CN101880728A - 一种肠球菌属多重pcr检测引物及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肠球菌属多重PCR检测引物，包括肠球菌属引物的序列、粪肠球菌种引物的序列和屎肠球菌种引物的序列。本发明建立了一种快速准确鉴定肠球菌的多重PCR方法，大大简化了查验程序，可以在很多基层实验室使用。能一次PCR鉴定到肠球菌属及粪肠球菌或屎肠球菌种，能最少检测出1ng的基因组DNA，敏感性高，特异性比较强，有利于肠球菌的鉴别与诊断，并且具有的较好敏感性、重复性和稳定性，为临床中肠球菌的检测提供了一种新的快速检测方法，也为肠球菌感染的分子流行病学调查，研究肠球菌分子发病机制，早期诊断，诊断试剂盒的研制与开发，药物或疫苗的免疫机制提供了试验依据和技术手段。

Description

一种肠球菌属多重PCR检测引物及方法

技术领域

本发明涉及一种多重PCR检测引物及方法，具体涉及一种肠球菌属多重PCR检测引物及方法。

背景技术

肠球菌为革兰阳性球菌，主要存在于人类或动物的胃肠道，也广泛分布于土壤，水，食物中，是一种重要的条件致病菌。近年来，由于肠球菌耐药菌株的日益增多，肠球菌的医院感染率不断增加，引起尿路感染、菌血症、创口感染、感染性心内膜炎以及食物中毒等，已成为医院感染的重要病原。肠球菌可以感染多种动物，从猪、家蚕、羔羊、驴等动物体内均分离出致病性肠球菌，并且已有研究表明，肠球菌可以在人与动物之间进行水平传播，有报道称可由发病猪直接传染人，引起人发病死亡。

目前，鉴定肠球菌的标准方法主要是依靠生化试验进行表型鉴定，这需要大量的时间进行生化管的准备和判断结果。另外，一些商品化鉴定试剂盒API Rapid ID 32Srep、BBL Crystal和Vitek-32等，虽能够将肠球菌鉴定到种的水平，检测结果也能在24小时后得到有效判读，且不适用基层快速鉴定，目前PCR仪普及率逐步提高，与单重PCR相比多重PCR具有高效性、系统性、经济简便性等优点，能在同一PCR反应管内同时检出多个型别的目的基因，适宜于成组病原体检测，节省时间，节省试剂，节约经费开支，能为临床提供更多更准确的诊断信息，建立一种快速鉴定种属的多重PCR方法显得尤为必要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是传统的肠球菌属和主要肠球菌种的检测方法不适用基层快速鉴定，提供一种肠球菌多重PCR检测引物及方法。

本发明的技术方案是：一种肠球菌属多重PCR检测引物，它的序列如下：

肠球菌属引物的序列如下：

上游引物E1：5′-GTGTCGCTGATGGATGG-3′；

下游引物E2：5′-GCAAGCCGAACTGAGAGA-3′；

粪肠球菌种引物的序列如下：

上游引物FL1：5′-ACATATGTGAATAACTTAACC-3′；

下游引物FL2：5′-TATTGGTGACTCTTGGTTTGG-3′；

屎肠球菌种引物的序列如下：

上游引物FM1：5′-GATAATACAATAGAAGAATTAT-3′；

下游引物FM2：5′-AGCTTTTTTGATATTCTTCTTTA-3′。

利用肠球菌属多重PCR检测引物检测肠球菌属的方法，包括提取样品的DNA后，用PCR反应体系和PCR反应程序对样品进行检测，

所述PCR反应体系，在25μl体系中加入以下成份：

2×PCRTaqMix              8μl

E1/FL1/FM1                3μl

E1/FL2/FM2                3μl

模板DNA                   2μl

dd H₂O                    9μl

                                    

