CN110791590A

CN110791590A - 非洲猪瘟病毒vp72和cd2v基因的双重实时荧光检测引物探针组、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN110791590A
Application number: CN201911098281.8A
Authority: CN
Inventors: 黄震巨; 李春燕; 李沛; 林晓; 滕丽琼
Original assignee: Nanning Zhongce Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Nanning zhuangbo Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2019-11-12
Filing date: 2019-11-12
Publication date: 2020-02-14
Anticipated expiration: 2039-11-12
Also published as: CN110791590B

Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，公开了一种非洲猪瘟病毒VP72基因及CD2V基因荧光检测引物探针组、试剂盒及方法。本发明的引物探针组针对VP72基因，正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1，反向引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，特异性荧光探针核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，针对CD2V基因，正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，特异性荧光探针核苷酸序列如SEQ ID No.12，其中，所述特异性荧光探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。本发明在一次扩增反应中同时检测两种基因，实现了对非洲猪瘟病毒的野毒株和CD2V基因缺失疫苗株进行简便、快捷、准确、特异性检测的目的。

Description

非洲猪瘟病毒VP72和CD2V基因的双重实时荧光检测引物探针组、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种非洲猪病病毒VP72和CD2V基因的双重实时荧光检测引物探针组、试剂盒及检测方法。

背景技术

非洲猪瘟(African Swine Fever,ASF)是一种高发病性、高死亡性的急性猪传染病，对猪和猪产品国际贸易产生巨大卫生和社会经济影响。ASF的流行病学非常复杂，可以经过许多途径传播，如饲料、运输、虫媒等等。该病的致病因子ASF病毒(ASFV)，是非洲猪瘟病毒科家族的唯一成员，属Asfivirus。它是一种复杂的包膜病毒，具有二十面体形态，由四个同心层和一个大的双链DNA分子组成，长度在170至193kbp之间。

疫苗接种是传染病的最佳控制措施之一。目前在非洲猪瘟疫苗的研究中主要集中在灭活疫苗、弱毒疫苗、病毒活载体疫苗、核酸疫苗等。灭活疫苗指运用物理或化学方法去除病原活性，感染能力丧失，但仍具有抗原性。到目前为止，运用多种传统方法制备的ASF灭活疫苗都不能对猪提供有效的免疫保护。弱毒疫苗以不同的毒株来源分为三种：天然致弱病毒株、传代致弱毒株以及重组致弱毒株。大量实验结果表明：天然弱毒株及传代弱毒株在生物安全方面仍存在问题。目前在我国研究者根据非洲猪瘟病毒在中国的流行株的基因型别，开发了一系列的重组弱毒株疫苗，通过生物技术方法，将ASFV中的某个或某几个基因进行敲出，制备出基因缺失疫苗，其中CD2V基因缺失疫苗是研究最多的一种基因缺失ASFV疫苗。

由于目前市场上使用CD2V缺失疫苗的研究数据还不充分，具体其的免疫效果仍待进一步的研究，在其疫苗使用过程中就需要对ASFV野毒株和CD2V基因缺失的疫苗株进行区分鉴定，对使用疫苗的有非洲猪瘟症状的猪群的感染源进行正确的鉴别。

发明内容

基于上述背景介绍，本发明的目的是提供一种非洲猪病病毒VP72和CD2V基因的双重实时荧光检测引物探针组、试剂盒及检测方法。

本发明利用双重实时荧光PCR方法，以非洲猪瘟病毒的VP72基因和CD2V基因作为靶基因，当检测结果显示VP72基因和CD2V基因同时是阳性时，说明被检测样本中含有非洲猪瘟野毒株；单检测结果显示VP72基因为阳性而CD2V基因为阴性时，说明检测样本中为非洲猪瘟CD2V基因缺失的疫苗株；当VP72基因和CD2V基因都为阴性时，说明检测样本中不含非洲猪瘟病毒。优化设计引物、探针和反应条件，使得在一次扩增反应中同时检测两种基因，对非洲猪瘟病毒的野毒株和CD2V基因缺失疫苗株进行特异性检测，达到简便、快捷、准确可靠和安全的目的，防止假阳性结果。

