CN102250879B

CN102250879B - 一种临床血液样品中病原菌dna的制备方法和试剂盒

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Publication number: CN102250879B
Application number: CN 201110148921
Authority: CN
Inventors: 周立庆
Original assignee: GUANGZHOU INNOGENIX BIOMEDICINE TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: GUANGZHOU INNOGENIX BIOMEDICINE TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2011-06-03
Filing date: 2011-06-03
Publication date: 2013-10-30
Anticipated expiration: 2031-06-03
Also published as: CN102250879A

Abstract

本发明公开了一种临床血液样品病原菌DNA的制备方法和试剂盒。它是将临床血液样品与牛胆汁或牛胆粉混合，使牛胆汁或牛胆粉裂解非病原菌细胞；在裂解非病原菌细胞的同时或裂解后，加入脱氧核糖核酸酶降解非病原菌细胞裂解后释放出的DNA；将上一步骤获得的混合物离心，收集沉淀物；按常规方法从沉淀物中制备病原菌DNA。本发明利用临床样品中的致病细菌和真菌对牛胆汁和牛胆粉具有耐受性的特点，利用牛胆汁或牛胆粉将临床血液样品中的非病原菌细胞裂解，使非病原菌细胞DNA释放出来，再用脱氧核糖核酸酶降解，选择性去除非病原菌DNA，使病原菌DNA富集。利用该DNA进行PCR反应，能避免占绝大多数的非病原菌DNA对病原菌PCR检测的干扰，提高PCR反应的专一性和灵敏度。

Description

一种临床血液样品中病原菌DNA的制备方法和试剂盒

技术领域：

本发明属于病原菌感染的分子诊断学领域，具体涉及一种从临床血液样品中富集提取病原菌DNA的制备方法，以及该方法所用的试剂盒。

背景技术：

临床微生物学实验室目前用于鉴定病人系统性感染常用的标准方法是血液培养。然而，血液培养方法的灵敏度则受到抗生素的使用及样品中所含病源菌的数量的巨大影响。甚至有些致病菌根本不可能在体外培养生长。另外，血液培养方法周期长，通常需要2至5天的时间才有可能得到结果，极大地延误了对病人的有效治疗。

近年来，核酸聚合酶链反应(PCR)在传染性疾病的分子诊断领域逐渐得到广泛的应用。理论上讲，PCR诊断方法对病原微生物的检测既专一灵敏又方便迅速。然而，从实际操作来看，这些以PCR为基础的诊断方法目前还没有显示出比血液培养方法有更大的优越性，有时甚至还比不上传统血液培养方法。其主要原因之一是临床样品中含有大量的非病原菌DNA。这些非病原菌DNA的存在严重地干扰了PCR诊断方法的专一性和灵敏度(Navarro et al.，FEMS Immunol.Med.Microbiol.2002；34：147-151；Horz et al.，JMicrobial Methods.2008；72(1)，pp98-102；Handschur et al.，Comp Immunol Microbiol Infect Dis.2009；32(3)：207-219)。

PCR诊断方法的专一性和灵敏度在很大程度上取决于检测样品DNA的制备提取方法。目前用于提取制备临床样品中DNA的方法对病原菌DNA和其它来源的非病原菌DNA没有任何区别。因此，所得的DNA提取物实质上是病原菌DNA和非病原菌DNA(如人血液细胞DNA)的混合物。在其DNA提取物中存在的这些非病原菌DNA能与用于检测病原菌基因DNA的PCR寡聚核苷酸引物非专一性结合，从而导致假阳性或假阴性的检测结果。如果临床样品DNA制备物中病原菌DNA的比例越小，则导致假阳性或假阴性检测结果的可能性就越大。