总体积                    25μl

所述PCR反应程序为：

95℃预变性5min；进入循环，94℃变性30s，49℃退火1min，72℃延伸1min 10s，30个循环；72℃终止10min。

本发明的有益效果是：本发明建立了一种快速准确鉴定肠球菌的多重PCR方法，大大简化了查验程序，可以在很多基层实验室使用。能一次PCR鉴定到肠球菌属及粪肠球菌或屎肠球菌种，能最少检测出1ng的基因组DNA，敏感性高，特异性比较强，有利于肠球菌的鉴别与诊断，并且具有的较好敏感性、重复性和稳定性，为临床中肠球菌的检测提供了一种新的快速检测方法，也为肠球菌感染的分子流行病学调查，研究肠球菌分子发病机制，早期诊断，诊断试剂盒的研制与开发，药物或疫苗的免疫机制提供了试验依据和技术手段。

本发明的检测结果，将190株疑似菌株，其中，70株分离自患病猪组织病料；60株分离自健康猪粪便；60株分离自零售鲜猪肉分别进行多重PCR，结果显示：粪肠球菌检出率分别为30％、46.7％、25％，屎肠球菌检出率分别为54.3％、38.3％、55％，其他肠球菌检出率分别为7.1％、10％、13.3％。

附图说明

图1为PCR特异性扩增结果，其中，1-5：ATCC29212、ATCC32223、E1、E2、E3，M：DL2000DNAMarker 6-10：E4、E5、葡萄球菌、链球菌、乳球菌；

图2为PCR特异性扩增结果，其中，M：DL2000DNAMarker；1-10：E6-E14，空白对照；

图3为PCR敏感性试验结果，其中，1-5：ATCC32223：5ng/ul，0.5ng/ul，0.05ng/ul，5pg/u，0.5pg/ul，M：DL2000DNAMarker(由上至下分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)；6-10：E1：5ng/ul，0.5ng/ul，0.05ng/ul，5pg/ul，0.5pg/ul；

图4为肠球菌16S rRNA、FL和FM重组质粒鉴定结果，其中，M1：λ-EcoT14ⅠdigestMarker，1-3：肠球菌16S、FL和FM基因酶切，M2：DL2000DNA Marker。

具体实施方式

实施例

一种肠球菌属多重PCR检测引物，它的序列如下：

肠球菌属引物的序列如下：

上游引物E1：5′-GTGTCGCTGATGGATGG-3′；

下游引物E2：5′-GCAAGCCGAACTGAGAGA-3′；

粪肠球菌种引物的序列如下：

上游引物FL1：5′-ACATATGTGAATAACTTAACC-3′；

下游引物FL2：5′-TATTGGTGACTCTTGGTTTGG-3′；

屎肠球菌种引物的序列如下：

上游引物FM1：5′-GATAATACAATAGAAGAATTAT-3′；

下游引物FM2：5′-AGCTTTTTTGATATTCTTCTTTA-3′。

利用肠球菌属多重PCR检测引物检测肠球菌属的方法，包括提取样品的DNA后，用PCR反应体系和PCR反应程序对样品进行检测，

所述PCR反应体系，在25μl体系中加入以下成份：

2×PCR TaqMix         8μl

E1/FL1/FM1            3μl

E1/FL2/FM2            3μl

模板DNA               2μl

dd H₂O                9μl

                                

总体积                25μl

所述PCR反应程序为：

95℃预变性5min；进入循环，94℃变性30s，49℃退火1min，72℃延伸1min 10s，30个循环；72℃终止10min。

本发明中，详细的实验过程如下：

1材料

1.1试验菌株

14株标准菌株(编号为E1-E14)为2006～2007年期间，分离自河南洛阳、济源、许昌等地送检病猪的肝、脾、肾、粪便，经Vitek-32全自动生化鉴定系统及16S rRNA测序鉴定的菌株，其中粪肠球菌(E.faecalis)6株、屎肠球菌(E.faecium)6株，E.sanguinicola两株(16s rRNA序列Genbank号分别是FJ378700.1和FJ378705.1)；这些菌株均于50％甘油中在-70℃下由本实验室保存。链球菌编号是CVCC562，葡萄球菌和乳球菌由本实验室分离保藏。ATCC29212、CMCC(B)32223粪肠球菌阳性参考菌株由广东环凯微生物科技有限公司提供。

