CN112501262A - 一种基于双重多酶介导的核酸扩增检测方法及试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于双重多酶介导的核酸扩增检测方法，包括以下步骤：预扩增、冻干复溶、扩增检测、结果分析。本发明包含使用常温核酸扩增技术并结合巢式扩增原理，单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶以及打开DNA双链的酶等多个酶促反应，可在30‑45℃恒温条件下，10‑20分钟内将DNA扩增数百万倍以上，配合荧光检测技术，可以实现对DNA的快速鉴定。本发明方法操作简单、时间短、仪器要求低，适合用于DNA快速诊断。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于双重多酶介导的核酸扩增检测方法及试剂。
背景技术
核酸扩增技术分为PCR技术与等温核酸扩增技术，对应的分别为在温度循环和恒定温度下核酸的扩增。为了提升PCR扩增的效率，巢式PCR技术发展起来了。巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对(而非一对)PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似，第二对引物称为巢式引物(因为他们在第一次PCR扩增片段的内部)结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片段，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。
巢式PCR的主要特征是利用引物与靶标核酸退火温度的差异，外侧一对引物先退火并扩增，而后降低退火温度，内侧一对引物退火扩增。相当于对检测靶标进行了两次PCR扩增放大，极大的提高了反应的检测灵敏度与特异性。然而，这种利用引物对之间的退火温度差异实现的巢式PCR，在等温扩增的技术上无法得到应用。如果直接将两对或更多引物放入等温扩增反应中，短的扩增产物会迅速积累，而长的扩增引物无法有效得到延伸，也无法实现通过多对引物对检测灵敏度进行提升。
基于多酶协作的等温扩增技术(专利号：ZL201310086850.3)是一种利用多酶协同作用(Enzymes mediated amplification，EMA)，能在较低的恒定温度下通过酶来完成双链解开，引物退火，引物延伸的循环过程达到核酸扩增。该方法可以在常温下实现核酸的高效扩增，然而其灵敏度和反应效率仍然有一定的优化空间。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于双重多酶介导的核酸扩增检测方法，这是一种新的、灵敏度更高、检测速度更快的常温扩增检测核酸的方法，其特点是特异性强、准确率高，操作简单、时间短、仪器要求低，能够实现快速、准确及低成本地检测核酸。
为达到上述目的，本发明的技术方案是：一种基于双重多酶介导的核酸扩增检测方法，包括以下步骤：
1)预扩增：将核酸样本和稀释液加入到冻干酶管中，混匀，离心后在30-45℃预扩增5-10分钟；
2)冻干复溶：取1)反应后得到的混合液以及稀释液加入到冻干酶管中，充分复溶；
3)扩增检测：将2)得到的复溶的冻干酶管放入核酸荧光检测仪中，30-45℃扩增5-10分钟，每30秒扫描荧光一次；采集荧光数据，绘制时间-荧光信号图；
4)结果分析：如果样本扫描荧光曲线为典型“S”型，则判断为阳性结果；反之，则为阴性结果。
其中，步骤1)的稀释液为稀释液1，所述稀释液1的成分如下：每100ml稀释液中含0.2-2M的MgAc22.80ml、0.5-5M的KAc 1.20ml、0.2-2M pH8.0的Tris-Ac 10.00ml、1-50％的PEG8K 36.60ml、0.1-1M二硫苏糖醇0.40ml、水49.00ml。
其中，步骤1)的冻干酶管为含预扩增引物组的扩增冻干酶管1，所述预扩增引物组为靶标基因目的序列外侧的上、下游引物。
优选的，预扩增和扩增的温度为37-45℃。
优选的，所述含预扩增引物组的扩增冻干酶管1的成分如下：每4ml冻干酶管中含有20-200ng/μl DNA解链蛋白200μl、100～1000ng/μl单链DNA结合蛋白240μl、10-100ng/μlDNA聚合酶96μl、1-10ng/μl ATP再生蛋白80μl、1-30ng/μl DNA限制性内切酶200μl、1-30ng/μl辅助蛋白60μl、1-100μM上游引物6μl、1-100μM下游引物6μl、1-20μM探针10μl、0.1-2M磷酸肌酸钠115μl、10-100mM ATP115μl、1-25mM dNTPs 20μl、0.1-10M pH8.0的Tris-Ac40μl、1-5％海藻糖8μl、KAc 0.002-0.04g。
其中，步骤2)的稀释液为稀释液2；所述稀释液2的成分如下：每100ml稀释液中含0.1-1M的MgAc2 2.80ml、0.3-2.5M的KAc 1.20ml、0.1-1M pH8.0的Tris-Ac 10.00ml、1-25％的PEG8K 36.60ml、0.1-1M二硫苏糖醇0.40ml、水49.00ml。
其中，步骤2)的冻干酶管为含荧光检测引物组的检测冻干酶管2；所述荧光检测引物组为靶标基因目的序列内侧的上、下游引物和探针。
