CN105200162A - 一种快速区分hp-prrs活疫苗jxa1-r株与野毒株的hrm检测方法及其引物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXA1-R株与野毒株的HRM检测方法及其引物，操作简单：只需PCR反应之前加荧光饱和染料即可；检测速度快且高通量：全部操作过程只需3小时，极大缩短了分型所需时间；费用低，不需要特异性荧光标记探针，每个样品的饱和染料成本为1.6RMB；准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高通量地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及病毒野毒株与疫苗毒株的鉴别方法，具体涉及一种快速区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXA1-R株与野毒株的HRM检测方法及其引物。
背景技术
高致病性猪繁殖与呼吸综合征（High pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome，HP-PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV，porcine reproductive and
respiratory syndrome virus）变异株引起的一种急性高致死性疫病，该变异株称为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）。发病主要特征为怀孕母猪流产、早产、木乃伊胎等，母猪流产率可达30%以上；仔猪出现严重的呼吸道症状，感染率可达100%，死亡率在50%以上。目前我国主要采取以疫苗免疫为主的综合性防控措施，对猪实施强制免疫，使用的高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗均为活疫苗（江西株JXAl-R、湖南株Hun4-F112、天津株TJM-F92、广东株GDr180）。
由于高致病性猪蓝耳病疫苗种类较多，再加上国内外学者与养猪企业对HP-PRRS疫苗使用观点的差异，导致我国目前猪蓝耳病疫苗的使用非常混乱，多种疫苗株的同时使用很可能会导致疫苗株间的同源重组，导致疫苗株毒性返强的可能。对发病猪病原检测，有效、尽早地诊断是疫苗株或是疫苗株返强引起的猪蓝耳病，还是野毒感染引起猪体发病，对于猪场有效控制及最大限度减少经济损失具有重要意义。目前还没有一种有效鉴别高致病性猪蓝耳病野毒株与疫苗株的检测方法。针对江西株JXAl-R的检测方法目前有荧光探针法报道（魏津. 等. 高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)病毒含量荧光定量PCR方法的建立[J]. 中国兽药杂志, 2013, 47(10): 39-42），针对JXA1野毒株与JXA1-R疫苗株的鉴别诊断有PCR方法的报道（何玲, 等. 猪繁殖与呼吸综合征病毒变异野毒株与JXA1-R疫苗毒株快速鉴别方法的建立[J]. 中国畜牧兽医, 2011, 38(1): 198-201）。但针对高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXA1-R株与野毒株鉴别诊断方法的报道还没有。所以建立一种快速有效的鉴别高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXA1-R株与野毒株的检测方法具有重要的意义。
发明内容
为了解决上述存在的问题，本发明利用JXA1-R株和高致病性猪繁殖与呼吸综合征野毒株（HP-PRRSV）的单核苷酸多态性进行高分辨率熔解曲线分析（high-resolution melt
analysis of single nucleotide polymorphisms，SNP-HRM），建立区分JXA1-R疫苗毒株和HP-PRRSV野毒株SNP-HRM分型方法。
本发明的目的在于提供一种快速区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXA1-R株与野毒株的HRM检测引物。
本发明的目的在于提供一种快速区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXA1-R株与野毒株的HRM检测方法。
本发明的再一目的在于提供一种快速区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXA1-R株与野毒株的HRM检测试剂盒。
本发明所采取的技术方案是：
一种快速区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXA1-R株与野毒株的HRM检测方法的引物，其核苷酸序列如下所示：
引物P1：TCGCCRCGGGAGTCTGR（SEQ ID NO：1），
引物P2：RGCGGAAACTTTGACCACTT（SEQ ID NO：2），
引物P3：TGAGAAGAGGATTACGGCT（SEQ ID NO：3），
引物P4：GGCCTGGTTGGGATCATAAG（SEQ ID NO：4）。