1.2主要仪器

微量加样器                                    Eppendorf

PTC-200型PCR仪                                MJ RESEARCH

3K30型冷冻离心机                              德国sigma

S2-93自动双重纯水蒸馏器                       上海亚荣生化仪器厂

DYCP-31B型电泳槽                              北京六一仪器厂

DYY-111-6B型电泳仪                            北京六一仪器厂

sp-D垂直净化工作台                            蚌埠净化设备厂

SIM-F124制冰机                                日本三洋

Alphalmager^TM 2200型凝胶成像仪                Alpha Innotech公司

水浴恒温振荡器                                金坛市荣华仪器制造有限公司，SHA-C型

78-1磁力加热搅拌器                            金坛市荣华仪器制造有限公司

1.3主要试剂

琼脂糖                                        西班牙进口分装

Proteinase K                                  美国Amresco

溶菌酶                                        北京索莱宝科技有限公司

苯酚/氯仿/异戊醇25∶24∶1                     北京索莱宝科技有限公司

琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒                       北京百泰克生物技术有限公司

X-gal、限制性内切酶BamHⅠ                     Takara生物工程(大连)有限公司

IPTG、DNA Marker                              Takara生物工程(大连)有限公司

2×PCR TaqMix                                 北京美莱博医学科技有限公司

pTG19-T载体                                   上海捷瑞生物工程有限公司

GoldView                                      北京赛百盛生物工程公司

脑-心浸萃液态培养基(BHI)                      广东环凯微生物科技有限公司

其他试剂                                      国产分析纯产品

基因工程菌E.coli DH5α                        河南农业大学微生物实验室

1.4主要溶液和培养基的配制

(1)脑-心浸萃液态培养基(BHI)：

取9g状培养基，加入250ml单蒸水，使用磁力搅拌器加热搅拌至完全溶解，121℃高压灭菌20min。

(2)溶菌酶：

用灭菌10mmol/L Tris-Cl(pH8.0)立即溶解溶菌酶，配制成50mg/mL浓度的贮存液，-20℃保存备用。

(3)蛋白酶K：

用高压灭菌的50mmol/LTris(pH8.0)和1.5mmol/L乙酸钙溶液配制成浓度为20mg/mL的溶液。-20℃保存备用。

(4)2mol/L NaCl：

在800mL单蒸水中溶解117.0g NaCl，然后定容至1L，分装后121℃高压灭菌20min。

(5)50×Tris-乙酸(TAE)：

242g Tris、57.1ml冰醋酸、100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，加单蒸水定容至1000ml，使用前稀释成1×TAE。

(6)0.1M CaCl₂：

取1.1g CaCl₂，容于90ml灭菌三蒸水中，定容至100ml，用0.22μm滤器过滤除菌，4℃保存备用。

(7)氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)贮存液：

用灭菌三蒸水将氨苄青霉素配成100mg/ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成小份，-20℃保存备用。

(8)IPTG溶液：

将固体IPTG用灭菌三蒸水溶解，配成终浓度为100mg/ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装于-20℃保存备用。

(9)X-gal溶液：

用二甲基甲酰胺(DMF)溶解固体X-gal，配制其浓度为20mg/ml，保存于棕色瓶内或用铝箔避光保存，贮存于-20℃备用。

(10)LB液体培养基

取10g细菌培养用的胰化蛋白胨(bacto-teyptone)(Oxoid Ltd公司产品)、5g细菌培养用的酵母提取物(bacto-yeat extract)(Oxoid Ltd公司产品)、10g NaCl，加800ml灭菌三蒸水搅拌使溶质完全溶解，用10mol/L NaOH调节pH值至7.0，定容至1000ml，分装至试管，每管5ml，121℃灭菌20min，4℃保存备用。

(11)LB固体培养基

在LB液体培养基中加入琼脂粉至终浓度为1.5％(w/v)。121℃灭菌20min，冷却至55℃左右时，无菌倒入灭菌平皿，凝固后4℃保存备用。

(12)氨苄青霉素琼脂平板

待琼脂培养基温度降至55℃左右时，加入氨苄青霉素，使终浓度为100μg/ml，混匀，无菌倒入灭菌平皿，凝固后4℃保存备用。

(13)Solution Ⅰ溶液：

1M Tis-HCL(pH8.0)25ml，0.5M EDTA(pH8.0)20ml，20％Glucose(1.1M)45ml，加去离子水定容至1L，高压灭菌后4℃保存备用。使用前每50ml的Solution Ⅰ中加入2ml的RNase(20mg/mL)。