作为本发明的第一方面，本发明提供一种非洲猪病病毒VP72和CD2V基因的双重实时荧光检测引物探针组。

作为优选，所述引物探针组中，针对VP72基因，正向引物核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，特异性荧光探针核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；针对CD2V基因，正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，特异性荧光探针核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，其中，所述特异性荧光探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

作为优选，所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一种，荧光淬灭基因选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种。

作为本发明的第二方面，本发明提供一种非洲猪病病毒VP72和CD2V基因的双重实时荧光检测试剂盒。

作为优选，所述试剂盒包括针对非洲猪病病毒VP72基因和CD2V基因的实时荧光PCR检测引物探针组，其中，针对VP72基因，正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，特异性荧光探针核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；针对CD2V基因，正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，反向引物核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示，特异性荧光探针核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，其中，所述特异性荧光探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

作为优选，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品。

作为优选，所述阳性对照品为含有非洲猪瘟病毒VP72基因保守区序列的阳性质粒和含有非洲猪瘟病毒CD2V基因保守区序列的阳性质粒的混合质粒，其中，所述含有非洲猪瘟病毒VP72基因保守区序列的阳性质粒的碱基序列如SEQ ID NO.13所示，所述含有非洲猪瘟病毒CD2V基因保守区序列的阳性质粒的碱基序列如SEQ ID NO.14所示。

作为优选，所述阴性对照品为ddH₂O。

作为优选，所述试剂盒还包括PCR缓冲液、PCR底物、MgCl₂、DNA聚合酶和/或水解酶。

作为本发明的第三方面，本发明提供一种非洲猪病病毒VP72和CD2V基因的双重实时荧光检测方法。

作为优选，所述检测方法包括如下步骤：提取待测样本的DNA，以待测样本的DNA为模板，采用本发明所述的试剂盒进行实时荧光PCR反应，根据实时荧光PCR扩增曲线分析待测样本，确定待测样本存在的是非洲猪病病毒野毒株还是CD2V基因缺失疫苗株。

具体如下：提取待测样品的DNA，以待测样品的DNA为模板，在非洲猪瘟病毒VP72基因及CD2V基因的正向引物、反向引物、特异性荧光探针及PCR Mix存在下进行实时荧光PCR反应，根据实时荧光PCR扩增曲线分析待测样品；针对VP72基因，正向引物核苷酸序列如SEQID NO.1所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，特异性荧光探针核苷酸序列如SEQID NO.3所示；针对CD2V基因，正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，特异性荧光探针核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，其中，所述特异性荧光探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。。

作为优选，所述实时荧光PCR反应程序为：50℃，1min；95℃，5min；95℃，15s，60℃，30s，共计45个循环。

本发明所述检测方法需要实时荧光PCR反应结束后，利用实时荧光PCR仪分析软件，根据实时荧光PCR的扩增曲线分析待测样品。优选的，所述分析待测样品结果判定标准如下：

作为本发明的第四方面，本发明提供了本发明所述的引物探针组、试剂盒在用于检测非洲猪瘟病毒VP72基因和CD2V基因中的应用。

本发明的有益效果为：

(1)快速高效：只需一次实时荧光PCR反应即可同时检测两个基因；

(2)高特异性：本发明与非猪猪瘟病毒VP72及CD2V基因以外的基因、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)、猪蓝耳病病毒(PPRSV)等均无交叉反应；

(3)高灵敏度：检测灵敏度可达到10copies/μL；

(4)鉴定简单：根据实时荧光数据，直接判断扩增结果，无需电泳检测，避免核酸扩增产物开盖污染的风险。

附图说明

图1(A)为本发明的一个实施例中采用VP72-1引物组和CD2V-1引物组进行PCR扩增的曲线图。

图1(B)为本发明的一个实施例中采用VP72-1引物组和CD2V-2引物组进行PCR扩增的曲线图。

图1(C)为本发明的一个实施例中采用VP72-2引物组和CD2V-1引物组进行PCR扩增的曲线图。

图1(D)为本发明的一个实施例中采用VP72-2引物组和CD2V-2引物组进行PCR扩增的曲线图。

图2(A)为FAM通道荧光曲线图，从左到右依次为10⁴copies/μL、10³copies/μL、10²copies/μL、10¹copies/μL、10⁰copies/μL5个的阳性质粒的扩增结果。