优选的，所述含预扩增引物组的冻干酶管2的成分如下：每4ml冻干酶管中含有20-200ng/μl DNA解链蛋白200μl、100～1000ng/μl单链DNA结合蛋白240μl、10-100ng/μl DNA聚合酶96μl、1-10ng/μl ATP再生蛋白80μl、1-30ng/μl DNA限制性内切酶200μl、1-30ng/μl辅助蛋白60μl、1-100μM上游引物6μl、1-100μM下游引物6μl、1-20μM探针10μl、0.1-2M磷酸肌酸钠115μl、10-100mM ATP115μl、1-25mM dNTPs 20μl、0.1-10M pH8.0的Tris-Ac 40μl、1-5％海藻糖8μl、KAc 0.002-0.04g。
优选的，预扩增引物组和荧光检测引物组的引物长度在25-35个碱基之间，分别和所测靶标核酸正、反核酸序列匹配或同源度超过85％，且预扩增引物对1在荧光检测引物对2的外侧。方便起见，在本发明中简称预扩增引物组为引物对1，荧光检测引物组为引物对2。
优选的，荧光检测引物组的探针长度为35-50个碱基。
优选的，探针包含1个荧光基团，1～2个淬灭基团，1个碱基缺失以及1个3’端羟基封闭修饰；其中碱基缺失位于探针中部(距离5’端或3’端大于或等于15个碱基)，荧光基团和淬灭基团修饰的碱基分别在碱基缺失的上下游且间隔小于等于6个碱基。
所谓外侧和内侧是指引物在靶标基因中的相对位置。对于本发明而言，会有正向引物两条称为F1、F2，反向引物两条称为R1、R2，F1的序列在F2序列5’端的上游，R1的序列在R2序列端的上游。F1和R1就称为外侧引物，而F2与R2是内侧引物。
本发明还提供了基于双重多酶介导的核酸扩增检测试剂，所述核酸扩增检测试剂包括：
(1)稀释液1：每100ml稀释液中含0.2-2M的MgAc22.80ml、0.5-5M的KAc 1.20ml、0.2-2M pH8.0的Tris-Ac 10.00ml、1-50％的PEG8K 36.60ml、0.1-1M二硫苏糖醇0.40ml、水49.00ml；
(2)稀释液2：每100ml稀释液中含0.1-1M的MgAc2 2.80ml、0.3-2.5M的KAc1.20ml、0.1-1M pH8.0的Tris-Ac 10.00ml、1-25％的PEG8K 36.60ml、0.1-1M二硫苏糖醇0.40ml、水49.00ml；
(3)含预扩增引物组的扩增冻干酶管1；所述预扩增引物组为靶标基因目的序列外侧的上、下游引物；每4ml冻干酶管中含有：20-200ng/μl DNA解链蛋白200μl、100～1000ng/μl单链DNA结合蛋白240μl、10-100ng/μl DNA聚合酶96μl、1-10ng/μl ATP再生蛋白80μl、1-30ng/μl DNA限制性内切酶200μl、1-30ng/μl辅助蛋白60μl、1-100μM上游引物6μl、1-100μM下游引物6μl、1-20μM探针10μl、0.1-2M磷酸肌酸钠115μl、10-100mM ATP115μl、1-25mMdNTPs 20μl、0.1-10M pH8.0的Tris-Ac 40μl、1-5％海藻糖8μl、KAc 0.002-0.04g；
(4)含荧光检测引物组的检测冻干酶管2；所述荧光检测引物组为靶标基因目的序列内侧的上、下游引物和探针；每4ml冻干酶管中含有：20-200ng/μl DNA解链蛋白200μl、100～1000ng/μl单链DNA结合蛋白240μl、10-100ng/μl DNA聚合酶96μl、1-10ng/μl ATP再生蛋白80μl、1-30ng/μl DNA限制性内切酶200μl、1-30ng/μl辅助蛋白60μl、1-100μM上游引物6μl、1-100μM下游引物6μl、1-20μM探针10μl、0.1-2M磷酸肌酸钠115μl、10-100mM ATP115μl、1-25mM dNTPs 20μl、0.1-10M pH8.0的Tris-Ac 40μl、1-5％海藻糖8μl、KAc 0.002-0.04g。
其中，所述冻干酶管的真空冷冻冻干工艺为：-80～-50℃预冻4-8h；-40℃，1-4h；-30℃，1-4h；-20℃，1-3h；-10℃，1-3h；-5℃，1-3h；0℃，1-3h；5℃，1-3h；10℃，1-3h；15℃，1-3h；20℃，1-3h；真空度小于30帕斯卡。
优选的，所述冻干酶管的真空冷冻冻干工艺的真空度也可小于20帕斯卡。
优选的，所述冻干酶管的真空冷冻冻干工艺的真空度也可小于10帕斯卡。
本发明设计了预扩增反应1，在预扩增反应5-10分钟后，取出一部分反应体系进行扩增检测反应2，然后进行荧光检测。
预扩增反应1的预扩增试剂包括以下成份：每4ml冻干酶管中含有20-200ng/μlDNA解链蛋白200μl、100～1000ng/μl单链DNA结合蛋白240μl、10-100ng/μl DNA聚合酶96μl、1-10ng/μl ATP再生蛋白80μl、1-30ng/μl DNA限制性内切酶200μl、1-30ng/μl辅助蛋白60μl、1-100μM上下游引物6μl(引物对1)、0.1-2M磷酸肌酸钠115μl、10-100mM ATP115μl、1-50mM dNTPs 20μl、0.1-10M pH8.0的Tris-Ac 40μl、1-5％海藻糖8μl、KAc 0.002-0.04g；
扩增检测反应2的扩增检测试剂包括以下成份：每4ml冻干酶管中含有20-200ng/μl DNA解链蛋白200μl、100～1000ng/μl单链DNA结合蛋白240μl、10-100ng/μl DNA聚合酶96μl、1-10ng/μl ATP再生蛋白80μl、1-30ng/μl DNA限制性内切酶200μl、1-30ng/μl辅助蛋白60μl、1-100μM上下游引物6μl(引物对2)、1-20μM探针10μl、0.1-2M磷酸肌酸钠115μl、10-100mM ATP115μl、1-25mM dNTPs 20μl、0.1-10M pH8.0的Tris-Ac 40μl、1-5％海藻糖8μl、KAc 0.002-0.04g；
