CN102002531A - 一种弓形虫检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种弓形虫检测试剂盒及其应用。本发明提供的试剂盒，包括三对引物，即与弓形虫基因组中Gen Bank Accession Number AF146527基因结合的内侧引物对、外侧引物对和环形引物对。本发明的弓形虫检测试剂盒，检测灵敏度高，最低可检测出10个拷贝的靶DNA，操作简单方便，特别适于养猪场的常规体检，基层临床医学检测工作及现场即时检测。

Description

一种弓形虫检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及一种弓形虫检测试剂盒及其应用。

背景技术

弓形虫病是由刚地弓形虫引起的一种人畜共患的原虫病。弓形虫可感染多种动物：45种哺乳动物，70种鸟类和5种冷血动物。猫和猫科动物是弓形虫的终末宿主，在终末宿主体内弓形虫主要侵袭小肠上皮细胞，造成肠道疾病。而在中间宿主(如猪、牛、羊等)体内，弓形虫侵入肠壁经血液或淋巴进入单核巨噬细胞系统的细胞内寄生，并扩散到全身各处组织器官，如脑、淋巴结、肝、心、肺、肌肉等，造成全身多器官性的病变，对中间宿主的危害相当大。猪是弓形虫的主要易感动物，据有关报道显示，我国猪场的弓形虫感染率最高，约26.6％，最高可达60％。

现有的弓形虫检测方法很多，大致可以分为三大类，即病原学诊断方法、血清学诊断方法和分子生物学诊断法。病原学诊断方法包括组织学诊断、动物接种试验和细胞培养法。病原学诊断需要一定数量实验动物，而且实验周期较长。血清学诊断方法包括美蓝染色试验(DT)、间接荧光抗体试验(IFAT)、凝集试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)。分子生物学诊断方法主要是聚合酶链式反应(PCR)，该方法比前两种方法快速，灵敏，但需要使用特殊的PCR仪，不适于基层应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种弓形虫检测试剂盒及其应用。本发明提供的试剂盒基于环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术，可以快速检测弓形虫。

本发明提供了检测弓形虫的专用引物，由以下三对环介导等温扩增所用引物组成；一对引物是与弓形虫基因组中GenBank Accession Number AF146527基因(核苷酸序列如序列表的序列1所示)结合的内侧引物对，一对引物是与弓形虫基因组中GenBankAccession Number AF146527基因结合的外侧引物对，一对引物是与弓形虫基因组中GenBank Accession Number AF146527基因结合的环形引物对。

所述专用引物的靶区域具体可为序列表的序列1自5’末端第301-511位核苷酸所示的DNA。

所述内侧引物对由上游引物FIP和下游引物BIP组成，所述上游引物FIP的核苷酸序列具体可为序列表中的序列4，所述下游引物BIP的核苷酸序列具体可为序列表中的序列5；所述外侧引物对由上游引物F3和下游引物B3组成，所述上游引物F3的核苷酸序列具体可为序列表中的序列2，所述下游引物B3的核苷酸序列具体可为序列表中的序列3；所述环形引物对由上游引物LF和下游引物LB组成，所述上游引物LF的核苷酸序列具体可为序列表中的序列6，所述下游引物LB的核苷酸序列具体可为序列表中的序列7。

F3：5’-TGGGAAGCGACGAGAGTC-3’(序列表的序列2)；

B3：5’-TGGATTCCTCTCCTACCCCT(序列表的序列3)；

FIP：5’-CCGGTGTCTCTTTTTCCACCCTTTTTTCGGAGAGGGAGAAGATGTTT-3’(序列表的序列4)；

BIP：5’-TCGTGGTGATGGCGGAGAATTTTCCTCCTCCCTTCGTCCAA-3’(序列表的序列5)；

LF：5’-GGAAAAGCAGCCAAGCCG-3’(序列表的序列6)；

LB：5’-GAATTGAAGAGTGGAGAAGAGGGCG-3’(序列表的序列7)。

应用所述专用引物检测弓形虫的原理如下：

根据弓形虫GenBank Accession Number AF146527基因(序列表的序列1)部分区域(序列1自5’末端第301-511位核苷酸)设计一组用于环介导等温扩增的引物，即内侧引物对(内侧上游引物FIP和内侧下游引物BIP)、外侧引物对(外侧上游引物F3和外侧下游引物B3)和环形引物对(环形上游引物LF和环形下游引物LB)。三对引物和所述区域变异区域的八个特定区域的序列完全配对(见表1)，可以确保反应的彻底进行，也保证了检测方法的特异性。

