CN101942506B

CN101942506B - 环介导恒温扩增技术快速检测微小原甲藻的方法

Info

Publication number: CN101942506B
Application number: CN 201010173306
Authority: CN
Inventors: 张凤英; 马凌波; 徐兆礼
Original assignee: East China Sea Fishery Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: East China Sea Fishery Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2010-05-12
Filing date: 2010-05-12
Publication date: 2013-02-06
Anticipated expiration: 2030-05-12
Also published as: CN101942506A

Abstract

本发明涉及一种环介导恒温扩增技术快速检测微小原甲藻的方法，包括：(1)赤潮藻类的基因组DNA提取；(2)4条LAMP扩增引物：Pm-F3：CGCGCTTGATCGTCTCTT；Pm-B3：CCAGTGGCAAGCCAAGAC；Pm-FIP：ACCCGCAGACGAGCTACCATTGTGTCAACGCCTGTTCG；Pm-BIP：TGGCAGAACTCATTTGCGGACTCTTCCAGAATGCCAAGGACA；(3)LAMP扩增反应体系；(4)LAMP扩增产物的检测。本发明的LAMP检测方法具有操作简单快速、对仪器要求不高、特异性强、扩增效率高、结果判定简单等优点，适合对微小原甲藻进行快速鉴定和检测。

Description

环介导恒温扩增技术快速检测微小原甲藻的方法

技术领域

本发明属微小原甲藻的DNA分子检测领域，特别是涉及一种环介导恒温扩增技术快速检测微小原甲藻的方法。

背景技术

微小原甲藻(Prorocentrum minimum)是中国海域多发赤潮藻，近年来引发多起赤潮。赤潮已成为一种世界性的公害，它对海洋生态平衡、海洋渔业、水产资源、以及人类健康的产生很大危害。对赤潮进行预测成为学者们关注的问题，而对赤潮藻类进行检测是首要一环，传统的藻类鉴定是通过形态学的观察来划分的，从色素，色素体，贮藏物质等的差别来辨别不同种的藻类细胞，这是一件费时费力的事，而且不同的种属差别很细微，非长期从事该工作的专业人员难以胜任这项工作，并且环境对藻类形态有很大影响，鉴定到种存在的困难较多。

目前，利用分子生物学手段检测微藻的方法日渐成熟，这些方法从分子水平解决了某些从形态上难以区分的藻类分类和鉴定问题。自从聚合酶链式反应(Polymerase ChainReaction，PCR)技术发明以来，这种技术就被应用到诸多领域。许多学者通过微藻某些基因片段扩增来对藻类进行鉴定，例如通过对核糖体rDNA序列分析，核糖体间隔区(ITS)的PCR扩增和测序，从而完成对微藻类的种类鉴定。荧光原位杂交也是近年来微藻鉴定的检测手段，有些学者利用核糖体大亚基(LSU)和ITS区分子探针对某些赤潮微藻进行了鉴定，但是这种技术对探针要求高。实时荧光定量PCR检测也是近年来微藻检测一个方向，这种方法非常灵敏，检测时间需1～2小时，但是所需实验仪器(荧光定量PCR仪)和试剂价格昂贵。上述方法因为实验条件等因素限制不能应用于现场检测。

2000年，日本学者Notomi等开发了一种新颖的恒温核酸扩增方法，即环介导恒温扩增反应(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等温条件(65℃左右)下保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应。此反应不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程，而且结果判定简单，既可以利用仪器检测或肉眼观察核酸扩增过程中产生的焦磷酸镁沉淀判定，也可以采用肉眼观察反应液的颜色变化来迅速判定。

这种技术已经广泛应用到病原菌检测方面，取得理想的检测效果。但迄今为止，尚未见将该技术应用于微小原甲藻检测鉴别的相关文献报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种环介导恒温扩增技术快速检测微小原甲藻的方法，该方法具有操作简单快速、对仪器要求不高、特异性强、扩增效率高、结果判定简单等优点，适合对微小原甲藻快速鉴定和现场检测。

本发明的一种环介导恒温扩增技术快速检微小原甲藻的方法，包括：

(1)赤潮藻类的基因组DNA提取

(2)LAMP扩增引物

(3)LAMP扩增反应体系

(4)LAMP扩增产物的检测。

所述步骤(3)中的LAMP扩增反应体系所用试剂为：2.5uL 10×buffer(内含2mM的MgSO4)，2个内引物Pm-FIP和Pm-BIP的终浓度均为1.6μM，两个外引物Pm-F3和Pm-B3的终浓度均为0.2μM，此外还包括6mM MgSO4，0.6mM dNTP，0.6M Betaine(Sigma-Aldrich)，8U Bst DNA聚合酶，1uL DNA模板(36ng)；

所述步骤(3)中的LAMP扩增反应体系的条件为：反应温度65℃，反应时间60min，最后于85℃保持3min终止反应；

所述步骤(4)中的LAMP扩增产物检测，电泳检测可见阳性反应出现梯状条带，阴性反应没有条带的出现，肉眼观察可见阳性反应管内有大量白色沉淀产生，或加2μL100×SYBR Green I于反应管中，反应管呈现绿色为阳性，反应管内颜色不变的则为阴性。