预扩增试剂以及扩增试剂的冻干流程：-80～-50℃预冻4-8h；-40℃，1-4h；-30℃，1-4h；-20℃，1-3h；-10℃，1-3h；-5℃，1-3h；0℃，1-3h；5℃，1-3h；10℃，1-3h；15℃，1-3h；20℃，1-3h；真空度小于30帕斯卡，或小于20帕斯卡，或小于10帕斯卡。
外侧引物(即预扩增引物组)长度为25-35bp，其序列与靶标核酸的序列匹配或同源性高于85％，内侧引物(即荧光检测引物组)长度为25-35bp，其序列与靶标核酸的序列匹配或同源性高于85％。
探针的长度为35-50bp，探针包含1个荧光基团，1～2个淬灭基团，1个碱基缺失以及1个3’端羟基封闭修饰；其中碱基缺失位于探针中部(距离5’端或3’端大于或等于15个碱基)，荧光基团和淬灭基团修饰的碱基分别在碱基缺失的上下游且间隔小于等于6个碱基；
以上所述两种上、下游引物和探针组可以是与靶标核酸的目的序列同源性大于85％的序列；或者，所述上、下游引物和探针是与靶标核酸的目的序列碱基互补的序列。
本发明提供了一种基于双重多酶介导的核酸扩增检测试剂，包括以下内容：
(1)稀释液1；
(2)稀释液2；
(3)含预扩增引物组的扩增冻干酶管1；所述预扩增引物组为靶标基因特定序列外侧的上、下游引物；
(4)含荧光检测引物组的检测冻干酶管2；所述荧光检测引物组为靶标基因特定序列内侧的上、下游引物和探针；
其中，所述稀释液1的成分如下：每l00ml稀释液中含0.2-2M的MgAc22.80ml、0.5-5M的KAc 1.20ml、0.2-2M pH8.0的Tris-Ac 10.00ml、1-50％的PEG8K 36.60ml、0.1-1M二硫苏糖醇0.40ml、水49.00ml。
其中，所述稀释液2的成分如下：每100ml稀释液中含0.1-1M的MgAc22.80ml、0.3-2.5M的KAc 1.20ml、0.1-1M pH8.0的Tris-Ac 10.00ml、1-25％的PEG8K 36.60ml、0.1-1M二硫苏糖醇0.40ml、水49.00ml。
其中，所述含预扩增引物组的冻干酶管1的成分如下：每4ml冻干酶管中含有20-200ng/μl DNA解链蛋白200μl、100～1000ng/μl单链DNA结合蛋白240μl、10-100ng/μl DNA聚合酶96μl、1-10ng/μl ATP再生蛋白80μl、1-30ng/μl DNA限制性内切酶200μl、1-30ng/μl辅助蛋白60μl、1-100μM上游引物6μl、1-100μM下游引物6μl、1-20μM探针10μl、0.1-2M磷酸肌酸钠115μl、10-100mM ATP115μl、1-25mM dNTPs 20μl、0.1-10M pH8.0的Tris-Ac 40μl、1-5％海藻糖8μl、KAc 0.002-0.04g。
其中，所述含预扩增引物组的冻干酶管2的成分如下：每4ml冻干酶管中含有20-200ng/μl DNA解链蛋白200μl、100～1000ng/μl单链DNA结合蛋白240μl、10-100ng/μl DNA聚合酶96μl、1-10ng/μl ATP再生蛋白80μl、1-30ng/μl DNA限制性内切酶200μl、1-30ng/μl辅助蛋白60μl、1-100μM上游引物6μl、1-100μM下游引物6μl、1-20μM探针10μl、0.1-2M磷酸肌酸钠115μl、10-100mM ATP115μl、1-25mM dNTPs 20μl、0.1-10M pH8.0的Tris-Ac 40μl、1-5％海藻糖8μl、KAc 0.002-0.04g。
其中，冻干酶的真空冷冻冻干工艺为：-80～-50℃预冻4-8h；-40℃，1-4h；-30℃，1-4h；-20℃，1-3h；-10℃，1-3h；-5℃，1-3h；0℃，1-3h；5℃，1-3h；10℃，1-3h；15℃，1-3h；20℃，1-3h；真空度小于30帕斯卡。真空度也可小于20帕斯卡，或小于10帕斯卡。
本发明的引物探针设计规则：引物对1和引物对2的设计长度为25-35个碱基之间，引物对1与引物对2分别和所测靶标核酸正反核酸序列匹配或同源度超过85％，且引物对1在引物对2的外侧。探针有多点修饰，探针长度为35-50个碱基。探针包含1个荧光基团，1～2个淬灭基团，1个碱基缺失以及1个3’端羟基封闭修饰；其中碱基缺失位于探针中部(距离5’端或3’端大于或等于15个碱基)，荧光基团和淬灭基团修饰的碱基分别在碱基缺失的上下游且间隔小于等于6个碱基。
本发明使用常温核酸扩增技术和巢式扩增原理，通过DNA解链蛋白、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶等多个酶促反应，可在30-45℃恒温条件下，第一步预扩增在10分钟内使目的核酸得以扩增数百万倍，配合第二步进一步扩增和荧光检测技术，可以实现对待检核酸的快速鉴定。
本发明中的稀释液1和稀释液2即为dEMA(Double Enzymes MediatedAmplification，双重多酶介导的核酸扩增技术)扩增缓冲液，稀释液1可直接用于dEMA预扩增，稀释液2可直接用于dEMA检测，。
本发明的dEMA体系(包括稀释液1和2、含引物的冻干酶管1和2)通过比较酶加样量、引物浓度、反应温度、反应时间等确定最终反应体系。
