碱基增添20bp以内，共有22个序列碱基缺失在20bp以内，建立的方法可有效区分A19疫苗株、其他疫苗株和野毒株。刘炳滟(2020)运用上述同样方法，成功发现用于鉴别布鲁氏菌S2疫苗株核酸标识序列。而BCSP31、IS711是报道的布鲁氏菌属检测通用基因，已广泛用于属的鉴定。
实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。该技术使用特异性探针对定量分子进行识别，具有很高的准确性。同时靶序列由引物和探针双重控制，特异性好、假阳性低。此外，具有灵敏度高、速度快、高通量、可直接定量等优点，该方法已较为成熟，并广泛用于疫病诊断，如新冠病毒、非洲猪瘟病毒检测等。
当前我国施行的是“免疫净化”和”检疫净化”两种策略。“免疫净化”是在布病流行区域，及时通过检疫淘汰阳性家畜后，对其他受感染风险的畜群实现大规模免疫A19或S2疫苗，或采用两者交叉免疫策略来保护未感染动物。而“检疫净化”是在布病低流行区域采用的科学策略，通过血清学方法及时检疫淘汰阳性畜，隔离受感染风险动物，从而净化畜群。此外，精确识别动物流产的病原，也是控制布病风险的重要因素。据报道全国畜群(牛、羊)流产由布鲁氏菌导致流产占30％，其流产胎儿羊水中含菌量巨大，可能由自然感染菌株导致，也可能由非科学使用疫苗导致。我国目前暂未有区分A19、S2疫苗株和非疫苗株(自然感染株)的快速检测试剂盒，因此开发灵敏度高、特异性强的区分疫苗免疫和自然感染的三重实时荧光定量PCR检测试剂盒(方法)，对快速鉴定流产病原，以及加强背景清楚的牛/羊临床样本(鼻/肛拭子、牛奶、可能污染的饲料或饲草等)的布病风险监测，科学意义和实用价值巨大。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：针对当前传统血清学方法无法区分疫苗免疫和自然感染，病原学监测缺少敏感性高特异性强的区分布病疫苗免疫和自然感染鉴别诊断产品(方法)这一难题，本发明提供一套快速鉴别布病疫苗(A19和S2)免疫与自然感染菌株的多重TaqM an荧光定量PCR检测的引物和探针组合、试剂盒及检测方法，从而实现快速诊断布病病原，达到及时防控。
本发明的技术方案为：用于区分布鲁氏菌疫苗免疫与自然感染的三重荧光定量PCR检测的引物和探针组合，包括SEQ ID No.1～SEQ ID No.6所示核苷酸序列的引物及SEQID No.7～SEQ ID No.9所示核苷酸序列的TaqMan探针。
进一步地，所述SEQ ID No.7所示核苷酸序列的TaqMan探针5’端标记FAM，3’端标记BHQ1，SEQ ID No.8所示核苷酸序列的TaqMan探针5’端标记CY5，3’端标记BHQ2，SEQ IDNo.9所示核苷酸序列的TaqMan探针5’端标记VIC，3’端标记BHQ2。
一种检测试剂盒，含有上述所述的引物和探针组合。
进一步地，还包含2×qPCR核心试剂预混液、50×ROX Reference Dye、阳性对照或阴性对照中的任一种或多种。
用于区分布鲁氏菌疫苗免疫与自然感染的三重荧光定量PCR检测的方法，包括如下步骤：
(1)提取待检测样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)的基因组DNA为模板，用上述所述的引物和探针组合进行荧光定量PCR扩增；
(3)通过荧光信号对检测结果进行判定。
进一步地，荧光定量PCR扩增的体系为：含模板(样品DNA/阳性对照/阴性对照)2μL，引物组共2.2μL(含I、A和S序列的上下游引物分别为0.5μL、0.2μL和0.4μL)，探针组共1.2μL(含I、A和S序列的探针分别为0.3μL、0.5μL和0.4μL)、2×qPCR核心试剂预混液10μL，50×ROX Reference Dye 0.4μL、ddH2O 4.2μL，共20μL。
进一步地，荧光定量PCR扩增的反应程序为：第一步，37℃2min；第二步，95℃30s，第三步，95℃10s，60℃30s，40个循环。