表1专用引物与序列1所示基因的结合区域

所述专用引物在具有高度链置换催化活性的DNA聚合酶的作用下可完成对模板DNA的扩增。扩增过程分为三个阶段，具体如下：

(1)循环起始阶段

一端内侧引物先与模板结合并启动DNA合成。相同一端的外侧引物随后与模板结合启动DNA合成，并发生链置换释放出含有内侧引物序列的DNA单链。该单链DNA作为模板先后与另一端的内侧引物和外侧引物结合，启动DNA合成并发生链置换，最后形成一个初始的茎环DNA。

(2)反应循环阶段

内侧引物与初始茎环DNA结合，启动链置换DNA合成，可产生另一个初始茎环DNA和一个新的两倍长度的茎环DNA。这些茎环DNA可作为模板继续与内侧引物结合启动链置换DNA合成，并且每次合成均可使茎环DNA的茎长度成倍增长。进入循环阶段后，会产生许多分子大小不同的茎环DNA，这些茎环DNA还可作为模版与环形引物结合，启动更多的DNA合成并发生链置换。最后经过一个小时的等温扩增，目的DNA可累积10⁹拷贝。

所述专用引物可用于制备试剂盒；所述试剂盒用于检测待测样本中是否含有弓形虫和/或辅助鉴定弓形虫。

本发明还保护含有所述专用引物的试剂盒；所述试剂盒用于检测待测样本中是否含有弓形虫和/或辅助鉴定弓形虫。该试剂盒在使用过程中，所述内侧引物对、所述外侧引物对和所述环形引物对作为一个整体组使用，使用时应该尽量避免引物二聚体的形成。

所述试剂盒可包括溶液B(B液)，由溶剂和溶质组成；溶剂为水(如双蒸水)；溶质及其浓度如下：所述上游引物F3为2.4-3.6pmol/μl，所述下游引物B3为2.4-3.6pmol/μl，所述上游引物FIP为20-28pmol/μl，所述下游引物BIP为20-28pmol/μl，所述上游引物LF为10-14pmol/μl，所述下游引物LB为10-14pmol/μl。

所述溶液B中，所述上游引物F3为3pmol/μl，所述下游引物B3为3pmol/μl，所述上游引物FIP为24pmol/μl，所述下游引物BIP为24pmol/μl，所述上游引物LF为12pmol/μl，所述下游引物LB为12pmol/μl。

所述试剂盒还可包括溶液A(A液)，由溶剂和溶质组成；溶剂为水(如双蒸水)；溶质及其浓度如下：KCl为16.67nmol/μl，MgSO₄·7H₂O为13.33nmol/μl，(NH₄)₂SO₄为16.67nmol/μl，钙黄绿素为0.083nmol/μl，MnCl₂·4H₂O为1nmol/μl，四种脱氧核苷酸(dNTPs)各2.33nmol/μl，甜菜碱为0.33μmol/μl，Tris-HCl(1M，pH8.8)为33.33nmol/μl，Tween-20为0.17％(体积百分含量)，Bst DNA聚合酶为0.80U/μl。

所述试剂盒还可包括C液，即阳性对照。所述阳性对照可为煮沸10分钟后的含弓形虫的小鼠腹水，弓形虫含量为100个/μl。

所述试剂盒还可包括离心管(如0.2或0.6ml规格)，检样管(在离心管中加一片FTA卡，如直径为1.2mm的FTA卡)，螺口离心管(如2.0ml规格)、一次性自吸式微量吸管(如10±2μl规格)和滴管(如每滴20±3μL规格)等。

本发明还提供了一种检测来自死亡动物的样品中是否携带弓形虫的方法，是用所述专用引物或所述试剂盒对来自死亡动物的样品的总DNA进行环介导等温扩增反应，检测扩增产物，确定来自死亡动物的样品中是否携带弓形虫；所述环介导等温扩增反应的条件为：60-65℃、30-90min。

所述环介导等温扩增反应的温度具体可为60-63℃或63-65℃。所述环介导等温扩增反应的时间具体可为：30-50min、50-60min、60-70min或70-90min。

