CN102168137A

CN102168137A - 用环介导等温扩增技术检测隐孢子虫卵囊dna的引物组、试剂盒、检测方法及应用

Info

Publication number: CN102168137A
Application number: CN201110039104XA
Authority: CN
Inventors: 沈玉娟; 袁忠英; 曹建平; 尹建海; 徐馀信
Original assignee: National Institute of Parasitic Diseases of Chinese Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: National Institute of Parasitic Diseases of Chinese Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2011-02-16
Filing date: 2011-02-16
Publication date: 2011-08-31

Abstract

本发明公开了一种用环介导等温扩增技术检测隐孢子虫卵囊DNA的引物组，包括外部引物对(F3、B3)和内部引物对(FIP、BIP)，其中，F3具有SEQ ID No：1所示的序列或其互补链，B3具有SEQ ID No：2所示的序列或其互补链，FIP具有SEQ ID No：3所示的序列或其互补链，BIP具有SEQ ID No：4所示的序列或其互补链。本发明还公开了用该引物组进行环介导等温扩增反应，检测隐孢子虫卵囊DNA的方法、检测用试剂盒及该引物组在制备隐孢子虫卵囊DNA检测剂中的应用。本发明通过设计两对隐孢子虫特异引物，实现隐孢子虫卵囊DNA的快速检测，从而提高隐孢子虫病的临床诊断速度和准确率。

Description

用环介导等温扩增技术检测隐孢子虫卵囊DNA的引物组、试剂盒、检测方法及应用

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种检测隐孢子虫卵囊DNA的方法，尤其涉及一种用环介导等温扩增技术检测隐孢子虫卵囊DNA的方法；此外，本发明还涉及用环介导等温扩增技术检测隐孢子虫卵囊DNA的引物组及应用。

背景技术

隐孢子虫(Cryptosporidium)是一种危害严重的机会性致病的人兽共患胃肠道原虫，卵囊污染水源、食物等造成隐孢子虫病暴发流行，宿主广泛，可感染包括人在内的240多种动物。隐孢子虫呈全球分布，感染病例遍及6大洲90多个国家，感染人和动物后引起腹泻，是艾滋病患者死亡的主要病因之一。WHO于1986年将隐孢子虫病作为艾滋病病人的一项怀疑指标。迄今为止该病尚无有效治疗药物和疫苗预防。免疫功能正常人群感染，常可引起急性、自限性腹泻，婴幼儿、免疫功能缺陷或免疫抑制人群感染，可引起慢性消耗性腹泻，甚至死亡。由隐孢子虫感染引发的腹泻是世界六大腹泻病之一，可从动物传播到人，人传播到动物，并在人与人、动物与动物以及人和动物之间广泛传播，造成重大经济和社会影响。隐孢子虫病被WHO和美国CDC列入新发传染病，同时被列为美国政府生物恐怖制剂名单的第三位(http://www.nsf.org/consumer/bioterrorism/bioterrorism_agents.asp)，也是其中唯一一种寄生虫病原。隐孢子虫的检测已被列入我国2005年颁布的《城市用水水质指标》，2008年7月1日起实施的《生活饮用水卫生标准》(GB5749-2006)明确了隐孢子虫是水质必检指标之一，并且全国各地最迟于2012年7月1日起实施。

我国自1987年首次报道隐孢子虫病患者以来，在二十多个省市均有病例报道，感染率1.4％～13.3％，其中艾滋病患者的感染率为4.0～4.7％。

近年来，国内外已经建立了对隐孢子虫的多种检测方法。隐孢子虫病检测方法主要有小肠黏膜活检法、粪便集卵法、染色法、免疫学诊断法和分子生物学诊断法等。小肠黏膜活检法因对患者造成组织损伤已逐渐被淘汰，现在常用的方法有改良抗酸染色法(modified acid-fast staining，MAFS)、免疫荧光单克隆抗体检测法(immunofluorescence using monoclonal antibody，IFA-McAb)、PCR检测等。前两个方法操作简单，但都需要镜检，对人员要求较高，且敏感性较PCR法低。随着分子生物学技术的发展，核酸扩增技术是一种极有价值的研究手段，国内外学者建立了敏感性高、特异性强的隐孢子虫PCR检测方法，但PCR技术较为复杂，实验条件要求严格，操作繁琐，时间较长，需要特殊的仪器，费用也较高、限制了其在基层单位的推广应用。

