CN101974633A - 一种定量检测微囊藻的方法及其专用标准品 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种定量检测微囊藻的方法及其专用标准品。本发明提供一种检测样品中微囊藻的标准品，为含有16S rRNA基因的重组质粒或重组菌或重组细胞；所述16S rRNA基因的序列是序列表中的序列1。所述重组质粒中的出发质粒是pMD-18T。本发明的定量检测微囊藻的标准品具有广谱识别和特异性相结合的特点，敏感性高，制备方法简便，可以长期保存，纯度好，线性检测范围宽，可以用于水环境样品中微囊藻的快速定量检测。

Description

一种定量检测微囊藻的方法及其专用标准品

技术领域

本发明涉及一种定量检测微囊藻的方法及其专用标准品。

背景技术

由于大量氮、磷等污染物排放到水环境中，水体富营养化已成为全球公共卫生问题，其直接后果是湖泊、水库等缓流水体形成大面积蓝藻水华。我国一些重要的淡水湖泊如太湖、巢湖和滇池等每年都有不同程度的蓝藻水华爆发，其优势种主要是微囊藻。蓝藻水华的大面积爆发，极大地危害水体生态系统的结构和功能，其最主要危害之一就是产生和释放以微囊藻毒素为主要类型的蓝藻毒素。

微囊藻属蓝藻门蓝藻纲色球藻目色球藻科，是我国很多淡水湖泊和水库富营养化水体中的优势藻类。微囊藻毒素(Microcystins，简称MCs)是由在水体中生长并能形成水华的几种蓝藻(blue-green algae，亦称为蓝细菌(cyanobacteria))，尤其是微囊藻(Microcystis)产生的一类藻类毒素。微囊藻毒素是一种肝毒素，长期饮用含有微囊藻毒素的水，会引发肝损伤甚至肝癌。因此，快速准确地检测水环境中的微囊藻，对于有效预警蓝藻水华大规模爆发、保障水环境安全具有重要意义。

目前，对微囊藻的鉴定方法主要是物理方法和分子生物学方法。

1.物理学方法

微囊藻鉴定的传统方法是物理方法，其原理是根据不同类的藻都有表明其身分的特征，如形态学上的差别，色素、色素体、贮藏物质等的差别等等。微囊藻的物理方法分辨主要是根据形态上的空间布局和群体的构型不同。目前从传统的碘量法发展了很多种方法。

(1)离心沉降法：取一定量的水样，离心去除上请液，收集藻体，加入少量生理盐水混匀，用于下一步镜检。该方法快速，可在30min内检测到结果；由于活藻体，色素体等细胞结构没有破坏，易鉴定，显微图像清晰；所需水样品量少(50～100mL)，且不需用化学药品等(高锡伦，邱俊铎，马宜山.单细胞藻类的两种简易分离法.水产养殖，1992，(2)：9～10.)。

(2)显微彩色图像识别法：将制备的样本标明藻类的种类和数量后，在高倍显微镜下，通过CCD摄像将获取的模拟图像信号输入图像采集卡中，并转换成数字图像，将待测样品的特征信息与计算机中的图像信息进行对比(聂晶晶，李元，杨良.水华微囊藻鉴定技术研究进展.环境科学导刊.2008，27(5)：1-5；高建峰，翁天楚，陈琼洁.离心沉降法检测水中藻类技术.西南给排水，2006，28(2)：1-4)。该方法自动化程度高，克服了肉眼主观观察引起的误差。

上述方法耗时长、劳动强度大、效率低、需要丰富的经验，非专业人员无法从事；并且环境对藻类的形态有很大的影响，鉴定出具体的种存在的困难较多，都需要从分子上找出直接的证据以鉴别。

2.分子生物学方法

用分子生物学技术对藻类进行鉴定和检测是目前的研究热点之一，这种方法可能重建或证实基于形态学和生理学特征的分类和检测。Nübel等(1999)对底栖蓝细菌和硅藻的分布进行了研究，发现用16S rRNA基因分析的累积数量是形态学分析的2倍。这说明了一些形态学相似的类群通过16S rRNA分析可能呈现不同的基因型。研究发现，16S rRNA能够较好的区别相同属内种间的株系，但对于种以下的株系则显出分辨率不足的缺陷，能更准确地检测出特定种型的藻。

聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)技术在藻的分类和检测中应用最为广泛，在普通PCR技术的基础上，经历了从相对定量到绝对定量的过渡，发展了定量PCR(quantitative PCR)技术实时定量PCR(Real-Time Quantitative PCR)技术是Holland等在1991年最先提出。该方法实现了PCR从定性到定量质的飞跃，且具有引物和探针的双重特异性，且在全封闭的状态下实现扩增及产物分析，结果稳定，可重复性好，同时还有效减少了污染及对人体的危害，在大批量标本检测中能有效减少劳动量，成为分子生物学和分子诊断的重要技术平台，广泛应用于环境样品中微生物的检测及研究中。

由于定量PCR具有快速、灵敏的优点，因此，可以应用此技术可用于快速检测水环境中少量的微囊藻，为快速预警提供技术支持。近年一些研究者已经采用real-timePCR技术检测来水环境中的微囊藻，该技术的关键是对水环境中的微囊藻进行准确定量，其中不同外标准品的构建成为研究的关键技术。

一个单细胞的微囊藻，只含有一个16S基因。有研究表明，在实验室条件下培养的微囊藻，藻细胞数与16S rRNA基因数一致。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测样品中微囊藻的标准品。

本发明提供的检测样品中微囊藻的标准品，为含有16S rRNA基因的重组质粒或重组菌或重组细胞；所述16S rRNA基因的序列是序列表中的序列1。

序列表中的序列1有396个脱氧核糖核苷酸组成。

所述重组质粒中的出发质粒是pMD-18T。

本发明的另一个目的是提供检测样品中微囊藻的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)以重组质粒或重组菌或重组细胞为标准品模板，用PCR扩增的体系进行实时荧光定量PCR扩增，建立标准品的浓度与临界循环数对应的一元线性回归曲线，即得到标准曲线；

2)用待测样品替换步骤1)中的标准品，进行实时荧光定量PCR扩增，根据扩增结果的临界循环数和标准曲线，得到待测样品中16S rRNA基因的数量，即得到待测样品中微囊藻的数量；

所述PCR扩增的体系由实时荧光定量PCR扩增缓冲液、引物对和模板组成；所述引物对中的各引物在体系中的浓度均为0.1μmol/L，所述引物对中的一条引物为序列表中的序列2，另一条引物为序列表中的序列3。

所述标准品模板在所述PCR扩增的体系中的浓度为1.1×10¹拷贝/μL、1.1×10²拷贝/μL、1.1×10³拷贝/μL、1.1×10⁴拷贝/μL、1.1×10⁵拷贝/μL、1.1×10⁶拷贝/μL、1.1×10⁷拷贝/μL、1.1×10⁸拷贝/μL或1.1×10⁹拷贝/μL。

所述PCR反应中的退火温度为59℃。

所述重组质粒或重组菌或重组细胞为含有16S rRNA基因的重组质粒或重组菌或重组细胞；所述16S rRNA基因的序列是序列表中的序列1。

所述重组质粒中的出发质粒是pMD-18T。

本发明的第三个目的是提供一种检测微囊藻的试剂盒。

本发明提供的检测微囊藻的试剂盒，包括引物对，所述引物对中的一条引物为序列表中的序列2，另一条引物为序列表中的序列3。

本发明的第四个目的是提供一种PCR试剂。

本发明提供的PCR试剂，包括实时荧光定量PCR扩增缓冲液、引物对；所述引物对中各每个引物在试剂中的浓度均为0.1μmol/L，所述引物对中的一条引物为序列表中的序列2，另一条引物为序列表中的序列3。