一种快速区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXA1-R株与野毒株的HRM试剂盒，该试剂盒含有上述所述的引物。
一种快速区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXA1-R株与野毒株的HRM检测方法，包括以下步骤：
1）从样品中提取病毒核酸；
2）以核酸为模板，用权利要求1所述的引物对P1和P2进行预扩增反应获得预扩增产物；
3）以预扩增产物作为DNA模板，用权利要求1所述的引物对P3、P4及荧光饱和染料进行PCR-HRM扩增反应获得扩增产物；
4）对扩增产物进行HRM分析，确定病毒类型。
进一步的，步骤2）中PCR预扩增反应体系为：
模板RNA
1
µL
PrimeScript 1 Step Enzyme
Mix 0.5 µL
2×1 Step Buffer
6.25µL
引物P1
0.5µL
引物P2
0.5µL
Syto9
0.5µL
RNase Free ddH2O
3.75µL
总体积
13µL。
进一步的，步骤2）中的预扩增反应程序为：50℃反转录30min；95℃预变性3min；95℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸60s；循环35次。
进一步的，步骤3）中的PCR-HRM扩增反应体系为：
pH 8.0的2×Buffer
10.0µL
MgCl2
2.8µL
dNTPs
2.0µL
引物P3
0.5µL
引物
P4
0.5µL
Syto9
0.5µL
1.0 U Taq
HS
0.2µL
模板DNA
1.0 µL
ddH2O
2.5µL
总体积
20µL。
进一步的，步骤3）中的PCR-HRM扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸20s；循环35次；98℃变性2min，40℃杂合2min，60℃到85℃以0.3℃/s的熔解速率进行熔解曲线分析。
进一步的，步骤4）中所述HRM分析的具体分析过程为：分别以72℃~74℃和84℃~86℃温度区间作为JXA1-R PCR-HRM扩增产物熔解曲线归一化温度区间，并分别以HP-PRRSV野毒株和JXA1-R疫苗毒株质粒样品为阳性对照对临床样品进行基因分型；与HP-PRRSV野毒株阳性对照进行比较时，若其基因分型置信值GCP大于或等于95%则判定为HP-PRRSV野毒株；与JXA1-R疫苗毒株阳性对照进行比较时，若其基因分型置信值GCP大于或等于95%则判定为JXA1-R疫苗毒株。
本发明的有益效果是：
1）本发明首次建立了一种快速区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXA1-R株与野毒株的HRM检测方法及其引物，操作简单：只需在PCR反应之前加荧光饱和染料即可；检测速度快且高通量：全部操作过程只需3小时，极大缩短了分型所需时间；费用低，不需要特异性荧光标记探针，每个样品的饱和染料成本为1.6 RMB；准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高通量地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。
2）本发明的PCR-HRM引物，对HP-PRRSV活疫苗JXA1-R株与野毒株，均有很好的扩增性，有助于提高PCR的效率，减少病毒鉴别分型的时间。
3）本发明的PCR-HRM引物特异性好，除可以与HP-PRRSV活疫苗JXA1-R株与野毒株结合外，不与其他常见猪源病毒，如猪瘟病毒（classical swine fever virus, CSFV）、猪伪狂犬病毒（Pseudorabies Virus, PRV）、猪圆环2型（Porcine circovirus type 2,
PCV2）、猪细小病毒（Porcine parvovirus, PPV）等核酸结合，特异性扩增PRRSV核酸，有利于提高本发明对PRRSV经典和变异毒株分析的正确性。
4）本发明利用套式PCR方法来提高区别HP-PRRSV活疫苗JXA1-R株与野毒株的准确性和重复性。
附图说明
图1 为JXA1-R疫苗毒株和HP-PRRSV野毒株（HP-PRRSV GD1）SNP-HRM分析方法归一化（A）和峰型化（B）熔解曲线图；
图2 为JXA1-R疫苗毒株和HP-PRRSV野毒株（HP-PRRSV GD1）SNP-HRM分析方法临床样品归一化（A）和峰型化（B）熔解曲线图；其中样品JXA1-R疫苗株和HP-PRRSV 野毒株（GD1）分别作为阳性对照；
图3 为本发明方法检测并区分JXA1-R疫苗毒株和HP-PRRSV野毒株（PRRSV GD1）的特异性试验结果；
图4 为本发明方法检测JXA1-R疫苗毒株的灵敏度试验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例
1
一种快速区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗
JXA1-R
株与野毒株的
HRM
检测方法
引物
1）PCR预扩增引物
