CN112831609A - 检测非洲猪瘟病毒mgf-505-1r基因的pcr引物、试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本公开提供了一种检测非洲猪瘟病毒MGF‑505‑1R基因的PCR引物，选自以下两对引物中的任意一对：引物1：由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成；引物2：由SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的核苷酸序列组成。本公开还提供了一种检测非洲猪瘟病毒MGF‑505‑1R基因的试剂盒，包括：PCR混合液、酶混合液、阴性对照及阳性对照，所述PCR混合液包括引物，所述引物为上述引物1或引物2。本公开提供的试剂盒，扩增效率高，检测灵敏度、特异性高，可用于猪的唾液、鼻腔拭子、血液、组织等样本中的非洲猪瘟病毒MGF‑505‑1R基因检测。

Description

检测非洲猪瘟病毒MGF-505-1R基因的PCR引物、试剂盒及方法

技术领域

本公开涉及生物技术的领域，尤其涉及检测非洲猪瘟病毒MGF-505-1R基因的PCR引物、试剂盒及方法。

背景技术

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的猪的一种急性、烈性、出血性、高度接触性传染病，强毒株可在感染后约5-14天内致死家猪，致死率接近100％。由于非洲猪瘟病毒具有复杂的免疫逃避机制，缺乏典型的中和抗体，没有有效的疫苗用于防疫，无特效治疗药物。根据我国国情和已有病毒病防控经验，疫苗是防控非洲猪瘟疫情最为有效和经济的方法，研制有效、安全的疫苗十分迫切。

非洲猪瘟基因组较大，有24个基因型，不同基因型之间的生物学特性差异较大，免疫逃逸机制复杂，不同基因型之间交叉免疫保护能力较差。CD2V缺失的BA71株(基因I型)已经充分致弱，免疫猪后对BA71毒株存活率均100％，但相同基因缺失的中国流行株Pig/HLJ/2018(基因II型)和Malawi Lil-20/1株(基因II型)免疫猪后对相应毒株的存活率分别约50％和0％。鉴于这种现实，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所采用非洲猪瘟中国流行株Pig/CN/HLJ/2018，经基因工程技术敲除该毒株的毒力基因MGF-505-1R基因制得MGF-505-1R基因缺失病毒灭活疫苗，可提供对非洲猪瘟中国流行强毒株的100％免疫保护。

MGF-505-1R基因缺失疫苗免疫生猪时，因为野毒的存在，还会发生接种了疫苗的个体出现非洲猪瘟病毒感染致病，猪场业主可能会有种猜测，猜测之一就是“是否疫苗仍然致毒？”。有鉴于此，本发明人研究和设计了一种检测非洲猪瘟病毒MGF-505-1R基因的PCR引物、试剂盒及方法。

发明内容

本公开提供了一种检测非洲猪瘟病毒MGF-505-1R基因的PCR引物、试剂盒及其应用，以区分非常猪瘟病毒感染是因为野毒还是因为疫苗本身致毒的。

根据本公开的一个方面，一种检测非洲猪瘟病毒MGF-505-1R基因的PCR引物，选自以下两对引物中的任意一对：

引物1：由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成；

引物2：由SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的核苷酸序列组成。

根据本公开的至少一个实施方式，所述PCR引物由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成。

根据本公开的一个方面，一种检测非洲猪瘟病毒MGF-505-1R基因的试剂盒，包括：PCR混合液、酶混合液、阴性对照及阳性对照，所述PCR混合液包括引物，所述引物为上述引物1或引物2。

根据本公开的至少一个实施方式，所述PCR混合液，包括：TAKARA公司生产的10XTakaRa Ex Taq反应缓冲液、10mM dNTPs、一对浓度各为5μM的引物1或引物2、灭菌超纯水。

根据本公开的至少一个实施方式，所述10X TakaRa Ex Taq反应缓冲液、所述dNTPs、所述引物及所述灭菌超纯水的溶液体积比例为2.5:2.5:2.5:11.5。