进一步地，通过荧光信号对检测结果进行判定的方法为：若同时检测出三条TaqMan探针的荧光信号和三条相对应的扩增曲线，则为非疫苗株引起的自然感染；若同时检出SEQ ID No.7和SEQ ID No.9所示探针标记的荧光信号和两条相对应的扩增曲线，则待检样品中含有牛种布鲁氏菌A19疫苗株核酸；若同时检出SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示探针标记的荧光信号和两条相对应的扩增曲线，则待检样品中含有猪种布鲁氏菌S2疫苗株核酸；若未检出荧光信号和未有相对应的扩增曲线，则待检样品中不含布鲁氏菌核酸。
进一步地，若检出FAM、Cy5和VIC荧光信号和三条相对应的扩增曲线，则为非疫苗株引起的自然感染；若检出FAM和VIC荧光信号和两条相对应的扩增曲线，则待检样品中含有牛种布鲁氏菌A19疫苗株核酸；若检出FAM和Cy5荧光信号和两条相对应的扩增曲线，则待检样品中含有猪种布鲁氏菌S2疫苗株核酸；若未检出荧光信号和未有相对应的扩增曲线，则待检样品中不含布鲁氏菌核酸。
表1荧光结果与判定
布病诊断包括流行病学及细菌分离鉴定、血清学检测和分子生物学检测，其中细菌分离培养鉴定需要时间长(约1周)，操作繁琐，并且需要高级别生物安全实验室条件；而通过传统的血清学试验(如试管凝集试验、补体结合试验、虎红平板凝集试验、ELISA等)，无法实现鉴别诊断(疫苗株与自然感染菌株均为光滑型表型，均诱导产生光滑型LPS抗体)，并且受限于胞内寄生菌抗体产生低、持续时间短因素，荧光定量PCR具有敏感性高、特异性强、操作简便特点，具备其他普通PCR明显敏感性优势，克服了分离培养所需生物安全因素以及时间长缺陷，可对临床样本实现快速确诊。本发明的目的主要针当前应用最为广泛的疫苗株(S2、A19)特异性核酸序列，以及布鲁氏菌属通用核酸序列成功开发三重荧光定量PCR试剂盒(方法)，从而实现布病病原核酸快速鉴别诊断，为布病防控提供有效技术支撑。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的方法能特异性区分疫苗免疫病原核酸和自然感染病原核酸，同时具有灵敏度高、特异性强、操作便捷等优点，适合对背景清楚的临床样本(鼻/肛拭子、牛奶、可能污染的饲料或饲草等)直接检测，重点用于免疫净化场临床样品的监测，为布鲁氏菌病准确诊断和及时防控提供技术支持。
附图说明
图1为布鲁氏菌的多重TaqMan荧光定量PCR标准曲线；
图2为A19疫苗株的多重TaqMan荧光定量PCR标准曲线；
图3为S2疫苗株的多重TaqMan荧光定量PCR标准曲线；
图4为布鲁氏菌的多重TaqMan荧光定量PCR灵敏度检测结果；
图5为A19疫苗株的多重TaqMan荧光定量PCR灵敏度检测结果；
图6为S2疫苗株的多重TaqMan荧光定量PCR灵敏度检测结果；
图7为多重TaqMan荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、溶血性曼氏杆菌、产单核细胞李氏杆菌、多杀性巴氏杆菌的结果；
图8为多重TaqMan荧光定量PCR检测牛种布鲁氏菌2308株、羊种布鲁氏菌M28株、猪种布鲁氏菌S1330株的结果；
图9为多重TaqMan荧光定量PCR检测A19疫苗株的结果；
图10为多重TaqMan荧光定量PCR检测S2疫苗株的结果。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
本发明涉及的微生物资源信息
牛种布鲁氏菌2308株、牛种布鲁氏菌A19疫苗株、羊种布鲁氏菌M28株、猪种布鲁氏菌S1330株、猪种布鲁氏菌S2疫苗株、大肠埃希氏菌CVCC237株、金黄色葡萄球菌CVCC3053株、溶血性曼氏杆菌CVCC1655株、产单核细胞李氏杆菌CVCC1597株、多杀性巴氏杆菌CVCC390株均由中国兽医药品监察所保存与供应。
实施例1对比分析相同来源的布鲁氏菌强毒株/疫苗株