通常用于病原菌鉴定的临床样品中存在的病原菌数量极少，例如伤寒病患者的血液样品中伤寒菌的含量少至0.3细菌/毫升，而多数真菌疾病的临床血液样品也仅有约10真菌/毫升。从这样的临床样品中制备的DNA仅仅含有几个病原菌DNA分子，而绝大多数的DNA则是非病原菌DNA。临床诊断的目标就是要求能够从这样的样品中检测证明是否有病原菌DNA的存在，从而准确无误的鉴定导致感染的病原菌。占绝大多数的非病原菌DNA在临床样品中的存在，给PCR反应在传染性疾病诊断上应用带来了严重的问题和困难。

发明内容：

本发明的目的是提供一种能从临床血液样品中有效且选择性去除非病原菌DNA，富集病原菌DNA的制备方法。利用本方法制备的DNA进行PCR反应，能尽量避免占绝大多数的非病原菌DNA对PCR检测病原菌的干扰，在很大程度上提高了PCR反应的专一性和灵敏度。

本发明的临床血液样品中病原菌DNA的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)将临床血液样品与牛胆汁或牛胆粉混合，使牛胆汁或牛胆粉裂解非病原菌细胞；

(b)在裂解非病原菌细胞的同时或裂解后，加入脱氧核糖核酸酶降解非病原菌细胞经裂解后释放出的游离DNA；

(c)将步骤(b)获得的混合物经离心分离，收集含有病原菌细胞的沉淀物；

(d)按照常规方法从沉淀物中分离制备病原菌DNA。

本发明中牛胆汁或牛胆粉加入的浓度、放置的温度和时间，本领域技术人员可以根据实验来掌控，其达到的程度就是使牛胆汁或牛胆粉充分地裂解非病原菌细胞，如血液组织，主要裂解的是血细胞，降解的是血细胞DNA。

所述脱氧核糖核酸酶的加入量，其目的主要是降解非病原菌细胞裂解后释放出的DNA，其量本领域技术人员可以根据常规知识或实验获得。

所述的步骤(a)中将临床血液样品与牛胆粉混合，优选牛胆粉在血液样品与牛胆粉的混合体系中的浓度为5～75g/L，裂解温度为4～65℃，裂解时间为1～5h。

进一步优选，所述的步骤(a)中的牛胆粉在混合体系中的浓度为20～50g/L，裂解温度为23～25℃，裂解时间为5～15min。

更进一步优选是将牛胆粉先溶于水中，再与血液样品混合。这样的话，牛胆粉在血液样品中的分散性好，不会造成局部浓度过高的现象。

牛胆汁是指牛的胆汁，而牛胆粉是指动物牛的干燥胆汁，是现有技术中的商品，市场上有销售。

临床样品中的病原菌是耐牛胆汁或胆酸盐的致病细菌和真菌，主要来源于以下属种：不动杆菌属(Acinetobacter spp)，拟杆菌属(Bacteroides spp)，柠檬酸细菌属(Citrobacter spp)，肠杆菌属(Enterobacter spp)，大肠杆菌(Escherichia coli)，棱形杆菌(Fusobacterium)，流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)，克雷伯菌属(Klebsiella spp)，分支杆菌(mycobacterium)，卟啉单胞菌(Porphyromonas spp)，普氏菌属(Prevotella spp)，变形杆菌(Proteus spp)，假单胞菌(Pseudomonas spp)，沙门氏菌(Salmonella spp)，志贺氏菌属(Shigella)，肠球菌(Enterococcus spp)，李斯特氏菌(Listeria spp)，葡萄球菌(Staphylacoccus spp)，链球菌(Streptococcus spp)和耶尔森氏菌(Yersinia spp)，曲霉菌属(Aspergillus)，蛙粪霉菌属(Basidiobolus)，头孢霉菌(Cephalosporium)，虫霉属(Entomophthora)，Skopulariopsis，毛霉菌(Mucor)，根毛霉属(Rhizomucor)，头霉菌(Absidia)，根霉菌属(Rhizopus)，交链孢霉(Altenaria)，匍柄霉属(Stemphylium)，葡萄孢菌(Botrytis)，金孢子菌属(Chrysosporium)，弯孢(霉)属(Curvularia)，长蠕孢属(Helmithosporium)，半孢子菌(Hemispora)，黑孢子菌(Nigrospora)，拟青霉属(Paecilomyces)，疱霉属(Phoma)，梭孢壳属(Thielavia)，并头状菌属(Syncephalastrum)和念珠菌(Candida)。