应用本发明提供的专用引物或试剂盒检测弓形虫，可以通过直接检视反应液颜色的变化来判断样本中是否含有弓形虫。直接检视方法为：环介导等温扩增后，阳性对照由棕黄色变为亮绿色，阴性对照保持棕黄色不变(说明实验结果可信)；此时若待检样品也保持棕黄色，则说明待检样品的检测结果为阴性(该样本不含有弓形虫)，此时若待检测样品由棕黄色变为亮绿色，则说明待测样本的检测结果为阳性(该样品中含有弓形虫)。

所述弓形虫具体可为RH株、PY株、GY株、ZC株、NT株或CN株等现有的常规弓形虫毒株(宋慧群1，张德林2，廖申权1，翁亚彪1，林瑞庆1，朱兴全；中国弓形虫虫株529bp重复序列的PCR扩增、克隆及分析；中国农业科学2007，40(9)：2114-2118)。

本发明提供的试剂盒可用于检测多种样本(如核酸、血液、腹水、水样、脑、肺、肝、脾等)中的弓形虫。可用商品化试剂盒提取待测样本的核酸，所得核酸溶液直接作为模板使用。若待测样本为腹水或水样，可将待测样本放入2.0ml螺口离心管中，于沸水浴中煮沸10min，冷却至室温后即可做模板使用。若待测样本为血液，可取10μl血样样本滴加于检样管中的FTA卡上，孵育10min后，将液体吸出，留下卡片，加入200μl市售纯净水或双蒸水，室温下静置3分钟后将管内水全部吸出，所留FTA卡片即可作为模板使用。若待测样本为脑、肺、肝、脾等组织器官，可将采集的组织取一定量置于研钵中，加入市售纯净水或双蒸水，组织研磨成匀浆，反复冻融三次后，5000rpm离心5min，吸取上清；取10μl上清液滴加于检样管中的FTA卡上，孵育10min后将液体吸出，留下纸片，加入200μl市售纯净水或双蒸水，室温下静置3分钟后，将水全部吸出，所留FTA卡片即可作为模板使用。

用所述试剂盒进行检测时，环介导等温扩增前可将A液和B液混合均匀(9体积份A液和1体积份B液混合)，得到混合液，然后将模板、阳性对照和阴性对照(市售纯净水或双蒸水)分别与混合液混合，进行环介导等温扩增。

应用本发明提供的专用引物或试剂盒检测弓形虫，特异性高且灵敏度高，最低可检测出10个拷贝的靶DNA。与PCR检测方法相比，应用本发明提供的专用引物或试剂盒检测，不需要昂贵的PCR仪，只需普通的金属或水浴锅即可，并且检测结果通过观察可见荧光即可，操作简单方便。本发明的试剂盒可应用于养猪场的常规体检，基层临床医学检测工作及现场即时检测。

附图说明

图1为实施例4的检测结果。

图2为实施例5的检测结果。

图3为实施例6的检测结果。

图4为实施例7的检测结果。

图5为实施例8的检测结果。

图6为实施例9的检测结果。

图7为实施例10的检测结果。

图8为实施例11的检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。取待检猪淋巴结作组织切片检查，用吉姆萨染色镜检，如观察到有弓形虫速殖子可确诊为弓形虫感染的猪。

实施例1、弓形虫检测试剂盒的制备

一、引物的合成

人工合成以下3对引物：

F3：5’-TGGGAAGCGACGAGAGTC-3’(序列表的序列2)；

B3：5’-TGGATTCCTCTCCTACCCCT(序列表的序列3)；

FIP：5’-CCGGTGTCTCTTTTTCCACCCTTTTTTCGGAGAGGGAGAAGATGTTT-3’(序列表的序列4)；

BIP：5’-TCGTGGTGATGGCGGAGAATTTTCCTCCTCCCTTCGTCCAA-3’(序列表的序列5)；

LF：5’-GGAAAAGCAGCCAAGCCG-3’(序列表的序列6)；

LB：5’-GAATTGAAGAGTGGAGAAGAGGGCG-3’(序列表的序列7)。

二、检样管的制备

市售0.6ml离心管(要求无核酸污染)，装入用打孔器切下的直径1.2mm的FTA卡(Whatman，Cat No.WB120205)，得到检样管。

三、阳性对照的制备

含弓形虫的小鼠腹水，用双蒸水稀释至100个/μl，放入2.0ml螺口离心管中，水浴中煮沸10分钟，得到含有阳性对照(C液)的离心管，置于-20℃保存。

四、配制LAMP反应液

A液由溶质和溶剂组成；溶剂为双蒸水；溶质及其浓度如下：KCl为16.67nmol/μl，MgSO₄·7H₂O为13.33nmol/μl，(NH₄)₂SO₄为16.67nmol/μl，钙黄绿素为0.083nmol/μl，MnCl₂·4H₂O为1nmol/μl，四种脱氧核苷酸(dNTPs)各2.33nmol/μl，甜菜碱为0.33μmol/μl，Tris-HCl(1M，pH8.8)为33.33nmol/μl，Tween-20为0.17％(体积百分含量)，Bst DNA聚合酶为0.80U/μl。

