CN109072289A - 自动化巢式重组酶聚合酶扩增 - Google Patents

Abstract

一种流感测定系统，其包括样品模块、微流体核酸扩增装置和分析器，所述分析器促进对经由所述样品模块被递送至所述核酸扩增装置的样品的完全自动化巢式重组酶聚合酶扩增(RPA)。所述测定包括将样品提供至微流体装置，并使所述样品中的靶多核苷酸序列扩增。使所述靶多核苷酸序列扩增包括对所述样品进行第一轮扩增以得到第一扩增产物，并对所述第一扩增产物进行第二轮扩增以得到第二扩增产物。所述第二扩增产物包括完全含在所述第一轮扩增期间所产生的所述第一扩增产物内的较小序列。

Description

自动化巢式重组酶聚合酶扩增

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年3月4日提交的标题为“自动化巢式重组酶聚合酶扩增(AUTOMATED NESTED RECOMBINASE POLYMERASE AMPLIFICATION)”的美国专利申请序号62/303,934的权益，所述专利申请以引用的方式整体并入本文中。

有关政府利益的声明

本发明是在政府支持下根据美国卫生与公众服务部授予的HHSO100201400011C进行的。政府在本发明中具有一定的权利。

发明领域

本发明涉及一种流感测定系统，且更具体地说，涉及一种系统，其包括样品模块、微流体核酸扩增装置和分析器，所述分析器促进对经由所述样品模块被递送至所述核酸扩增装置的样品的完全自动化巢式重组酶聚合酶扩增(RPA)。

发明背景

痕量水平的多核苷酸序列的检测能够在病原体和遗传疾病的检测中起到重要的作用并有助于使治疗方案适合于具体的感染或基因型。某些等温的核酸扩增方法能够在几分钟之内将靶多核苷酸序列从痕量水平扩增至极高和可检测的水平。这类等温方法，例如重组酶聚合酶扩增(RPA)或切口产生与延伸扩增反应(Nicking and ExtensionAmplification Reaction，NEAR)，能够允许使用者检测痕量的具体序列，促进即时检验并增加诊断的方便性和速度。

发明概要

本文公开的核酸扩增装置被建构成包括一系列微流体通道，所述微流体通道将主要反应室和次要反应室与检测室互连。还提供了集成泵模块以允许液体在适当时间选择性地通过装置。提供了主要反应室，其中发生第一轮RPA，使所关注的靶多核苷酸序列扩增。在第一轮RPA后，将样品液体与特定的RPA引物组合并移至次要反应室。在次要扩增期间，使完全含在主要反应产物内的序列扩增以形成次要反应产物；然后检测次要反应产物。可以使用光学或电化学方式实现检测。

在进入多个次要反应室前，来自第一轮RPA的产物混合物可以分成多个物流并通过试剂贮存器，在试剂贮存器中产物混合物与相同或不同的RPA引物组合。用这样的方式，核酸扩增装置可以用于检测超过一种所关注的标靶(例如甲型流感病毒和乙型流感病毒)。在一些情况下，次要反应室中的一个可以用作对照物。

第一通用方面包括将样品提供至微流体装置，并使所述样品中的靶多核苷酸序列扩增。使所述靶多核苷酸序列扩增包括对所述样品进行第一轮扩增以得到第一扩增产物，并对所述第一扩增产物进行第二轮扩增以得到第二扩增产物。所述第二扩增产物包括完全含在第一轮扩增期间所产生的第一扩增产物内的较小序列。

第一通用方面的实现方式可以包括以下特征中的一个或多个。

一些实现方式包括检测第二扩增产物。

在一些实施方案中，检测所述第二扩增产物可以包括将第二扩增产物用连接至荧光团和猝灭剂的第一寡核苷酸标记以得到标记的第二产物，使所述猝灭剂从标记的第二扩增产物裂解，以及光学检测来自所述荧光团的信号，其中可检测信号指示存在所述第二扩增产物。使所述猝灭剂裂解可以使用核酸酶进行。所述核酸酶可以靶向双链DNA。在一些情况下，所述核酸酶为甲酰胺基嘧啶-DNA糖基酶。

在一些实施方案中，检测所述第二扩增产物包括将所述第二扩增产物用连接至氧化还原部分的第一寡核苷酸标记以得到标记的第二扩增产物，使所述氧化还原部分从标记的第二扩增产物裂解，以及电化学检测来自裂解的氧化还原部分的信号，其中可检测信号指示存在所述第二扩增产物。所述氧化还原部分典型地选自由以下组成的组：吩噻嗪、吩噁嗪、二茂铁、铁氰化物、钌(III)、锇(II)、蒽醌、吩嗪和其衍生物。使所述氧化还原部分裂解可以使用核酸酶进行。所述核酸酶可以靶向双链DNA。在一些情况下，所述核酸酶为甲酰胺基嘧啶-DNA糖基酶。

一些实现方式包括对所述第二扩增产物进行第三轮扩增以得到第三扩增产物，以及检测所述第三扩增产物，其中所述第三扩增产物包括完全含在第二轮扩增期间所产生的第二扩增产物内的较小序列。

样品可以从动物获得。举例来说，样品可以从动物的血液、痰液、粘液、唾液、眼泪或尿液获得。在一些情况下，样品是从人类获得。

靶核酸可以包括靶多核苷酸序列。在一些实施方案中，靶核酸是从动物病原体获得。所述动物病原体可以是单链DNA病毒、双链DNA病毒或单链RNA病毒。动物病原体可以是细菌。靶核酸可以是双链DNA、单链DNA或RNA。在一些情况下，靶核酸是选自由以下组成的组：基因组DNA、质粒DNA、病毒DNA、线粒体DNA、cDNA、合成双链DNA和合成单链DNA。靶核酸可以是病毒DNA或病毒RNA。在某些情况下，动物病原体为甲型流感病毒或乙型流感病毒。