有益效果

本发明的LAMP检测方法具有操作简单快速(1小时内即可完成检测)、对仪器要求不高、特异性强、扩增效率高、结果判定简单等优点，适合对微小原甲藻快速鉴定和检测，有望应用到赤潮现场快速检测领域。

附图说明

图1为微小原甲藻LAMP检测电泳图；

图2为微小原甲藻LAMP检测SYBR Green I染色图；

其中，1.微小原甲藻，2.米氏凯伦藻，3.环状异帽藻，4.赤潮异湾藻，5.卡氏前沟藻，6.利玛原甲藻，7.角毛藻，8.微小亚历山大藻，9.链状亚历山大藻，10.塔玛亚历山大藻。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

微小原甲藻LAMP扩增引物的设计

(1)微小原甲藻的基因组DNA提取

把培养至对数期的微小原甲藻细胞液分装至2ml离心管，离心，倒掉上清，加入600μL提取液(100mmol/L Tris-Hcl，100mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，2％CTAB，2％β-巯基乙醇)，65℃水浴1h。加入等体积PCI抽提液(体积比，苯酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1)，混匀，4℃，12500rpm，10min。转移上清液至新离心管中，加入RNase至终浓度为1μg/mL，37C放置30min。PCI重复抽提一次，4℃，12500rpm离心10min。水相转移至新离心管中，加入2倍体积无水乙醇，室温下放置8-12min，静置沉淀DNA。在4℃，12500rpm，离心20min。弃上清液，70％乙醇洗涤DNA沉淀2次。DNA溶于无菌水，待用。

(2)PCR扩增引物设计及扩增后目标基因序列的获得

将步骤(1)提取到的微小原甲藻基因组DNA，以其为模板进行PCR扩增，以核糖体DNA转录单元内间隔区(Intemal Transcribed Spacer，ITS)为目标基因序列；扩增引物为：

LH2：5’AGGTGAACCTGCGGAAGGATC3’；

Dlam：5’CCTGCAGTCGACA(TG)ATGCTTAA(AG)TTCAGC(AG)GG3’；

分别对应于18S rDNA3’末端和24S rDNA 5’末端区域；

扩增体系：反应总体系为50μL，其中包括5μL 10×PCR反应缓冲液，4μL MgCl₂(25mmol/L)，0.4μL TaqDNA聚合酶(5U/μL)，2μL dNTP(2.5mml/L)，2μL基因组DNA(50μg/mL)，加ddH₂O补足体积；

扩增后的目的基因序列：

GATCCATTTGTGAACTAATCGTGTGAGCTCGTGGGGGTGGACGCTCGCGTCCATGCTCAGGAGTTCGAGGGCAGTGTTGGGCTGGATTTGCATCACGACTCTTCTAGCCTCCTGCCGGGGATCTTGAACACACTCATGACATGATTACCCTCTTGCTTTATGCAACCGCCATAAGCAACTTTCAGCGATGGATGTCTCGGCTCAACCACCAATGAAGGGCGCAGCGAAGTGTGATAAGCATTGTGAGTTGCCGAAGTCCGTGAACCAATGGAGACTTGAACGCGCATTGCGCTGTTGGGACATGCCTGACAGCAGGCCTGCTTCAGTGTCTAGTCTTCCTTCCCCTGTGCTCTGCGCACAGGTGTGAGTGTTTGCGCATTAAAGAGCGTTGCCTTTGATGTGCGCAGTTGAACAAGACTGGTGTGCGGTTGGGCATCCGACGATGCACTTCAGTGCTGACTGTTGTCCCCGCATTTCCACTCTGCTATCTGTGCAGACTTCTGCACAAAGACCTGAAGTAGACCAGCAAACCCGCTGAACTTAAGCATATGTCGACTGCAGGA；

(3)LAMP扩增引物设计

对上述测定的序列进行B1ast分析后，找到转录单元内间隔区ITS1和ITS2，分别以ITS1和ITS2区为靶序列设计引物，用Primer Explorer V4设计引物：

实施例2

微小原甲藻与阴性对照实验

(1)赤潮藻类的基因组DNA提取

共包括10种藻类的DNA提取：微小原甲藻(Prorocentrum minimum)，米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)，环状异帽藻(Heterocapsa circularisquama)，赤潮异湾藻(Heterosigmaakashiwo)，卡氏前沟藻(Amphidinium carterae)，利玛原甲藻(Prorocentrum lima)，角毛藻(Chaetoceros sp.)，微小亚历山大藻(Alexandrium minutum)，链状亚历山大藻(Alexandrium catenella)以及塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)；