(14)Solution Ⅱ溶液：

10％SDS 50ml，2N NaOH 50ml，加灭菌三蒸水定容至500ml，充分混匀，室温保存。

(15)Solution Ⅲ溶液：

KOAc 147g，CH₃COOH 57.5ml，加入300ml去离子水搅拌溶解，定容至500ml，121℃灭菌20min，4℃保存备用。

2方法

2.1模板的制备

按照Messick^[128]报道的方法进行常规酚/氯仿抽提，并稍加改进，具体操作如下：

(1)细菌培养：将试验菌株接种于5ml BHI液体培养基中，37℃摇床(300rpm)培养过液。

(2)细菌收集：取1.5ml培养物于1.5ml EP管中，室温10000rpm离心5min，弃上清，沉

淀重新悬浮于1ml TE(pH8.0)中(用ddH₂O也行)。

(3)菌体裂解：加入10μl 50mg/ml的溶菌酶，37℃作用2h。再加2mol/LNaCl 50μl，10％SDS110μl，20mg/ml的Proteinase K 10μl，50℃作用3h。(此时菌液应为透明粘稠液体)

(4)抽提：将菌液均分到两个1.5ml EP管，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，室温放置10min。12000rpm离心10min。反复抽提两到三次。(上清很粘稠，吸取时应小心，最好剪去枪头尖)。

(5)沉淀：加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。12000rpm离心10min。

(6)洗涤：用75％乙醇洗涤沉淀。

(7)抽(凉)干后，溶于50μl灭菌三蒸水，取6μl电泳检测，剩余样品放于-20℃保存，作PCR模板用。

2.2引物选择与合成

属特异性引物参考表1序列，利用primer 5.0软件自行设计；根据sodA基因序列设计粪肠球菌和屎肠球菌种特异性引物，由上海博尚生物技术有限公司合成，引物序列见表2。

表1属特异性引物参考菌株Genbank登录序列号

表2属特异性引物及种特异性引物序列

2.3PCR扩增与回收纯化

2.3.1PCR反应体系

2×PCR TaqMix              8μl

模板DNA                    2μl

dd H₂O                     9μl

                                   

总体积                     25μl

其中2×PCR TaqMix组成为：0.2U Taq DNA Polymerase/μl；400μM dNTP each；20mMTris-HCl，PH 8.7；100mM KCl；3mM MgCl₂。

2.3.2PCR反应

PCR扩增在PCR仪(PTC-200型)上进行，反应程序如下：

95℃预变性                5min

72℃终止                  10min

用三蒸水作为空白对照。

2.3.3PCR特异性试验以葡萄球菌和链球菌做阴性对照。

临床上，细菌初步鉴定需要革兰氏染色、形态学观察，初步判定疑似肠球菌，通过染色和形态学观察和肠球菌较为类似的是链球菌和葡萄球菌，故本实验只用链球菌和葡萄球菌做特异性实验。

2.3.4PCR灵敏性试验将提取的ATCC32223和F1株的DNA模板经ND-1000微量紫外可见分光光度计(Thermo)测定含量后，用三蒸水进行倍比稀释，设定含量分别为10ng、1ng、100pg、10pg、1pg，按确定的扩增体系和扩增条件进行扩增，以出现特异扩增带的模板用量的最高稀释倍数计算可检出的肠球菌最低DNA含量。

2.3.5PCR扩增结果判定取10μl PCR产物，经含GoldView的1.5％琼脂糖凝胶电泳，以MarkerDL2000为分子量对照。并用Alphalmager^TM 2200型凝胶图像分析系统拍摄。

