CN104651534A - 一种猪圆环病毒环介导等温扩增试剂盒及其应用 - Google Patents

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谢永平
许力干
韦志锋
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Abstract

本发明公开了一种猪圆环病毒环介导等温扩增试剂盒及其应用，该试剂盒包括LAMP引物、2×反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、荧光目视检测试剂、超纯水和猪圆环病毒DNA模板；所述的LAMP引物包括外引物F3与B3、内引物FIP与BIP和环引物LF与LB。特异性检测和敏感性检测证实，本发明提供的环节导等温扩增试剂盒可实时监测反应并且定量检测出猪圆环病毒的拷贝数，快速准确的获得检测结果，为简便、快速和可靠的检测猪圆环病毒带来便利。

Description

一种猪圆环病毒环介导等温扩增试剂盒及其应用
技术领域
 本发明涉及微生物检测技术领域，具体说是涉及一种快速、可视化并且可实时定量检测猪圆环病毒的环介导等温扩增试剂盒及其应用。
背景技术
圆环病毒（PCV）属于圆环病毒科，是目前已知脊椎动物病毒中最小的一种。猪是圆环病毒的主要宿主，各种年龄的猪对圆环病毒均有较强易感性。胚胎期或生后早期感染的猪，往往在断奶后才发病，一般集中在5周龄~18周龄，尤其在6周龄~12周龄最多见。怀孕母猪感染圆环病毒后，导致繁殖障碍，并可经胎盘垂直传染给仔猪。感染猪可自鼻液、粪便等排泄物中排出病毒，经消化道、呼吸道引起感染。
以圆环病毒II型（PCV-2）为主要病原，并与猪细小病毒（PPC）或与猪繁殖、呼吸综合征病毒（PRRSV）等病原共同感染而引起的一种新的传染病——断奶仔猪衰竭综合征，近年来，已在世界各地发生；此外圆环病毒可引起猪皮炎与肾病综合征，该病发病率可达14％，病死率可高达30％；可引起增生性坏死性间质性肺炎，该病发病率为2％~30％，病死率为4％~10％；还可造成繁殖障碍，导致母猪发情率增加、产木乃伊胎、流产以及死产和产弱仔等，给养猪业带来严重威胁和巨大的经济损失。
对圆环病毒的快速准确诊断是临床上防治猪圆环病毒的关键。目前实验室诊断PCV的方法大致可分为2类：①病毒的分离与鉴定；②分子生物学方法。病毒分离与鉴定具有结果准确可靠的特点，多用于急性病例的确诊和新疫区的确定，但此方法需要多次操作程序，影响因素较多，且费时费力，不适于此病的快速诊断。分子生物学方法包括PCR、定量PCR、套式PCR，虽然PCR方法较病毒分离鉴定方法快速准确，但需要昂贵的仪器设备，成本较高，在结果判定上需要进行琼脂糖凝胶电泳，容易造成实验室污染导致出现假阳性结果，也不适合基层和现场检测。
发明内容
本发明的目的是为了解决基层检测猪圆环病毒困难、耗时长和仪器昂贵等问题，提供一种为基层简便、快捷准确地检测猪圆环病毒的试剂盒，为实现本发明目的所使用的技术方案为：一种猪圆环病毒环介导等温扩增试剂盒，该试剂盒包括LAMP引物、2×反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、荧光目视检测试剂、超纯水和猪圆环病毒DNA模板；所述的LAMP引物包括外引物F3（SEQ ID NO：1）与B3（SEQ ID NO：2）、内引物FIP（SEQ ID NO：3）与BIP（SEQ ID NO：4）和环引物LF（SEQ ID NO：5）与LB（SEQ ID NO：6）；
其中：
F3   GGGAGTCTGGTGACCGTT
B3  CCATCCCACCACTTGTTTCT
FIP  ACGCTTCTGCATTTTCCCGCTCGAGCAGCACCCTGTAACG
BIP CACGTCATTGTGGGGCCACCTTCCAGTATGTGGTTTCCGG
LF TTCAAAAGTTCAGCCAGCCC
LB TGTGGTAAAAGCAAATGGGCT；
所述的2×反应缓冲液是Tris-HCL、KCL、MgSO4、(NH4)2SO4、Tween20、Betaine和dNTPs。
以上所述的猪圆环病毒DNA模板提取自猪圆环病毒培养物，是使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取。
以上所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。
以上所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL 35-55mM、KCL 10-30mM、MgSO4 15-28mM、(NH4)2SO4 18-28mM、Tween20 0.5-1.5℅、Betaine 1.3-3.5M 和dNTPs 2.4-4.8mM，其配制方法在pH为8.6条件下，将上述溶剂混合均匀获得。
一种猪圆环病毒环介导等温扩增试剂盒的应用，于兽医临床上检测疑似猪圆环病变组织是否含有猪圆环病毒，具体检测步骤包括：
（1）LAMP引物的设计与合成
（2）检测猪圆环病毒DNA模板的提取
（3）LAMP反应体系建立
（4）LAMP检测方法。
以上所述的LAMP反应体系建立以25μl计，
2×反应缓冲液                       12.5 μL
Bst DNA聚合酶                      1 μL