本发明的有益效果包括：
1、本方法检测灵敏度更高；经本发明实验对比，双重多酶介导dEMA的核酸扩增检测比常温核酸检测EMA灵敏度高出一倍以上；
2、本方法检测时间更短；dEMA检测出峰时间都在5分钟之内，少于EMA(常温核酸检测)检测或PCR检测时间；
3、本方法检测试剂经过冻干处理，有利于保存、运输和使用
本发明操作简单、时间短、仪器要求低，非常适合用于核酸现场快速检测。
本发明不用于疾病诊断和治疗目的。
附图说明
图1是为实施例1中双重多酶介导的核酸扩增检测虾肝肠孢虫(EHP)的核酸扩增荧光曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明，所选配方为试剂盒的优选配方，但并不用来限制本发明的范围。
实施例1，双重多酶介导的核酸扩增检测虾肝肠胞虫
一、实验试剂和设备：
1、实验试剂：
无害化处理过的虾肝肠胞虫样本；
DNA提取试剂盒：柱法核酸提取试剂盒(苏州点晶生物科技有限公司)；
双重多酶介导的核酸扩增检测虾肝肠胞虫的试剂主要组成成分见表1：
表1
其中，稀释液1：每100ml稀释液中含1M的MgAc22.80ml、2M的KAc 1.20ml、1M pH8.0的Tris-Ac 10.00ml、30％的PEG8K36.60ml、0.1-1M二硫苏糖醇0.40ml、水49.00ml；
释液2的成分如下：每100ml稀释液中含0.5M的MgAc2 2.80ml、1M的KAc 1.20ml、0.5M pH8.0的Tris-Ac 10.00ml、15％的PEG8K 36.60ml、0.1-1M二硫苏糖醇0.40ml、水49.00ml。
预扩增冻干酶1和检测冻干酶2生产工艺：
预扩增冻干酶管1组分：每4ml冻干酶管中含有100ng/μl DNA解链蛋白200μl、500ng/μl单链DNA结合蛋白240μl、80ng/μl DNA聚合酶96μl、8ng/μl ATP再生蛋白80μl、15ng/μl DNA限制性内切酶200μl、15ng/μl辅助蛋白60μl、100μM EHP-F1 6μl、100μM EHP-R1 6μl、1M磷酸肌酸钠115μl、100mM ATP 115μl、25mM dNTPs 20μl、1M pH8.0的Tris-Ac 40μl、5％海藻糖8μl、KAc 0.02g。
其中引物序列，所述上游引物是EHP-F1：5’-TTAAAGGGTCCGTAGTCGTAGATGCAAT-3’；EHP-R1：5’-TACGTCTAAGAGCATCGCTTTCGCCTCC-3’。
检测冻干酶管2：每4ml冻干酶管中含有100ng/μlDNA解链蛋白200μl、500ng/μl单链DNA结合蛋白240μl、80ng/μlDNA聚合酶96μl、8ng/μlATP再生蛋白80μl、15ng/μlDNA限制性内切酶200μl、15ng/μl辅助蛋白60μl、100μM EHP-F2 6μl、100μM EHP-R2 6μl、10μM EHP-P(荧光探针)10μl、1M磷酸肌酸钠115μl、100mM ATP 115μl、25mM dNTPs 20μl、1M pH8.0的Tris-Ac 40μl、5％海藻糖8μl、KAc 0.02g。
其中引物序列，EHP-F2：5’-AAAAGGTGGTGTTAAAAGCCATTGAGT-3’；EHP-R2：5’-GTCTTGAGATTTCATTCTTTGCCCACCT-3’；EHP-P(荧光探针)：5’-TTTCATTCTTTGCCCACCTATACCATGC/i6-FAMdT/C/idSp/C/iBHQ1dT/ATCCGTTCCGCTA--3’(3’C3Spacer)。其中“i6-FAMdT”指6-FAM(6-羧基荧光素)荧光标记的dT核苷酸，“idSp”指碱基缺失，“iBHQ1dT”指带有BHQ1淬灭基团标记的dT核苷酸，“C3Spacer”指3’羟基封闭。
冻干工艺：将上述配好，20μl分装八联管，按以下优选冻干程序冻干：-50℃预冻4h；-40℃，4h；-30℃，4h；-20℃，3h；-10℃，3h；-5℃，1h；0℃，1h；5℃，1h；10℃，1h；15℃，1h；20℃，1h；真空度为10帕斯卡。
双重多酶介导的核酸扩增检测虾肝肠胞虫的试剂主要组成成分见表2：
表2
其中，稀释液：每100ml稀释液中含1M的MgAc22.80ml、2M的KAc 1.20ml、1M pH8.0的Tris-Ac 10.00ml、30％的PEG8K 36.60ml、0.1-1M二硫苏糖醇0.40ml、水49.00ml；
检测冻干酶试剂：每4ml冻干酶管中含有100ng/μl DNA解链蛋白200μl、500ng/μl单链DNA结合蛋白240μl、80ng/μl DNA聚合酶96μl、8ng/μl ATP再生蛋白80μl、15ng/μl DNA限制性内切酶200μl、15ng/μl辅助蛋白60μl、100μM EHP-F2 6μl、100μM EHP-R2 6μl、l0μMEHP-P(荧光探针)10μl、1M磷酸肌酸钠115μl、100mM ATP 115μl、25mM dNTPs 20μl、1MpH8.0的Tris-Ac 40μl、5％海藻糖8μl、KAc 0.02g。其中引物序列，EHP-F2：5’-AAAAGGTGGTGTTAAAAGCCATTGAGT-3’；EHP-R2：5’-GTCTTGAGATTTCATTCTTTGCCCACCT-3’；EHP-P(荧光探针)：5’-TTTCATTCTTTGCCCACCTATACCATGC/i6-FAMdT/C/idSp/C/iBHQ1dT/ATCCGTTCCGCTA--3’(3’C3 Spacer)