B液由由溶质和溶剂组成；溶剂为双蒸水；溶质及其浓度如下：F3为3pmol/μl，B3为3pmol/μl，FIP为24pmol/μl，BIP为24pmol/μl，LF为12pmol/μl，LB为12pmol/μl。

五、试剂盒的组装

试剂盒由以下物质组成：A液、B液、含有阳性对照的离心管和检样管。

实施例2、弓形虫检测试剂盒的制备

一、引物的合成

同实施例1的步骤一。

二、反应管的制备

同实施例1的步骤二。

三、阳性对照的制备

同实施例1的步骤三。

四、配制LAMP反应液

A液同实施例1的A液。

B液由由溶质和溶剂组成；溶剂为双蒸水；溶质及其浓度如下：F3为3.6pmol/μl，B3为3.6pmol/μl，FIP为28pmol/μl，BIP为28pmol/μl，LF为14pmol/μl，LB为14pmol/μl。

五、试剂盒的组装

同实施例1的步骤五。

实施例3、弓形虫检测试剂盒的制备

一、引物的合成

同实施例1的步骤一。

二、反应管的制备

同实施例1的步骤二。

三、阳性对照的制备

同实施例1的步骤三。

四、配制LAMP反应液

A液同实施例1的A液。

B液由由溶质和溶剂组成；溶剂为双蒸水；溶质及其浓度如下：F3为2.4pmol/μl，B3为2.4pmol/μl，FIP为20pmol/μl，BIP为20pmol/μl，LF为10pmol/μl，LB为10pmol/μl。

五、试剂盒的组装

同实施例1的步骤三。

实施例4、弓形虫检测试剂盒的应用

取两头猪，1头确诊为弓形虫RH株感染的猪(病猪)，1头健康猪。对两头猪采血，分别采用实施例1制备的试剂盒对血液样本进行检测。

一、样本的处理

取10μl血液滴加于检样管中的FTA卡上，孵育10min后，吸除液体，留下FTA卡，加入200μl双蒸水，室温下静置3分钟(如需要，可在管内进行适当的人工混合)，将水全部吸出。

采用病猪血液进行上述处理，得到3支反应管，作为I组反应管。

采用健康猪血液进行上述处理，得到3支反应管，作为II组反应管。

二、环介导等温扩增

将A液和B液充分混合均匀(9体积份A液和1体积份B液混合)，得到混合液。

向I组反应管和II组反应管中每管加入20μl混合液，进行环介导等温扩增。在3支0.6ml离心管中各加入20μl混合液，再各加入10μl双蒸水(阴性对照)，环介导等温扩增。在3支0.6ml离心管中各加入20μl混合液，再各加入10μl C液(阳性对照)，进行环介导等温扩增。

环介导等温扩增的反应条件为：置于60℃恒温水浴反应90min。

三、检视

环介导等温扩增后，通过直接检视判断样本是否含有弓形虫。结果见图1。阳性对照均由棕黄色变为亮绿色，阴性对照均保持棕黄色不变。健康猪的3支反应管均为棕黄色，病猪的3支反应管均有亮绿色可见荧光。

实施例5、弓形虫检测试剂盒的应用

取两头猪，1头确诊为弓形虫PY株感染的猪(病猪)，1头健康猪。对两头猪采血，分别采用实施例3制备的试剂盒对血液样本进行检测。

一、样本的处理

同实施例4的步骤一。

二、环介导等温扩增

环介导等温扩增的反应条件为：置于65℃恒温水浴反应70min。其它均同实施例4的步骤二。

三、检视

环介导等温扩增后，通过直接检视判断样本是否含有弓形虫。结果见图2。阳性对照均由棕黄色变为亮绿色，阴性对照均保持棕黄色不变。健康猪的3支反应管均为棕黄色，病猪的3支反应管均有亮绿色可见荧光。