图2(B)为VIC通道荧光曲线图，从左到右依次为10⁴copies/μL、10³copies/μL、10²copies/μL、10¹copies/μL、10⁰copies/μL5个的阳性质粒的扩增结果。

图3(A)为本发明检测方法对ASFV野毒株的特异性实验图。

图3(B)为本发明检测方法对ASFV CD2V基因缺失疫苗株的特异性实验图。

图3(C)为本发明检测方法对其他病毒的特异性实验图。

具体实施方式

下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

在本发明中，若无特别指明，实施例中采用的方法为本领域通用技术，所有的设备和原料等均为本行业常用产品，可从市场中购得。

实施例1：非洲猪瘟病毒VP72基因和CD2V基因的荧光PCR检测引物探针组的设计

本实施例参考GenBank上已公布的非洲猪瘟病毒VP72基因及CD2V基因序列，使用DNAMAN 6.0软件对多序列进行比对，分别选择该两个基因中特异性高、较为保守的片段作为目的基因。大量实验表明，不同的引物对PCR扩增的效果和灵敏度具有一定的影响。因此，本实施例中针对VP72和CD2V目的基因片段分别设计了2组引物探针：VP72-1、VP72-2、CD2V-1、CD2V-2(引物序列如表1所示)，其中VP72-1和VP72-2序列可以和非洲猪瘟病毒VP72基因的相应序列特异性结合，CD2V-1、CD2V-2序列可和非洲猪瘟病毒CD2V基因的相应序列特异性结合。其中，上述四组引物扩增目的片段的大小分别为137bp、146bp、144bp和106bp。

表1 VP72-1、VP72-2、CD2V-1和CD3V-2序列信息

分别将VP72基因的2组引物探针与CD2V基因的2组引物探针两两配对，在一管反应体系中分别加入一对VP72基因的上、下游引物及相对应的荧光探针和CD2V基因的上、下游引物及相对应的荧光探针，两种基因的上、下游引物在反应体系中的终浓度皆为400nmol/L，两种基因的荧光探针在反应体系中的终浓度皆为100nmol/L，用VP72基因及CD2V基因混合阳性质粒行引物探针筛选，其中，VP72-1引物探针与CD2V-1引物探针配对组的扩增曲线如图1(A)所示，VP72-1引物探针与CD2V-2引物探针配对组的扩增曲线如图1(B)所示，VP72-2引物探针与CD2V-1引物探针配对组的扩增曲线如图1(C)所示，VP72-2引物探针与CD2V-2引物探针配对组的扩增曲线如图1(D)所示；在实验过程中，FAM通道用于检测VP72基因，VIC通道用于检测CD2V基因。

由图1结果可见，VP72-1引物探针与CD2V-2引物探针配对后，对于VP72基因和CD2V基因两者的扩增曲线均最优，出峰最早，荧光强度最高(纵坐标值)并且有明显的指数期和平台期，说明两对引物探针之间在扩增过程中相互干扰最小(图1(B))。而其它引物探针曲线上升峰高较低，出峰时间较晚，相对表现较差。说明VP72-1引物探针与CD2V-2引物探针配对组扩增反应效率更高。

其中，VP72-1引物探针的正向引物核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，反向引物核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，特异性荧光探针核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，其特异性荧光探针的5′端标记有FAM荧光报告基团，3′端标记有BHQ1荧光淬灭基团；CD2V-2引物探针的正向引物核苷酸序列如SEQIDNo.10所示，反向引物核苷酸序列如SEQIDNo.11所示，特异性荧光探针核苷酸序列如SEQ ID No.12所示，其特异性荧光探针的5′端标记有VIC荧光报告基团，3′端标记有BHQ1荧光淬灭基团。