FIP                                 40 pmol
BIP                                 40 pmol
F3                                  5 pmol
B3                                  5 pmol
猪圆环病毒DNA                      2 μL
超纯水                              补足25 μL。
以上所述的LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测的方法。
以上所述的LAMP检测方法采用Loopamp LA-320C实时浊度仪进行密闭全程监控，反应温度为63℃、反应在20-30分钟间出现扩增。
本发明的实质性特点和进步是：
1）特异性强
所检测的阴性对照病毒和水对照均无阳性结果出来，与PCR检测结果一致。且操作简便、快速获得检测结果、无需昂贵复杂的仪器。
2）灵敏度高
普通PCR检测方法的灵敏度为1.274×10-2 ng/μL，而使用本发明的LAMP检测方法，检测限约为1.274×10-3 ng/μL，是普通PCR的10倍。
3）迅速获得结果
普通的PCR整个过程在24小时左右才能得出结果，目前多数建立的LAMP反应方法在反应结束后，须采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像来判定结果，从病毒基因组DNA提取到获取试验结果，需要4-5小时左右。本发明提供的LAMP检测方法反应在25 分钟左右出现扩增，60分钟内即可完成扩增，且结果判读方式简便-，依据反应管浊度值的变化情况即可判断结果，扩增反应结束即可获得试验结果，不需要再进行琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像来判定结果，从基因组DNA提取到获得最终结果可在2-3小时内完成。
4）不造成污染
目前LAMP方法用于直接观察的荧光染料为反应后加入，而本发明的荧光染料是在反应前加入的钙黄绿素商用染料（非syber-green），检测过程不需要开盖。此外，本发明的LAMP检测方法在结果判定上，直接通过浊度仪检测反应管的浊度值来判定结果，可不进行荧光染料法检测结果或者进行琼脂糖凝胶电泳检测结果，不需要开盖，能有效避免污染。
5）可实时定量
本发明利用Tubidimeter real-time LA-320 浊度仪来实时分析LAMP反应的结果，不同的标准样品的浓度对应的浊度值的时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可求出各时间的猪圆环病毒2型拷贝数，达到定量检测产物的目的。
附图说明
图1是本发明的LAMP方法特异性检测结果，其中1：猪圆环病毒2型；2：细小病毒；3：伪狂犬病毒；4：猪瘟病毒；5：蓝耳病病毒；6：口蹄疫病毒；7：传染性胃肠炎病毒；8：流行性腹泻病毒；9：空白对照（水）。猪圆环病毒2型反应管出现浊度的上升曲线，7 株对照病毒反应管和水对照反应管均无扩增。
图2和图3是分别使用本发明LAMP方法和普通PCR方法进行的猪圆环病毒2型敏感性检测的结果。其中1：1.27×102 ng/μL；2：1.27×101 ng/μL；3：1.27×100ng/μL；4：1.27×10-1ng/μL； 5：1.27×10-2ng/μL；6：1.27×10-3ng/μL；7：1.27×10-4ng/μL；8：1.27×10-5ng/μL；9：1.27×10-6 ng/μL；10：1.27×10-7 ng/μL；11：1.27×10-8 ng/μL；12：水。猪圆环病毒2型基因组DNA的起始浓度为1.27×102 ng/μL，经10倍倍比连续稀释后，进行LAMP和PCR扩增，结果显示本发明的LAMP法检测限约为1.27×10-3 ng/μL，而普通PCR方法检测限约为1.27×10-2ng/μL。
图4是加入荧光染料后肉眼观察结果：左管为以猪圆环病毒2型基因组DNA为模板的反应情况，为阳性结果，右管为阴性对照的反应情况，为阴性结果。
图5是本发明猪圆环病毒2型定量标准曲线：利用不同的标准样品的浓度对应的浊度值对时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可求出各时间的猪圆环病毒2型拷贝数。
具体实施方式
1、材料的准备
猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、蓝耳病病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病毒、传染性胃肠炎病毒、流行性腹泻病毒、细小病毒，均为市售疫苗。LAMP DNA扩增试剂盒购自北京蓝谱生物科技有限公司，货号LMP204；病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒，购自康为世纪生物科技有限公司，货号CW0548。
2 、LAMP引物的设计与合成
根据GenBank 中的圆环病毒2型Rep基因序列，利用LAMP法引物辅助设计软件PrimerExplorer V4 软件设计一套LAMP引物，其中F3、B3 为外引物，FIP、BIP 为内引物，LF和LB为环引物，其中
F3   GGGAGTCTGGTGACCGTT