2.3.6PCR产物纯化、回收

按照百泰克快捷型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(离心柱型)要求回收，具体操作步骤：

(1)在长波紫外灯下，用干净刀片切下所需回收的含有目的DNA的凝胶，尽量切除不含目的DNA的凝胶，得到凝胶体积越小越好。

(2)将切下的含有目的DNA的凝胶放入1.5mL离心管，称量出凝胶重量。

(3)加三倍体积溶胶/结合液DB(如凝胶0.1g其体积可视为100μl，则加入300μl溶胶液)。

(4)56℃水浴放置10min(或直至胶完全溶解)。每2～3min涡旋震荡一次加速溶解。

(5)每100mg最初的凝胶重量加入150μl的异丙醇，震荡混匀。(此步可以提高回收率)

(6)将上一步所得溶液加入吸附柱AC中(吸附柱放入收集管)，12000rpm离心45s，弃去收集管中废液。

(7)加入700μl漂洗液WB(先加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，倒掉废液。

(8)将吸附柱AC放回收集管，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液WB，以免体系中残留的乙醇抑制下游反应。

(9)取出吸附柱AC，放入一个干净的EP管，在吸附膜中间部位加入50μl洗脱缓冲液EB(先在65～70℃水浴中加热洗脱缓冲液效果更好)，室温放置2min，12000rpm离心1min。若需要较多量的DNA，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1min。

2.416SrRNA基因的克隆、鉴定

2.4.1PCR产物与T载体的连接

参照上海捷瑞生物工程有限公司T载体使用说明书进行，将3种回收纯化的PCR产物分别与pTG19-T载体相连，连接反应体系如下：

pTG19-T vector            2.0μl

纯化PCR产物               4.0μl

10×T4buffer              1.0μl

T4DNALigase               1.0μl

dd H₂O                    2.0μl

                                   

总体积                    10.0μl

瞬时高速离心混匀，4℃连接过夜；可直接将连接产物用于转化。

2.4.2感受态细胞的制备

(1)将冻存的大肠杆菌DH5α在LB平板培养基上划线培养14h，挑取单个菌落接种于LB液体培养基，37℃200rpm震摇培养13h。

(2)取上述培养物200μl接种于5ml LB液体培养基中，37℃200rpm震摇2h。

(3)取1.5ml分装至无菌大EP管中，冰浴15min，4℃5000rpm离心5min，弃上清收集菌体。

(4)用预冷的CaCl₂(0.1M，高压灭菌)500μl悬浮菌体，轻轻吹打混匀，冰浴30min。

(5)4℃5000rpm离心5min，弃上清收集菌体，再次用预冷的CaCl₂100μl重悬菌体，轻轻吹打混匀，即为感受态细胞。

(6)4℃放置2h，感受态细胞直接用于转化。

2.4.3重组质粒的转化

参考萨姆布鲁克的方法(萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，分子克隆实验指南[M]，第三版，科学出版社，2002.)并稍加改进，具体步骤如下：

取DH5α感受态细胞100μl，加入连接产物5μl，冰浴30min，42℃热激90s，迅速冰浴2min，无菌加入1ml不含抗生素的LB液体培养基，37℃250rpm振荡培养1h，使菌液复苏并表达抗性，5000rpm离心5min，弃去上清液，剩余200μl重悬沉淀，再加入40μl X-gal(20mg/ml)和8μl IPTG(200mg/ml的异丙基硫代-β-半乳糖苷)，混匀，均匀涂布于含50μg/mlAmp的LB固体培养基上，超净工作台上吹干，37℃培养16h。取出放置4℃3h，蓝白斑颜色对比更加明显。

2.4.5小量重组质粒的提取

(1)从上述转化培养的固体培养基中挑取2个白色单个菌落，分别接种于含100μg/ml Amp的LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜，取4.5ml菌液12000rpm离心1min，弃上清，收集菌体。