实施例2：非洲猪瘟病毒VP72基因及CD2V基因的荧光PCR检测试剂盒及检测方法

本实施例提供一种非洲猪瘟病毒VP72和CD2V基因的双重实时荧光PCR检测试剂盒，包括PCR反应混合液、阳性对照品和阴性对照品。

PCR反应混合液的成分及各成分的反应终浓度如下：1*PCR Buffer、1mmol/LdNTP、2.5mmol/L MgCl₂、400nmol/L引物混合液、100nmol/L探针混合液、3U DNA聚合酶、0.5U UNG酶。

本实施例所述的引物混合液中，对于VP72基因，正向引物核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，对于CD2V基因，正向引物核苷酸序列如SEQ ID No.10所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，其中，两种正向引物的含量相等，两种反向引物的含量相等，正向引物和反向引物的摩尔配比为1:1。

本实施例提供的探针混合液中，非洲猪瘟病毒VP72基因的特异性探针碱基序列如SEQ ID No.3所示，CD2V基因的特异性探针碱基序列如SEQ ID No.12所示，VP72基因特异性荧光探针的5′端标记有FAM荧光报告基团，3′端标记有BHQ1荧光淬灭基团；CD2V基因特异性荧光探针的5′端标记有VIC荧光报告基团，3′端标记有BHQ1荧光淬灭基团，其中，两种特异性荧光探针的摩尔配比为1:1。

本实施例提供的阳性对照品为含有非洲猪瘟病毒VP72基因保守区序列的阳性质粒和含有CD2V基因保守区序列的阳性质粒的混合质粒，阴性对照品ddH₂O。

含VP72基因保守区序列的阳性质粒的碱基序列如下：

CGACTGGCGTATAAAAAGTCCAGGAAATTCATTCACCAAATCCTTTTGCGATGCAAGCTTTATGGTGATAAAGCGCTCGCCGAAGGGAATGGATACCGAGGGAATAGCAAGGTTCACGTTCTCGTTAAACCAAAAGCGCAGCTTAATCCAGAGCGCAAGAGGGGGCTGATAGTATTTAGGGGTTTGAGGTCCATTACAGCTGTAATGAACATTACGTCTTATGTCCAGATACGTTGCGTCCGTAATAGGAGTAATATCTTGTTTACCTGCTGTTTGGATATTGTGAGAGTTCTCGGGAAAATGTTGTGAAAGGAATTTCGGGTTGGTATGGCTGCACGTTCGCTGCGTATCATTTTCATCGGTAAGAATAGGTTTGCTTTGGTGCGGCTTGTGCAAATCATGAATGTTGCATAGGAGAGGGCCACTAGTTCCCTCCACCGATACCTCCTGGCCGACCAAGTGCTTATATCCAGTCATTTTATCCCCTGGGATGCAAAATTTGCGCACAAGCGTTGTGACATCCGAACTATATTCGTCCAGGGAATTTCCATTTACATCGAATCTTACGTTTTCATAAAGTCGTTCTCCGGGGTATTCGCAGTAGTAAACCAAGTTTCGGTACGCATTCTTTGTGCCGGGTACAATAGGTCTTCC(SEQ ID No.13)。