B3  CCATCCCACCACTTGTTTCT
FIP  ACGCTTCTGCATTTTCCCGCTCGAGCAGCACCCTGTAACG
BIP CACGTCATTGTGGGGCCACCTTCCAGTATGTGGTTTCCGG
LF TTCAAAAGTTCAGCCAGCCC
LB TGTGGTAAAAGCAAATGGGCT
3、病毒基因组DNA提取
使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒（康为世纪生物科技有限公司，货号CW0548）提取猪圆环病毒2型或疑似猪圆环病毒2型感染的病变组织的DNA/RNA，以及对照病毒的基因组DNA/RNA。
4、LAMP反应体系建立
按照试剂盒说明书，按25μl体系配置：
2×反应缓冲液                          12.5 μL
Bst DNA聚合酶                         1 μL
FIP                                    40 pmol
BIP                                    40 pmol
F3                                       5 pmol
B3                                       5 pmol
猪圆环病毒DNA                          2μL
超纯水                                   补足25 μL。
LAMP反应在以实时浊度仪( LA-320C，日本荣研公司)进行密闭全程监控的形式监测本方法的检出情况，浊度仪实时监控扩增情况，可绘制标准曲线，通过获得未知样品达到0.1浊度值对应的时间值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数，反应温度以63℃做为反应温度。
5、LAMP检测方法
1）特异性检测
使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取猪圆环病毒2型以及对照毒株-猪瘟病毒、猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病毒、传染性胃肠炎病毒、流行性腹泻病毒、细小病毒的基因组DNA/RNA，作为LAMP反应的模板，同时以水作为空白对照，检验LAMP方法的特异性。
2）敏感性检测
提取的猪圆环病毒2型基因组DNA，测定其浓度，用RNA-Free Water连续10倍倍比稀释成10个稀释度，以各DNA稀释度作为模板，进行LAMP扩增和PCR扩增，对比本发明的LAMP方法和普通PCR方法对检测圆环病毒2型的敏感性。
3）荧光可视化检测
根据浊度仪监控优化的条件，加入荧光染料，荧光染料在反应前加入，加入的染料为钙黄绿素商用染料，63℃下反应30分钟后，在紫外灯下观察，不采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像，避免开盖跑电泳观察造成的气溶胶污染实验室。
实施例1 LAMP检测方法的特异性结果
对1株猪圆环病毒2型、7株对照病毒和水对照进行LAMP扩增，结果如图1所示，猪圆环病毒2型反应管在20分钟左右出现浊度的上升曲线，为阳性结果，7株对照病毒反应管和水对照反应管均无扩增情况出现，为阴性结果。
实施例2 LAMP检测方法的敏感性结果
猪圆环病毒2型基因组DNA的起始浓度为1.27×102 ng/μL，经10倍倍比连续稀释后，进行LAMP和普通PCR扩增，结果如图2和图3所示，结果显示本发明的LAMP法检测限约为1.27×10-3ng/μL，而普通PCR 法检测限为1.27×10-2ng/μL。
实施例3 LAMP检测方法的荧光可视化检测结果
根据浊度仪监控优化的条件，加入荧光染料，63℃反应60分钟后，在紫外灯下观察，图4为观察结果，左管为以猪圆环病毒2型DNA为模板的反应情况，为阳性结果，右管为阴性对照，为阴性结果。试验结果表明，建立的LAMP方法可以方便基层使用，只需使用试剂盒配合本方法设计的LAMP引物，加入样品后，用低廉的水浴锅来保持63℃ 60分钟，即可快速观察结果，且无需开盖，避免了污染。
实施例4猪圆环病毒2型定量标准曲线的绘制
以猪圆环病毒2型DNA为模板，以本LAMP方法设计的外引物F3和B3为PCR扩增引物，将PCR扩增得到的目的基因片段连接于载体pMD18-T，转化大肠杆菌感受细胞DH5a，氨苄西林抗性筛选获得单克隆菌，提取重组的质粒DNA，经测序确认后，作为标准样品，测定重组质粒pMD18-T-Rep的起始浓度，用RNA-Free Water进行连续10倍倍比稀释8个稀释度，取各稀释度2 μL作为模板进行LAMP扩增，
