CN104975077A - 猪源附红细胞体荧光定量pcr检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种猪源附红细胞体荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒包括：针对SEQ ID NO:1所示猪附红细胞体a1基因序列设计的TaqMan探针；针对SEQ ID NO:1所示猪附红细胞体a1基因序列设计的引物对。本发明基于a1基因的猪源附红细胞体荧光定量PCR检测试剂盒，具有特异性强、灵敏性高、重复性好的特点，可快速、准确、高通量地检测出猪血样品中是否存在附红细胞体，可应用于猪的附红细胞体病的临床诊断、分子流行病学调查、疗效评估和猪场净化等方面，对于猪的附红细胞体病的早期快速诊断、防控和净化具有重要意义。

Description

猪源附红细胞体荧光定量PCR检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于动物血液中支原体感染检测技术领域，具体涉及一种猪源附红细胞体荧光定量PCR检测试剂盒及其应用。

背景技术

猪源附红细胞体属于不能体外培养的嗜血支原体家族中的成员，一般寄生在猪红细胞的表面、血浆和骨髓。猪源附红细胞体感染在全世界广泛分布，给养猪业带来严重的经济损失。其急性感染可导致严重的菌血症、急性红细胞溶血，有时可导致年轻仔猪死亡、怀孕母猪流产等。对于慢性感染的猪只，血液中细菌含量低，临床症状多变，比如可能出现温和的黄疸、亚健康、生长速度缓慢、生产能力低下或对其他的感染性疾病易感。在强烈的免疫作用和抗生素治疗之下，猪源附红细胞体依旧可以在宿主体内建立慢性和持续性的感染。猪感染附红细胞体后，极有可能在症状消失后转化为慢性感染。目前发现感染猪的附红细胞体（即猪源附红细胞体）有两种，包括猪附红细胞体（Mycoplasma suis）和小附红细胞体（M.parvum）。由于依靠16S rRNA基因及Rnase P RNA序列的分子鉴定方法才出现不久，对小附红细胞体的研究尚不充分。

目前应用于猪附红细胞体病的检测方法有多种，包括镜检、血清学检测、PCR等。而临床上该病的诊断最初主要以镜检为主，包括鲜血压片和涂片染色镜检。由于附红细胞体主要寄生在红细胞表面和血浆中，常导致红细胞变形。但红细胞的变形可以由多种因素引起，如涂片技术、渗透压的改变等，因此许多人容易将变形红细胞错误判断为附红细胞体感染，从而导致误诊，因此直接涂片和悬滴法不宜作为确诊方法，只能视为疑似病例。检测慢性感染的最有效方法是接种脾切除的动物,观察其是否发病，但该方法费时、费力，也不适合常规检测。

血清学方法包括采用间接血凝试验（Indirect Hemagglutination Assay，IHA）、补体结合试验（complement fixation test，CFT）或酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测抗体等，其中ELISA方法的敏感性很高，取得了不错进展。但由于猪附红细胞体至今不能进行体外培养，抗原及抗体的获得难度较大，限制了血清学诊断方法的发展和使用，至今该类方法尚未能真正在临床上得到应用（Hoelzle et al.，2006）。

近几年虽然用PCR方法诊断猪附红细胞体病的报道屡见不鲜，但常用于种型鉴定的基于16S rRNA基因的PCR技术非特异性扩增十分严重，同时需要进行电泳分离及染色处理，且不能准确定量，故使其应用受到限制。1995年，美国TPeTrkinElmer公司研制成功具有革命性意义的荧光定量PCR技术，它在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定时分析，可以利用质粒标准品作为模板直接计算样品DNA中的附红细胞体的拷贝数。荧光定量PCR具体包括2大类，即探针类和染料类方法。相比SYBR GreenⅠ等染料类定量方法，探针类方法因为利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，具有更高的特异性。其主要代表是TaqMan探针法。目前基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR（TaqMan real-time PCR）检测猪源附红细胞体的方法报道的还很少，2008年闫若潜、吴志明等人根据GenBank中猪附红细胞体推测的功能性基因ORF2序列设计引物和TaqMan探针，建立了猪附红细胞体的TaqMan荧光定量PCR检测方法。但由于该基因很难进行后续PCR扩增、种型鉴定及蛋白表达，所以没有得到广泛应用。2013年，曹薇等人建立了基于猪附红细胞体g1基因的TaqMan实时荧光定量PCR，用于800多份田间样品的检测，并与普通PCR结果相比较，证明其具有良好的特异性、敏感性及重复性。但是，其特异性和敏感性可能还有待进一步提高。

