CN102363810B

CN102363810B - 牡蛎单孢子虫lamp检测试剂盒

Info

Publication number: CN102363810B
Application number: CN 201110356505
Authority: CN
Inventors: 谢芝勋; 谢丽基; 庞耀珊; 刘加波; 邓显文; 谢志勤
Original assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Current assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Priority date: 2011-11-11
Filing date: 2011-11-11
Publication date: 2013-04-24
Anticipated expiration: 2031-11-11
Also published as: CN102363810A

Abstract

本发明公开了一种牡蛎单孢子虫LAMP检测试剂盒，它采用环介导等温扩增(LAMP)技术，并根据牡蛎单孢子虫共有的基因保守区设计了两个特异性内引物、两个特异性外引物和两个特异性环引物。应用本发明的LAMP检测试剂盒，仅需通过对组织样品进行DNA提取并进行环介导等温扩增，即可检测出牡蛎单孢子虫，解决了现有技术检测时间长、工作量大、交叉污染、操作复杂等缺陷，具有特异性强、敏感性高、快速且成本低、操作方法更简单，特别适于基层现场快速检测牡蛎单孢子虫的需要。

Description

牡蛎单孢子虫LAMP检测试剂盒

技术领域

本发明涉及牡蛎单孢子虫检测领域，尤其是一种牡蛎单孢子虫LAMP检测试剂盒。

背景技术

单孢子虫(Haplospori dium sp)对牡蛎养殖的危害较大，主要感染牡蛎血细胞、结蒂组织和消化道上皮，可引起牡蛎较高的死亡率，在美洲、大洋洲和亚洲等国家的感染普遍存在。

单孢子虫的传统检测方法有电镜观察、组织细胞学检查、原位杂交等，这些方法费时费力，缺乏专一性，在实际工作中具有一定的局限性。目前，虽已建立起单孢子虫PCR和荧光定量PCR检测方法，其检测敏感性也比较高，但是常规PCR需要使用PCR仪和进行凝胶电泳，荧光定量PCR则需要使用更加昂贵的荧光定量PCR仪和试剂等，，因而难以适应基层现场检测需要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种特异性强、敏感性高、仪器要求低、操作快速简便且成本低的牡蛎单孢子虫LAMP检测试剂盒，以满足基层现场快速检测牡蛎单孢子虫的需要。

为解决上述技术问题本发明采用如下技术方案：

牡蛎单孢子虫LAMP检测试剂盒，该试剂盒含有以下试剂：

反应液A：含有10×等温反应缓存液、Bst DNA聚合酶8U/ul、10mM dNTPs、25mM硫酸镁、20uM的内引物1、20uM的内引物2、20uM的外引物1、20uM的外引物2、20uM的环引物1、20uM的环引物2、5M甜菜碱、625μM钙黄绿素和12.5mM氯化锰；10×等温反应缓存液含有200mM pH值为8.8的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1％曲拉通X-100；

内引物1序列为AGTCCGAAAACTTTGATTTCTCTCATAGTCCCAACTATAAACTATGTCG，

内引物2序列为GGAGTATGCTCGCAAGGGTGGTCAAATTAAGCCGCAGG，

外引物1序列为GACGATCAGATACCGTCG，

外引物2序列为TGGTAAGTTTTACCGTGTTGA，

环引物1序列为GGAAGTAAACTTGCCCAATGCTTAG，

环引物2序列为ACGGAAGGGCACCACCAGAT。

反应液A每管24ul，其组成为：2.5ul 10×等温反应缓存液、1.0ul Bst DNA聚合酶8U/ul、3ul 10mM dNTPs、3ul 25mM硫酸镁、0.25ul 20uM的内引物1、0.25ul 20uM的内引物2、2ul 20uM的外引物1、2ul 20uM的外引物2、1ul 20uM的环引物1、1ul 20uM的环引物2、0.5ul 5M甜菜碱、1ul 625μM钙黄绿素和1ul 12.5mM氯化锰和5.5ul双蒸水。