实施例6、弓形虫检测试剂盒的应用

取两头猪，1头确诊为弓形虫GY株感染的猪(病猪)，1头健康猪。对两头猪采血，分别采用实施例2制备的试剂盒对血液样本进行检测。

一、样本的处理

同实施例4的步骤一。

二、环介导等温扩增

环介导等温扩增的反应条件为：置于60℃恒温水浴反应50min。其它均同实施例4的步骤二。

三、检视

环介导等温扩增后，通过直接检视判断样本是否含有弓形虫。结果见图3。阳性对照均由棕黄色变为亮绿色，阴性对照均保持棕黄色不变。健康猪的3支反应管均为棕黄色，病猪的3支反应管均有亮绿色可见荧光。

实施例7、弓形虫检测试剂盒的应用

取两头猪，1头确诊为弓形虫ZC株感染的死猪，1头健康猪。对两头猪采血，分别采用实施例1制备的试剂盒对血液样本进行检测。

一、样本的处理

用死猪血液代替病猪血液，其它同实施例4的步骤一。

二、环介导等温扩增

环介导等温扩增的反应条件为：置于65℃恒温水浴反应30min。其它均同实施例4的步骤二。

四、检视

环介导等温扩增后，通过直接检视判断样本是否含有弓形虫。结果见图4。阳性对照均由棕黄色变为亮绿色，阴性对照均保持棕黄色不变。健康猪的3支反应管均为棕黄色，死猪的3支反应管均有亮绿色可见荧光。

实施例8、弓形虫检测试剂盒的应用

取两头猪，1头确诊为弓形虫NT株感染的死猪，1头健康猪。对两头猪分别取肝组织，分别采用实施例1制备的试剂盒对肝组织样本进行检测。

一、样本的处理

将肝组织置于研钵中，加入双蒸水，组织研磨成匀浆，反复冻融三次后，5000rpm离心5min，吸取上清，用商品化DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，购自天根生化科技北京有限公司)提取DNA，得到DNA溶液。

采用死猪的肝组织进行上述处理，得到死猪肝脏DNA模板。

采用健康猪的肝组织进行上述处理，得到健康猪肝脏DNA模板。

二、环介导等温扩增

将A液和B液充分混合均匀(9体积份A液和1体积份B液混合)，得到混合液。在3支0.6ml离心管中各加入20μl混合液，再各加入10μl死猪肝脏DNA模板，进行环介导等温扩增。在3支0.6ml离心管中各加入20μl混合液，再各加入10μl健康猪肝脏DNA模板，进行环介导等温扩增。在3支0.6ml离心管中各加入20μl混合液，再各加入10μl双蒸水(阴性对照)，环介导等温扩增。在3支0.6ml离心管中各加入20μl混合液，再各加入10μlC液(阳性对照)，进行环介导等温扩增。

环介导等温扩增的反应条件为：置于63℃恒温水浴反应60min。其它均同实施例4的步骤二。

三、检视

环介导等温扩增后，通过直接检视判断样本是否含有弓形虫。结果见图5。阳性对照均由棕黄色变为亮绿色，阴性对照均保持棕黄色不变。健康猪的3支反应管均为棕黄色，死猪的3支反应管均有亮绿色可见荧光。

如果检测脑组织、肺组织或脾组织等其它组织，将待测组织代替肝组织进行上述操作即可。

实施例9、弓形虫检测试剂盒的应用

取两头猪，1头确诊为弓形虫CN株感染的猪(病猪)，1头健康猪。对两头猪分别取腹水，分别采用实施例1制备的试剂盒对腹水样本进行检测。

一、样本的处理

将病猪腹水置于2.0ml螺口离心管中，于沸水浴中煮沸10min，得到病猪腹水模板。将健康猪腹水置于2.0ml螺口离心管中，于沸水浴中煮沸10min，得到健康猪腹水模板。冷却后进行环介导等温扩增。

二、环介导等温扩增

将A液和B液充分混合均匀(9体积份A液和1体积份B液混合)，得到混合液。在3支0.6ml离心管中各加入20μl混合液，再各加入10μl病猪腹水模板，进行环介导等温扩增。在3支0.6ml离心管中各加入20μl混合液，再各加入10μl健康猪腹水模板，进行环介导等温扩增。在3支0.6ml离心管中各加入20μl混合液，再各加入10μl双蒸水(阴性对照)，环介导等温扩增。在3支0.6ml离心管中各加入20μl混合液，再各加入10μl C液(阳性对照)，进行环介导等温扩增。

