CN104232789A - 可同时鉴别猪繁殖与呼吸综合症病毒的rt-pcr技术 - Google Patents

Abstract

本发明属于重大动物疫病检疫检测领域，具体涉及到一组用于可同时区别猪繁殖与呼吸综合症野毒株（包括经典毒株、高致病性毒株）和疫苗毒株鉴别诊断的RT-PCR引物、操作方法及其临床应用；设计特异性引物、提取RNA、利用RT-PCR两步法得到产物、将产物进行凝胶电泳，于凝胶成像系统进行观察；本发明把疫苗毒株序列存在双缺失区域（TJM-F92），作为野毒株和疫苗株分子诊断的靶区域，选择最优保守区域设计RT-PCR引物。该引物特异性好，对PRRSV疫苗株和野毒株(高致病性和经典毒株)可以鉴别诊断，且对其他猪源性病毒均无扩增反应。该方法检测极限为3.5TCID₅₀的PRRSV，对仪器要求不高，适用于基层检疫。

Description

可同时鉴别猪繁殖与呼吸综合症病毒的RT-PCR技术

技术领域    

    本发明属于重大动物疫病检疫检测领域，具体涉及到一组用于可同时区别猪繁殖与呼吸综合症野毒株（包括经典毒株、高致病性毒株）和疫苗毒株区别诊断的RT-PCR引物、操作方法及其临床应用。

背景技术    

    猪繁殖与呼吸病毒PRRSV是一种单股正链RNA病毒，有囊膜，归属于冠状病毒科、动脉炎病毒属。

    猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)引起的急性热性高度接触性传染病，临床上引起妊娠母猪繁殖障碍，仔猪和育肥猪呼吸症状。该病首次报道于美国（1987年)，此后该病已呈世界性分布，世界多国均见有PRRSV感染的报道，给世界养猪业造成巨大损失，已经被国际兽医局(OIE)列为B类传染病，我国也将经典猪繁殖与呼吸综合症列为二类动物传染病；2006年发生在中国的由变异毒株引起的高致病性蓝耳病，造成重大损失，被列为一类动物传染病。鉴别诊断经典和高致病性猪繁殖与呼吸综合症具有重要的临床意义。

    对于PRRSV的防治，除了采用疫苗进行定期的免疫接种外，尚无特异性治疗方法。而目前用于PRRSV防制的主要为弱毒疫苗，大规模应用弱毒疫苗使得区分动物发病与疫苗免疫变得困难。鉴别疫苗毒和野毒是非常关键的，是判定疾病的前提，可用于引种和免疫净化疾病。

目前常用的PRRSV诊断方法有很多,包括病毒中和试验、酶联免疫吸附试验、间接免疫荧光试验、免疫组织化学，但存在操作复杂费时，特异性不强的缺点，且又很难鉴别PRRSV野毒感染和疫苗接种。而近年来发展起来的实时荧光定量PCR（realtime PCR）以操作简单，灵敏度高、速度快为优点，但由于实验仪器及试剂昂贵，很难普遍用于基层实验室，不利于疾病早发现和早处理。

综上，迫切需要建立一种可以鉴别诊断PRRSV疫苗毒株和高致病性毒株、经典毒株野毒感染的敏感而特异检测方法，对蓝耳病的监测防控和免疫净化发挥重要作用。

发明内容    

本研究建立了可以同时区别诊断PRRSV野毒（包括经典毒株、高致病性毒株）和疫苗毒株感染的敏感而特异的RT-PCR引物和检测方法，可以普遍适用于基层检疫和临床应用。

本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案来实现：

用于区分检测猪繁殖与呼吸综合症病毒野毒株与疫苗株的RT-PCR引物包括正义引物和反义引物：

名称	序列（5’-3’）
		正义引物	CGACACCATCCGAGCCG
反义引物	CCTGCACCTGTGTCATCAAGC

注：胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）、腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）   。

本发明提供了一种用于可同时区分PRRS野毒株（包括经典毒株、高致病性毒株）和疫苗株的方法，包括以下步骤：

1）提取RNA ：

   用DEPC(0.1%)H₂O溶解疫苗毒株干粉，取200μl疫苗，使用RNAiso plus提取RNA，其他步骤如常规提取到RNA，用20μl无RNA酶的DEPC(0.1%)H₂O溶解RNA；