猪附红细胞体DnaK样蛋白热休克蛋白A1（heat shock proteins A1，HspA1）定位在猪附红细胞体胞浆及胞膜上，具有表面可接触性、ATP酶（ATPase）活性及抗原性，可能参与对宿主红细胞的黏附，该HspA1蛋白的编码基因被命名为猪附红细胞体a1基因。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种基于a1基因的猪源附红细胞体荧光定量PCR检测试剂盒，由于a1基因具有比g1基因更稳定、更保守的遗传特性，本发明基于a1基因的猪源附红细胞体检测试剂盒比之前基于g1基因的检测试剂盒特异性更强、灵敏性更高，可快速、准确地检测出猪血样品中是否存在附红细胞体。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

在本发明的一个方面，提供了一种猪源附红细胞体荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒包括：

针对SEQ ID NO:1所示猪附红细胞体a1基因序列设计的TaqMan探针，该探针与所述猪附红细胞体a1基因序列第45～191位、第360～532位、第534～631位、第684～811位、第1038～1141位、第1143～1234位、第1236～1363位、或第1371～1462位的核苷酸序列特异性结合；

针对SEQ ID NO:1所示猪附红细胞体a1基因序列设计的引物对，该引物对用于扩增所述猪附红细胞体a1基因序列第45～191位、第360～532位、第534～631位、第684～811位、第1038～1141位、第1143～1234位、第1236～1363位、或第1371～1462位的核苷酸序列。

优选的，所述探针与SEQ ID NO:1序列第360～532位的核苷酸序列特异性结合；所述引物对用于扩增SEQ ID NO:1序列第360～532位的核苷酸序列。

更优选的，所述探针与SEQ ID NO:1序列第360～484位的核苷酸序列特异性结合；所述引物对用于扩增SEQ ID NO:1序列第360～484位的核苷酸序列。

在本发明的一个优选实施例中，所述探针的序列如SEQ ID NO:6所示；所述引物对的序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。

所述试剂盒还包括：含有猪附红细胞体a1基因的阳性重组质粒标准品。优选的，该阳性重组质粒是将长度为1657bp的猪附红细胞体a1基因插入pMD18-T载体而制得。

所述试剂盒还包括：荧光定量PCR反应缓冲液及聚合酶。

所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有淬灭基团。

在本发明的另一方面，还提供了上述猪源附红细胞体荧光定量PCR检测试剂盒在制备诊断猪的附红细胞体病的产品中的应用。

本发明基于a1基因的猪源附红细胞体荧光定量PCR检测试剂盒，具有特异性强、灵敏性高、重复性好的特点，可快速、准确、高通量地检测出猪血样品中是否存在附红细胞体，可应用于猪的附红细胞体病的临床诊断、分子流行病学调查、疗效评估和猪场净化等方面，对于猪的附红细胞体病的早期快速诊断、防控和净化具有重要意义。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例1的猪附红细胞体a1基因的PCR扩增电泳图；

图2是本发明实施例1的重组质粒pMD18-T-a1的双酶切鉴定电泳图；

图3是本发明实施例1的不同分离株猪附红细胞体a1基因核苷酸序列的比对分析图；

图4是本发明实施例2猪附红细胞体a1基因重组质粒pMD18-T-a1梯度稀释扩增曲线(图4A)及建立的标准曲线(图4B)图；

图5是本发明实施例4猪附红细胞体a1基因的实时荧光定量PCR特异性实验扩增曲线图；

图6是本发明实施例5重组质粒pMD18-T-a1的TaqMan实时荧光定量PCR重复性实验扩增曲线图；

图7是本发明实施例6猪附红细胞体a1基因TaqMan实时荧光定量PCR扩增产物电泳图；

图8是本发明实施例6小附红细胞体阳性样品的TaqMan实时荧光定量PCR扩增曲线图。具体实施方式

下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》（萨姆布鲁克J，拉塞尔D W，著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译.分子克隆实验指南，第3版，北京：科学出版社，2002）中所述的方法进行。