Notomi等在2000年报道了一种新的DNA扩增方法-环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)技术，该法具有简单、快速、特异性强的特点，而且不需要PCR仪，肉眼可判断结果及反应时间短等优点。虽然LAMP对引物设计的要求高，原理较复杂，实际操作简便、快速，只需下载相应的软件即可进行在线设计。随着世界各地隐孢子虫病例的报道显著增多，为寻找一种能在基层实验室及现场监测广泛使用的隐孢子虫快速检测方法，是非常急需和必要的。因此，建立隐孢子虫的LAMP快速检测方法，对于隐孢子虫病的临床诊断具有重要的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种用环介导等温扩增(简称LAMP)技术检测隐孢子虫卵囊DNA的引物组。

本发明要解决的技术问题之二是提供一种用环介导等温扩增技术检测隐孢子虫卵囊DNA的方法。

本发明要解决的技术问题之三是提供该引物组在制备隐孢子虫卵囊DNA检测剂中的应用。

本发明要解决的技术问题之四是提供一种隐孢子虫卵囊DNA检测用试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明建立了LAMP法检测牛粪中的隐孢子虫，继而用此方法检测了47份隐孢子虫卵囊DNA阳性样本，50份隐孢子虫卵囊DNA阴性样本和50份现场采集不同来源粪便DNA样本，以寻找一种新的、能在基层实验室及现场监测方面广泛使用的快速检测方法及检测用引物组。

在本发明的一方面，提供一种用环介导等温扩增技术检测隐孢子虫卵囊DNA的引物组，所述引物组包括外部引物对(F3、B3)和内部引物对(FIP、BIP)，其中，F3具有SEQ ID No：1所示的序列或其互补链，B3具有SEQ ID No：2所示的序列或其互补链，FIP具有SEQ ID No：3所示的序列或其互补链，BIP具有SEQ ID No：4所示的序列或其互补链。

在本发明的另一方面，提供一种用环介导等温扩增技术检测隐孢子虫卵囊DNA的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测虫株卵囊DNA；

(2)用上述引物组(包含外部引物对(F3、B3)和内部引物对(FIP、BIP)，其中，F3具有SEQ ID No：1所示的序列或其互补链，B3具有SEQ ID No：2所示的序列或其互补链，FIP具有SEQ ID No：3所示的序列或其互补链，BIP具有SEQ ID No：4所示的序列或其互补链)，进行环介导等温扩增反应；

(3)根据扩增产物判定该虫株是否为隐孢子虫。

步骤(2)中，所述环介导等温扩增的总反应体系为：10μmol/L的FIP和 BIP分别为2μl，10μmol/L的F3和B3分别为0.5μl，10mmol/L的dNTPs 1μl，5mol/L的三甲铵乙内酯5μl，0.1mol/L的MgSO₄ 1.5μl，10×Bst DNA聚合酶缓冲液2.5μl，Bst DNA聚合酶8U 1μl，DNA模板5μl，加双蒸水至25μl。

步骤(2)中，所述环介导等温扩增的反应程序为：将所述总反应体系中除Bst DNA聚合酶8U以外的所有反应物混匀，在95℃下预热5min，冷却后，加Bst DNA聚合酶8U 1μl，在65℃下反应60min，再在80℃下反应10min，终止反应。

步骤(3)中，所述判定的方法可以为：取部分扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳，若电泳图谱呈现LAMP特征性梯状条带，则说明待测虫株为隐孢子虫。