根据上述致病菌，本领域技术人员可以按照常规知识设计其特异性引物，再以本发明的制备方法获得的病原菌DNA为模版进行常规PCR反应，检测样品中是否含有上述致病菌。

本发明还提供一种制备临床血液样品中病原菌DNA的试剂盒，其特征在于，包括牛胆汁或牛胆粉，脱氧核糖核酸酶和常规DNA提取试剂。

本发明还提供一种临床诊断检测血液样品中病原菌的试剂盒，其特征在于，包括牛胆汁或牛胆粉、脱氧核糖核酸酶，常规DNA提取试剂盒、常规PCR反应试剂和病原菌的检测引物。

本发明利用临床样品中的致病细菌和真菌对牛胆汁和牛胆粉具有耐受性的特点，利用牛胆汁或牛胆粉将临床血液样品中的非病原菌细胞裂解，使非病原菌细胞DNA释放出来，再利用脱氧核糖核酸酶降解，从而有效且选择性去除非病原菌DNA，使得病原菌DNA得到了富集。利用本发明方法制备获得的DNA进行PCR反应，能尽量避免占绝大多数的非病原菌DNA对PCR检测病原菌的干扰，在很大程度上提高了PCR反应的专一性和灵敏度。

附图说明：

图1是从临床样品中富集提取病原菌DNA的原理和步骤图；

图2是利用本发明的方法和传统DNA分离方法制备获得的DNA电泳比较图，其中M：DNA分子量标记；1-7，利用本发明的两种方法制备的DNA；8-14，利用传统方法制备的DNA，1和8，2和9，3和10，4和11，5和12，6和13，7和14的血液样品中分别含有3x10⁵，3x10⁴，3x10³，3x10²，30，3，0伤寒菌/毫升；

图3是不同浓度的牛胆汁中脱氧核糖核酸酶对人血液细胞DNA的降解作用；其中1：DNA分子量标记物；2：未加脱氧核糖核酸酶和牛胆粉；3-8：加脱氧核糖核酸酶(2x10³单位)，牛胆粉的浓度分别是0，10，30，50，70和90g/L，每个反应使用0.5微克人血液DNA。

图4是不同浓度的牛胆粉处理对脱氧核糖核酸酶活性的影响；其中A：室温处理15分钟；B：室温处理30分钟；C：室温处理60分钟；M：DNA分子量标记物；1、不加脱氧核糖核酸酶和牛胆粉的对照；2，3，4，5分别用0，50，75和100g/L的牛胆粉溶液处理脱氧核糖核酸酶，每个反应含0.5微克人血液DNA，牛胆粉处理的脱氧核糖核酸酶(10³单位)，室温反应时间1小时。

图5是DNA聚合酶链反应检测伤寒菌灵敏度的比较；利用本发明的方法或传统方法制备的DNA作为模板进行PCR反应，其产物通过1％的琼脂糖凝胶电泳显示出放大的伤寒菌鞭毛蛋白基因(fliC-d)片断(763碱基对)，M：DNA分子量标记；P：伤寒菌DNA阳性对照；N：无DNA阴性对照；1-7：利用本发明的方法制备的DNA作为模板；8-14：利用传统方法制备的DNA作为模板，1和8，2和9，3和10，4和11，5和12，6和13，7和14血液样品中分别含有3x10⁵，3x10⁴，3x10³，3x10²，30，3，0伤寒菌/毫升。