含CD2V基因保守区序列的阳性质粒的碱基序列如下：

ATGATAATACTTATTTTTTTAATATTTTCTAACATAGTTTTAAGTATTGATTATTGGGTTAGTTTTAATAAAACAATAATTTTAGATAGTAATATTACTAATGATAATAATGATATAAATGGAGTATCATGGAATTTTTTTAATAATTCTTTTAATACACTAGCTACATGTGGAAAAGCAGGTAACTTTTGTGAATGTTCTAATTATAGTACATCAATATATAATATAACAAATAATTGTAGCTTAACTATTTTTCCTCATAATGATGTATTTGATACAACATATCAAGTAGTATGGAATCAAATAATTAATTATACAATAAAATTATTAACACCTGCTACTCCCCCAAATATCACATATAATTGTACTAATTTTTTAATAACATGTAAAAAAAATAATGGAACAAACACTAATATATATTTAAATATAAATGATACTTTTGTTAAATATACTAATGAAAGTATACTTGAATATAACTGGAATAATAGTAACATTAACAATTTTACAGCTACATGTATAATTAATAATACAATTAGTACATCTAATGAAACAACACTTATAAATTGTACTTATTTAACATTGTCATCTAACTATTTTTATACTTTTTTTAAATTATATTATATTCCATTAAGCATCATAATTGGGATAACAATAAGTATTCTTCTTATATCCATCATAACTTTTTTATCTTTACGAAAAAGAAAAAAACATGTTGAAGAAATAGAAAGTCCACCACCTGAATCTAATGAAGAAGAACAATGTCAGCATGATGACACCACTTCCATACATGAACCATCTCCCAGAGAACCATTACTTCCTAAGCCTTACAGTCGTTATCAGTATAATACACCTATTTACTACATGCGTCCCTCAACACAACCACTCAACCCATTTCCCTTACCTAAACCGTGTCCTCCACCCAAACCATGTCCGCCACCCAAACCATGTCCTCCACCTAAACCATGTCCTTCAGCTGAATCCTATTCTCCACCCAAACCACTACCTAGTATCCCGCTACTACCCAATATCCCGCCATTATCTACCCAAAATATTTCGCTTATTCATGTAGATAGAATTATTTAA(SEQ ID No.14)。

应用本实施例的试剂盒对样本中的非洲猪瘟病毒VP72基因及CD2V基因的检测：

1、样品核酸的提取

1.1、核酸提取：采用天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)，按照说明步骤提取待测样本基因组DNA。

2、PCR反应体系的配置：每个检测样品对应一个PCR反应管，每个PCR反应管中各反应组分和所加入的体积如表2所示。

表2反应体系配置表:

PCR反应体系组分	体积(μL)
		PCR反应混合液	45
DNA模板	5
		总体积	50

进一步地，本发明建立的方法中为了避免所用试剂失效或受到污染，设置有阳性对照品及阴性对照品，其中，阴性对照品为ddH₂O，阳性对照品为含VP72基因保守区序列的阳性质粒和含非洲猪瘟病毒CD2V基因保守区序列的阳性质粒的混合质粒，其中，含VP72基因保守区序列的阳性质粒的碱基序列如SEQ ID No.13所示，含非洲猪瘟病毒CD2V基因保守区序列的阳性质粒的碱基序列如SEQ ID No.14所示，混合质粒中两种阳性质粒的摩尔配比为1:1。阴性对照的设计能有效验证所用试剂是否受到污染，避免假阳性发生，阳性对照的设计能有效验证受用试剂的有效性，避免假阴性的发生。

3、将配置好反应体系的PCR反应管放置于ABI7500扩增仪中，按照下列程序进行PCR扩增：50℃，1min；95℃，5min；95℃15s，60℃30s(荧光采集)，共计45个循环。每个循环收集FAM和VIC通道的荧光，其中，FAM通道用于检测VP72基因，VIC通道用于检测CD2V基因。

4、扩增结束后根据荧光曲线判断和CT值判定待检样本结果。

实施例3：应用本发明的试剂盒进行实际样本检测

为验证本发明所述引物、探针、试剂在实际情况下能正常使用，于是模拟实际情况，使用本发明的引物、探针、试剂对实际样本进行检测。实际样本共12份，其中4份为ASFV野毒株阳性猪血清、4份为CD2V基因缺失疫苗株阳性猪血清、4份为正常猪(野毒株和疫苗株均阴性)血清。检测结果与已知PCR检测结果一致，符合率100％。

本发明具有快速、实时、灵敏、准确、的鉴别ASFV野毒株和疫苗株的优点。

实施例4：本发明的试剂盒灵敏度试验

提取ASFV VP72基因和CD2V基因阳性质粒，并用NanoDrop测量阳性质粒的浓度，并分别按比例稀释到相同的浓度后等比例混合，然后再将混合质粒稀释到10⁴copies/μL、10³copies/μL、10²copies/μL、10¹copies/μL、10⁰copies/μL 5个浓度梯度进行灵敏度试验。