16S rRNA基因、引物对、重组质粒或重组细胞在检测样品中微囊藻中的应用也是本发明保护的范围；

所述16S rRNA基因的序列是序列表中的序列1；

所述引物对中的一条引物为序列表中的序列2，另一条引物为序列表中的序列3；

所述重组质粒或重组菌或重组细胞为含有16S rRNA基因的重组质粒或重组菌或重组细胞，所述重组质粒中的出发质粒是pMD-18T。

所述样品具体为水样。

本发明的实验证明，上述外标准品pMD-18T-16S的制备方法中，微囊藻的DNA是从培养的铜绿微囊藻中提取的。利用此外标准品，建立real-time PCR方法精确和灵敏，有序列2和序列3组成的引物可以特异地检测多种微囊藻。本发明的定量检测微囊藻的标准品具有广谱识别和特异性相结合的特点，敏感性高，制备方法简便，可以长期保存，纯度好，线性检测范围宽，可以用于水环境样品中微囊藻的快速定量检测。

附图说明

图1为利用引物(序列2和序列3)检测铜绿微囊藻、小球藻和硅藻

图2为定量PCR扩增曲线

图3为定量PCR标准曲线

图4为定量PCR检测熔解曲线图

图5为质粒标准品定量PCR扩增后凝胶电泳图

图6为利用显微镜计数法和定量PCR方法检测铜绿微囊藻16S rDNA基因片段浓度比较

图7为实际水样定量PCR检测的熔解曲线

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、定量检测微囊藻的标准品pMD-18T-mcyA质粒标准品制备

1.铜绿微囊藻的培养

铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)编号为FACHB-905，购自中国科学院武汉水生生物研究所。

根据中国科学院水生生物研究所提供的培养方法，培养铜绿微囊藻。根据提供的配方(表1)配置BG11培养基，即在1000mL去离子水中，分别加入以下物质，灭菌后4℃保存。

表1BG11培养基配方

藻种的培养，切忌将少量的藻种接种在大量的培养基中。培养藻种的整个过程要求绝对的无菌操作，培养和转接所需要的实验工具必须灭菌，并在无菌的条件下保存；转接藻种必须在超净台或无菌的接种箱内进行；藻种需要在密闭的无菌空间培养，不能在敞开的空间培养；藻种培养的光暗周期为光∶暗＝14h∶10h。必须定期在显微镜下镜检藻种是否污染。初次接种，将10mL藻液接种在20mL培养基中，在弱光照下培养，可以帮助藻种适应新的培养基和培养环境，待藻种适应后，随着藻种细胞密度的增加，可逐步提高光照，扩大培养。

2.针对微囊藻特异性引物设计

在GenBank中下载微囊藻所有16S RNA的序列，将这些序列输入DNAMAN软件中进行多序列比较分析其同源性，进行引物设计和合成，引物的GC含量在40-60％之间，PCR产物长度为200-500bp。根据微囊藻(编号：AB012326.1)设计引物，引物序列如下：

16S-F：5-TATTGGGCGTAAAGCGTCCT-3(序列2)；

16S-R：5-AACCACATACTCCACCGCTT-3(序列3)。

用无菌双蒸水将引物配制成200μM的储存液，分装，-20℃保存。

3.微囊藻总基因组DNA的提取

利用Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0(TaKaRa Code：DV811A)试剂盒提取微囊藻的总DNA，操作步骤参考说明书，具体步骤为：

(1)取100μL培养的铜绿微囊藻905，梯度稀释后，加入650μL的Solution A，室温静置1分钟。

(2)加入400μL的Solution B，振荡混合。

(3)加入1mL的4℃预冷的Solution C溶液，充分混匀后，12,000rpm离心2分钟。

注：Solution C溶液的制备方法：首次使用前，请将1.1mL的Solution C原液移入125mL的Solution C空瓶中，然后加入68.75mL的异丙醇、41.25mL的异丁醇，混合均匀，配制成Solution C溶液后使用。Solution C溶液请于4℃保存。