本发明采用环介导等温扩增(LAMP)技术，并根据牡蛎单孢子虫共有的基因保守区(见序列表SEQ.ID.No.1)设计了两个特异性内引物、两个特异性外引物和两个特异性环引物，由此发明了用于快速检测牡蛎单孢子虫的牡蛎单孢子虫LAMP检测试剂盒。应用本发明的LAMP检测试剂盒建立牡蛎单孢子虫检测方法，仅需通过对组织样品进行DNA提取并进行环介导等温扩增，即可检测出牡蛎单孢子虫。该法无需昂贵的PCR仪只需普通水浴锅，却比PCR检测有更高的灵敏度，且不必通过凝胶电泳观察结果，操作简单而快速，特别适用于基层现场检测。

另外，常规的LAMP方法，需要在反应结束后开盖加入SYBR Green I或Gene Finder染料来显色，容易造成假阳性：一方面，反应产物易形成气溶胶而污染周围环境造成假阳性；另一方面，SYBR Green I或Gene Finder染料还会由于引物二聚体而引起假阳性。因此，本发明使用内加钙黄绿素+氯化锰替代了外加的SYBR Green I和Gene Finder染料，即在配置LAMP反应液时就加入反应液中而无需LAMP反应后再开盖加入；而且，钙黄绿素+氯化锰仅在发生LAMP反应时才出现绿色，避免了SYBR Green I和Gene Finder染料带来的假阳性问题，所以具有更好的特异性。

附图说明

图1是应用本发明牡蛎单孢子虫LAMP检测试剂盒的检测方法特异性试验结果图。

图1中：1单孢子虫，2折光马尔太虫，3副溶血弧菌，4派琴虫，5溶藻弧菌，6河弧菌，7拟态弧菌，8牡蛎组织。

图2是应用本发明牡蛎单孢子虫LAMP检测试剂盒的检测方法敏感性试验结果图。

图2中：1-8分别为以下不同浓度的牡蛎单孢子虫DNA 1ng/管，100pg/管，10pg/管，1pg/管，100fg/管，10fg/管，1fg/管，0.1fg/管。

图3是PCR方法检测牡蛎单孢子虫敏感性试验结果图。

图3中：M为100bp DNA ladder，1-8分别为以下不同浓度的牡蛎单孢子虫DNA 1ng/管，100pg/管，10pg/管，1pg/管，100fg/管，10fg/管，1fg/管，0.1fg/管。

具体实施方式

一、牡蛎单孢子虫LAMP检测试剂盒的配制

反应液A：每管24ul，其组成为：2.5ul 10×等温反应缓存液、1.0ul Bst DNA聚合酶8U/ul、3ul 10mM dNTPs、3ul 25mM硫酸镁、0.25ul 20uM的内引物1、0.25ul 20uM的内引物2、2ul 20uM的外引物1、2ul 20uM的外引物2、1ul 20uM的环引物1、1ul 20uM的环引物2、0.5ul 5M甜菜碱、1ul 625μM钙黄绿素和1ul 12.5mM氯化锰和5.5ul双蒸水。

其中，10×等温反应缓存液含有200mM pH值为8.8的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1％曲拉通X-100。

内引物1序列为AGTCCGAAAACTTTGATTTCTCTCATAGTCCCAACTATAAACTATGTCG(见序列表SEQ.ID.No.2)，

内引物2序列为GGAGTATGCTCGCAAGGGTGGTCAAATTAAGCCGCAGG(见序列表SEQ.ID.No.3)，

外引物1序列为GACGATCAGATACCGTCG(见序列表SEQ.ID.No.4)，

外引物2序列为TGGTAAGTTTTACCGTGTTGA(见序列表SEQ.ID.No.4)，

环引物1序列为GGAAGTAAACTTGCCCAATGCTTAG(见序列表SEQ.ID.No.6)，

环引物2序列为ACGGAAGGGCACCACCAGAT(见序列表SEQ.ID.No.7)。

二、应用本发明牡蛎单孢子虫LAMP检测试剂盒检测牡蛎单孢子虫的方法(以下简称LAMP检测法)