2）RT-PCR两步法：

   以上一步骤提取的RNA为模板，配制10μl反转录体系进行反转录，10μl反应体系的配制为：Random primer终浓度为2μM，20μM Random primer 1μl、10μM dNTPs 0.5μl、5x M-MLV buffer 2μl、RNase Inhibitor (40U/μl) 0.5μl、 RTase M-MLV (RNase H-) 0.5μl、RNA模板5μl、RNase-free H₂O 0.5μL；

反转录程序为：30℃ 10 min、42℃ 60min、70℃ 15min、4℃ 5min，得到反转录产物；

配制PCR混合体系：20μM正义引物和反义引物各0.5μl，2.5μM dNTPs 8μl,10xPCR buffer（Mg²⁺) 5μl，TAKARA Taq(5U/μl) 0.5μl，反转录产物2μl，用灭菌去离子水补充至25μl，PCR反应程序：95 ℃ 5min，以94 ℃ 30s、55 ℃ 30s 和72 ℃ 1min进行30个循环，72 ℃ 10min，4 ℃ 5min，得到产物；

３）电泳观察：

取10μl 的上述产物，经3%琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像系统观察，结果为：在460bp处出现条带为TJM-F92疫苗毒株；在820bp出现条带，为高致病性蓝耳病野毒株；如果在907bp处出现条带，为蓝耳病病毒经典毒株。

本发明的有益效果：根据比较猪繁殖与呼吸综合症病毒核苷酸序列，把疫苗毒株序列存在双缺失区域（TJM-F92），作为野毒株和疫苗株分子诊断的靶区域，选择最优保守区域设计RT-PCR引物。该引物特异性好，对PRRSV疫苗株和野毒株(高致病性和经典毒株)可以区分诊断，且对其他猪源性病毒均无扩增反应。该方法检测极限为3.5TCID₅₀的PRRSV。该方法对仪器要求不高，适用于基层检疫。

附图说明    

图1是PRRS与其他猪源性病毒特异性试验结果；

图2是PRRS疫苗株鉴别结果；

图3是RT-PCR灵敏性试验结果；

图4是临床样本检测。

具体实施方式  

本发明提供了一种可同时区别诊断猪繁殖与呼吸综合征野毒株（包括经典毒株、高致病性毒株）和疫苗株的RT-PCR的引物和方法。为使本发明的目的、技术方案和效果更加清楚，以下结合具体实例对本发明技术方案进一步详细阐明。本发明的用于区分诊断PRRSV野毒株和疫苗株的RT-PCR方法的建立过程如下：

（1）特异性引物设计与合成:在GeneBank上下载多个PRRS经典株、高致病毒株、疫苗毒株基因序列，用DNAstar的Meglign进行序列比对，找到基因保守区用primer premier5.0设计特异性引物，用oligo6.0评估引物，由大连宝生物（TAKARA）公司合成，得到如下引物序列，分别为序列表SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示：

名称	序列（5’-3’）	序列表编号
			正义引物	CGACACCATCCGAGCCG	SEQ ID NO.1
反义引物	CCTGCACCTGTGTCATCAAGC	SEQ ID NO.2

（2） PRRSV及对照病毒提取RNA:用DEPC(0.1%)H₂O溶解疫苗毒株干粉，取200μl疫苗，使用RNAiso plus提取RNA，其他步骤如常规提取RNA，用20μl无RNA酶的DEPC(0.1%)H₂O溶解RNA。

（3） RT-PCR两步法：以上一步骤提取的RNA为模板，配制10μl反转录体系进行反转录，Random primer终浓度为2μM，10μl反应体系的配制：20μM Random primer 1μl、10μM dNTPs 0.5μl、5x M-MLV buffer 2μl、RNase Inhibitor (40U/μl) 0.5μl、 RTase M-MLV (RNase H-) 0.5μl、RNA模板5μl、RNase-free H₂O 0.5μL；确定最佳反转录程序为：30℃ 10 min、42℃ 60min、70℃ 15min、4℃ 5min；

以反转录产物cDNA为模板进行PCR扩增，配制PCR混合体系：20μM正义引物和反义引物各0.5μl，2.5μM dNTPs 8μl,10xPCR buffer（Mg²⁺) 5μl，TAKARA Taq(5U/μl) 0.5μl，反转录产物2μl，用灭菌去离子水补充至25μl，最优PCR反应程序：95 ℃ 5min，以94 ℃ 30s、55 ℃ 30s 和72 ℃ 1min进行30个循环，72 ℃ 10min，4 ℃ 5min，得到产物；PCR结束后，取10μl PCR产物在3%琼脂糖凝胶电泳中检测扩增结果，判定样品中是否含有PRRSV。