本发明在前期实验中对41条猪附红细胞体a1基因进行序列分析和比对，发现a1基因具有比g1基因更稳定、更保守的遗传特性，可能更加适合用于猪源附红细胞体的分子检测。基于此，本发明研制了基于猪附红细胞体a1基因的检测猪源附红细胞体的TaqMan实时荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒能更加特异、敏感及可重复地检测猪源附红细胞体，对于现场猪附红细胞体病的诊断和防控具有重要意义。

本发明的猪源附红细胞体荧光定量PCR检测试剂盒，包括：

针对SEQ ID NO:1所示猪附红细胞体a1基因序列设计的TaqMan探针，该探针与所述猪附红细胞体a1基因序列第45～191位、第360～532位、第534～631位、第684～811位、第1038～1141位、第1143～1234位、第1236～1363位、或第1371～1462位的核苷酸序列特异性结合；

针对SEQ ID NO:1所示猪附红细胞体a1基因序列设计的引物对，该引物对用于扩增所述猪附红细胞体a1基因序列第45～191位、第360～532位、第534～631位、第684～811位、第1038～1141位、第1143～1234位、第1236～1363位、或第1371～1462位的核苷酸序列。

实施例1猪源附红细胞体a1基因的扩增和序列分析比对

1.猪附红细胞体感染阳性血液

从上海长宁、嘉定、松江区某屠宰场分别采集猪新鲜血液,提前于采样管中加入抗凝剂柠檬酸三钠（浓度为1.32%），血液与抗凝剂比例为1:10。血液带回实验室，经基于g1基因的TaqMan Real-time PCR技术检测为猪源附红细胞体阳性者用于试验。

2.猪血基因组DNA的提取

2.1血液处理

将41份经基于g1基因的TaqMan real-time PCR技术检测为猪附红细胞体阳性的抗凝血以3000r/min离心10min，倒掉上层的溶液后，小心吸取中间红细胞（约500μL），放入灭菌后的2mL离心管中，立即进行血液基因组DNA的提取，或放于-20℃保存备用。

2.2提血液基因组DNA的提取

按照上海赛百盛基因技术有限公司生产的全血基因组DNA提取试剂盒说明书，提取血液基因组DNA。

3.猪附红细胞体a1基因的扩增和序列分析比对

3.1猪附红细胞体a1基因引物的设计

根据GenBank中登录的猪附红细胞体德国54/96分离株a1基因序列（登录号AM265536），应用Primer Premier5.0软件设计一对引物，上游引物:5’-CAACTAACTCCTGTGTAGCTGTAAT-3’(SEQ ID NO：2),位于a1基因核苷酸序列的第44-68位；下游引物：5’-TCTTTTAGTTGATTCATCTTAGCCT-3’(SEQ ID NO：3)，位于该基因核苷酸序列的第1676-1700位。引物由上海英骏生物技术有限公司合成，预计扩增片段长度为1657bp。

3.2猪附红细胞体a1基因的PCR扩增

以经检测为猪附红细胞感染阳性的猪血液基因组DNA为模板进行扩增，PCR反应体系为：10×PCR buffer2.5μL，上、下游引物（100μmol/L）各0.2μL，2.5mmol/L dNTP4μL，模板DNA1.0μL，Ex Taq酶（5U/μL）0.25μL，加灭菌ddH₂O至25μL。PCR扩增条件为：95℃预变性5min；94℃变性45s，55℃退火60s，72℃延伸90s，37个循环；72℃延伸8min。PCR反应结束后，取5μL PCR扩增产物，加1μL6×loading buffer，混合均匀后上样，150V恒压电泳20min。电泳结束后取出凝胶，于成像系统Image Quant300（美国GE公司）中观察结果。

