CN104450969B - 猪博卡病毒1型、2型和3型多重pcr检测方法 - Google Patents

猪博卡病毒1型、2型和3型多重pcr检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了同时鉴别检测猪博卡病毒1型、2型和3型的多重PCR方法。多重PCR方法引物包括PBoV1引物对、PBoV2引物对及PBoV3引物对。该方法利用不同引物对扩增出不同大小的病毒核酸片段来达到鉴别诊断的目的。本发明可同时检测并区分PBoV1、PBoV2和PBoV3，具有特异性强、敏感性高、省时省力等优点。

Description

猪博卡病毒1型、2型和3型多重PCR检测方法
技术领域
本发明专利属于动物病原微生物检测技术领域，具体的说是一种同时鉴别三种不同猪博卡病毒的多重PCR检测方法。
背景技术
猪博卡病毒(Porcine bocavirus，PBoV)自2009年被首次发现以来，证实存在序列同源性较低的三种基因型(Jiang YH et al，2014，J Gen Virol，95：453-465)，被疑为猪圆环病毒相关性疾病、“猪腹泻病”的重要病原，并在这类病的发生发展上起重要作用，已成为世界各国科研人员的研究热点。
猪博卡病毒1型(PBoV1)发现于瑞典患仔猪多系统衰竭综合征的猪体中，其基因组大小约为4786bp(GenBank Number：HQ223038)，核苷酸序列水平上与犬博卡病毒、牛细小病毒、大猩猩博卡病毒和人博卡病毒的同源性分别为52-55％、44-45％、50％和44-48％(AL et al.，2009，Virus Res，146(1-2)：125-129)。基因组结构编码3个主要的开放阅读框(Open reading frames，ORF)，ORF1和ORF3编码非结构蛋白(NS1和NP1)，ORF2编码结构蛋白(VP1/2)(Zeng S et al.，2011，J Gen Virol，92(Pt 4)：784-788)。
猪博卡病毒2型(PBoV2)亦是利用病毒的宏基因组研究方法之一非序列依赖的单一引物核酸扩增技术(Sequence-independent single primer amplification，SISPA)由中国科研人员发现于中国健康猪群的粪便中，而在该基因型中仍有不同的基因亚群，它们的基因组大小分别约为5173bp和5186bp(GenBank Number：HM053693-GU053694)，核苷酸序列同源性为93.6％-94.2％。与其他博卡病毒属一样也有3个主要的ORF(Cheng WX，et al.，2010，PLoS One，5(10)：e13583)。
此外，在发现PBoV2的同时，在样品6V和7V中还发现了不同于PBoV2的DNA片段(2407bp和2434bp)(GenBank Number：HM053672-HM053673)，其包括部分非结构蛋白基因和完整的VP1基因，故把6V和7V命名为猪博卡病毒3型(PBoV3)。之后的研究中，北爱尔兰研究人员又报道两种PBoV，其基因组大小为5082bp(GenBank Number：JF512472)和4125bp(GenBank Number：JF512473)，进化树分析其也与6V和7V同源性高(McKillen J et al.，2011，Vet Microbiol，152(1-2)：39-45)。香港的科学人员也发现两种PBoV，其基因组大小为5278bp和5177bp(GenBank Number：JF429834-JF429836)，进化树分析其与6V和7V同源性高(Lau SK et al.，2011，J Gen Virol，92(Pt 9)：2047-2059)。
目前，猪场中猪博卡病毒混合感染严重。现有文献表明，由于病原研究基础较薄弱和体外病毒分离培养等难度，其检测方法主要有单纯PCR(Zhai S et al.，2010，ArchVirol，155(8)：1313-1317)、荧光PCR(Li B et al.，J Virol Methods.179(2)：390-395)、双重PCR(蔡雨函等，2013，中国兽医科学，43(8)：833-838)等，存在着费时费力、不能同时鉴别三种病毒等缺点。
发明内容
本专利的目的在于运用分子生物学、生物信息学等方法进行引物设计、序列比对及反应体系优化，构建三种猪博卡病毒多重PCR检测方法，实现猪博卡病毒“一样三检”的快速检测效果。该方法为猪博卡病毒诊断提供一种快速检测方法，填补三种猪博卡病毒诊断方法的空白，为猪博卡病毒不同基因型的诊断、调查、防控及净化提供一定的技术支持与帮助。
本发明专利要解决的技术问题通过以下技术方案来实现：
本发明涉及的检测引物有3对，分别是PBoV1引物对、PBoV2引物对及PBoV3引物对，其中用于PBoV1检测的PBoV1引物对包括PBoV1-F和PBoV1-R两条引物，用于PBoV2检测的PBoV2引物对包括PBoV2-F和PBoV2-R两条引物以及用于PBoV3检测的PBoV3引物对包括PBoV3-F和PBoV3-R两条引物。