实验设备：
移液器，苏州点晶Clicki荧光检测仪、震荡器及离心机，定时器。
二、实验方法：
1、无害化处理的虾肝肠胞虫样本的提取：
将无害化处理的虾肝肠胞虫用离心柱核酸提取方法提取DNA。
2、检测步骤
双重多酶介导的核酸扩增检测虾肝肠胞虫步骤
(1)取10μl虾肝肠胞虫DNA和10μl稀释液1加入到冻干酶管1中，上下剧烈混匀3-4次，短暂离心后30-45℃预扩增10分钟；
(2)取10μl上步反应后得到的混合液以及10μl稀释液2加入到冻干酶管2中，充分复溶；
(3)将复溶的冻干酶管2放入核酸荧光检测仪中，30-45℃扩增5-10分钟，每30秒扫描荧光一次；采集荧光数据，绘制时间-荧光信号图；
(4)结果分析：如果样本扫描荧光曲线为典型“S”型，则判断为阳性结果；反之，则为阴性结果
对比例 常温核酸检测虾肝肠胞虫步骤：
(1)取10μl虾肝肠胞虫DNA和10μl稀释液1加入到冻干酶试剂中，上下剧烈混匀3-4次，短暂离心后放入核酸荧光检测仪中，30-45℃扩增30分钟，每30秒扫描荧光一次；采集荧光数据，绘制时间-荧光信号图；
(2)结果分析：如果样本扫描荧光曲线为典型“S”型，则判断为阳性结果；反之，则为阴性结果
检测结果见图1，图中不同曲线为不同的样本稀释倍数的检测结果的荧光曲线。可见dEMA检测EHP样品，不论稀释倍数如何，其起峰时间都在5分钟内。dEMA及EMA检测虾肝肠胞虫的平行对比结果见列表3，可见双重多酶介导dEMA的核酸扩增检测比常温核酸检测EMA灵敏度高出一倍以上，而且前者检测时间均小于4分钟，比常温检测的时间要短。
表3 dEMA及EMA检测虾肝肠胞虫的平行对比
实施例2，dEMA(Double Enzymes Mediated Amplification，双重多酶介导的核酸扩增技术)检测非洲猪瘟
一、实验试剂和设备：
1、实验试剂：
无害化处理过的非洲猪瘟阴性和阳性样品；
DNA提取试剂盒：柱法核酸提取试剂盒(苏州点晶生物科技有限公司)；
双重多酶介导的核酸扩增检测非洲猪瘟的试剂主要组成成分见表4：
表4
其中，稀释液1：每100ml稀释液中含1M的MgAc22.80ml、2M的KAc 1.20ml、1M pH8.0的Tris-Ac 10.00ml、30％的PEG8K 36.60ml、0.1-1M二硫苏糖醇0.40ml、水49.00ml；
释液2的成分如下：每100ml稀释液中含0.5M的MgAc22.80ml、1M的KAc 1.20ml、0.5M pH8.0的Tris-Ac 10.00ml、15％的PEG8K 36.60ml、0.1-1M二硫苏糖醇0.40ml、水49.00ml。
预扩增冻干酶1和检测冻干酶2生产工艺：
预扩增冻干酶管1组分：每4ml冻干酶管中含有100ng/μl DNA解链蛋白200μl、500ng/μl单链DNA结合蛋白240μl、80ng/μl DNA聚合酶96μl、8ng/μl ATP再生蛋白80μl、15ng/μl DNA限制性内切酶200μl、15ng/μl辅助蛋白60μl、100μM ASFV-F1 6μl、100μMASFV-R1 6μl、1M磷酸肌酸钠115μl、100mM ATP 115μl、25mM dNTPs 20μl、1M pH8.0的Tris-Ac 40μl、5％海藻糖8μl、KAc 0.002-0.04g。其中引物序列，所述上游引物是ASFV-F1：5’-ATACCAAAGGTAAGCTTGTTTCCCA-3’；ASFV-R1：5’-TAACATTATATATGGCATCAGGAGGAGC-3’。
检测冻干酶管2：每4ml冻干酶管中含有100ng/μl DNA解链蛋白200μl、500ng/μl单链DNA结合蛋白240μl、80ng/μl DNA聚合酶96μl、8ng/μl ATP再生蛋白80μl、15ng/μl DNA限制性内切酶200μl、15ng/μl辅助蛋白60μl、100μM ASFV-F2 6μl、100μM ASFV-R2 6μl、10μMASFV-P(荧光探针)10μl、1M磷酸肌酸钠115μl、100mM ATP 115μl、25mM dNTPs 20μl、1MpH8.0的Tris-Ac 40μl、5％海藻糖8μl、KAc 0.002-0.04g。其中引物序列，ASFV-F2：5’-TCTTATTGCTAACGATGGGAAGGCCGA-3’；ASFV-R2 5’-CCCGTATGCGGGCGTACTTTATTGTATT-3’；ASFV-P(荧光探针)：5’-AGTGGGTTCGGGGTCGGGTTTCCCATAAC/iFAMdT//idSp/T/iBHQ1dT/GTTCACATTTTTA-3’(C3 Spacer)；
冻干工艺：将上述配好，20μl分装八联管，按以下优选冻干程序冻干：-50℃预冻4h；-40℃，4h；-30℃，4h；-20℃，3h；-10℃，3h；-5℃，1h；0℃，1h；5℃，1h；10℃，1h；15℃，1h；20℃，1h；真空度为10帕斯卡。
作为对比例，常温核酸检测非洲猪瘟的试剂主要组成成分见表5：
表5
其中，稀释液：每100ml稀释液中含1M的MgAc22.80ml、2M的KAc 1.20ml、1M pH8.0的Tris-Ac 10.00ml、30％的PEG8K 36.60ml、0.1-1M二硫苏糖醇0.40ml、水49.00ml；