通过Clustal Omega软件对比分析相同来源的布鲁氏菌强毒株/疫苗株，牛种布鲁氏菌2308强毒株/A19疫苗株；猪种布鲁氏菌S1330强毒株/S2疫苗株，查找疫苗株A19、S2特有的缺失/增添片段，然后将该特异性片段在NCBI与其他疫苗株比对，分别确定A19、S2特有缺失序列。
结果显示，IS711基因序列为布鲁氏菌特异性序列：
GCCTACCGCTGCGAATAAAGCCAACACCCGGCCATTATGGTGACTGTCCGCAAGCTTCAAGCCTTCTATCCGG(SEQ ID No.10)；命名为I序列。
A19疫苗株特有缺失序列(下划线部分)：
TCGTCATCCTCAATGGCGGCATCGACCTTTCGGTCGGCTCCACGCTGGGGCTGGCCGGTGTGGTCGCG GGCTTCCTGATGCAGGGCGTGACCTTGCAGGAATTCGGCATCATCCTTTATTTCCCGGT(SEQ ID No.11)；命名为A序列。
S2疫苗株特有缺失序列(下划线部分)：
GATCTCGGCCTGTGTCAGCCCGCCATCCACACTCGCCAGCAATTCCAATATGTCCAGCCCCTTGTCCAGCGCGGGCGCGCGATAGCGATCGTCAGTTTCCAAGGTCGGCTCCCTCATAAATGGCTTTCTTCATA(SEQ IDNo.12)，命名为S序列。
实施例2多重TaqMan荧光定量PCR建立及退火温度、引物与探针浓度的优化
根据I、A和S序列设计3对引物组和3条探针(表2)，其工作浓度的引物和探针均为10μM。采用单一变量的优化方法，对退火温度、引物浓度、探针浓度等进行优化。反应体系为20μl：2×qPCR核心试剂预混液10μL，50×ROX Reference Dye 0.4μL、模板2μL、引物与探针均为0.1-1.0μL，ddH2O补足至20μL。反应程序：第一步，37℃2min；第二步，95℃30s，第三步，95℃10s，58-66℃30s，40个循环。
结果显示，最佳退火温度为60℃；I、A和S序列的上下游引物分别为0.5μL、0.2μL和0.4μL；I、A和S序列的探针分别为0.3μL、0.5μL和0.4μL。
表2基因引物和探针
引物名称 序列(5’-3’)
IS-F 5’-GCCTACCGCTGCGAATAAAG-3’(SEQ ID No.1)
IS-R 5’-CCGGATAGAAGGCTTGAAGCT-3’(SEQ ID No.2)
IS-P FAM-CACCCGGCCATTATGGTGACTGTCC-BHQ1(SEQ ID No.7)
A19-F 5’-TCGTCATCCTCAATGGCG-3’(SEQ ID No.3)
A19-R 5’-ACCGGGAAATAAAGGATGATG-3’(SEQ ID No.4)
A19-P CY5-CATCAGGAAGCCCGCGACCAC-BHQ2(SEQ ID No.8)
S2-F 5’-GATCTCGGCCTGTGTCAGC-3’(SEQ ID No.5)
S2-R 5’-TATGAAGAAAGCCATTTATGAGGG-3’(SEQ ID No.6)
S2-P VIC-TCCAATATGTCCAGCCCCTTGTCCAG-BHQ2(SEQ ID No.9)
实施例3多重TaqMan荧光定量PCR标准曲线的确定
以布鲁氏菌、A19和S2疫苗株基因组DNA为模板，利用设计的3对特异性引物分别进行单一PCR扩增，PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，用DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物，连接至pMD18-T载体构建重组质粒pMD-IS711、pMD-A19和pMD-S2，经菌液PCR鉴定、测序加以验证。利用紫外分光光度计检测3种阳性质粒浓度，分别计算其拷贝数。