检测结果如图2(A)和图2(B)所示，从左到右依次为10⁴copies/μL、10³copies/μL、10²copies/μL、10¹copies/μL、10⁰copies/μL的扩增结果，从中可以看出本发明的荧光PCR扩增试剂的检测灵敏度可达10¹copies/μL，表明本发明的荧光PCR检测试剂盒和检测方法对ASFV野毒株和CD2V基因缺失疫苗株的鉴别诊断具有高度的灵敏性。

实施例5：本发明的试剂盒的特异性试验

为了检测本发明试剂盒的特异性，分别对ASFV野毒株样本、对ASFV CD2V基因缺失疫苗株样本及其他病毒样本进行检测，分析本试剂盒对非洲猪瘟病毒和近源病毒的检测情况。

检测结果如图3(A)至图3(C)所示，仅非洲猪瘟病毒样品出现正常扩增，阴性对照品(ddH₂O)及猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)、猪蓝耳病病毒(PPRSV)样品均未出现扩增。上述结果说明，本发明荧光PCR检测试剂盒能特异性扩增出ASFV中的靶序列，而不与其他病毒核酸发生交叉反应。说明本发明方法及试剂盒特异性好，未出现假阴性。

在缺少本文中所具体公开的任何元件、限制的情况下，可以实现本文所示和所述的发明。所采用的术语和表达法被用作说明的术语而非限制，并且不希望在这些术语和表达法的使用中排除所示和所述的特征或其部分的任何等同物，而且应该认识到各种改型在本发明的范围内都是可行的。因此应该理解，尽管通过各种实施例和可选的特征具体公开了本发明，但是本文所述的概念的修改和变型可以被本领域普通技术人员所采用，并且认为这些修改和变型落入所附权利要求书限定的本发明的范围之内。

本文中所述或记载的文章、专利、专利申请以及所有其他文献和以电子方式可得的信息的内容在某种程度上全文包括在此以作参考，就如同每个单独的出版物被具体和单独指出以作参考一样。申请人保留把来自任何这种文章、专利、专利申请或其他文献的任何及所有材料和信息结合入本申请中的权利。

序列表

<110> 南宁众册生物科技有限公司

<120> 非洲猪瘟病毒VP72和CD2V基因的双重实时荧光检测引物探针组、试剂盒及方法

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ataaagcgct cgccgaaggg a 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tacagctgta atggacctca a 21

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ataccgaggg aatagcaagg ttcacgtt 28

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aagaataggt ttgctttggt 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttgtgcgcaa attttgcatc 20

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttgtgcaaat catgaatgtt gcatagg 27

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atacaacata tcaagtagta tg 22

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atatattagt gtttgttcca t 21

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aataaaatta ttaacacctg ctactcc 27

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

catgttgaag aaatagaaag 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gtaatggttc tctgggagat 20

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atctaatgaa gaagaacaat gtcagca 27

<210> 13

<211> 654

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cgactggcgt ataaaaagtc caggaaattc attcaccaaa tccttttgcg atgcaagctt 60

tatggtgata aagcgctcgc cgaagggaat ggataccgag ggaatagcaa ggttcacgtt 120

ctcgttaaac caaaagcgca gcttaatcca gagcgcaaga gggggctgat agtatttagg 180

ggtttgaggt ccattacagc tgtaatgaac attacgtctt atgtccagat acgttgcgtc 240

cgtaatagga gtaatatctt gtttacctgc tgtttggata ttgtgagagt tctcgggaaa 300

atgttgtgaa aggaatttcg ggttggtatg gctgcacgtt cgctgcgtat cattttcatc 360

ggtaagaata ggtttgcttt ggtgcggctt gtgcaaatca tgaatgttgc ataggagagg 420

gccactagtt ccctccaccg atacctcctg gccgaccaag tgcttatatc cagtcatttt 480

atcccctggg atgcaaaatt tgcgcacaag cgttgtgaca tccgaactat attcgtccag 540

ggaatttcca tttacatcga atcttacgtt ttcataaagt cgttctccgg ggtattcgca 600

gtagtaaacc aagtttcggt acgcattctt tgtgccgggt acaataggtc ttcc 654

<210> 14

<211> 1083

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atgataatac ttattttttt aatattttct aacatagttt taagtattga ttattgggtt 60