1、组织样品中DNA的提取

使用北京天跟生物工程公司的海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(商品名：海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒，型号：DP324-03)提取组织DNA，浓度能达到20ng/ul。

2、牡蛎单孢子虫LAMP反应

以提取的牡蛎单孢子虫DNA为模板，在装有24μL反应液A管中加入1μL待检DNA构成25ul反应体系；LAMP反应程序如下：62℃60min，然后80℃5min。直接用肉眼观察颜色变化，如颜色变为绿色，则说明样品中含有牡蛎单孢子虫；如果颜色为桔红色，说明待检样品不含有牡蛎单孢子虫。

三、LAMP检测法的特异性和敏感性试验

1.特异性试验

分别以单孢子虫、折光马尔太虫、副溶血弧菌、派琴虫、溶藻弧菌、河弧菌、拟态弧菌和牡蛎组织的核酸为模板，按照前述牡蛎单孢子虫LAMP反应体系和条件进行反应。

结果见图1，对牡蛎单孢子虫的检测为阳性结果(显示绿色)，而对折光马尔太虫、副溶血弧菌、派琴虫、溶藻弧菌、河弧菌、拟态弧菌和牡蛎组织的检测均为阴性(显示桔红色)。

2.敏感性试验

将牡蛎单孢子虫DNA按10倍递增稀释成1ng、100pg、10p g、1pg、100fg、10fg、1fg、0.1fg。

牡蛎单孢子虫LAMP检测方法检出限与PCR对比

牡蛎单孢子虫LAMP检测方法反应体系和条件按前述进行。

牡蛎单孢子虫PCR反应组成如下：在25ul的反应体系中含10×PCR Buffer 2.5μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μl，牡蛎样品模板DNA 1μL，25μmol/L的上、下游引物(上游引物为MSX-A：5’-CGACTTTGGCATTAGGTTTCAGACC-3’；下游引物为MSX-B：5’-ATGTGTTGGTGACGCTAACCG-3’，)各0.5μl，dd H₂O补足25μL。扩增程序为94℃变性5分钟，然后进入94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟的循环，共进行35个循环，最后再经72℃延伸10分钟。

牡蛎单孢子虫LAMP检测方法通过肉眼直接观察结果，结果见图2。将PCR产物在1％琼脂糖凝胶中进行电泳，然后进行溴化乙锭染色，结果见图3。牡蛎单孢子虫LAMP检测方法的检测限为1fg，而常规PCR的检测限为100fg，LAMP方法敏感性比常规PCR高100倍。

Claims

1.一种牡蛎单孢子虫LAMP检测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有以下试剂：

反应液A：每管24ul，其组成为2.5ul 10×等温反应缓存液、1.0ul Bst DNA聚合酶8U/ul、3ul 10mM dNTPs、3ul 25mM硫酸镁、0.25ul 20uM的内引物1、0.25ul 20uM的内引物2、2ul 20uM的外引物1、2ul 20uM的外引物2、1ul 20uM的环引物1、1ul 20uM的环引物2、0.5ul 5M甜菜碱、1ul 625μM钙黄绿素和1ul 12.5mM氯化锰和5.5ul双蒸水；所述10×等温反应缓存液含有200mM pH值为8.8的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1%曲拉通X-100；

所述内引物1序列为AGTCCGAAAACTTTGATTTCTCTCATAGTCCCAACTATAAACTATGTCG，

所述内引物2序列为GGAGTATGCTCGCAAGGGTGGTCAAATTAAGCCGCAGG，

所述外引物1序列为GACGATCAGATACCGTCG，

所述外引物2序列为TGGTAAGTTTTACCGTGTTGA，

所述环引物1序列为GGAAGTAAACTTGCCCAATGCTTAG，

所述环引物2序列为ACGGAAGGGCACCACCAGAT。