将3种阳性质粒等拷贝数混合后进行10倍倍比稀释，以质粒浓度梯度为1×107copies/μl-1×101copies/μl为模板进行多重TaqMan荧光定量PCR，确定其标准曲线。由图1、图2和图3可知，布鲁氏菌、A19疫苗株和S2株的拷贝数x与Ct值的线性关系分别是：y＝-3.2107x+38.796、y＝-3.0825x+38.766、y＝-3.3394x+39.83；R2分别为：0.9964、0.9946、0.9979；扩增效率(E)分别为：104.86％、110.9％、99.27％。
实施例4多重TaqMan荧光定量PCR灵敏度(最小检测量)的确定
将3种阳性质粒等体积混合后进行10倍倍比稀释，以质粒浓度梯度为1×107copies/μl-1×100copies/μl为模板进行多重TaqMan荧光定量PCR，确定其灵敏度。由图4、图5和图6可知，多重TaqMan荧光定量PCR检测的最低拷贝数均是10copies/μl。
实施例5多重TaqMan荧光定量PCR特异性检测
以牛种布鲁氏菌2308株、牛种布鲁氏菌A19疫苗株、羊种布鲁氏菌M28株、猪种布鲁氏菌S1330株、猪种布鲁氏菌S2疫苗株、大肠埃希氏菌CVCC237株、金黄色葡萄球菌CVCC3053株、溶血性曼氏杆菌CVCC1655株、产单核细胞李氏杆菌CVCC1597株、多杀性巴氏杆菌CVCC390株的基因组DNA为模板，重组质粒pMD-IS711、pMD-A19和pMD-S2为阳性对照，ddH2O为阴性对照，进行多重TaqMan荧光定量PCR特异性检测。
由图7与表3可知，以金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、溶血性曼氏杆菌、产单核细胞李氏杆菌和多杀性巴氏杆菌基因组DNA为模板，多重TaqMan荧光定量PCR均无扩增结果(图7)；以牛种布鲁氏菌2308株、羊种布鲁氏菌M28株、猪种布鲁氏菌S1330株基因组DNA为模板，多重TaqMan荧光定量PCR能同时扩增出I、A和S序列(图8)；以牛种布鲁氏菌A19疫苗株基因组DNA为模板，多重TaqMan荧光定量PCR能同时扩增出I和S序列(图9)；以猪种布鲁氏菌S2疫苗株基因组DNA为模板，多重TaqMan荧光定量PCR能同时扩增出I和A序列(图10)；综上所述，多重TaqMan荧光定量PCR特异性强，且能有效区分A19、S2疫苗株、自然感染菌株。
表3多重TaqMan荧光定量PCR试剂盒特异性检测结果
检测病原 FAM检测通道 CY5检测通道 VIC检测通道
金黄色葡萄球菌 阴性 阴性 阴性
大肠埃希氏菌 阴性 阴性 阴性
溶血性曼氏杆菌 阴性 阴性 阴性
产单核细胞李氏杆菌 阴性 阴性 阴性
多杀性巴氏杆菌 阴性 阴性 阴性
牛种布鲁氏菌2308株 阳性 阳性 阳性
羊种布鲁氏菌M28株 阳性 阳性 阳性
猪种布鲁氏菌S1330株 阳性 阳性 阳性
牛种布鲁氏菌A19疫苗株 阳性 阴性 阳性
猪种布鲁氏菌S2疫苗株 阳性 阳性 阴性
ddH2O 阴性 阴性 阴性
实施例6多重TaqMan荧光定量PCR重复性检测
分别选择三种阳性质粒浓度是103copies/μl、105copies/μl、107copies/μl为多重TaqMan荧光定量PCR反应的模板，进行荧光PCR扩增，每个浓度的阳性质粒做三次重复，计算批间与批内的变异系数。由表4所知，多重TaqMan荧光定量PCR的批间与批内试验变异系数均小于2％，表明该方法具有良好的重复性。
表4多重TaqMan荧光定量PCR试剂盒重复性检测结果
实施例7多重TaqMan荧光定量PCR对临床病料检测效果
对临床送检疑似布鲁氏菌病的55份样本(鼻/肛拭子、牛奶、病变组织)分别运用多重TaqMan荧光定量PCR试剂盒和多重PCR《动物布鲁氏菌病诊断技术》(CB/T 18646-2018)进行检测，确定试剂盒与现行国家标准的符合率。
由表5所知，对临床送检疑似布鲁氏菌病的55份样本(鼻/肛拭子、牛奶、病变组织)，多重TaqMan荧光定量PCR试剂盒共检测布鲁氏菌10份、A19疫苗株8份、S2疫苗株13份，阴性样品24份，与现行国家标准的检测结果一致。