步骤(3)中，所述判定的方法可以为：取部分扩增产物，加入显色液，若显色结果呈阳性，则说明待测虫株为隐孢子虫。所述显色液可以采用本领域常规的各种显色液，例如可以采用SYBR Green I荧光染料作为显色液，所述阳性结果为在SYBR Green I荧光染料显色下呈现绿色。

在本发明的另一方面，还提供上述引物组在制备隐孢子虫卵囊DNA检测剂中的应用。在本发明的另一方面，还提供一种隐孢子虫卵囊DNA检测用试剂盒，其包含上述外部引物对(F3、B3)和内部引物对(FIP、BIP)，其中，F3具有SEQ ID No：1所示的序列或其互补链，B3具有SEQ ID No：2所示的序列或其互补链，FIP具有SEQ ID No：3所示的序列或其互补链，BIP具有SEQ ID No：4所示的序列或其互补链。

LAMP技术有其独特的核酸扩增原理，利用一种链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)和两对特殊的引物，对靶序列上的6个特异序列区进行特异地识别，在65℃的等温水箱反应1h即可将靶序列扩增至10⁹～10¹⁰倍，产生肉眼可见的反应副产物-白色焦磷酸镁沉淀，加入荧光染料SYBR Green I后，反应混合物变绿，阴性则保持SYBR Green I的橙色不变。LAMP产物不能直接测序鉴定，也不能用于基因的钓取与克隆，只适用于对病原体的检测。自LAMP技术发明后不久，就被用于各种寄生虫的检测，与PCR技术相比，LAMP技术省略经典PCR所需要的一系列变性、退火、延伸等复杂程序，在等温的条件下进行扩增反应，没有模板的变性、复性过程，节省了大量时间，同时不需要PCR仪等昂贵的仪器设备，具有简便、快速、特异等优点。

本发明从牛粪中提取隐孢子虫卵囊DNA，根据LAMP引物设计的原理，针对隐孢子虫18S rRNA序列的保守区域，设计4条LAMP反应引物，用LAMP方法检测牛粪中的隐孢子虫。实验结果表明该引物没有与蓝氏贾第鞭毛虫发生交叉反应，具有很好的特异性。因此，为探索其作为隐孢子虫快速检测，且有望用于现场样本检测，以及基层使用。且实验结果证明，采用LAMP法对现场样本的检测结果与巢氏PCR检测结果一致。本发明方法有望替代巢氏PCR用于现场样本隐孢子虫的检测、监测和筛查。与现有的检测方法相比，本发明的检测方法不仅操作简单，特异性强，而且可以同时进行多个样本的检验，从而有效地提高了隐孢子虫的检测速度和准确率。本发明的引物组对隐孢子虫的检测具有敏感性和特异性高等优点，具有较好的诊断价值，在隐孢子虫病诊断方面具有广泛的应用前景。

附图说明

图1是本发明实施例中SYBR Green I染料与LAMP扩增产物结合后的显色结果示意图，其中，1表示隐孢子虫，2表示蓝氏贾第鞭毛虫，3表示阴性对照；

图2是本发明实施例中对LAMP扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳的结果图，其中，M表示100bp DNA标志物，1表示隐孢子虫，2表示蓝氏贾第鞭毛虫，3表示阴性对照。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

1.材料

1.1虫株(卵囊)

改良抗酸染色法确定自然感染的牛源隐孢子虫卵囊粪便采自徐州某养牛场，用于方法建立；其他阳性样本采自上海、徐州、绍兴、哈尔滨、郑州和四川阿坝等地区牛、猪、羊、犬等动物和人；现场样本采自上海、绍兴和四川阿坝牛、猪、羊等动物和人。该实施例采用47份隐孢子虫卵囊DNA阳性样本，50份隐孢子虫卵囊DNA阴性样本和50份现场采集不同来源粪便DNA样本。本实验所用人源蓝氏贾第鞭毛虫滋养体由首都医科大学馈赠，并保存在液氮中。