根据HP-PRRSV疫苗株JXA1-R和HP-PRRSV野毒株基因序列设计出扩增疫苗株JXA1-R和野毒株部分基因片段的引物对P1和P2（PCR预扩增引物），其碱基序列如下所示。
P1：TCGCCRCGGGAGTCTGR（SEQ ID NO：1），
P2：RGCGGAAACTTTGACCACTT（SEQ ID NO：2）；
其中R为简并碱基，为碱基A或G；
2）PCR-HRM引物：
经过对所设计的大量引物进行筛选后，发现引物碱基序列SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4对PCR-HRM方法区分HP-PRRSV疫苗株JXA1-R和HP-PRRSV野毒株的效果最好，其碱基序列如下所示。
P3：TGAGAAGAGGATTACGGCT（SEQ ID NO：3），
P4：GGCCTGGTTGGGATCATAAG（SEQ ID NO：4）。
实施例
2
一种快速区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗
JXA1-R
株与野毒株的
HRM
检测方法
标准样品的
PCR-HRM
分析
1）HP-PRRSV标准品核酸的提取：
将JXA1-R疫苗加入3mL PBS盐酸缓冲溶液进行溶解得JXA1-R疫苗样品溶液，准备好感染过GD1野毒株（HP-PRRSV野毒株）的猪血清样品，分别取该2种样品各200μL，并按TAKARA的MiniBEST Viral RNA/DNA
Extraction Kit Ver.4.0的说明书进行样品中核酸的提取。
2）阳性标准样品的PCR- HRM操作步骤
为了验证所设计的引物对实际样品的鉴别能力，本研究利用JXA1-R疫苗（JQ804986）和GD1野毒株（HP-PRRSV野毒株，KR056088）作为标准样品进行PCR-HRM分析。分别以上述标准样品提取核酸作为核酸模板，分别进行PCR-HRM预扩增反应、PCR-HRM扩增反应和分析。
2.1 RT-PCR预扩增
参照PrimeScript® One Step
RT-PCR Kit产品说明书，按以下组成配制RT-PCR反应液。引物P1/P2为区分PRRSV经典毒株和变异毒株的预扩增引物：
预扩增反应程序为50℃反转录30min；95℃预变性3min；95℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸60s；循环35次。
2.2 PCR-HRM分析
将引物P1/P2预扩增产物稀释100倍后作为模板，以P3/P4为引物进行第2轮不对称PCR扩增，PCR-HRM扩增反应体系如下：
PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸20s；循环35次；
HRM运行程序：98℃变性2min，40℃杂合2min，60℃到85℃以0.3℃/s的熔解速率进行熔解曲线分析。HRM试验结果用Rotor-GeneTMQ 2.0.2.软件进行分析。
3）阳性标准样品PCR-HRM结果分析
PCR扩增产物用Rotor-Gene Q分析仪进行分析。JXA1-R疫苗毒株和HP-PRRSV野毒株（HP-PRRSV GD1）的SNP HRM分析结果如图1所示。
图1为JXA1-R疫苗毒株和HP-PRRSV野毒株（HP-PRRSV GD1）SNP HRM分析方法归一化（A）和峰型化（B）熔解曲线图。分析结果显示，本发明SNP-HRM分析方法能够区分JXA1-R疫苗毒株和HP-PRRSV野毒株（HP-PRRSV GD1）。其中JXA1-R疫苗毒株Tm值为78.00±0.02℃，HP-PRRSV野毒株Tm值为78.89±0.02℃。
实施例
3
临床样品
PCR-HRM
分析
1）从样本中提取病毒核酸：分别取疑似感染有HP-PRRSV的猪肺脏组织样品2g，加入3mL PBS盐酸缓冲溶液进行研磨，将研磨好的匀浆液4000×g 离心 8 min，并吸取离心上清液至-80℃保存备用。或血清样本200μL组织样品匀浆液和血清样品按TAKARA的MiniBEST Viral RNA/DNA
Extraction Kit Ver.4.0的说明书进行核酸提取。
2）以提取的病毒核酸为模板，进行RT-PCR预扩增（参照PrimeScript® One Step RT-PCR Kit试剂盒说明书），预扩增反应体系为：
预扩增反应程序为50℃反转录30min；95℃预变性3min；95℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸60s；循环35次。
3）将预扩增产物稀释100倍后作为模板，以P3/P4为引物进行第2轮不对称PCR扩增，PCR-HRM扩增反应体系如下：
PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸20s；循环35次；
HRM运行程序：98℃变性2min，40℃杂合2min，60℃到85℃以0.3℃/s的熔解速率进行熔解曲线分析。HRM试验结果用Rotor-GeneTMQ 2.0.2.软件进行分析。
4）对扩增产物进行HRM分析（用Rotor-GeneTMQ 2.0.2.软件进行分析），确定病毒为JXA1-R疫苗毒株或HP-PRRSV野毒株，具体分析过程为：