根据本公开的至少一个实施方式，所述酶混合液为浓度5U/μL的10X TakaRa ExTaq酶，所述TakaRa Ex Taq酶含UDG酶。

根据本公开的至少一个实施方式，所述阳性对照为含引物1或引物2扩增片段的克隆质粒，所述克隆质粒为非洲猪瘟中国流行株Pig/CN/HLJ/2018。

根据本公开的至少一个实施方式，所述阴性对照为双蒸水。

根据本公开的一个方面，一种检测非洲猪瘟病毒MGF-505-1R基因的方法，所述方法用于非疾病诊断用途，包括以下步骤：提取待测样本的DNA；以待测样本的DNA为模板，采用引物1作为PCR引物建立PCR反应体系进行PCR扩增；对扩增产物进行分析；如果扩增产物出现224bp的条带，说明待检测的样本中含有非洲猪瘟病毒。

根据本公开的至少一个实施方式，所述PCR反应体系为：5μM的上下游引物各2.5μL，10X TakaRa Ex Taq反应缓冲液2.5μL，10mM的dNTPs 2.5μL，1mM的dUTPs 2.5μL，含UDG酶的10X TakaRa Ex Taq 2.5μL，灭菌超纯水5μL，样本核酸提取液5μL，总体积25μL。

根据本公开的至少一个实施方式，所述PCR的反应程序为：UNG处理：50℃，2min；预变性：95℃，1min；40个循环扩增：95℃10s、58℃10s、72℃10s。

采用上述技术方案之后，本公开具有以下有益效果：

本公开的试剂盒包括两对特异性扩增引物，扩增引物用于扩增非洲猪瘟病毒MGF-505-1R基因。本公开提供的试剂盒，扩增效率高，检测灵敏度、特异性高，可用于猪的唾液、鼻腔拭子、血液、组织等样本中的非洲猪瘟病毒MGF-505-1R基因检测。

附图说明

附图示出了本公开的示例性实施方式，并与其说明一起用于解释本公开的原理，其中包括了这些附图以提供对本公开的进一步理解，并且附图包括在本说明书中并构成本说明书的一部分。

图1是梯度变性温度的凝胶电泳图。

具体实施方式

下面结合附图和实施方式对本公开作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于解释相关内容，而非对本公开的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与本公开相关的部分。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本公开中的实施方式及实施方式中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施方式来详细说明本公开。

实施例1 PCR引物的筛选

本实施例从NCBI查找到中国流行株Pig/HLJ/2018(基因II型)MGF-505-1R基因的序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，用该序列在NCBI中Blast相近的毒株序列20个，Blast结果如表1所示，找到简并的MGF-505-1R基因序列，其简并的核苷酸序列如SEQ IDNo.6所示，以此序列为目标序列，采用primer5设上下游引物MGF550-1R_F和MGF550-1R_R，如表2所示，该对引物扩增MGF-505-1R基因，可以得到224个碱基对的片段。

表1 Blast结果

序列号	毒株信息
		MN172368.1:27747-29342	ASFV/pig/China/CAS19-01/2019
MK628478.1:27744-29339	ASFV/LT14/1490
		LR722600.1:28707-30302	ASFV CzechRepublic Jan-17
LR722599.1:28710-30305	ASFV Moldova Jan-17
		MK543947.1:27792-29387	Belgium/Etalle/wb/2018
MK645909.1:27751-29346	ASFV-wbBS01
		LR536725.1:28712-30307	ASFV Belgium Jan-18
MK333180.1:27747-29342	Pig/HLJ/2018
		MH910496.1:27656-29251	Georgia Feb-08
MH910495.1:27716-29311	Georgia Feb-08
		MK128995.1:27736-29331	China/2018/AnhuiXCGQ
MH681419.1:27748-29343	ASFV/POL/2015/Podlaskie
		LS478113.1:20444-22039	Estonia 2014
NC_044959.1:27734-29329	Georgia Jan-07
		MN194591.1:29402-30996	ASFV/Kyiv/2016/131
AY261364.1:22891-24486	Tengani 62

表2扩增引物信息表

根据SEQ ID No.6所示的简并序列，设计了2对引物，即：引物1：MGF-505-1R_1F、MGF-505-1R_1R；引物2：MGF-505-1R_2F、MGF-505-1R_2R。对其敏感性和特异性进行PCR检测，结果表明引物2的敏感性和特异性显著低于引物1，因此，最终选择引物1作为优选的引物，该引物由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成。

实施例2非洲猪瘟病毒MGF-505-1R基因PCR检测试剂盒

本实施例提供了一种检测非洲猪瘟病毒MGF-505-1R基因的试剂盒，包括：PCR混合液、酶混合液、阴性对照及阳性对照，所述PCR混合液包括引物，所述引物为实施例1所述的引物1或引物2。