1.2主要试剂和仪器

Bst DNA聚合酶购自英国Biolabs公司；三甲铵乙内酯(Betaine)购自美国Sigma公司；硫酸镁购自上海通亚公司；SYBR Green I购自美国Amresco公司；DNA标志物购自立陶宛Fermentas公司；脱氧核苷三磷酸(dNTPs)和PCR Mix购自Promega公司；粪便DNA提取试剂盒购自Qiagen公司；基因组DNA提取试剂盒、庆大霉素购自北京天根公司；骆蛋白胰酶水解物(Casein enzymatichudrolysate)、L-半胱氨酸盐酸盐(L-cystein hydrochloride)、脱水牛胆汁(dehydrated bovine bile)、牛血清白蛋白、维生素C购自Sigama公司；199培养基、小牛血清、双抗(青、链霉素10000单位/ml)购自Gibico公司；酵母提取物(Yeast extract)购自英国OXOID公司；葡萄糖、氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、枸橼酸铁胺购自上海化学试剂有限公司；0.22μm微孔滤膜过滤购自Pall公司；小型台式离心机(5417R)购自德国Eppendorf公司；PCR仪购自东胜公司；电热等温水浴锅(HWS24)购自上海一恒科技仪器有限公司。

2.方法

2.1隐孢子虫卵囊基因组DNA提取

将0.2g粪便样品放入2mlEP管中，按粪便DNA提取试剂盒说明书操作以提取隐孢子虫卵囊基因组DNA，-20℃保存备用。所有粪便样本均按此方法提取DNA。

2.2蓝氏贾第鞭毛虫滋养体基因组DNA提取

(1)蓝氏贾第鞭毛虫滋养体体外培养

TYI-33培养基(Trypticase Yeast，Iron-serum TYI-s)制备：骆蛋白胰酶水解物10g，酵母提取物10g，葡萄糖10g，氯化钠2g，磷酸氢二钾1g，磷酸二氢钾600mg，L-半胱氨酸盐酸盐1g，维生素C 200mg，枸橼酸铁胺22.8mg，双抗(青、链霉素10000单位/ml)10ml，庆大霉素1ml，10％脱水牛胆汁10ml，1％199培养基30ml，混匀，定容至900ml，用0.22μm微孔滤膜过滤，加新生小牛血清(用前在56℃温度下灭活30min)100ml，现配现用。

将冻存在液氮中的蓝氏贾第鞭毛虫滋养体复苏后，用TYI-33培养基体外培养1～2周，到达对数生长期后，收集滋养体。

(2)蓝氏贾第鞭毛虫DNA提取

取上述蓝氏贾第鞭毛虫滋养体，用基因组DNA提取试剂盒(北京天根公司)，按基因组DNA提取试剂盒说明书操作以提取蓝氏贾第鞭毛虫DNA，-20℃保存备用。

2.3引物设计和合成

根据隐孢子虫18S rRNA序列(GenBank登录号3873244)利用PrimerExplorer V4软件设计2对LAMP引物，分别是外部引物对(F3、B3)和内部引物对(FIP、BIP)，其序列为：

F3：5′-CTT ACT CCT TCA GCA CCT TA-3′(如SEQ ID No：1所示)；

B3：5′-CAA GAA AGA GCT ATC AAT CTG T-3′(如SEQ ID No：2所示)；

FIP：5′-CGT CAA TTC CTT TAA GTT TCA GCC TGA GAA ATC AAA GTC TTT GGGTT-3′(如SEQ ID No：3所示)；

BIP：5′-CCT GCG GCT TAA TTT GAC TCA CAA TCC TTC CTA TGT CTG GAC-3′(如SEQ ID No：4所示)。

上述引物由上海生工生物技术有限公司合成。

2.4LAMP扩增反应

25μl反应体系：10μmol/L的FIP和BIP分别为2μl，10μmol/L的F3和B3分别为0.5μl，10mmol/L的dNTPs 1μl，5mol/L的三甲铵乙内酯5μl，0.1mol/L的MgSO₄ 1.5μl，10×Bst DNA聚合酶缓冲液2.5μl，Bst DNA聚合酶8U 1μl，DNA模板5μl，加双蒸水至25μl。