具体步骤如下：

把培养至对数期的10种藻细胞液分装至2ml离心管，离心，倒掉上清，加入600μL提取液(100mmol/L Tris-Hcl，100mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，2％CTAB，2％β-巯基乙醇)，65℃水浴1h。加入等体积PCI抽提液(苯酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1)，混匀，4℃，12500rpm，10min。转移上清液至新离心管中，加入RNase至终浓度为1μg/mL，37℃放置30min。PCI重复抽提一次，4℃，12500rpm离心10min。水相转移至新离心管中，加入2倍体积无水乙醇，室温下放置8-12min，静置沉淀DNA。在4℃，12500rpm，离心20min。弃上清液，70％乙醇洗涤DNA沉淀2次。DNA溶于无菌水，待用。

(2)LAMP扩增引物

(3)LAMP扩增反应体系

LAMP扩增反应体系为25uL，包括：2.5uL 10×buffer(内含2mM ofMgSO4)，2个内引物Pm-FIP和Pm-BIP的终浓度均为1.6μmol/L，两个外引物Pm-F3和Pm-B3的终浓度均为0.2μmol/L，另外还包括6mmol/L MgSO4，0.6mmol/L dNTP，0.6mol/L Betaine(Sigma-Aldrich)，8U Bst DNA聚合酶，1uL DNA模板(36ng)，反应温度为65℃，反应时间为60min，最后85℃3min，终止反应；

(4)LAMP扩增产物的检测

a.LAMP产物特异性扩增的确认

取2μL反应后的LAMP产物于1.5％的琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像系统观察，可见只有微小原甲藻有梯状条带出现，其他微藻没有扩增条带(见图1)；

b.由于LAMP反应产生白色焦磷酸镁沉淀，可肉眼直接观察，在本方法中阳性反应管内可见到大量白色沉淀产生；或加2μL 100×SYBR Green I于反应管中，阳性反应管呈现绿色，而阴性反应管内颜色不变，仍然为原来的橙色(见图2)。

SEQUENCE LISTING

<110>中国水产科学研究院东海水产研究所

<120>环介导恒温扩增技术快速检测微小原甲藻的方法

<160>5

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

cgcgcttgat cgtctctt 18

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ccagtggcaa gccaagac 18

<210>3

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

acccgcagac gagctaccat tgtgtcaacg cctgttcg 38

<210>4

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

tggcagaact catttgcgga ctcttccaga atgccaagga ca 42

<210>5

<211>563

<212>DNA

<213>微小原甲藻(Prorocentrum minimum)

<400>5

gatccatttg tgaactaatc gtgtgagctc gtgggggtgg acgctcgcgt ccatgctcag 60

gagttcgagg gcagtgttgg gctggatttg catcacgact cttctagcct cctgccgggg 120

atcttgaaca cactcatgac atgattaccc tcttgcttta tgcaaccgcc ataagcaact 180

ttcagcgatg gatgtctcgg ctcaaccacc aatgaagggc gcagcgaagt gtgataagca 240

ttgtgagttg ccgaagtccg tgaaccaatg gagacttgaa cgcgcattgc gctgttggga 300

catgcctgac agcaggcctg cttcagtgtc tagtcttcct tcccctgtgc tctgcgcaca 360

ggtgtgagtg tttgcgcatt aaagagcgtt gcctttgatg tgcgcagttg aacaagactg 420

gtgtgcggtt gggcatccga cgatgcactt cagtgctgac tgttgtcccc gcatttccac 480

tctgctatct gtgcagactt ctgcacaaag acctgaagta gaccagcaaa cccgctgaac 540

ttaagcatat gtcgactgca gga 563

Claims

1.一种环介导恒温扩增技术快速检微小原甲藻的方法，包括：

（1）赤潮藻类的基因组DNA提取

（2）LAMP扩增引物

两个外引物：

Pm-F3：5’-CGCGCTTGATCGTCTCTT-3’

Pm-B3：5’-CCAGTGGCAAGCCAAGAC-3’；

两个内引物：

Pm-FIP：5’-ACCCGCAGACGAGCTACCATTGTGTCAACGCCTGTTCG-3’

Pm-BIP：5’-TGGCAGAACTCATTTGCGGACTCTTCCAGAATGCCAAGGACA-3’；

（3）LAMP扩增反应体系

（4）LAMP扩增产物的检测；

所述步骤（3）中的LAMP扩增反应体系所用试剂为：2.5uL 10×buffer，两个内引物Pm-FIP和Pm-BIP的终浓度均为1.6μM，两个外引物Pm-F3和Pm-B3的终浓度均为0.2μM，另外包括6mM MgSO4，0.6mM dNTP,0.6M Betaine，8U Bst DNA聚合酶，1uL DNA模板；

所述步骤（3）中的LAMP扩增反应体系的条件为：反应温度65℃，反应时间60min，最后于85℃保持3min终止反应。

2.根据权利要求1所述的一种环介导恒温扩增技术快速检微小原甲藻的方法，其特征在于：所述步骤（4）中的LAMP扩增产物检测，电泳检测可见阳性反应出现梯状条带，阴性反应没有条带的出现，肉眼观察可见阳性反应管内有大量白色沉淀产生，或加2μL100×SYBR Green I于反应管中，反应管呈现绿色为阳性，反应管内颜色不变的为阴性。