本实施例所述PCR混合液，包括：TAKARA公司生产的10X TakaRa Ex Taq反应缓冲液、10mM dNTPs、一对浓度各为5μM的引物1或引物2、灭菌超纯水。

本实施例所述10X TakaRa Ex Taq反应缓冲液、所述dNTPs、所述引物及所述灭菌超纯水的溶液体积比例为2.5:2.5:2.5:11.5。

本实施例所述酶混合液为浓度5U/μL的10X TakaRa Ex Taq酶，所述TakaRa ExTaq酶含UDG酶。

本实施例所述阳性对照为含引物1或引物2扩增片段的克隆质粒，所述克隆质粒为非洲猪瘟中国流行株Pig/CN/HLJ/2018。

本实施例所述阴性对照为双蒸水。

实施例3非洲猪瘟病毒MGF-505-1R基因PCR检测方法

本实施例应用实施例2的试剂盒对非洲猪瘟病毒MGF-505-1R基因进行检测：

1、样品核酸的提取

核酸提取：采用天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)，按照说明步骤提取待测样本基因组DNA。

2、PCR反应体系的配置：每个检测样品对应一个PCR反应管，每个PCR反应管中各反应组分和所加入的体积：5μM的上下游引物1各2.5μL，10X TakaRa Ex Taq反应缓冲液2.5μL，10mM的dNTPs 2.5μL，1mM的dUTPs 2.5μL，含UDG酶的10X TakaRa Ex Taq 2.5μL，灭菌超纯水5μL，样本核酸提取液5μL，总体积25μL。

进一步地，本实施例建立的方法中为了避免所用试剂失效或受到污染，设置有阳性对照品及阴性对照品，其中，阴性对照品为灭菌超纯水，阳性对照品为含有非洲猪瘟病毒MGF-505-1R基因序列的阳性质粒Pig/CN/HLJ/2018。阴性对照的设计能有效验证所用试剂是否受到污染，避免假阳性发生，阳性对照的设计能有效验证受用试剂的有效性，避免假阴性的发生。

3、扩增变性温度用梯度温度PCR仪选取最佳变性温度。变性温度梯度区间为55.2-64.7℃，PCR扩增反应程序为：95℃30s的预变性，40个循环95℃10s，55.2-64.7℃10s，72℃10s的扩增。将扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分离，确认片段大小与预期一致，扩增结果如图1所示，并且确定最佳变性温度为58℃。

4、将配置好反应体系的PCR反应管放置于PCR扩增仪中，按照下列程序进行PCR扩增：UNG处理：50℃，2min；预变性：95℃，1min；40个循环扩增：95℃10s、58℃10s、72℃10s。

5、扩增结束后根据琼脂凝胶电泳判定待检样本结果。

扩增产物用琼脂糖凝胶电泳显示该扩增产物是否含有224个碱基对的片段，进而判断该核酸样品中是否含有MGF-505-1R基因。本公开为缺失基因MGF-505-1R设计了PCR扩增引物，扩增引物扩增感染猪样本的核酸，将扩增产物用琼脂糖凝胶电泳方法检测是否存在224个碱基对的目标扩增产物，即可得到检测结果，如果扩增出了224个碱基对的片段，则判定该核酸样品中含有MGF-505-1R基因，也即样本受到了野生毒株的感染；如果没有扩增出224个碱基对的片段，则判定该核酸样品中不含有MGF-505-1R基因，也即样本没有受到野生毒株的感染。

实施例4应用本发明的试剂盒进行实际样本检测

为验证本公开所述引物、试剂在实际情况下能正常使用，于是模拟实际情况，使用本公开的引物、试剂对实际样本进行检测。实际样本由龙岩学院生命科学学院提供，共12份，其中4份为ASFV野毒株阳性猪血清、4份为MGF-505-1R基因缺失疫苗株阳性猪血清、4份为正常猪(野毒株和疫苗株均阴性)血清。检测结果与已知PCR检测结果一致，符合率100％。

本公开具有快速、实时、灵敏、准确的鉴别ASFV野毒株和疫苗株的优点。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例/方式”、“一些实施例/方式”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例/方式或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例/方式或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例/方式或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例/方式或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例/方式或示例以及不同实施例/方式或示例的特征进行结合和组合。