具体实施方式：

以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

牛胆粉对血细胞的裂解作用

牛胆粉(sigma公司生产，货号为Fluka，B3883)水溶液是将一定量的牛胆粉溶于水中，溶解完全即可。

取1毫升新鲜人血液，分别与4毫升浓度分别为0，15，20，25，30和50g/L的牛胆粉水溶液混合，室温(23～25℃)下放置。隔一定时间取样品10微升，放入200微升的生理盐水中，然后用显微镜观察血细胞的裂解程度。

结果如表1所示，从表1可以看出，牛胆粉能迅速且完全的将血细胞裂解。详细的讲，即使作用长达5个小时，血细胞在生理盐水中(无牛胆粉)也不会裂解，12g/L的牛胆粉只能使血细胞部分裂解，而16g/L以上浓度的牛胆汁则能在较短时间内使血细胞完全裂解。牛胆粉浓度越高，血细胞裂解的越快。

表1：牛胆粉对血细胞的裂解作用

实施例2：

一、模拟临床血液样品的制备

将一个伤寒菌菌落接种到2毫升胰蛋白胨大豆肉汤(英国OXOID Tryptone Soya Broth：缩写TSB)，在37℃恒温摇床，200转/分钟，培养2小时，获得伤寒菌培养液。先将伤寒菌培养液稀释至在A₆₀₀下，OD为0.25，然后再进一步做10倍系列稀释液。从稀释液中各取100微升，在胰蛋白胨大豆琼脂培养基上37℃培养，以确定各稀释液中伤寒菌的含量。

用无菌注射器抽取人血液，立即放入含有肝素的试管。将900毫升新鲜血液与100微升含不同数量的伤寒菌稀释液混合。其混合物即为模拟临床血液样品，该模拟临床血液样品用于DNA的分离制备。

二、DNA分离提取方法的比较

(1)传统DNA提取制备方法：取200微升模拟临床血液样品，使用商品血液DNA分离试剂盒QIAamp DNA mini kit((Qiagen，Crawley，UK，货号为QI0400))，按试剂盒使用说明书的步骤分离提取样品DNA。

(2)本发明方法1：将200微升模拟临床血液样品与等体积的100g/L的牛胆粉水溶液混合，室温(23～25℃)下放置15分钟，然后13000转/分钟离心5分钟以收集沉降物。用100微升0.1M CaCl₂将其沉降物溶解，并加入1微升(2x10³单位)微球菌脱氧核糖核酸酶(New England Biolabs)，37℃放置10分钟，然后13000转/分钟离心5分钟收集沉降物。取200微升生理盐水将其沉降物溶解，然后使用商品血液DNA分离试剂盒QIAamp DNA mini kit(Qiagen，Crawley，UK)，按试剂盒使用说明书的步骤分离提取样品DNA。

(3)本发明方法2：将200微升模拟临床血液样品与等体积的100g/L的牛胆粉水溶液混合，并加入10微升(2x10³单位/微升)微球菌脱氧核糖核酸酶(New England Biolabs)，37℃放置10分钟，然后13000转/分钟离心5分钟收集沉降物。取200微升生理盐水将其沉降物溶解，然后使用商品血液DNA分离试剂盒QIAamp DNA mini kit(Qiagen，Crawley，UK)，按试剂盒使用说明书的步骤分离提取样品DNA。

将不同方法制备的DNA提取物进行琼脂糖凝胶电泳比较检查，其结果如图2所示，其中1-7，利用本发明的两种方法制备的DNA；8-14，利用传统方法制备的DNA，1和8，2和9，3和10，4和11，5和12，6和13，7和14的血液样品中分别含有3x10⁵，3x10⁴，3x10³，3x10²，30，3，0伤寒菌/毫升，由图2可以看出使用传统方法制备的DNA提取物中含有大量的非病原性人血液DNA，而使用本发明方法制备的DNA提取物则显示不出非病原菌DNA的存在。

三、血液样品中伤寒菌鞭毛蛋白基因DNA的PCR检测及DNA制备方法对PCR检测灵敏度的影响

用于检测伤寒菌鞭毛蛋白基因的PCR反应引物是：

H-for(ACTCAGGCTTCCCGTAACGC)