反应程序为：将上述反应体系中除Bst DNA聚合酶8U以外的所有反应物混匀，放入电热等温水浴锅中，在95℃下预热5min，放到冰上，加Bst DNA聚合酶8U 1μl，在65℃反应60min，再在80℃反应10min，终止反应。取部分LAMP扩增产物，加入1000×SYBR Green I染料1μl进行显色反应，变绿色为阳性，棕色为阴性。分别取5μl扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳，LAMP产物的电泳图呈特征性梯状条带。

2.5.巢氏PCR

根据隐孢子虫18S rRNA序列(登录号3873244)设计2对引物，分别为：18S-1F：5′-TTC TAG AGC TAA TAC ATG CG-3′(如SEQ ID No：5所示)，18S-1R：5′-CCC ATT TCC TTC GAA ACA GGA-3′(如SEQ ID No：6所示)；18S-2F：5′- CTC ATA AGG TGC TGA AGG AGT A-3′(如SEQ ID No：7所示)，18S-2R：5′-GGA AGG GTT GTA TTT ATT AGA TAA AG-3′(如SEQ ID No：8所示)。引物由上海生工生物技术有限公司合成。PCR反应体系：2×PCR预混溶液(Mix)25μl，10mg/ml牛血清白蛋白(BSA)2μl，上下游引物各4μl，灭菌双蒸水13μl，模板DNA 2μl。扩增条件：94℃5min，94℃45s；第1次PCR 55℃45s(第2次PCR 58℃45s)，72℃1min，共35个循环；72℃7min。取部分PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳分析。

3.结果

3.1显色反应

取部分LAMP扩增产物，分别加入1000×SYBR Green I染料1μl，显色反应的结果如图1所示，隐孢子虫卵囊DNA检测管(1号管)经显色后呈现绿色(阳性)，而阴性对照管(3号管)和蓝氏贾第鞭毛虫检测管(2号管)为棕色(阴性)。本实验检测的47份隐孢子虫卵囊DNA阳性样本均呈绿色，50份阴性样本和50份现场样本呈棕色。

3.2凝胶电泳分析

分别取部分扩增产物，进行2％琼脂糖凝胶电泳，获得的电泳图谱如图2所示。其中，隐孢子虫卵囊DNA检测管的扩增产物经电泳后呈现出LAMP特征性梯状条带(见图2中的1)，而蓝氏贾第鞭毛虫检测管(见图2中的2)及阴性对照管(见图2中的3)均未扩增出条带，可见引物(即外部引物对(F3、B3)和内部引物对(FIP、BIP))不与蓝氏贾第鞭毛虫发生交叉反应，由此表明本发明的引物具有良好的特异性。50份现场样本检测结果与巢氏PCR结果一致，未见目的条带。

4.总结

本发明从牛粪中提取隐孢子虫卵囊DNA，根据LAMP引物设计的原理，针对隐孢子虫18S rRNA序列的保守区域，设计4条LAMP反应引物，用LAMP方法检测牛粪中的隐孢子虫，鉴于蓝氏贾第鞭毛虫同样引起腹泻，是隐孢子虫病中需要鉴别诊断的虫种，故本实验选用蓝氏贾第鞭毛虫DNA为对照，以检测此方法的特异性。实验结果显示隐孢子虫检测管经显色后变绿色，蓝氏贾第鞭毛虫检测管和阴性对照管为棕色，隐孢子虫卵囊DNA检测管产物经2％琼脂糖凝胶电泳后呈LAMP特征性梯状条带，而蓝氏贾第鞭毛虫和阴性对照则未扩增出条带，实验结果表明该引物没有与蓝氏贾第鞭毛虫发生交叉反应，具有很好的特异性。因此，为探索其作为隐孢子虫快速检测，且有望用于现场样本检测，以及基层使用，本实验用此方法检测了47份隐孢子虫卵囊DNA阳性样本、50份隐孢子虫卵囊DNA阴性样本和50份现场样本，结果47份隐孢子虫卵囊DNA阳性样本呈绿色、50份隐孢子虫卵囊DNA阴性样本和50份现场样本呈棕色，50份现场样本检测结果与巢氏PCR检测结果一致。实验证明，本发明方法有望替代巢氏PCR用于现场样本隐孢子虫的检测、监测和筛查。