(4)弃去上层有机相，再加入1mL的4℃预冷的Solution C溶液，充分混匀后，12,000rpm离心2分钟。

(5)弃去上层有机相，然后将水相溶液(无色下层)转移至置于Collection Tube上的Filter Cup中，12,000rpm离心1分钟。

注：有机相(上层)带有颜色，请务必除尽，否则会阻碍DNA结合到DNA制备膜上。相间沉淀不必考虑，在过滤时将被去除。

(6)弃Filter Cup，在滤液中加入400μL的DB Buffer，混合均匀。

(7)将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。将上述操作6混合溶液转移至Spin Column中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。

(8)将500μL的Rinse A加入至Spin Column中，12,000rpm离心30秒钟，弃滤液。

(9)将700μL的Rinse B加入至Spin Column中，12,000rpm离心30秒钟，弃滤液。

注)Rinse B在首次使用前，请添加56mL的100％乙醇，混合均匀。请沿SpinColumn管壁四周加入Rinse B，这样有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份。

(10)重复操作步骤9。

(11)将Spin Column安置于Collection Tube上，12,000rpm离心1分钟。

(12)将Spin Column安置于新的1.5mL的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入50μL的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1分钟。

注)把灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热至65℃使用时有利于提高洗脱效率。

(13)12,000rpm离心1分钟洗脱DNA，得到铜绿微囊藻905的总基因组DNA。

4.质粒标准品制备

A.目的片段的制备

取20μL上述得到的铜绿微囊藻905的总基因组DNA作为PCR反应的模板，PCR反应体系为150μL：4μL 20μM上游引物(序列2)，4μL 20μM下游引物(序列3)，4μL 10μM dNTP，7μL TaqDNA聚合酶(5u/μL)，12μL 25μM MgCl2，15μL 10×PCR缓冲液，84μL无菌双蒸水。

PCR反应程序为先94℃4min；然后94℃1min，59℃40s，72℃1.5min，进行35个循环；再72℃延伸10min。取5μL PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，结果表明扩增产物大小为396bp。

B.PCR产物纯化

取140μL上述PCR产物经过2％琼脂糖凝胶电泳，切胶后利用TaKaRa切胶回收试剂盒回收(TaKaRa Code：DV805A)，具体方法如下：

(1)使用TAE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，并在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率。

(2)切碎胶块，按照以1mg＝1μL进行计算，向胶块中加入等体积的胶块融化液DR-I Buffer。

(3)均匀混合后75℃加热融化胶块(低熔点琼脂糖凝胶只需在45℃加热)。此时应间断振荡混合，使胶块充分融化(约6-10min)。

(4)向上述胶块融化液中加入DR-I Buffer量的1/2体积量的DR-II Buffer，均匀混合。当分离小于400bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20％的异丙醇。

(5)将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。

(6)将上述操作4的溶液转移至Spin Column中，12,000rpm离心1min，弃滤液。

(7)将500μL的Rinse A加入Spin Column中，12,000rpm离心30秒钟，弃滤液。

(8)将700μL的Rinse B加入Spin Column中，12,000rpm离心30秒钟，弃滤液。重复操作步骤8。

(9)将Spin Column安置于Collection Tube上，12,000rpm离心1min。

(10)将Spin Column安置于新的1.5mL的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入25μL的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1min，得到纯化的PCR产物。

C.PCR产物与质粒连接

将上述纯化的PCR产物与

18-T Vector(TaKaRa Code：D101A)在T₄DNA连接酶及缓冲液的条件下连接，4℃连接过夜。操作步骤参考

18-T Vector产品使用手册，具体步骤如下：

(1)在微量离心管中配制下列DNA连接反应溶液(20μL)：18-T Vector 1μL，PCR纯化产物4μL，Solution I 5μL。

(2)16℃反应30min。

(3)全量(20μL)连接溶液加入至100μL大肠杆菌感受态菌DH5a，冰中放置30min。

(4)42℃加热45s后，再在冰中放置1min。

(5)加入1mL LB液体培养基，37℃振荡培养60min。

(6)8000rpm离心2min，弃去上清，混匀取适量涂布在含有Amp⁺的LB固体培养皿。

(7)37℃过夜培养(12-16h)，形成单菌落。

D.PCR鉴定阳性克隆

在0.2mL PCR管中，预先加入10μL dH₂O，用灭菌牙签挑取单个菌落，在含有Amp的LB固体培养基上留种，并蘸入dH₂O中，95℃热裂解10min，获得DNA。以此DNA为模版，微囊藻特异性引物(16S-F和16S-R)为引物，进行扩增，结果为得到396bp片段的为阳性菌落。