环介导等温扩增的反应条件为：置于63℃恒温水浴反应60min。

三、检视

环介导等温扩增后，通过直接检视判断样本是否含有弓形虫。结果见图6。阳性对照均由棕黄色变为亮绿色，阴性对照均保持棕黄色不变。健康猪的3支反应管均为棕黄色，病猪的3支反应管均有亮绿色可见荧光。

实施例10、弓形虫检测试剂盒灵敏度的检测

一、重组质粒的制备

合成序列表的序列1所示的DNA(AF146527基因)，与pEASY-T1Simple载体(pEASY-T1Simple Cloning Vector，购自全式金生物公司)连接，然后转化大肠杆菌感受态细胞(E.coliDH5α菌株，购自全式金生物公司)，得到含有重组质粒的重组菌。一个重组质粒分子对应一个拷贝的AF146527基因。

二、各浓度质粒样本的制备

提取重组菌中的重组质粒，通过分光光度计法测定并计算拷贝数浓度。用双蒸水将质粒稀释到所需要的浓度，即0.1×10⁴拷贝/μL、0.1×10³拷贝/μL、0.1×10²拷贝/μL、1拷贝/μL和0.1拷贝/μL。

三、弓形虫的检测

分别对步骤制备的各浓度的质粒样本进行检测，检测步骤如下：

将实施例1制备的试剂盒中的A液和B液充分混合均匀(9体积份A液和1体积份B液混合)，得到混合液。在21支0.6ml离心管中各加入20μl混合液，3支离心管加入10μL浓度为0.1×10⁴拷贝/μL的质粒样本(检测组1)，3支离心管加入10μL浓度为0.1×10³拷贝/μL的质粒样本(检测组2)，3支离心管加入10μL浓度为0.1×10²拷贝/μL的质粒样本(检测组3)，3支离心管加入10μL浓度为1拷贝/μL的质粒样本(检测组4)，3支离心管加入10μL浓度为0.1拷贝/μL的质粒样本(检测组5)，3支离心管加入10μL双蒸水(阴性对照)，3支离心管加入10μL C液(阳性对照)；进行环介导等温扩增(65℃反应1h)。

环介导等温扩增后，通过直接检视判断样本是否含有弓形虫。结果见图7。阳性对照均由棕黄色变为亮绿色，阴性对照均保持棕黄色不变。检测组1的三个反应管均有亮绿色可见荧光，检测组2的三个反应管均有亮绿色可见荧光，检测组3的三个反应管均有亮绿色可见荧光，检测组4的三个反应管均有亮绿色可见荧光，检测组5的三个反应管均为棕黄色无荧光液体。说明实施例1制备的试剂盒的灵敏度为10个拷贝的DNA。

实施例11、弓形虫检测试剂盒特异性的检测

将其它致病寄生虫：鸡源贝氏隐孢子虫、伊氏锥虫(612(L)型虫株(中国兽医药品监察所)、柔嫩艾美耳球虫(617(L)型虫株(中国兽医药品监察所)和新孢子虫，分别采用实施例1制备的试剂盒进行检测。

一、鸡源贝氏隐孢子虫和新孢子虫的分离鉴定

1、鸡源贝氏隐孢子虫的分离鉴定

取可疑病例鸡的粪便，先后过100目、150目和200目筛，去除粗渣。以适当生理盐水稀释后，2000×g离心30min，弃上清液，沉渣采用不连续Sheather’s蔗糖密度梯度离心法纯化，收集中间卵囊层，显微镜观察为隐孢子虫卵囊。

2、新孢子虫的分离鉴定

将无菌采集的新孢子虫感染牛流产胎儿新鲜的脑组织研磨成匀浆，加入2000mg/L青霉素和2000mg/L链霉素，用移液器取1mL匀浆接种到已长成单层的Vero细胞培养瓶中，在37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下进行培养。同时设对照组。接种后8h换液，之后隔天换液，每天用倒置显微镜观察支撑细胞和新孢子虫的形态，观察结果为新孢子虫。

二、样本的处理

用商品化DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，购自天根生化科技北京有限公司)分别提取各个寄生虫的基因组DNA，得到DNA溶液作为模板。