检测冻干酶试剂：每4ml冻干酶管中含有100ng/μl DNA解链蛋白200μl、500ng/μl单链DNA结合蛋白240μl、80ng/μl DNA聚合酶96μl、8ng/μl ATP再生蛋白80μl、15ng/μl DNA限制性内切酶200μl、15ng/μl辅助蛋白60μl、ASFV-F2 6μl、100μM ASFV-R2 6μl、10μMASFV-P(荧光探针)10μl、1M磷酸肌酸钠115μl、100mM ATP 115μl、25mM dNTPs 20μl、1MpH8.0的Tris-Ac 40μl、5％海藻糖8μl、KAc 0.002-0.04g。其中引物序列，ASFV-F2：5’-TCTTATTGCTAACGATGGGAAGGCCGA-3’；ASFV-R2 5’-CCCGTATGCGGGCGTACTTTATTGTATT-3’；ASFV-P(荧光探针)：5’-AGTGGGTTCGGGGTCGGGTTTCCCATAAC/iFAMdT//idSp/T/iBHQ1dT/GTTCACATTTTTA-3’(C3 Spacer)；
非洲猪瘟qPCR试剂为外购。
2、实验设备：
移液器，苏州点晶Clicki荧光检测仪、震荡器及离心机，杭州博日定量qPCR仪，定时器。
二、实验方法：
1、无害化非洲猪瘟样本的提取：
将无害化非洲猪瘟样本用离心柱核酸提取方法提取DNA。
2、检测步骤
双重多酶介导的核酸扩增检测非洲猪瘟步骤
(1)取10μl非洲猪瘟DNA和10μl稀释液1加入到冻干酶管1中，上下剧烈混匀3-4次，短暂离心后37-45℃预扩增10分钟；
(2)取10μl上步反应后得到的混合液以及10μl稀释液2加入到冻干酶管2中，充分复溶；
(3)将复溶的冻干酶管2放入核酸荧光检测仪中，37-45℃扩增5-10分钟，每30秒扫描荧光一次；采集荧光数据，绘制时间-荧光信号图；
(4)结果分析：如果样本扫描荧光曲线为典型“S”型，则判断为阳性结果；反之，则为阴性结果
对比例常温核酸检测(EMA)非洲猪瘟步骤：
(1)取10μl非洲猪瘟DNA和10μl稀释液1加入到冻干酶试剂中，上下剧烈混匀3-4次，短暂离心后放入核酸荧光检测仪中，37-45℃扩增30分钟，每30秒扫描荧光一次；采集荧光数据，绘制时间-荧光信号图；
(2)结果分析：如果样本扫描荧光曲线为典型“S”型，则判断为阳性结果；反之，则为阴性结果
qPCR检测非洲猪瘟步骤：
(1)根据试剂说明书将酶和buffer配成工作反应液；
(2)将提取5μl非洲猪瘟DNA加入到15μ1反应液中，将反应管放入荧光定量PCR仪中，按照说明书设置反应程序，反应为45个循环；
(3)结果分析：如果样本扫描荧光曲线为典型“S”型，且Ct值＜36，则为阳性；Ct值＞40，则为阴性；如果介于之间需要复测后确定。
dEMA、EMA以及PCR平行对比检测实验结果见表6，在24份样品中，dEMA检测出阳性样本9例，高于PCR(8列)以及EMA(6例)；所检出9例中，其中8例与PCR结果一致；并且，dEMA检测出峰时间都在5分钟之内，少于EMA检测或PCR检测时间。
表6 dEMA、EMA及PCR检测非洲猪瘟病毒的平行对比
注：可见例2、5、20均为dEMA检出阳性，而EMA未检出。其中，例5、20为PCR同样检出阳性。
本发明包含使用常温核酸扩增技术并结合巢式扩增原理，单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶以及打开DNA双链的酶等多个酶促反应，可在37-45℃恒温条件下，10-20分钟内使将DNA扩增数百万倍以上，配合荧光检测技术，可以实现对DNA的快速鉴定。
本发明检测灵敏度高，双重多酶介导dEMA的核酸扩增检测比常温核酸检测EMA灵敏度高出一倍以上；检测时间更短；dEMA检测出峰时间都在5分钟之内，少于EMA(常温核酸检测)检测或PCR检测时间。本发明方法操作简单、时间短、仪器要求低，适合用于DNA快速诊断。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 苏州点晶生物科技有限公司
<120> 一种基于双重多酶介导的核酸扩增检测方法及试剂
<130> 0
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> Enterocytozoon hepatopenaei
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(28)
<400> 1
ttaaagggtc cgtagtcgta gatgcaat 28
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> Enterocytozoon hepatopenaei
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(28)
<400> 2
tacgtctaag agcatcgctt tcgcctcc 28
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> Enterocytozoon hepatopenaei
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(27)
<400> 3
aaaaggtggt gttaaaagcc attgagt 27
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> Enterocytozoon hepatopenaei
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(28)
<400> 4
gtcttgagat ttcattcttt gcccacct 28