本领域的技术人员应当理解，上述实施方式仅仅是为了清楚地说明本公开，而并非是对本公开的范围进行限定。对于所属领域的技术人员而言，在上述公开的基础上还可以做出其它变化或变型，并且这些变化或变型仍处于本公开的范围内。

序列表

<110> 龙岩学院

<120> 检测非洲猪瘟病毒MGF-505-1R基因的PCR引物、试剂盒及方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcccgtaaat gaagccct 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gccgcatgat atggcatt 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctcaatcaac ccacgcac 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tctttttccg ccgcatac 18

<210> 5

<211> 1596

<212> DNA

<213> Pig/HLJ/2018

<400> 5

atgttctctc tccagaactt atgtcgaaaa acattaccta accgtaaact tcctgaattt 60

tttgacgaat atatattaca actgctggga ttatactggg aaaaccatgg aactattcaa 120

cgagcaggaa acaactgtgt gcttatacag caacataccc tcattcccgt aaatgaagcc 180

ctgagaacag cagcatctga agaaaattat gagatcgtga gccttttatt agcgtgggag 240

gggaaccttt actatgctat tataggggct ctagagggca accgccacga cttaattcgt 300

aaatatgatg accaaatcaa ggaccatcat gaaattctgc cattcattga cgatccagtc 360

atatttcaca aatgccatat catgcggcaa tgcttttttg attgtatttt atatcaagct 420

gtaaaatata gtaagtttcg cgttcttctt tactttaaac atagattaga ggatgatttg 480

cccttcactc atttacttat tgaaaaggca tgtaaagatc ataattatga agttattaaa 540

tggatatatg aaaacctaca tatctacaat atgatagata cctttgaatg tgctattgcc 600

cataaggatc tacatctata ttgtttgggg tatagattta tatataacag aatcgtaccc 660

gataagtatc atcatttaga tattcgcatg ctttcaagcc tacaactcct acataaggtg 720

gcagccaaag gatacttaga ttttatccta gaaaccttaa agtatgatca taataaagat 780

aatataaata ttattctaac acaagctgca acctataacc atagaaaaat tttaatctat 840

ttcattcctc aatcaaccca cgcacagata gaacaatgtt tactagtggc gataaaagca 900

aaatcttcca ggaaaacctt gaacttacta ctgtctcacc taaacctttc catcaacctc 960

atcaaaaaaa taagccatta tgttgccact tacaattcaa caaatataat aggcattctg 1020

agtatgcggc ggaaaaagaa gatatattta gatatcatat tgacaaaatt tgtaaaaaaa 1080

gctattttta ataagtttgt cgttcgatgt atggatacat tttctataaa cccggaaaga 1140

atccttaaaa tagccgcgcg aataaatagg atgatgttag tgaaaaaaat atctgaacat 1200

gtttggaaaa atcatgcggt tagacttaaa taccttaaac atgcggtaca cacgatgaag 1260

cataaagatg ggaaaaatag actcatgaac tttatctatg atcgctgtta ttaccatatg 1320

caaggggaag aaatctttag cctcgcaaga ttttatgcaa tccatcatgc accaaagttg 1380

tttgacgttt tttatgattg ttgtatccta gatacgatac gattcaaaag ccttctttta 1440

gattgttcac atatcatagg taaaaacgct catgatgcta ccaatatcaa catcgtgaac 1500

aagtatatcg gcaacctgtt tgttatggga gttcttagca aaaaagaaat cttacaggac 1560

tatccatcca tttattctaa acaatacatg ccttag 1596

<210> 6

<211> 1596

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgttctctc tycagaacyt atgtcgaaaa acattacctr acygtaaact tcctgaattt 60