本发明的特征还涉及到以下步骤。
配置50μL PCR反应体系：2×Buffer 25μL，PBoV1-F、PBoV1-R、PBoV2-F、PBoV2-R、PBoV3-F和PBoV3-R各0.5μL，PBoV1、PBoV2及PBoV3模板分别3μL，灭菌H2O 13μL。
PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共计35个循环；72℃再延伸10min；
结果观察：取10μL PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像系统下观察结果。
进一步的，本发明建立的方法，其特征在于包括了本发明所述的引物。
更进一步的，本发明所述的引物用于检测猪博卡病毒1型、2型和3型。
所述的步骤用于检测猪博卡病毒1型、2型和3型的单一感染或混合感染。
本发明所述的应用或者检测方法不仅仅用于临床的疾病诊断和检测，还可以应用于畜牧业、食品安全、生物制药、生物模型构建等多种非疾病诊断和治疗的领域。
本发明公开了同时鉴别检测猪博卡病毒1型、2型和3型的多重PCR方法，具有特异性强、敏感性高、省时省力等优点。该方法为猪博卡病毒的诊断提供一种快速检测方法，填补三种猪博卡病毒诊断方法的空白，为猪博卡病毒不同基因型的诊断、调查、防控及净化提供一定的技术支持与帮助。
附图说明
图1是多重PCR扩增结果；M：DNA Marker 2000；1：阴性对照；2：PBoV1阳性质粒；3：PBoV2阳性质粒；4：PBoV3阳性质粒；5：PBoV1+PBoV2+PBoV3阳性质粒；
图2是多重PCR特异性试验结果；M：DNA Marker 2000；1：阴性对照；2：PBoV1阳性质粒；3：PBoV2阳性质粒；4：PBoV3阳性质粒；5：PBoV1+PBoV2+PBoV3阳性质粒；6：猪圆环病毒2型阳性DNA；7：犬博卡病毒阳性DNA；8：猫博卡病毒阳性DNA；
图3多重PCR敏感性结果；M：DNA Marker 2000；1-8：100-10-7质粒倍比稀释。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，其操作步骤会进一步明确。
优化实施例：
1材料和方法
1.1猪博卡病毒1型、2型和3型阳性重组质粒，猪圆环病毒2型毒株由广东省农业科学院动物卫生研究所制备保存。此外，猪博卡病毒3型、犬博卡病毒、猫博卡病毒毒株由香港大学刘嘉佩教授馈赠。
1.2主要试剂
DNA提取试剂盒、PCR试剂购自北京天根公司，DNA Marker 2000购自Takara公司。
1.3引物设计
分别根据最新文献及GenBank中猪博卡病毒1型、2型、3型的序列，设计三对引物。引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。引物序列见表1。
表1多重PCR引物序列
备注：Y＝C/T；K＝G/T；B＝G/T/C；V＝G/A/C
1.4DNA的提取
按照DNA提取试剂盒说明书进行病毒DNA提取。
1.5多重PCR方法建立
以猪博卡病毒1型、2型和3型阳性重组质粒混合物为多重PCR的模板，建立多重PCR方法。采用50μL PCR反应体系：2×Buffer 25μL，PBoV1-F、PBoV1-R、PBoV2-F、PBoV2-R、PBoV3-F和PBoV3-R各0.5μL，PBoV1、PBoV2及PBoV3模板分别3μL，灭菌H2O 13μL。PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共计35个循环；72℃再延伸10min。取10μL PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成效系统下观察结果。
1.6多重PCR的特异性试验
以优化好的多重PCR反应体系及条件，对猪博卡病毒1型、2型、3型、猪圆环病毒2型、犬博卡病毒、猫博卡病毒等进行PCR扩增，来检测该方法的特异性。
1.7多重PCR的敏感性试验
分别测定猪博卡病毒1型、2型、3型阳性重组质粒的模板浓度，然后进行倍比稀释，来测定该方法的敏感性。
2结果
2.1多重PCR的扩增
采用优化好的多重PCR对猪博卡病毒1型、2型、3型阳性重组质粒及混合液进行扩增，结果获得大小约为600bp，350bp及200bp的片段，与测序结果620bp、329bp及163bp的片段相吻合，结果如图1所示。
2.2多重PCR的特异性试验
用建立的多重PCR对猪博卡病毒1型、2型、3型单个阳性重组质粒及混合液、猪圆环病毒2型、犬博卡病毒、猫博卡病毒等核酸进行扩增，结果显示只有猪博卡病毒1型、2型、3型单个阳性重组质粒及混合液出现预期大小的扩增目的条带，而猪圆环病毒2型、犬博卡病毒、猫博卡病毒等未呈现条带，表明该方法具有较好的特异性(如图2所示)。
2.3多重PCR的敏感性试验
经检测，优化后的多重PCR的敏感性分别为8.189pg/ml(PBoV1)、10.28pg/ml(PBoV2)和9.405pg/ml(PBoV3)(如图3所示)。