（4）同时鉴别诊断猪繁殖与呼吸综合征野毒株（包括经典毒株、高致病性毒株）和疫苗株：该引物能同时鉴别诊断PRRS经典株(CH1-R)、高致病毒株（JXA1）和疫苗株（TJM-F92），见图2，其中，在460bp处出现条带为TJM-F92疫苗毒株；在820bp出现条带，为高致病性蓝耳病野毒株；如果在907bp处出现条带，为蓝耳病病毒经典毒株。

（5）RT-PCR检测引物特异性实验：分别以PRRS疫苗株、猪瘟病毒、口蹄疫病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒、伪狂犬病毒等的核酸为模板，以DEPC(0.1%)H2O所提取的核酸为阴性对照，按最优体系和最佳程序做RT-PCR；PRRSV特异性实验结果见图1，只有PRRS疫苗株有扩增条带，其他猪源性病毒均为阴性。

（6） RT-PCR检测PRRSV灵敏度实验：提取PRRSV疫苗株RNA，然后10倍比逐级稀释RNA，以上述体系和程序做RT-PCR，在3%琼脂糖凝胶电泳上能检测出扩增条带的最高稀释度即为RT-PCR的灵敏度，RT-PCR检测PRRSV检测的灵敏度实验结果见图3；从左到右的稀释倍数为10^0、10¹、10²、10³、阴。

（7）临床样本检测：

建立的RT-PCR方法对猪场送检的12个临床猪全血样本进行病原检测；

1）血样采集：以ACD为抗凝剂（1:4）采集猪全血，对样本标号，

2）提取RNA：使用TAKARA公司的RNiplus使用说明，提取血样RNA；同时提取PRRSV疫苗毒株和DEPC(0.1%)H2O RNA为对照。

3）RT-PCR：以上述步骤提的RNA为模板，配制反转录体系进行反转录；Random primer终浓度为2μM；

PCR:以上述反转录产物cDNA为模板，配制PCR混合体系，上下游引物终浓度各为0.4μM,根据琼脂糖凝胶电泳成像，判定阴阳对照成立，实验结果成立：见图4，12个血样RT-PCR检测3份阳性（3/12）。

以上应用实例仅用于说明本发明，本发明不限于以下实例，任何本领域的技术人员，在本发明公开技术范围内，很容易进行改变或变化都涵盖在本发明保护范围之内。

Claims (1)

1.可同时鉴别猪繁殖与呼吸综合症病毒的RT-PCR技术，其特征在于，步骤为：

1）用于区分检测猪繁殖与呼吸综合症病毒野毒株与疫苗株的RT-PCR引物包括正义引物和反义引物，分别为：

名称 序列（5’-3’） 正义引物 CGACACCATCCGAGCCG 反义引物 CCTGCACCTGTGTCATCAAGC

2）提取RNA ：

   用DEPC(0.1%)H₂O溶解疫苗毒株干粉，取200μl疫苗，使用RNAiso plus提取RNA，用20μl无RNA酶的DEPC(0.1%)H₂O溶解RNA；

3）RT-PCR两步法：

   以上一步骤提取的RNA为模板，配制10μl反转录体系进行反转录，10μl反应体系的配制：Random primer终浓度为2μM，20μM Random primer 1μl、10μM dNTPs 0.5μl、5x M-MLV buffer 2μl、RNase Inhibitor (40U/μl) 0.5μl、 RTase M-MLV (RNase H-) 0.5μl、RNA模板5μl、RNase-free H₂O 0.5μL；

反转录程序为：30℃ 10 min、42℃ 60min、70℃ 15min、4℃ 5min，得到反转录产物；

配制PCR混合体系：20μM正义引物和反义引物各0.5μl，2.5μM dNTPs 8μl,10xPCR buffer（Mg²⁺) 5μl，TAKARA Taq(5U/μl) 0.5μl，反转录产物2μl，用灭菌去离子水补充至25μl，PCR反应程序：95 ℃ 5min，以94 ℃ 30s、55 ℃ 30s 和72 ℃ 1min进行30个循环，72 ℃ 10min，4 ℃ 5min，得到产物；

4）电泳观察：取10μl 的上述产物，经3%琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像系统观察。