E.测序

将上述D鉴定为阳性的菌落接种于3mL LB(Amp⁺)培养液中，在37℃培养10-12h，取2mL菌液送测序公司测序。测序结果为该菌落的质粒中含有序列表中序列1所示的核苷酸，且该质粒为将序列表中的序列1插入18-T Vector得到的质粒，命名为pMD-18T-16S，将含pMD-18T-16S的菌命名DH5a/pMD-18T-16S。

进一步将序列1与NCBI中的微囊藻16S rRNA序列比对同源性，结果如下表2所示，可以看出，序列1与Gene Bank中多种微囊藻的16S rRNA序列具有98％以上的同源性，与其它基因没有同源性，因此pMD-18T-16S为定量检测微囊藻的标准品。

表2.序列1与GenBank中微囊藻16S rRNA序列比对信息

F.质粒标准品的大量获得

1、质粒的提取

将DH5a/pMD-18T-16S接种于150mL含有Amp⁺的LB液体培养基中，过夜培养(12-16h)，利用质粒大量提取试剂盒提取质粒(威格拉斯)，操作步骤参考使用说明，具体步骤如下：

(1)取过夜培养菌液150mL，装入合适的无菌离心瓶中，8000rpm 4℃离心30min，沉淀菌体，完全弃除上清；

(2)加入5mL Buffer I，充分混悬振荡菌体沉淀，使其完全分散开至无絮块存在，将细菌悬液移入50mL灭菌离心管中；

(3)加入5mL Buffer II，轻轻颠倒离心管6-8次，室温放置5min，使细菌完全裂解，溶液呈透明状；

(4)加入5mL Buffer III，立即颠倒离心管6-8次，充分混匀，至白色絮状物产生。冰上放置10-15min；

(5)上述裂解液于4℃14000rpm离心15min，小心吸出上清液，移入新的50mL灭菌离心管中；

(6)加入10mL异丙醇，颠倒离心管，充分混匀，放置于冰上10-15min；

(7)于4℃14000rpm离心10min，小心弃去上清，倒置轻轻沥干残余液体，加入0.5mL TE，完全溶解沉淀团块(可用宽口吸管轻轻吹打辅助溶解)。移入新的1.5mL的离心管中。

(8)质粒粗提物用台式离心机室温高速离心2min，上清移入新的1.5mL的离心管中(每管500μL)。

(9)加入100μL杂质清除液A(Buffer IV)，轻轻混匀，14000rpm离心2min，将上清液转移至新的离心管中。

(10)再加入100μL杂质清除液A(Buffer IV)，轻轻混匀，14000rpm离心5min，将上清液转移至新的离心管中。

(11)加入70μL杂质清除液B(Buffer V)，轻轻混匀，14000rpm离心5min，将上清液转移至新的离心管中。

(12)加入500μL异丙醇，混匀，室温放置10min。14000rpm室温离心10min，弃去上清液，用70％乙醇1mL轻轻洗涤，弃去液体，室温倒置晾干5min。

(13)500μLTE溶解沉淀(可在37℃水浴中振荡或用宽口吸管轻轻吹打辅助溶解)。

(14)加入200μL杂质清除液C(Buffer VI)，混匀后冰上放置10-30min，14000rpm室温离心10min，弃去上清液，轻轻加入1mL 70％乙醇洗涤两次，室温倒置晾干5-10min使乙醇完全蒸发。

(15)加适量TE(一般为500μL)溶解沉淀(可在37℃水浴中振荡或用宽口吸管轻轻吹打辅助溶解)，得到质粒标准品pMD-18T-mcyA。

(16)用分光光度计和琼脂糖电泳对质粒标准品pMD-18T-16S进行定量，定量后分装保存在-20℃。

2、质粒的检测

将上述得到的质粒标准品pMD-18T-16S用pH 8.0的1×TE梯度稀释后，利用超微量核酸蛋白测定仪(NanoDrop ND-2000C，美国)测定质粒标准品的浓度。按照公式进行质粒拷贝数的计算，计算公式如下：