agttttaata aaacaataat tttagatagt aatattacta atgataataa tgatataaat 120

ggagtatcat ggaatttttt taataattct tttaatacac tagctacatg tggaaaagca 180

ggtaactttt gtgaatgttc taattatagt acatcaatat ataatataac aaataattgt 240

agcttaacta tttttcctca taatgatgta tttgatacaa catatcaagt agtatggaat 300

caaataatta attatacaat aaaattatta acacctgcta ctcccccaaa tatcacatat 360

aattgtacta attttttaat aacatgtaaa aaaaataatg gaacaaacac taatatatat 420

ttaaatataa atgatacttt tgttaaatat actaatgaaa gtatacttga atataactgg 480

aataatagta acattaacaa ttttacagct acatgtataa ttaataatac aattagtaca 540

tctaatgaaa caacacttat aaattgtact tatttaacat tgtcatctaa ctatttttat 600

acttttttta aattatatta tattccatta agcatcataa ttgggataac aataagtatt 660

cttcttatat ccatcataac ttttttatct ttacgaaaaa gaaaaaaaca tgttgaagaa 720

atagaaagtc caccacctga atctaatgaa gaagaacaat gtcagcatga tgacaccact 780

tccatacatg aaccatctcc cagagaacca ttacttccta agccttacag tcgttatcag 840

tataatacac ctatttacta catgcgtccc tcaacacaac cactcaaccc atttccctta 900

cctaaaccgt gtcctccacc caaaccatgt ccgccaccca aaccatgtcc tccacctaaa 960

ccatgtcctt cagctgaatc ctattctcca cccaaaccac tacctagtat cccgctacta 1020

cccaatatcc cgccattatc tacccaaaat atttcgctta ttcatgtaga tagaattatt 1080

taa 1083

Claims

1.一种非洲猪瘟病毒VP72和CD2V基因的双重实时荧光检测引物探针组，其特征在于，针对VP72基因，正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1，反向引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，特异性荧光探针核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，针对CD2V基因，正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，特异性荧光探针核苷酸序列如SEQ ID No.12，其中，所述特异性荧光探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一种，荧光淬灭基因选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种。

3.一种非洲猪瘟病毒VP72和CD2V基因的双重实时荧光检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物探针组。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为含有非洲猪瘟病毒VP72基因保守区序列的阳性质粒和含有非洲猪瘟病毒CD2V基因保守区序列的阳性质粒的混合质粒，其中，所述含有非洲猪瘟病毒VP72基因保守区序列的阳性质粒的碱基序列如SEQID NO.13所示，所述含有非洲猪瘟病毒CD2V基因保守区序列的阳性质粒的碱基序列如SEQID NO.14所示。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照品为ddH₂O。

7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR缓冲液、PCR底物、MgCl₂、DNA聚合酶和/或水解酶。

8.一种非洲猪瘟病毒VP72和CD2V基因的双重实时荧光检测方法，其特征在于，包括如下步骤：提取待测样本的DNA，以待测样本的DNA为模板，采用如权利要求3～7任一项所述的试剂盒进行实时荧光PCR反应，根据实时荧光PCR扩增曲线分析待测样本，确定待测样本中存在的是非洲猪病病毒野毒株还是CD2V基因缺失疫苗株。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述实时荧光PCR反应程序为：50℃，1min；95℃，5min；95℃，15s，60℃，30s，共计45个循环。

10.如权利要求1或2所述的引物探针组，或权利要求3～7任一项所述的试剂盒在用于检测非洲猪瘟病毒VP72基因和CD2V基因中的应用。