以JXA1-R疫苗毒株的标准样品和HP-PRRSV野毒株（PRRSV GD1）的标准样品为阳性对照，采用95%GCP值作为基因分型阈值，即GCP值大于或等于95%时判定为同一基因型。
为了验证所建立的方法对实际临床样品的鉴别能力。本发明对广东省和江西省某猪场收集到的17份HP-PRRSV临床样品进行PCR-HRM分析，分析结果如图2，从中可以看出，17份HP-PRRSV临床样品被分型为3份疑似JXA1-R疫苗毒株和14份HP-PRRSV野毒株。其中，以JXA1-R疫苗毒株的标准样品为阳性对照，其中3份GCP值均大于95%，样品Tm值为77.9±0.05℃，疑似为JXA1-R株；而另14份GCP值在2.1-10.3%之间，Tm值为78.9±0.05℃，为HP-PRRSV野毒株；将这14份样品的结果与HP-PRRSV野毒株（PRRSV GD1）的标准样品进行比较，其GCP值均大于95%，进一步说明14份样品中含有HP-PRRSV野毒株（每个样品重复3次）。
另外，对这17份样品用针对PRRSV的ORF5基因的引物进行扩增并测序，做进化分析分析结果与本发明方法检测的结果完全一致，说明本发明方法的准确性高，可达100%。
实施例
4
特异性实验
下面对本发明建立的区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXA1-R株与野毒株的HRM检测方法进行特异性检测。
分别提取其他常见猪病毒核酸，如CSFV、PRV、PCV2和PPV的核酸为模板，以上述实施例3中所述的方法进行HRM分析，分别验证引物P1/P2、P3/P4特异性，同时以JXA1-R疫苗毒株的标准样品和HP-PRRSV野毒株（HP-PRRSV GD1）的标准样品为阳性对照，水作为阴性对照进行PCR-HRM分析。
分析结果如图3所示，从图上可看出，本发明HRM检测方法能特异性扩增出JXA1-R疫苗毒株和HP-PRRSV野毒株（PRRSV GD1）熔解峰，而其它常见病毒，如猪瘟病毒（classical swine fever virus, CSFV）、猪伪狂犬病毒（Pseudorabies Virus, PRV）、猪圆环2型（Porcine circovirus type 2,
PCV2）、猪细小病毒（Porcine parvovirus, PPV）样品均未扩增出熔解峰，表明本发明使用的引物P1/P2和P3/P4特异性高，适合作为HRM引物。
实施例
5
灵敏度试验
下面对本发明建立的区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXA1-R株与野毒株的HRM检测方法进行灵敏度检测。
分别以JXA1-R Nsp3质粒样品体外转录RNA为模板，梯度稀释后进行PCR-HRM分析，确定JXA1-R SNP-HRM方法最低检测限。体外转录按Transcript Aid T7 High Yield
Transcription Kit （Thermo Fisher Scientific）试剂盒说明书进行操作。用GeneJET RNA Purification Kit（Thermo Fisher Scientific）试剂盒对体外转录产物进行纯化。体外转录产物按用上述实施例2中所述的SNP-HRM方法进行灵敏度试验。
图4为高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXA1-R株与野毒株的HRM检测方法灵敏度试验结果。从图上可看出，本发明JXA1-R疫苗毒株SNP-HRM分析法最低检测限为70.8 copy/µL。
实施例
6
重复性试验
下面对本发明建立的区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXA1-R株与野毒株的HRM检测方法作重复性检测。
选取JXA1-R和HP-PRRSV分离株HP-PRRSV GD1阳性对照，分别抽提不同批次的RNA样品，用上述实施例2中方法进行重复性试验，并计算出批内和批间变异系数（CV%）。
实验结果如表1所示，从表中可看出，JXA1-R疫苗株和野毒分离株HP-PRRSV GD1样品在不同批次抽提核酸后的熔解曲线重复性较高。虽然，不同批次样品在熔解温度（Tm）上有微弱变化，但熔解峰形状、熔解温度和变异系数（CV% c）上无显著差异。
表1 本发明方法重复性试验结果
a 批内和批间变异系数由值计算得出
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所
<120> 一种快速区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXA1-R株与野毒株的HRM
检测方法及其引物
<130>
<160>
4
<170>
PatentIn version 3.5
<210>
1
<211>
17
<212>
DNA
<213> 人工引物
<400>
1
tcgccrcggg agtctgr
17
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2
<211>
20
<212>
DNA
<213> 人工引物
<400>
2
rgcggaaact ttgaccactt
20