质粒DNA的拷贝数＝(DNA的质量/DNA的摩尔质量)×6.02×10²³

其中DNA质量浓度＝A260×核酸稀释倍数×50/1000

双链DNA中1bp＝649Da；

计算后，确定含有微囊藻16s RNA质粒标准品pMD-18T-16S的拷贝数：5.5×10⁹拷贝/μL。

实施例2、微囊藻定量PCR检测方法的建立

1.定量PCR反应条件的优化

利用实施例1中的方法提取铜绿微囊藻(编号为FACHB-905)的DNA。依照

Premix Ex Taq^TM(Code：DRR041S)说明书，qPCR的反应体系为(20μL)：

Premix Ex Taq^TM 10μL，上、下游引物(mcyA-F、mcyA-R)各0.1-0.5μL(终浓度0.1-0.5μmol/L)，铜绿微囊藻(编号为FACHB-905)的DNA 2μL，双蒸水7.6μL补足体积至20μL。

铜绿微囊藻16S DNA qPCR反应程序如下，1个循环：95℃，5min；40个循环：95℃，5s，50-60℃，30s，72℃，30s，在退火过程中收集荧光；熔解曲线的过程为：95℃，1min，65℃1min，从65℃开始每30s温度升高0.5℃，结束温度为95℃。反应结束后4℃保存。

实验结果表明，引物16S-F、16S-R的最佳退火温度为59℃，最佳引物浓度为0.1μmol/L时，扩增效果最好。利用Blast在基因库中比对引物(16S-F和16S-R)，表明与其它种类的藻无相似性(表2)。

同时，为验证所用的引物(16S-F和16S-R)特异性强，分别提取绿藻门小球藻(Chlorella sp.，编号FACHB-1298，购自中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库)和硅藻门菱形藻(Nitzschia sp.，编号为FACHB-206，购自中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库)的DNA作为模板，以16S-F和16S-R为引物，最佳退火温度为59℃，最佳引物浓度为0.1μmol/L时，进行PCR，以铜绿微囊藻(编号为FACHB-905)的DNA为对照。

结果如图1所示，M：DNA Marker(DL 2000)；1：铜绿微囊藻(编号为FACHB-905)；2：绿藻门小球藻；3：硅藻(编号为FACHB-206)，从图中看出，只有铜绿微囊藻有396bp的片段，表明该引物与小球藻和硅藻无交叉反应。

2.定量PCR检测限、定量区间及标准曲线

以由实施例1得到的质粒标准品pMD-18T-16S经10倍梯度稀释后作为定量PCR(qPCR)模版DNA，PCR反应体系为20μL，加入2μL浓度为5.5×10⁰-5.5×10⁸拷贝/ul的质粒标准品作为反应模板，所以最终浓度是1.1×10¹、1.1×10²、1.1×10³、1.1×10⁴、1.1×10⁵、1.1×10⁶、1.1×10⁷、1.1×10⁸和1.1×10⁹拷贝/ul，以优化的最佳条件(上述1中得到的)进行qPCR反应。阴性对照为双蒸水，阳性对照为铜绿微囊藻(编号为FACHB-905)的DNA。以标准品稀释滴度的对数值为横坐标，以临界循环数(ThresholdCycle，Ct)为纵坐标建立实时定量PCR的标准曲线。

PCR扩增曲线如图2所示，从图中可以看出，扩增曲线平滑，扩增效果较好。

利用该qPCR反应条件检测质粒标准品pMD-18T-16S，最低检测限为1.1×10¹copies/反应，定量检测区间为1.1×10²-1.1×10⁸copies/ul，具体为1.1×10¹、1.1×10²、1.1×10³、1.1×10⁴、1.1×10⁵、1.1×10⁶、1.1×10⁷、1.1×10⁸和1.1×10⁹拷贝/ul，标准曲线方程分别为标准曲线斜率为-3.3039，R²＝0.998，扩增效率E＝10^1/3.3039-1＝1.007，即100.7％(图3)。