设置对照：浓度为1.68×102 ng/μL、1.68×101 ng/μL、1.68×100 ng/μL、1.68×10-1 ng/μL、1.68×10-2 ng/μL、1.68×10-3ng/μL、1.68×10-4 ng/μL、1.68×10-5 ng/μL、1.68×10-6 ng/μL、1.68×10-7 ng/μL的标准重组质粒pMD18-T-Rep样品各一个，因为浓度的负对数值与浊度值为0.1的时间值成线性关系，所以可以将浊度仪捕捉到的值与时间（如表1）做成标准曲线，获得标准曲线方程，y=0.2615x-8.2746，如图5所示。从标准曲线方程来看相关系数R2为0.9932，呈良好的线性关系。以时间为X值，可求出Y值即浓度的负次方数，则浓度为10-y，再乘以基数1.68，即为1.68 x10-y ng/μL。依据拷贝数换算公式copies/μL=（6.02 x 1023 x (ng/ul x 10-9)） / (DNA length x 660)，DNA length为载体序列大小加上目的基因序列大小，为2693+220=2913 bp，将其换算成拷贝数（copies/μL）：6.02 x 1023 x（2.05 x10-y x 10-9）/ (2913 x 660)，简化为：5.25 x 108 x10-y。如某试验样品达到浊度值为0.1的时间为30分钟时，带入所建立的标准曲线方程，求出Y等于-1.3296，则浓度为101.3296，再乘以基数1.68，即为该试验样品的浓度1.68×101.3296ng/μL，拷贝数为5.25 x 108 x101.3296，即为5.25 x 109.3296 copies/μL，从而达到定量的效果。
表1
时间（min） 24 28 32 36 39 42 46 52
标准值（-LOG） -2 -1 0 1 2 3 4 5

Claims (8)

1.一种猪圆环病毒环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括LAMP引物、2×反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、荧光目视检测试剂、超纯水和猪圆环病毒DNA模板；所述的LAMP引物包括外引物F3（SEQ ID NO：1）与B3（SEQ ID NO：2）、内引物FIP（SEQ ID NO：3）与BIP（SEQ ID NO：4）和环引物LF（SEQ ID NO：5）与LB（SEQ ID NO：6）；
其中：
F3  GGGAGTCTGGTGACCGTT
B3  CCATCCCACCACTTGTTTCT
FIP  ACGCTTCTGCATTTTCCCGCTCGAGCAGCACCCTGTAACG
BIP CACGTCATTGTGGGGCCACCTTCCAGTATGTGGTTTCCGG
LF TTCAAAAGTTCAGCCAGCCC
LB TGTGGTAAAAGCAAATGGGCT；
所述的2×反应缓冲液是Tris-HCL、KCL、MgSO4、(NH4)2SO4、Tween20、Betaine和dNTPs。
2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的猪圆环病毒DNA模板提取自猪圆环病毒培养物，是使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取。
3.根据权利要求1所述的猪圆环病毒环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。
4.根据权利要求1所述的猪圆环病毒环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL 35-55mM、KCL 10-30mM、MgSO4 15-28mM、(NH4)2SO4 18-28mM、Tween20 0.5-1.5℅、Betaine 1.3-3.5M 和dNTPs 2.4-4.8mM。
5.一种猪圆环病毒环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，于兽医临床上检测疑似猪圆环病变组织是否含有猪圆环病毒，具体检测步骤包括：
（1）LAMP引物的设计与合成
（2）检测猪圆环病毒DNA模板的提取
（3）LAMP反应体系建立
（4）LAMP检测方法。
6.根据权利要求5所述的猪圆环病毒环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，所述的LAMP反应体系建立以25μl计，
2×反应缓冲液                       12.5 μL
Bst DNA聚合酶                      1 μL
FIP                                 40 pmol
BIP                                 40 pmol
F3                                  5 pmol
B3                                  5 pmol
猪圆环病毒DNA                     2 μL
超纯水                              补足25 μL。
7.根据权利要求5所述的猪圆环病毒环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，所述的LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测的方法。
8.根据权利要求5所述的猪圆环病毒环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，所述的LAMP检测方法采用实时浊度仪进行密闭全程监控。
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