<210> 5
<211> 43
<212> DNA
<213> Enterocytozoon hepatopenaei
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(43)
<400> 5
tttcattctt tgcccaccta taccatgccc atccgttccg cta 43
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> African swine fever virus
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<400> 6
ataccaaagg taagcttgtt tccca 25
<210> 7
<211> 28
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Claims (10)
1.一种基于双重多酶介导的核酸扩增检测方法，其特征在于，所述核酸扩增检测方法包括以下步骤：
1)预扩增：将核酸样本和稀释液加入到冻干酶管中，混匀，离心后在30-45℃预扩增5-10分钟；
2)冻干复溶：取1)反应后得到的混合液以及稀释液加入到冻干酶管中，充分复溶；
3)扩增检测：将2)得到的复溶的冻干酶管放入核酸荧光检测仪中，30-45℃扩增5-10分钟，每30秒扫描荧光一次；采集荧光数据，绘制时间-荧光信号图；
4)结果分析：如果样本扫描荧光曲线为典型“S”型，则判断为阳性结果；反之，则为阴性结果。
2.如权利要求1所述的基于双重多酶介导的核酸扩增检测方法，其特征在于，步骤1)的稀释液为稀释液1，所述稀释液1的成分如下：每100ml稀释液中含0.2-2M的MgAc2 2.80ml、0.5-5M的KAc 1.20ml、0.2-2M pH8.0的Tris-Ac 10.00ml、1-50％的PEG8K 36.60ml、0.1-1M二硫苏糖醇0.40ml、水49.00ml。
3.如权利要求1所述的基于双重多酶介导的核酸扩增检测方法，其特征在于，步骤1)的冻干酶管为含预扩增引物组的扩增冻干酶管1，所述预扩增引物组为靶标基因目的序列外侧的上、下游引物。
4.如权利要求3所述的基于双重多酶介导的核酸扩增检测方法，其特征在于，所述含预扩增引物组的扩增冻干酶管1的成分如下：每4ml冻干酶管中含有20-200ng/μl DNA解链蛋白200μl、100～1000ng/μl单链DNA结合蛋白240μl、10-100ng/μl DNA聚合酶96μl、1-10ng/μl ATP再生蛋白80μl、1-30ng/μl DNA限制性内切酶200μl、1-30ng/μl辅助蛋白60μl、1-100μM上游引物6μl、1-100μM下游引物6μl、1-20μM探针10μl、0.1-2M磷酸肌酸钠115μl、10-100mMATP115μl、1-25mM dNTPs 20μl、0.1-10M pH8.0的Tris-Ac 40μl、1-5％海藻糖8μl、KAc0.002-0.04g。
5.如权利要求1所述的基于双重多酶介导的核酸扩增检测方法，其特征在于，步骤2)的稀释液为稀释液2；所述稀释液2的成分如下：每100ml稀释液中含0.1-1M的MgAc2 2.80ml、0.3-2.5M的KAc 1.20ml、0.1-1M pH8.0的Tris-Ac 10.00ml、1-25％的PEG8K 36.60ml、0.1-1M二硫苏糖醇0.40ml、水49.00ml。
6.如权利要求1所述的基于双重多酶介导的核酸扩增检测方法，其特征在于，步骤2)的冻干酶管为含荧光检测引物组的检测冻干酶管2；所述荧光检测引物组为靶标基因目的序列内侧的上、下游引物和探针。
7.如权利要求6所述的基于双重多酶介导的核酸扩增检测方法，其特征在于，所述含预扩增引物组的冻干酶管2的成分如下：每4ml冻干酶管中含有20-200ng/μl DNA解链蛋白200μl、100～1000ng/μl单链DNA结合蛋白240μl、10-100ng/μl DNA聚合酶96μl、1-10ng/μl ATP再生蛋白80μl、1-30ng/μl DNA限制性内切酶200μl、1-30ng/μl辅助蛋白60μl、1-100μM上游引物6μl、1-100μM下游引物6μl、1-20μM探针10μl、0.1-2M磷酸肌酸钠115μl、10-100mMATP115μl、1-25mM dNTPs 20μl、0.1-10M pH8.0的Tris-Ac 40μl、1-5％海藻糖8μl、KAc0.002-0.04g。
8.基于双重多酶介导的核酸扩增检测试剂，其特征在于，所述核酸扩增检测试剂包括：
(1)稀释液1：每100ml稀释液中含0.2-2M的MgAc2 2.80ml、0.5-5M的KAc 1.20ml、0.2-2MpH8.0的Tris-Ac 10.00ml、1-50％的PEG8K 36.60ml、0.1-1M二硫苏糖醇0.40ml、水49.00ml；
(2)稀释液2：每100ml稀释液中含0.1-1M的MgAc2 2.80ml、0.3-2.5M的KAc 1.20ml、0.1-1M pH8.0的Tris-Ac 10.00ml、1-25％的PEG8K 36.60ml、0.1-1M二硫苏糖醇0.40ml、水49.00ml；