三、环介导等温扩增

将实施例1制备的试剂盒中的A液和B液充分混合均匀(体积比：9份A液，1份B液)，得到混合液。在18支0.6ml离心管中各加入20μl混合液，其中3支离心管加入10μL鸡源贝氏隐孢子虫DNA溶液(检测组1)，3支离心管加入10μL伊氏锥虫DNA溶液(检测组2)，3支离心管加入10μL柔嫩艾美耳球虫DNA溶液(检测组3)，3支离心管加入10μL新孢子虫DNA溶液(检测组4)，3支离心管加入10μL双蒸水(阴性对照)，3支离心管加入10μL C液(阳性对照)；进行环介导等温扩增。

四、检视

环介导等温扩增后，通过直接检视判断样本是否含有弓形虫。结果见图8。阳性对照均由棕黄色变为亮绿色，阴性对照均保持棕黄色不变。检测组1的三个反应管均为棕黄色，检测组2的三个反应管均为棕黄色，检测组3的三个反应管均为棕黄色，检测组4的三个反应管均为棕黄色。说明实施例1制备的试剂盒检测猪弓形虫具有良好的特异性。

Claims (10)

1.一种检测弓形虫的专用引物，由以下三对环介导等温扩增所用引物组成；一对引物是与弓形虫基因组中GenBank Accession Number AF146527基因结合的内侧引物对，一对引物是与弓形虫基因组中GenBank Accession Number AF146527基因结合的外侧引物对，一对引物是与弓形虫基因组中GenBank Accession Number AF146527基因结合的环形引物对。

2.如权利要求1所述的专用引物，其特征在于：所述内侧引物对由上游引物FIP和下游引物BIP组成，所述上游引物FIP的核苷酸序列是序列表中的序列4，所述下游引物BIP的核苷酸序列是序列表中的序列5；所述外侧引物对由上游引物F3和下游引物B3组成，所述上游引物F3的核苷酸序列是序列表中的序列2，所述下游引物B3的核苷酸序列是序列表中的序列3；所述环形引物对由上游引物LF和下游引物LB组成，所述上游引物LF的核苷酸序列是序列表中的序列6，所述下游引物LB的核苷酸序列是序列表中的序列7。

3.权利要求1或2所述的专用引物在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒用于检测待测样本中是否含有弓形虫和/或辅助鉴定弓形虫。

4.一种含有权利要求1或2所述的专用引物的试剂盒；所述试剂盒用于检测待测样本中是否含有弓形虫和/或辅助鉴定弓形虫。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括溶液B；所述溶液B由溶剂和溶质组成；所述溶剂为水；所述溶质及其浓度如下：所述上游引物F3为2.4-3.6pmol/μl，所述下游引物B3为2.4-3.6pmol/μl，所述上游引物FIP为20-28pmol/μl，所述下游引物BIP为20-28pmol/μl，所述上游引物LF为10-14pmol/μl，所述下游引物LB为10-14pmol/μl。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述溶液B中，所述上游引物F3为3pmol/μl，所述下游引物B3为3pmol/μl，所述上游引物FIP为24pmol/μl，所述下游引物BIP为24pmol/μl，所述上游引物LF为12pmol/μl，所述下游引物LB为12pmol/μl。

7.如权利要求4或5或6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括溶液A；所述溶液A由溶剂和溶质组成；所述溶剂为水；所述溶质及其浓度如下：KCl为16.67nmol/μl，MgSO₄·7H₂O为13.33nmol/μl，(NH₄)₂SO₄为16.67nmol/μl，钙黄绿素为0.083nmol/μl，MnCl₂·4H₂O为1nmol/μl，四种脱氧核苷酸各2.33nmol/μl，甜菜碱为0.33μmol/μl，1M pH8.8Tris-HCl为33.33nmol/μl，Tween-20为0.17％(体积百分含量)，Bst DNA聚合酶为0.80U/μl。

8.一种检测来自死亡动物的样品中是否携带弓形虫的方法，是用权利要求1或2所述专用引物对来自死亡动物的样品的总DNA进行环介导等温扩增反应，检测扩增产物，确定来自死亡动物的样品中是否携带弓形虫；所述环介导等温扩增反应的条件为：60-65℃、30-90min。

9.权利要求1或2所述专用引物或权利要求4至7中任一所述试剂盒在检测待测样本中是否含有弓形虫中的应用。

10.权利要求1或2所述专用引物或权利要求4至7中任一所述试剂盒在辅助鉴定弓形虫中的应用。

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