结果如图1所示，对阳性猪附红细胞体全血基因组DNA进行a1基因的PCR扩增，获得了大小约为1660bp的扩增条带，与预期结果相符。图1中，M：DNA分子量标准DL2000；1～7：猪附红细胞体a1基因PCR扩增产物；P：阳性对照；N：阴性对照。

3.3PCR产物的纯化回收

利用Axygen DNA胶回收试剂盒，对PCR产物进行纯化回收，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。

3.4目的基因的克隆

将胶回收产物与载体pMD18-T连接，将连接产物转入Trans1-T1Phage Resistant化学感受态细胞中。

3.5重组质粒pMD18-T-a1的鉴定和序列测定

3.5.1重组质粒pMD18-T-a1的菌液PCR鉴定

根据蓝白斑筛选原理，挑取3个形状规则圆整的单个白色菌落，分别接种到5mL LB液体培养基中（含0.1%氨苄青霉素），37℃200r/min培养10h～12h后进行菌液PCR鉴定。反应体系为：2×Taq PCR MasterMix10μL，上、下游引物（100μmol/L）各0.2μL，菌液模板DNA2.0μL，加灭菌ddH₂O至20μL。PCR扩增条件为：95℃预变性5min；94℃变性45s，55℃退火60s，72℃延伸90s，37个循环；72℃延伸8min。PCR反应结束后，取5μL PCR扩增产物加1μL6×loading buffer，混合均匀后上样，150V恒压电泳。电泳结束后取出凝胶，于成像系统Image Quant300（美国GE公司）中观察结果。

3.5.2重组质粒pMD18-T-a1的酶切鉴定

将经菌液PCR鉴定正确的重组质粒转化菌用T天根T生化科技(T北京T)有限公司质粒小提试剂盒进行质粒提取。将小量提取后的质粒用内切酶BamHⅠ及HindⅢ双酶切，酶切体系如下：ddH₂O6.0μL，10×FD buffer2.0μL，BamHⅠ和HindⅢ各1.0μL，重组质粒10μL，总体积20μL。将上述混合液置于37℃酶切反应1h，吸取5μL酶切产物，加入1μL6×loading buffer，进行琼脂糖凝胶电泳检测。

结果如图2所示，重组质粒pMD18-T-a1经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，出现大小约为2692bp和1660bp两条带，与预测结果相符。图2中，M1：.DL2000DNA分子质量标准；M2：DL5000DNA分子质量标准；1：pMD18-T-a1双酶切产物。

3.5.3a1基因核苷酸序列测定

选取菌液PCR及酶切结果都为阳性的重组菌液，送上海英俊生物工程有限公司进行序列测定。测序结果：实施例1的3.1设计的引物扩增的猪附红细胞体a1基因全长核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.6不同株猪附红细胞体a1基因序列的比对与分析

将获得的序列用NCBI在线BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行同源性搜索；用BioEdit软件（版本号7.0.9.0）或DNAMAN软件（版本号7.0.2.176）将测序结果与NCBI上公布的猪附红细胞体德国54/96分离株株a1基因序列（登录号为AM265536）进行比对分析。

结果：共获得41条猪附红细胞体a1基因序列，扩增片段长度1657bp，利用BioEdit软件对序列进行Clustal W分析，剔除彼此间完全相同的序列34条，最终剩余7条序列。与GenBank登录的猪附红细胞体德国54/96分离株a1基因序列（登录号AM265536）相比，总共有41处位点发生碱基变异，分别发生在核苷酸序列的第44、192、209、252、278、279、294、296、338、368、369、440、458、504、524、533、632、645、663、668、683、770、812、863、878、933、945、977、1007、1037、1074、1142、1235、1304、1364、1370、1463、1472、1553、1564和1595位，其中第252位在所有分离株中都发生变异，由鸟嘌呤突变为胸腺嘧啶。第338、1553、1564、1595位在多个分离株同时发生突变，且都是胸腺嘧啶突变为其它碱基（图3）。而JD12、JD104两条序列在碱基第278、294和368位都是由鸟嘌呤突变为腺嘌呤。不同猪附红细胞体分离株间a1基因核苷酸序列的变异率在0.1～2.3%之间，不同分离株a1基因部分核苷酸序列比对结果见图3。