Claims (2)

1.一种用于检测猪博卡病毒1型、2型和3型多重PCR的引物组合物，其特征在于：所述引物组合物包括PBoV1引物对、PBoV2引物对及PBoV3引物对，其中PBoV1引物对包括PBoV1-F和PBoV1-R两条引物，PBoV2引物对包括PBoV2-F和PBoV2-R两条引物以及PBoV3引物对包括PBoV3-F和PBoV3-R两条引物；所述的引物具体为：
PBoV1-F：TCAATGGTACGTGCCGATAT SEQ ID NO.1
PBoV1-R：TTATTCTGCTTCGCCTGGTT SEQ ID NO.2
PBoV2-F：GAGGTATTCAGCCAGCACAT SEQ ID NO.3
PBoV2-R：AGYTCCTGCGGTTCTGTTTC SEQ ID NO.4
PBoV3-F：TYTTGAACATCCAGGGCTAC SEQ ID NO.5
PBoV3-R：CCATACACCTTBACCGCVTK SEQ ID NO.6。
2.一种非疾病诊断目的的猪博卡病毒1型、2型和3型多重PCR检测方法，其特征在于包括权利要求1所述的引物组合物；所述方法为：配置50μL PCR反应体系：2×Buffer25μL，PBoV1-F、PBoV1-R、PBoV2-F、PBoV2-R、PBoV3-F和PBoV3-R各0.5μL，PBoV1、PBoV2及PBoV3模板分别3μL，灭菌H2O13μL；
其中，PBoV1-F和PBoV1-R用于猪博卡病毒1型的检测，PBoV2-F和PBoV2-R用于猪博卡病毒2型的检测，PBoV3-F和PBoV3-R用于猪博卡病毒3型的检测；
PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共计35个循环；72℃再延伸10min；
结果观察：取10μL PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像系统下观察结果。
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