(2)加入SⅠ溶液150μl，剧烈振荡或吹打混合均匀。

(3)加入SⅡ溶液300μl，上下快速颠倒5次，-20℃放置5min。

(4)加入225μl预冷的SⅢ溶液，轻轻颠倒混匀，-20℃放置5min。

(5)4℃12000rpm离心5min

(6)吸650μl上清至另一EP管，4℃12000rpm离心3min。

(7)吸600μl上清至新EP管，加入300μl Tris饱和酚和300μl氯仿，上下颠倒，4℃12000rpm离心5min。

(8)小心吸取上清液500μl至另一新EP管中，加入500μl氯仿，4℃12000rpm离心5min。

(9)取上清400μl至另一EP管中，加无水乙醇800μl，上下颠倒混匀，静置2min，-20℃放置20min。4℃12000rpm离心10min，弃上清。

(8)加1ml 70％乙醇，上下颠倒，12000rpm离心2min后，弃上清。

(9)吸水纸吸干管壁残留乙醇，30μl TER溶解沉淀(勿吹打)，37℃放置30min，取2μl电泳检测。-20℃保存。

2.4.6重组质粒的鉴定

PCR鉴定：对菌液和质粒分别PCR扩增鉴定，反应体系及反应的程序同上。反应结束后，取8μl产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。

酶切鉴定：取提取的重组质粒，用BamHI酶切鉴定，酶切反应体系如下：

重组质粒            10μl

dd H₂O              7μl

10×Buffer          2μl

BamHⅠ              1μl

                        

总体系              20μl

混匀后37℃酶切反应3h，取8μl酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

2.5核苷酸序列测定及分析

将鉴定正确的重组菌，由北京博尚生物技术有限公司测序，测定的DNA序列以双链碱基互补的结果为准。将测的3个基因序列与GenBank数据库中序列blast，发现测序结果正确。

3结果与分析

3.1方法建立及特异性试验

以14株标准株、2株粪肠球菌参考菌株、葡萄球菌及链球菌基因组DNA为模板，去离子水为空白对照，PCR扩增结果见图1及图2。

ATCC39212、CMCC(B)32223、E4、E5、E7、E8、E10和E12株有肠球菌属特异性条带1096bp及粪肠球菌种特异性条带360bp，判定为粪肠球菌；E1、E2、E3、E6、E10和E11株有肠球菌属特异性条带1096bp及屎肠球菌种特异性条带215bp，判定为屎肠球菌。与16S rRNA测序结果一致。E13、E14只有属特异性条带1096bp，这两株是E.sanguinicola，未扩增出种特异性条带。葡萄球菌和链球菌PCR阴性。

3.2敏感性试验

分别取粪肠球菌和屎肠球菌菌株用灭菌双蒸水倍比稀释，最终可检测到的DNA量是1ng。见图3。

3.316S rRNA、FL和FM的T载体克隆与鉴定结果。

对克隆获得的阳性转化子，经提取质粒和酶切重组质粒鉴定，见图4，由图可知，酶切结果正确，并且在NCBI上Blast结果表明正确。

Claims (2)

1.一种肠球菌属多重PCR检测引物，其特征在于：它的序列如下：

肠球菌属引物的序列如下：

上游引物E1：5′-GTGTCGCTGATGGATGG-3′；

下游引物E2：5′-GCAAGCCGAACTGAGAGA-3′；

粪肠球菌种引物的序列如下：

上游引物FL1：5′-ACATATGTGAATAACTTAACC-3′；

下游引物FL2：5′-TATTGGTGACTCTTGGTTTGG-3′；

屎肠球菌种引物的序列如下：

上游引物FM1：5′-GATAATACAATAGAAGAATTAT-3′；

下游引物FM2：5′-AGCTTTTTTGATATTCTTCTTTA-3′。

2.利用权利要求书1所述的肠球菌属多重PCR检测引物检测肠球菌属的方法，包括提取样品的DNA后，用PCR反应体系和PCR反应程序对样品进行检测，其特征在于：

所述PCR反应体系，在25μl体系中加入以下成份：

2×PCR TaqMix         8μl

E1/FL1/FM1            3μl

E1/FL2/FM2            3μl

模板DNA               2μl

dd H₂O                9μl

                               

总体积                25μl

所述PCR反应程序为：

95℃预变性5min；进入循环，94℃变性30s，49℃退火1min，72℃延伸1min 10s，30个循环；72℃终止10min。

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