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3
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19
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DNA
<213> 人工引物
<400>
3
tgagaagagg attacggct
19
<210>
4
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20
<212>
DNA
<213> 人工引物
<400>
4
ggcctggttg ggatcataag
20
Claims (8)
1.一种快速区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXA1-R株与野毒株的HRM检测方法的引物，其核苷酸序列如下所示：
引物P1：TCGCCRCGGGAGTCTGR（SEQ ID NO：1），
引物P2：RGCGGAAACTTTGACCACTT（SEQ ID NO：2），
引物P3：TGAGAAGAGGATTACGGCT（SEQ ID NO：3），
引物P4：GGCCTGGTTGGGATCATAAG（SEQ ID NO：4）。
2.一种快速区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXA1-R株与野毒株的HRM试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有权利要求1所述的引物。
3.一种快速区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXA1-R株与野毒株的HRM检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）从样品中提取病毒核酸；
2）以核酸为模板，用权利要求1所述的引物对P1和P2进行预扩增反应获得预扩增产物；
3）以预扩增产物作为DNA模板，用权利要求1所述的引物对P3、P4及荧光饱和染料进行PCR-HRM扩增反应获得扩增产物；
4）对扩增产物进行HRM分析，确定病毒类型。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤2）中PCR预扩增反应体系为：
模板RNA 1 µL
PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 0.5 µL
2×1 Step Buffer 6.25µL
引物P1 0.5µL
引物P2
0.5µL
Syto9 0.5µL
RNase Free ddH2O 3.75µL
总体积 13µL。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤2）中的预扩增反应程序为：50℃反转录30min；95℃预变性3min；95℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸60s；循环35次。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤3）中的PCR-HRM扩增反应体系为：
pH 8.0的2×Buffer 10.0µL
MgCl2 2.8µL
dNTPs 2.0µL
引物P3 0.5µL
引物 P4 0.5µL
Syto9 0.5µL
1.0 U Taq HS 0.2µL
模板DNA
1.0 µL
ddH2O 2.5µL
总体积
20µL。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤3）中的PCR-HRM扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸20s；循环35次；98℃变性2min，40℃杂合2min，60℃到85℃以0.3℃/s的熔解速率进行熔解曲线分析。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤4）中所述HRM分析的具体分析过程为：分别以72℃~74℃和84℃~86℃温度区间作为JXA1-R PCR-HRM扩增产物熔解曲线归一化温度区间，并分别以HP-PRRSV野毒株和JXA1-R疫苗毒株质粒样品为阳性对照对临床样品进行基因分型；与HP-PRRSV野毒株阳性对照进行比较时，若其基因分型置信值GCP大于或等于95%则判定为HP-PRRSV野毒株；与JXA1-R疫苗毒株阳性对照进行比较时，若其基因分型置信值GCP大于或等于95%则判定为JXA1-R疫苗毒株。
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| CN201510481153.7A CN105200162B (zh) | 2015-08-06 | 2015-08-06 | 一种快速区分hp-prrs活疫苗jxa1-r株与野毒株的hrm检测方法及其引物 |
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