以上结果说明本研究所用引物的qPCR扩增该标准品的效率较高，线性关系良好，符合制备实时定量PCR标准曲线的要求。

3.定量PCR检测方法的特异性分析

定量PCR的熔点曲线主要是为了检测PCR产物是否是特异性目的产物。DNA双链的碱基组成不同，熔点温度不同。当到达产物的熔点温度导致DNA双链打开时，与DNA双链结合的SYBR Green荧光染料释放致荧光值降低。如果反应体系和条件优化得很好，引物的特异性很高，PCR产物纯度高，则熔点曲线的熔点峰窄且尖，如果产物不纯，有非特异性反应产物及引物二聚体，则熔点峰有几个峰。所用引物及荧光定量PCR条件及程序与1中的最佳条件一致，检测质粒标准品pMD-18T-16S，以双蒸水为阴性对照，铜绿微囊藻(编号为FACHB-905)的DNA为阳性对照。

结果如图4所示，可以看出，曲线平稳，峰尖且窄，熔解温度为87±1℃，证明该PCR扩增产物极为特异。

将PCR产物进行电泳，结果如图5所示，M：DNA Marker(DL 2000)；1-10：质粒标准品pMD-18T-16S浓度为1.1×10¹～1.1×10⁹拷贝/ul；P：阳性对照；N：阴性对照。从图中看出，PCR扩增产物长度为396bp，该qPCR反应特异性强。

4.定量PCR检测方法的重复性

采用实施例1的方法分别制得9批次的质粒标准品pMD-18T-16S。

将上述不同批次的质粒标准品2个月内反复冻融5次，进行qPCR测定(条件与1相同)，根据循环数的变异系数(CV)对重复性进行评价。

结果如表3所示，质粒标准品pMD-18T-16S的循环数变异系数分别为0.83％-7.89％，这些结果表明，质粒标准品pMD-18T-16S的标准曲线重复性良好。

表3pMD-18T-16S不同批次间重复性分析

5、定量PCR检测方法的准确性

在实验室条件下培养铜绿微囊藻(编号为FACHB-905)，培养方法参考实施例1，将培养至浓度约为10⁸个/mL的铜绿微囊藻梯度稀释培养，培养一周后，分别取培养液，梯度稀释，利用血球计数板在显微镜下(放大200倍)计数铜绿微囊藻的浓度，然后分别取相应的100ul铜绿微囊藻培养液，提取DNA后利用定量PCR测定16S的浓度，计数和定量PCR检测的详细结果如表4所示。

为了比较上述两种方法检测铜绿微囊藻浓度的一致性，将两种方法检测的铜绿微囊藻的浓度作图，结果如图6所示，横坐标为利用显微镜计数后铜绿微囊藻浓度(Log₁₀个/mL)，纵坐标为利用定量PCR检测铜绿微囊藻产毒基因16S rRNA的浓度(Log₁₀拷贝/mL)，两种检测方法的结果几乎一致(Y＝0.9621X)，相关性好(R²＝0.778)，说明本专利发明的定量PCR方法准确可信。

表4显微镜计数和定量PCR检测铜绿微囊藻的浓度

实施例3、利用定量PCR方法检测实际水环境样品中的微囊藻

1.实际水样采集

实际水样取自太湖及其周围的河流，取样时间为2010年8月10-11号。取样方法按照标准取样法，在水面一下0.5m处取。样品放入冰盒运回实验室，4℃保存。

2.叶绿素a和藻密度的测定

8月是太湖流域蓝藻水华爆发的季节，利用仪器YSI6600V2检测水样的藻密度和叶绿素a，结果如表5所示，叶绿素a浓度为1.7×10^-3-1.35×10^-2mg/L，藻密度为8.2×10⁵-2.4×10⁷个/L。(叶绿素a和藻密度是衡量水体富营养化的常规指标。)