表5临床病料检测结果

Claims (9)

1.用于区分布鲁氏菌疫苗免疫与自然感染的三重荧光定量PCR检测的引物和探针组合，其特征在于，包括SEQ ID No.1～SEQ ID No.6所示核苷酸序列的引物及SEQ ID No.7～SE Q ID No.9所示核苷酸序列的TaqMan探针。
2.根据权利要求1所述的引物和探针组合，其特征在于，所述SEQ ID No.7所示核苷酸序列的TaqMan探针5’端标记FAM，3’端标记BHQ1，SEQ ID No.8所示核苷酸序列的TaqMan探针5’端标记CY5，3’端标记BHQ2，SEQ ID No.9所示核苷酸序列的TaqMan探针5’端标记VIC，3’端标记BHQ2。
3.一种检测试剂盒，含有权利要求1或2所述的引物和探针组合。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，还包含2×qPCR核心试剂预混液、50×ROX Reference Dye、阳性对照或阴性对照中的任一种或多种。
5.用于区分布鲁氏菌疫苗免疫与自然感染的三重荧光定量PCR检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取待检测样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)的基因组DNA为模板，用权利要求1或2所述的引物和探针组合进行荧光定量PCR扩增；
(3)通过荧光信号对检测结果进行判定。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，荧光定量PCR扩增的体系为：含模板2μL，SEQ ID No.1～SEQ ID No.6所示的引物共2.2μL，SEQ ID No.7～SEQ ID No.9所示的探针共1.2μL、2×qPCR核心试剂预混液10μL，50×ROX Reference Dye 0.4μL、ddH2O 4.2μL，共20μL。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，荧光定量PCR扩增的反应程序为：第一步，37℃2min；第二步，95℃30s，第三步，95℃10s，60℃30s，40个循环。
8.根据权利要求5-7任一项所述的方法，其特征在于，通过荧光信号对检测结果进行判定的方法为：若同时检测出三条TaqMan探针的荧光信号和三条相对应的扩增曲线，则为非疫苗株引起的自然感染；若同时检出SEQ ID No.7和SEQ ID No.9所示探针标记的荧光信号和两条相对应的扩增曲线，则待检样品中含有牛种布鲁氏菌A19疫苗株核酸；若同时检出SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示探针标记的荧光信号和两条相对应的扩增曲线，则待检样品中含有猪种布鲁氏菌S2疫苗株核酸；若未检出荧光信号和未有相对应的扩增曲线，则待检样品中不含布鲁氏菌核酸。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，若检出FAM、Cy5和VIC荧光信号和三条相对应的扩增曲线，则为非疫苗株引起的自然感染；若检出FAM和VIC荧光信号和两条相对应的扩增曲线，则待检样品中含有牛种布鲁氏菌A19疫苗株核酸；若检出FAM和Cy5荧光信号和两条相对应的扩增曲线，则待检样品中含有猪种布鲁氏菌S2疫苗株核酸；若未检出荧光信号和未有相对应的扩增曲线，则待检样品中不含布鲁氏菌核酸。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN117551747A (zh) * 2023-12-29 2024-02-13 石家庄博瑞迪生物技术有限公司 一种基于多重TaqMan的qPCR特异性检测方法、试剂盒及其应用

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