Hd-rev(GGCTAGTATTGTCCTTATCGG)

(Levy et al.，J Clin Microbiol.2008；46(5)：1861-1866)。

PCR反应体积为50微升，其中含有0.5单位的Taq DNA聚合酶(Qiagen)，1倍的Qiagen PCR缓冲液，1.5mM MgCl₂，四种脱氧核苷三磷酸各为200μM，两种引物各0.5μM，10微升测试DNA样品。反应条件是95℃，5分钟；93℃30秒，55℃30秒，72℃40秒，35个循环；最后72℃延伸5分钟。反应完毕，使用琼脂糖凝胶电泳检查其PCR反应产物，如图5所示，其中1-14与上述DNA分离提取方法中的样品相对应，由图5可以看出，使用传统方法制备的DNA样品，伤寒菌鞭毛蛋白基因PCR反应检测的灵敏度是6000细菌/反应，而使用本发明方法制备的DNA提取物，伤寒菌鞭毛蛋白基因PCR反应检测的灵敏度可达6细菌/反应。由此表明，本发明的DNA制备方法能使伤寒菌鞭毛蛋白基因PCR反应检测的灵敏度提高1000倍。这主要是因为本发明的DNA制备方法将干扰检测灵敏度和专一性的大量非病原菌DNA，如人血细胞的DNA有选择性去除的结果。

由此可见，经本发明的方法对血液样品提取DNA后，虽然在琼脂糖电泳凝胶上显示不出来，但是实际上是因为血液中的非病原菌的血细胞DNA已被完全降解，而只有极少的病原菌DNA分子存在。另外，利用本发明的两种方法中的任意一种都能得到同样的效果。

实施例3：

不同浓度的牛胆粉水溶液对微球菌脱氧核糖核酸酶生物活性的影响

(1)取7个20微升含0.5微克人血液DNA，和分别含有0，10，30，50，70和90g/L的牛胆粉水溶液，放入反应管。向其中分别加入2x10³单位的微球菌脱氧核糖核酸酶，混匀并在室温下放置10分钟，然后使用琼脂糖凝胶电泳检查其反应液中的DNA降解情况。结果如图3所示：微球菌脱氧核糖核酸酶能将人血液DNA完全降解，并且在牛胆粉浓度高达90g/L的反应条件下，微球菌脱氧核糖核酸酶仍具有其生物活性。

(2)取10微升浓度分别为0，50或100g/L的牛胆粉水溶液，放入反应管。向其中分别加入10微升微球菌脱氧核糖核酸酶(2x10³单位/微升)，混匀并在室温下分别放置15分钟，30分钟和60分钟后，将1微升牛胆粉处理的微球菌脱氧核酸酶(10³单位/微升)与9微升含0.5微克的人血液DNA反应液混合，室温作用一小时，然后使用琼脂糖凝胶电泳检查其反应液中DNA的降解情况。结果如图4所示：微球菌脱氧核糖核酸酶经高达100g/L的牛胆粉水溶液处理一小时，仍然保持其生物活性，能将人血液DNA完全降解。

Claims

1.一种临床血液样品中病原菌DNA的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（a）将临床血液样品与牛胆粉混合，使牛胆粉裂解非病原菌细胞，牛胆粉在临床血液样品与牛胆粉的混合体系中的浓度为20～50g/L，裂解温度为23～25℃，裂解时间为5～15min；

（b）在裂解非病原菌细胞的同时或裂解后，加入脱氧核糖核酸酶降解非病原菌细胞经裂解后释放出的游离DNA；

（c）将步骤（b）获得的混合物经离心分离，收集含有病原菌细胞的沉淀物；

（d）按照常规方法从沉淀物中分离制备病原菌DNA。

2.根据权利要求1所述的临床血液样品中病原菌DNA的制备方法，其特征在于，所述的临床血液样品与牛胆粉混合是将牛胆粉先溶于水中，再与临床血液样品混合。