实施例2猪源附红细胞体TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

1.引物和探针的设计

将已获得且鉴定正确的41条猪附红细胞体a1基因序列与NCBI公布的a1基因（登录号为AM265536）序列利用DNAMAN软件（版本号7.0.2.176）进行多重序列比对分析，选取几段相对保守的片段，设计并合成一对特异性引物及TaqMan探针，确保所设计的引物及探针在NCBI上与其他物种病原体基因以及猪基因比对具有高度特异性。引物序列如下:F:5'-GCTGGAAAGATTGCTGGACTAGA-3'(SEQ ID NO：4)，位于1657bp a1基因核苷酸序列的第360-382位，R:5'-CCTCCCCCTAGGTCAT AAACAAGTA-3'(SEQ ID NO：5)，位于1657bp序列的第460-484位；探针序列如下：FAM-5’-CAGCTGCGCTAGCT-3’-TAMRA(SEQ IDNO：6)，位于1657bp序列的第412-425位，其5’端由荧光基团FAM标记，3’端由淬灭基团TAMRA标记。该引物扩增和探针反应的序列长度为125bp，具体核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。引物和探针由上海英俊生物技术有限公司合成。

2.荧光定量PCR反应体系：

根据TaKaRa公司Premix Ex Taq^TM （Probe qPCR）说明书，将PCR反应预混液调整至最优化体系，所用引物和探针的浓度均为10μM。

qPCR反应体系总体积20μL，包括：ddH₂O7.4μL，10μM的Forward primer和Reverseprimer各0.5μL，10μM MGB-probe0.2μL，ROX Reference Dye II0.4μL，Premix Ex Taq^TM（Probe qPCR）10μL，DNA1μL。上述反应液的添加需要在避光且干净无气溶胶污染处操作进行。

使用ABI PRISM Real-time PCR扩增仪，采用两步法进行扩增，阶段1，进行预变性，95℃30s，1Cycle；阶段2，进行PCR反应，95℃5s，60℃34s，40个循环。在PCR每个循环的延伸过程结束后，进行荧光信号的检测。40个循环全部结束后自动生成扩增曲线。

3.荧光定量标准品的准备

用分光光度计测定提取的重组质粒pMD18-T-a1（126-5号样品）的OD280、OD260值，计算OD260/OD280比值。连续测定了3次，3次计算的结果分别为:165.6ng/μL、163.8ng/μL、160.9ng/μL，平均浓度为163.4ng/μL。

已知质粒载体pMD18-T的长度为2692bp，插入的a1基因片段长度为1657bp；单位碱基对的平均分子量为649。则重组质粒pMD18-T-a1（126-5号样品）的分子量为M=649×（2692+1657）=2.82×10⁶，则重组质粒pMD18-T-a1（126-5号样品）的物质的量_pMD18-T-a1=m/M=163.4/（10⁹×2.82×10⁶）moL。根据阿伏伽德罗常数可知，1mol质粒标本中含有的a1基因拷贝数为6.02×10²³个，由此可以得出a1基因拷贝数浓度为C_a1=n_pMD18-T-a1×6.02×10²³copies/μL=3.48×10¹⁰copies/μL。

用稀释缓冲液（dilution buffer）对重组质粒标准品进行10倍梯度稀释，稀释方法如下：取3μL pMD18-T-a1重组质粒，加27μL稀释液dilution buffer，吹打混匀，涡悬，重复3次后，命名为10^-1，依此类推，分别稀释到10^-2、10^-3、10-⁴、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10，即使其最低浓度达到3.48copies/μL。稀释好的标准品立即用于下游实验，或-20℃保存备用。