tttgacgaat atatattaca actgctggga ttatactggg aaaaccatgg aactattcaa 120

cgagcaggaa acaactgtgt gcttatacag caacatamcc tcattcccgt aaatgaagcc 180

ctragaayag cagcatctga agaaaattat gagatcgtga gycttttatt agcrtgggag 240

gggaaccttt actatgctat tataggggct ctagagggca accgccacga cttaattcgt 300

aartatgatg accaaatcaa ggaccatcat gaaattctgc cattcattga cgatccagtm 360

atatttcaca aatgccatat catgcggcaa tgcttttttg attgtatttt atatcaagct 420

gtaaaatata gtaagtttcg cgttcttctt tmytttaaac atagattarr ggatgatttg 480

cccttcactc atttacttat tgaaaaggca tgtaaagatc ataattatga agtwattaaa 540

tggatatatg aaaacctaca tatctacaat atgatagata cctttgaatg tgctattgcc 600

cataaggatc tacrtctata ttgtttgggg tatagattta tatataacag ratcgtaccc 660

gataagtatc atcatttaga tattcgcatg ctttcaagcc tacaactcct rcataaggtg 720

gcagccaaag gatacttaga ttttatccta gaaaccttaa agtatgatca taataaagat 780

aatataaata ttattctaac acaagctgca acctataacc atagaaaaat tttaatctat 840

ttcattcctc aatcaaccca cgcacagata gaacaatgtt tactagtggc gataaaarca 900

aaatcttcca rgaaaacctt gaacttacta ctgtctcacc taaacctttc catcaayctc 960

atcaaaaaaa taagccatta tgttgccact tacaattcaa caaatataat aggcattctg 1020

agtatgcggc ggaaaaagaa gatatattta gatatcatat tgacaaaatt tgtaaaaaaa 1080

gctattttta ataartttgt cgttcgatgt atggatacat tttctataaa cccggaaaga 1140

atccttaaaa tagccgcgcg aataaatagg aygatgttag tgaaaaaaat atctgaacat 1200

gtttggaaaa atcatgcggt tagacttaaa taccttaaac atgcggtaca cacgatgaag 1260

cataaagatg ggaaaaatag actcatgaac tttatctatg atcgctgtta ttaccatatg 1320

caaggggaag aaatctttag cctcgcaaga ttttatgcaa tccatcatgc accaaagttg 1380

tttgacgttt tttatgattg ttgtatccta gatacgatac gattcaaaag ccttctttta 1440

gattgttcac atatcatagg taaaaacgct catgatgcta ccaatatcaa catcgtgaac 1500

aagtatatcg gcaacctgtt tgttatggga gttcttagca aaaaagaaat cttacaggac 1560

tatccatcca tytattctaa acawtacatg ccttag 1596

Claims (10)

1.一种检测非洲猪瘟病毒MGF-505-1R基因的PCR引物，其特征在于，选自以下两对引物中的任意一对：

引物1：由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成；

引物2：由SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的核苷酸序列组成。

2.如权利要求1所述的PCR引物，其特征在于，所述PCR引物由SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示的核苷酸序列组成。

3.一种检测非洲猪瘟病毒MGF-505-1R基因的试剂盒，其特征在于，包括：PCR混合液、酶混合液、阴性对照及阳性对照，所述PCR混合液包括引物，所述引物为如权利要求1所述的引物1或引物2。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR混合液，包括：TAKARA公司生产的10X TakaRa Ex Taq反应缓冲液、10mM dNTPs、一对浓度各为5μM的引物1或引物2、灭菌超纯水。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述10X TakaRa Ex Taq反应缓冲液、所述dNTPs、所述引物及所述灭菌超纯水的溶液体积比例为2.5:2.5:2.5:11.5。

6.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述酶混合液为浓度5U/μL的10X TakaRaEx Taq酶，所述TakaRa Ex Taq酶含UDG酶。

7.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为含引物1或引物2扩增片段的克隆质粒，所述克隆质粒为非洲猪瘟中国流行株Pig/CN/HLJ/2018；所述阴性对照为双蒸水。

8.一种检测非洲猪瘟病毒MGF-505-1R基因的方法，其特征在于，所述方法用于非疾病诊断用途，包括以下步骤：提取待测样本的DNA；以待测样本的DNA为模板，采用引物1作为PCR引物建立PCR反应体系进行PCR扩增；对扩增产物进行分析；如果扩增产物出现224bp的条带，说明待检测的样本中含有非洲猪瘟病毒。

9.如权利要求8所述的检测非洲猪瘟病毒MGF-505-1R基因的方法，其特征在于，所述PCR反应体系为：5μM的上下游引物各2.5μL，10X TakaRa Ex Taq反应缓冲液2.5μL，10mM的dNTPs 2.5μL，1mM的dUTPs 2.5μL，含UDG酶的10X TakaRa Ex Taq 2.5μL，灭菌超纯水5μL，样本核酸提取液5μL，总体积25μL。

10.如权利要求8所述的检测非洲猪瘟病毒MGF-505-1R基因的方法，其特征在于，所述PCR的反应程序为：UNG处理：50℃，2min；预变性：95℃，1min；40个循环扩增：95℃10s、58℃10s、72℃10s。

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