(3)含预扩增引物组的扩增冻干酶管1；所述预扩增引物组为靶标基因目的序列外侧的上、下游引物；每4ml冻干酶管中含有：20-200ng/μl DNA解链蛋白200μl、100～1000ng/μl单链DNA结合蛋白240μl、10-100ng/μl DNA聚合酶96μl、1-10ng/μl ATP再生蛋白80μl、1-30ng/μl DNA限制性内切酶200μl、1-30ng/μl辅助蛋白60μl、1-100μM上游引物6μl、1-100μM下游引物6μl、1-20μM探针10μl、0.1-2M磷酸肌酸钠115μl、10-100mM ATP115μl、1-25mMdNTPs 20μl、0.1-10M pH8.0的Tris-Ac 40μl、1-5％海藻糖8μl、KAc 0.002-0.04g；
(4)含荧光检测引物组的检测冻干酶管2；所述荧光检测引物组为靶标基因目的序列内侧的上、下游引物和探针；每4ml冻干酶管中含有：20-200ng/μl DNA解链蛋白200μl、100～1000ng/μl单链DNA结合蛋白240μl、10-100ng/μl DNA聚合酶96μl、1-10ng/μl ATP再生蛋白80μl、1-30ng/μl DNA限制性内切酶200μl、1-30ng/μl辅助蛋白60μl、1-100μM上游引物6μl、1-100μM下游引物6μl、1-20μM探针10μl、0.1-2M磷酸肌酸钠115μl、10-100mM ATP115μl、1-25mM dNTPs 20μl、0.1-10M pH8.0的Tris-Ac 40μl、1-5％海藻糖8μl、KAc 0.002-0.04g。
9.如权利要求8所述的基于双重多酶介导的核酸扩增检测试剂，其特征在于，所述冻干酶管的真空冷冻冻干工艺为：-80～-50℃预冻4-8h；-40℃，1-4h；-30℃，1-4h；-20℃，1-3h；-10℃，1-3h；-5℃，1-3h；0℃，1-3h；5℃，1-3h；10℃，1-3h；15℃，1-3h；20℃，1-3h；真空度小于30帕斯卡。
10.如权利要求8所述的基于双重多酶介导的核酸扩增检测试剂，其特征在于，所述检测冻干酶管2中的探针包含1个荧光基团，1～2个淬灭基团，1个碱基缺失以及1个3’端羟基封闭修饰；其中碱基缺失位于探针中部，荧光基团和淬灭基团修饰的碱基分别在碱基缺失的上下游且间隔小于等于6个碱基。
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Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005118853A2 (en) * | 2004-06-01 | 2005-12-15 | Asm Scientific, Inc. | Recombinase polymerase amplification |
| CN102168137A (zh) * | 2011-02-16 | 2011-08-31 | 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所 | 用环介导等温扩增技术检测隐孢子虫卵囊dna的引物组、试剂盒、检测方法及应用 |
| CN103421777A (zh) * | 2013-09-11 | 2013-12-04 | 北京市农林科学院林业果树研究所 | 无需pcr仪的侧翼核酸序列快速准确扩增方法及应用 |
| CN107916304A (zh) * | 2017-12-29 | 2018-04-17 | 苏州点晶生物科技有限公司 | 犬瘟热病毒荧光ema检测引物组、试剂盒和检测方法 |
| CN107916296A (zh) * | 2017-12-29 | 2018-04-17 | 苏州点晶生物科技有限公司 | 弓形虫核酸快速检测引物组、试剂盒和检测方法 |
| CN109072289A (zh) * | 2016-03-04 | 2018-12-21 | 爱乐圣地亚哥公司 | 自动化巢式重组酶聚合酶扩增 |
-
2020
- 2020-12-15 CN CN202011479850.6A patent/CN112501262A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005118853A2 (en) * | 2004-06-01 | 2005-12-15 | Asm Scientific, Inc. | Recombinase polymerase amplification |
| CN102168137A (zh) * | 2011-02-16 | 2011-08-31 | 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所 | 用环介导等温扩增技术检测隐孢子虫卵囊dna的引物组、试剂盒、检测方法及应用 |
| CN103421777A (zh) * | 2013-09-11 | 2013-12-04 | 北京市农林科学院林业果树研究所 | 无需pcr仪的侧翼核酸序列快速准确扩增方法及应用 |
| CN109072289A (zh) * | 2016-03-04 | 2018-12-21 | 爱乐圣地亚哥公司 | 自动化巢式重组酶聚合酶扩增 |
| CN107916304A (zh) * | 2017-12-29 | 2018-04-17 | 苏州点晶生物科技有限公司 | 犬瘟热病毒荧光ema检测引物组、试剂盒和检测方法 |
| CN107916296A (zh) * | 2017-12-29 | 2018-04-17 | 苏州点晶生物科技有限公司 | 弓形虫核酸快速检测引物组、试剂盒和检测方法 |
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