4.建立标准曲线

将重组质粒pMD18-T-a1（126-5号样品）标准品进行10倍梯度倍比稀释，从10^-1到10^-10的各个产物作为标准样品，设置好样品编号及反应浓度，在ABI PRISM Real-time PCR仪上，进行荧光定量PCR反应，得到各个标准样品对应的扩增曲线即标准曲线。

结果：10倍梯度稀释的重组质粒pMD18-T-a1标准品（编号126-5），在浓度为3.48×10⁸copies/μL、3.48×10⁷copies/μL、3.48×10⁶copies/μL、3.48×10⁵copies/μL、3.48×10⁴copies/μL、3.48×10³copies/μL、3.48×10²copies/μL时，都获得了良好的扩增曲线，Ct值都可以被准确读出，其中3.48×10²copies/μL稀释度对应的Ct值为35.716。当标准品稀释度为3.48×10copies/μL时，实时荧光定量PCR不能有效读出扩增曲线。阴性对照也没有扩增曲线（图4A）。将3.48×10²copies/μL－3.48×10⁸copies/μL不同稀释度标准品的实时荧光定量PCR反应Ct值进行对数换算后，自动形成标准曲线。结果显示其相关系数为r²=1.0，Ct=-3.326×Lg copy number+42.342。不同稀释度在标准曲线上的数据点与曲线拟合良好（图4B，表1）。图4中，A:猪附红细胞体a1基因重组质粒pMD18-T-a1梯度稀释扩增曲线；B:建立的标准曲线；1～10：分别为3.48×10⁹copies/μL、3.48×10⁸copies/μL、3.48×10⁷copies/μL、3.48×10⁶copies/μL、3.48×10⁵copies/μL、3.48×10⁴copies/μL、3.48×10³copies/μL、3.48×10²copies/μL、174copies/μl、87copies/μl的扩增曲线；11：空白对照（NTC）。

表1猪附红细胞体a1基因重组质粒pMD18-T-a1标准品不同稀释梯度拷贝数及Ct值

实施例3敏感性实验及Ct cut-off界值的确定

将重组质粒pMD18-T-a1（126-5号样品）作为标准品，已知其基因拷贝数浓度为3.48×10¹⁰copies/μL。用稀释缓冲液dilution buffer对其进行10倍梯度稀释，取3.48×10⁸copies/μL、3.48×10⁷copies/μL、3.48×10⁶copies/μL、3.48×10⁵copies/μL、3.48×10⁴copies/μL、3.48×10³copies/μL、3.48×10²copies/μL及3.48×10copies/μL8个稀释度作为模板进行实时荧光定量PCR反应，得到各个浓度梯度的标准品对应的扩增曲线及Ct值。在10^-8稀释度（即3.48×10²copies/μL浓度）之后，再进行2倍倍比稀释，共稀释6次，分别为2^-1、2^-2、2^-3、2^-4、2^-5、2^-6，来确定样品的阴阳性cut-off值。

结果：将重组质粒pMD18-T-a1标准品（编号126-5）进行10倍梯度倍比稀释，当稀释至3.48×10²copies/μL时，定量PCR的Ct值可以被准确读出，为35.716；当稀释至3.48×10copies/μL时，Ct值不能有效读出。在3.48×10²copies/μL后再重新进行2倍梯度稀释，共稀释6次，结果在2^-2倍稀释即87copies/μL时Ct值都可以检测到，Ct平均值为36.253；当稀释至2^-3倍即43.5copies/μL时，2个反应中有一个反应检测不到Ct值，故界定其cut off值为36.253，TaqMan实时荧光定量PCR的敏感性为87copies/μL。

实施例4猪源附红细胞体实时荧光定量PCR方法的特异性实验

取实验室保存的猪附红细胞体a1基因重组质粒pMD18-T-a1标准品（126-5号样品），以及鸡毒支原体（M.gallisepticam）Flow株及MGS₆株、滑膜支原体（M.synoviae）MSPO株、田鼠巴贝斯虫（Babesia microti）、刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）、微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）IowaⅡ株基因组DNA，置于ABI PRISM Real-time PCR仪上，进行实时荧光定量PCR反应，同时设阴性、阳性对照，根据扩增曲线检测该方法的特异性。