表5水样中叶绿素a浓度和藻密度

3.定量PCR检测实际水样中的微囊藻

(1)水样浓缩

根据藻密度，离心浓缩水样中的藻。取100ml水样，4℃，4000rpm离心10min。去除上清液，收集沉淀到1.5ml离心管中，大概浓缩至为1ml。然后再4℃，4000rpm离心5min，去除上清，保留剩余样品约100-200μL，用于DNA提取。

(2)DNA提取

利用Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0(TaKaRa Code：DV811A)试剂盒提取微囊藻的DNA，操作步骤参考说明书，具体步骤参考实施例1，最终获得DNA的体积为50μL。

(3)定量PCR检测

取提取的DNA 1μL，进行定量PCR检测，定量PCR检测体系和程序参考实施例2的1。测得水样中微囊藻的浓度(16S rRNA基因数)如表6所示，1.5×10⁵-4.4×10⁶拷贝/L。

定量PCR熔解曲线表明(图7)，曲线平稳，熔点曲线的熔点峰窄且尖，熔解温度为87±1℃，证明该PCR扩增产物极为特异。上述结果表明本发明提供的实时定量PCR的检测的结果较可靠，也表明本发明中所制备的质粒标准品具有较好的线性关系和检测范围。

表6利用qPCR检测水样中微囊藻的含量

Claims (10)

1.一种检测样品中微囊藻的标准品，为含有16S rRNA基因的重组质粒或重组菌或重组细胞；所述16S rRNA基因的序列是序列表中的序列1。

2.根据权利要求1所述的标准品，其特征在于：所述重组质粒中的出发质粒是pMD-18T。

3.一种检测样品中微囊藻的方法，包括如下步骤：

1)以重组质粒或重组菌或重组细胞为标准品模板，用PCR扩增的体系进行实时荧光定量PCR扩增，建立标准品的浓度与临界循环数对应的一元线性回归曲线，即得到标准曲线；

2)用待测样品替换步骤1)中的标准品，进行实时荧光定量PCR扩增，根据扩增结果的临界循环数和标准曲线，得到待测样品中16S rRNA基因的数量，即得到待测样品中微囊藻的数量；

所述PCR扩增的体系由实时荧光定量PCR扩增缓冲液、引物对和模板组成；所述引物对中的各引物在体系中的浓度均为0.1μmol/L，所述引物对中的一条引物为序列表中的序列2，另一条引物为序列表中的序列3。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述标准品模板在所述PCR扩增的体系中的浓度为1.1×10¹拷贝/μL、1.1×10²拷贝/μL、1.1×10³拷贝/μL、1.1×10⁴拷贝/μL、1.1×10⁵拷贝/μL、1.1×10⁶拷贝/μL、1.1×10⁷拷贝/μL、1.1×10⁸拷贝/μL或1.1×10⁹拷贝/μL。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：

所述PCR反应中的退火温度为59℃。

6.根据权利要求3-5中任一所述的方法，其特征在于：

所述重组质粒或重组菌或重组细胞为含有16S rRNA基因的重组质粒或重组菌或重组细胞；所述16S rRNA基因的序列是序列表中的序列1。

7.根据权利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于：

所述重组质粒中的出发质粒是pMD-18T。

8.一种检测微囊藻的试剂盒，包括引物对，所述引物对中的一条引物为序列表中的序列2，另一条引物为序列表中的序列3。

9.一种PCR试剂，包括实时荧光定量PCR扩增缓冲液、引物对；所述引物对中各每个引物在试剂中的浓度均为0.1μmol/L，所述引物对中的一条引物为序列表中的序列2，另一条引物为序列表中的序列3。

10.16S rRNA基因、引物对、重组质粒或重组细胞在检测样品中微囊藻中的应用；

所述16S rRNA基因的序列是序列表中的序列1；

所述引物对中的一条引物为序列表中的序列2，另一条引物为序列表中的序列3；

所述重组质粒或重组菌或重组细胞为含有16S rRNA基因的重组质粒或重组菌或重组细胞，所述重组质粒中的出发质粒是pMD-18T。

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