序列表

<110>中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所

<120>用环介导等温扩增技术检测隐孢子虫卵囊DNA的引物组、试剂盒、检测方法及应用

<130>CPC-NP-11-15072

<160>8

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>1

cttactcctt cagcacctta 20

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>2

caagaaagag ctatcaatct gt 22

<210>3

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

cgtcaattcc tttaagtttc agcctgagaa atcaaagtct ttgggtt 47

<210>4

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

cctgcggctt aatttgactc acaatccttc ctatgtctgg ac 42

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>5

ttctagagct aatacatgcg 20

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>6

cccatttcct tcgaaacagg a 21

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>7

ctcataaggt gctgaaggag ta 22

<210>8

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>8

ggaagggttg tatttattag ataaag 26

Claims

1.一种用环介导等温扩增技术检测隐孢子虫卵囊DNA的引物组，其特征在于：所述引物组包括外部引物对(F3、B3)和内部引物对(FIP、BIP)，其中，F3具有SEQ ID No：1所示的序列或其互补链，B3具有SEQ ID No：2所示的序列或其互补链，FIP具有SEQ ID No：3所示的序列或其互补链，BIP具有SEQ IDNo：4所示的序列或其互补链。

2.一种用环介导等温扩增技术检测隐孢子虫卵囊DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取待测虫株卵囊DNA；

(2)用权利要求1所述的引物组，进行环介导等温扩增反应；

(3)根据扩增产物判定该虫株是否为隐孢子虫。

3.如权利要求2所述的用环介导等温扩增技术检测隐孢子虫卵囊DNA的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述环介导等温扩增的总反应体系为：10μmol/L的FIP和BIP分别为2μl，10μmol/L的F3和B3分别为0.5μl，10mmol/L的dNTPs 1μl，5mol/L的三甲铵乙内酯5μl，0.1mol/L的MgSO₄ 1.5μl，10×Bst DNA聚合酶缓冲液2.5μl，Bst DNA聚合酶8U 1μl，DNA模板5μl，加双蒸水至25μl。

4.如权利要求3所述的用环介导等温扩增技术检测隐孢子虫卵囊DNA的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述环介导等温扩增的反应程序为：将所述总反应体系中除Bst DNA聚合酶8U以外的所有反应物混匀，在95℃下预热5min，冷却后，加Bst DNA聚合酶8U 1μl，在65℃下反应60min，再在80℃下反应10min，终止反应。

5.如权利要求2至4任一项所述的用环介导等温扩增技术检测隐孢子虫卵囊DNA的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述判定的方法为：

取部分扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳，若电泳图谱呈现LAMP特征性梯状条带，则说明待测虫株为隐孢子虫。

6.如权利要求2至4任何一项所述的用环介导等温扩增技术检测隐孢子虫卵囊DNA的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述判定的方法为：

取部分扩增产物，加入显色液，若显色结果呈阳性，则说明待测虫株为隐孢子虫。

7.如权利要求6所述的用环介导等温扩增技术检测隐孢子虫卵囊DNA的方法，其特征在于，所述显色液为SYBR Green I荧光染料，所述阳性结果为绿色。

8.一种如权利要求1所述的引物组在制备隐孢子虫卵囊DNA检测剂中的应用。

9.一种隐孢子虫卵囊DNA检测用试剂盒，其特征在于，其包含权利要求1所述的引物组。