结果如图5所示，猪附红细胞体a1基因重组质粒pMD18-T-a1标准品有明显的扩增曲线，其他物种包括鸡毒支原体Flow株基因组及MGS₆株、滑膜支原体MSPO株、田鼠巴贝斯虫、刚地弓形虫、微小隐孢子虫基因组DNA及阴性对照均无扩增曲线（图5），T表明该方法特异性强。图5中，1:猪附红细胞体a1基因重组质粒pMD18-T-a1标准品。

实施例5猪源附红细胞体实时荧光定量PCR方法的重复性实验

选择3.48×10⁸copies/μL、3.48×10⁷copies/μL、3.48×10⁶copies/μL、3.48×10⁵copies/μL、3.48×10⁴copies/μL、3.48×10³copies/μL、3.48×10²copies/μL7个不同浓度的重组质粒pMD18-T-a1标准品（126-5号样品），每个标准品在同一个反应中重复2次。同时对上述样品不同批次进行TaqMan实时荧光定量PCR扩增，分别得到相应扩增曲线。根据每个标准品在同一批次不同重复间及不同批次间的Ct值计算变异系数CV，确定该方法是否具有重复性及稳定性。

结果：重组质粒pMD18-T-a1标准品（编号126-5）的7个10倍稀释液（3.48×10⁸copies/μL、3.48×10⁷copies/μL、3.48×10⁶copies/μL、3.48×10⁵copies/μL、3.48×10⁴copies/μL、3.48×10³copies/μL、3.48×10²copies/μL）各进行4次TaqMan实时荧光定量PCR（其中批次内2次，批次间两次），均获得了良好的扩增曲线（图6），图6中，A、B为两次批间重复性检测结果；A为第一次批内不同稀释度的检测结果；B为第二次批内不同稀释度的检测结果。1～7：分别为3.48×10⁸copies/μL、3.48×10⁷copies/μL、3.48×10⁶copies/μL、3.48×10⁵copies/μL、3.48×10⁴copies/μL、3.48×10³copies/μL、3.48×10²copies/μL的扩增曲线。不同稀释度标准品进行4次实时荧光定量PCR所对应的平均Ct值在14.168～34.067间，标准差（SD）在0.046～0.232之间，变异系数（CV）值在0.19%～1.64%之间（表2），这些数值表明该方法误差小，扩增效率稳定。

表2基于a1基因的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的4次重复实验结果

实施例6采用本发明建立的基于a1基因的TaqMan实时荧光定量PCR方法检测猪源附红细胞体

1.对猪附红细胞体的检测

对猪附红细胞体阳性全血基因组DNA随机取样，采用实施例2设计的引物和探针进行a1基因的TaqMan实时荧光定量PCR反应。将荧光定量反应后产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到约125bp左右大小的目的条带（图7）。图7中，M：DNA分子质量标准GenRuler^TM Low Range；1～11：基于猪附红细胞体a1基因的TaqMan实时荧光定量PCR扩增产物；N：阴性对照。

2.对小附红细胞体的检测

选择3份经16S rRNA和RNase P RNA（rnpB）基因序列测定鉴定为小附红细胞体感染的猪血液样品（编号分别为SJ-135、SJ-148、SJ-151），提取基因组DNA，进行a1基因的TaqManreal-time PCR反应，结果均成功地获得了扩增曲线（图8），该3份样品的平均Ct值分别为：27.91、28.08和29.90。

实施例7田间样品的初步检测及与基于g1基因的TaqMan实时荧光定量PCR检测结果的比较

从上海市长宁某屠宰场、松江某屠宰场、嘉定某屠宰场分别随机采集育肥猪新鲜血液440份，利用购自上海赛百盛基因技术有限公司的血液基因组DNA提取试剂盒（树脂型）提取血液基因组DNA，采用建立的基于g1基因的TaqMan实时荧光定量PCR进行检测。所有样品同时采用基于a1基因的TaqMan real-time PCR方法进行检测，比较两者检测方法检测结果的异同。

对经过g1基因的荧光定量PCR检测的440份猪血DNA重新运用基于a1基因的TaqMan实时荧光定量PCR方法进行检测，结果显示，在440份样品中，116份经基于g1基因的荧光定量PCR检测为阳性的样品，基于a1基因的荧光定量PCR检测结果也为阳性；在324份经基于g1基因荧光定量PCR检测为阴性的样品，有103份经基于a1基因荧光定量PCR检测也为阳性，另外221份检测为阴性（表3）。两者的阳性符合率：116/219×100﹪＝52.97﹪，阴性符合率：221/221×100﹪＝100﹪。

表3基于a1基因和基于g1基因的TaqMan实时荧光定量PCR田间样品检测比较

在经TaqMan荧光定量PCR检测为阳性的田间样品中，选取50份样品进行16S rRNA和rnpB基因扩增和序列测定，并进行系统发育分析，结果显示，有33份为猪附红细胞体阳性样品，11份为小附红细胞体阳性样品，6份为上述两个种的混合感染。这些样品的成功检测，表明本发明基于a1基因的荧定量PCR不仅能检测出猪附红细胞体，也能检测小附红细胞体。

实施例8猪源附红细胞体实时荧光定量PCR检测试剂盒的组成及应用

1、试剂盒的组成

将探针、引物对、含有猪附红细胞体a1基因的阳性重组质粒标准品、荧光定量PCR反应缓冲液及聚合酶，装配成试剂盒，组装后置于-20℃保存。

2、本发明试剂盒的应用

（1）无菌采集病猪血液样品440份，加入抗凝剂柠檬酸葡萄糖（acid citrate dextrose,ACD），血液与抗凝剂的比例为1:10，混匀，4℃保存。

（2）取500μL抗凝血，用全血基因组DNA提取试剂盒提取猪血液样品基因组DNA，于-20℃保存。

（3）用本发明试剂盒进行荧光定量PCR检测，将扩增曲线与根据猪附红细胞体a1基因阳性质粒10倍梯度稀释所作的标准曲线进行比较、判定。结果：共检出猪附红细胞体感染阳性样品219份，感染率为49.77%。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种猪源附红细胞体荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

针对SEQ ID NO:1所示猪附红细胞体a1基因序列设计的TaqMan探针，该探针与所述猪附红细胞体a1基因序列第45～191位、第360～532位、第534～631位、第684～811位、第1038～1141位、第1143～1234位、第1236～1363位、或第1371～1462位的核苷酸序列特异性结合；

针对SEQ ID NO:1所示猪附红细胞体a1基因序列设计的引物对，该引物对用于扩增所述猪附红细胞体a1基因序列第45～191位、第360～532位、第534～631位、第684～811位、第1038～1141位、第1143～1234位、第1236～1363位、或第1371～1462位的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的猪源附红细胞体荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述探针与SEQ ID NO:1序列第360～532位的核苷酸序列特异性结合；所述引物对用于扩增SEQID NO:1序列第360～532位的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的猪源附红细胞体荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述探针与SEQ ID NO:1序列第360～484位的核苷酸序列特异性结合；所述引物对用于扩增SEQID NO:1序列第360～484位的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的猪源附红细胞体荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述探针的序列如SEQ ID NO:6所示；所述引物对的序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的猪源附红细胞体荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：含有猪附红细胞体a1基因的阳性重组质粒标准品。

6.根据权利要求5所述的猪源附红细胞体荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阳性重组质粒是将长度为1657bp的猪附红细胞体a1基因片段插入pMD18-T载体而制得。

7.根据权利要求1至4中任一项所述的猪源附红细胞体荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：荧光定量PCR反应缓冲液及聚合酶。

8.根据权利要求1至4中任一项所述的猪源附红细胞体荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有淬灭基团。

9.权利要求1所述的猪源附红细胞体荧光定量PCR检测试剂盒在制备诊断猪的附红细胞体病的产品中的应用。