在一些实现方式中，使样品中的两个或更多个靶多核苷酸序列扩增。在一个实例中，使包括甲型流感基因序列的靶多核苷酸序列和包括乙型流感基因序列的靶多核苷酸序列扩增。

在一些实现方式中，检测两种或更多种第二扩增产物。在某些实现方式中，检测包括甲型流感基因序列的第二扩增产物和包括乙型流感基因序列的第二扩增产物。

在第二通用方面中，诊断卡包括卡主体。所述卡主体包括主要反应室、一个或多个次要反应室、用于将样品流体供应至主要反应室的通道、与一个或多个次要反应室流体连接的一个或多个检测室以及与每个检测室相关联的检测模块。主要反应室被配置成用于对反应室中的样品流体进行第一核酸扩增以形成第一扩增产物。每个次要反应室被配置成用于对第一扩增产物进行第二核酸扩增以形成第二扩增产物。

第二通用方面的实现方式可以包括以下特征中的一个或多个。

在一些实施方案中，检测模块为光学模块，例如荧光检测器。所述荧光检测器可以包括用以将照明光引导至一个或多个检测室的单个光导管，和用以接收来自每个检测室的反射光的离散光导管。

在一些实施方案中，检测模块为电极模块。所述检测模块可以包括一系列终结在每个检测室的电极中的导电迹线。所述装置可以包括用以检测液体在微流体卡中的位置的额外导电迹线和电极。

在一些实现方式中，扩增包括重组酶聚合酶扩增(RPA)反应。

在一些实现方式中，诊断卡包括混合构件、泵和用于连接至样品模块的连接端口。主要反应室可以连接至加热器。主要反应室可以包括混合构件，或连接至混合构件。在一些情况下，主要反应室包括试剂。试剂可以包括RPA试剂。RPA试剂可以是冷冻干燥的。

在一些实现方式中，每个次要反应室包括试剂。试剂可以包括RPA试剂。RPA试剂可以是冷冻干燥的。

在一些实现方式中，样品流体为从动物获得的样品。样品可以从动物的血液、痰液、粘液、唾液、眼泪或尿液获得。在一些情况下，样品流体为从人类获得的样品。样品流体可以包括靶核酸。靶核酸可以从动物病原体获得。动物病原体可以是单链DNA病毒、双链DNA病毒或单链RNA病毒。在一些情况下，动物病原体为细菌。靶核酸可以是双链DNA、单链DNA或RNA。在某些情况下，靶核酸是选自由以下组成的组：基因组DNA、质粒DNA、病毒DNA、线粒体DNA、cDNA、合成双链DNA和合成单链DNA。靶核酸可以是病毒DNA或病毒RNA。动物病原体可以是甲型流感病毒或乙型流感病毒。

在一些实现方式中，第二扩增产物在样品流体递送至诊断卡后30分钟或更少时间、15分钟或更少时间、10分钟或更少时间或5分钟或更少时间时产生。诊断卡典型地为一次性的。

在一些实现方式中，诊断卡包括额外反应室，每个额外反应室被配置成用于进行额外一轮核酸扩增反应以形成额外扩增产物，使得来自每个相继n+1轮扩增的扩增产物为完全含在前面第n轮的扩增产物内的较小序列。

第三通用方面包括读数器，所述读数器被配置成用于容纳第二通用方面的诊断卡。所述读数器包括检测器，所述检测器被配置成用于检测次要反应室中第二扩增产物的存在。

第四通用方面包括核酸扩增装置。所述核酸扩增装置包括流体连接至第一进入口和第一排出口的第一反应室、流体连接至第二进入口和第二排出口的第二反应室、检测室、第一泵、第二泵和第三泵。第一进入口经由第一泵流体连接至第一反应室，且第一排出口流体连接至第一反应室。第一反应室经由第二泵流体连接至第二反应室，且第二排出口流体连接至第二反应室。第二进入口经由第三泵流体连接至第二反应室。

第四通用方面的实现方式可以包括以下特征中的一个或多个。

在一些实现方式中，核酸扩增装置为微流体装置。第一反应室典型地包括试剂。在一些情况下，第一反应室包括催化剂。催化剂可以包括镁。

在一些实现方式中，核酸扩增装置包括试剂贮存器，且第二泵和第三泵经由第一试剂贮存器流体连接至每个第二反应室。第二泵和第三泵可以经由第一试剂贮存器和第二试剂贮存器流体连接至每个第二反应室。在一些情况下，第一试剂贮存器和第二试剂贮存器为串联的。第一试剂贮存器可以包括寡聚物。第二试剂贮存器可以包括镁。

在一些实现方式中，每个第二反应室为检测室。每个检测室的一部分可以是光学上透明的。在一些情况下，电极连接至每个检测室。在一个实例中，三个电极连接至每个检测室。

在一些实现方式中，核酸扩增装置包括流体检测区。第一泵和第一反应室可以经由第一检测区连接。第二泵和第二反应室可以经由第二检测区连接。第三泵和第二反应室可以经由第三检测区连接。第三泵和第一反应室可以经由第四检测区连接。在一些情况下，每个检测区的一部分为光学上透明的。流动检测室可以连接至每个检测区。

在一些实现方式中，核酸扩增装置包括连接至第一反应室的加热器。第一反应室可以包括搅拌器。在某些实现方式中，第一泵被配置成用于经由第一进入口将被递送至核酸扩增装置的样品提供至第一反应室。第二泵和第三泵可以被配置成用于经由第二进入口将被递送至核酸扩增装置主体的试剂与来自第一反应室的产物组合以得到反应混合物。第二泵和第三泵可以被配置成用于将反应混合物的一部分提供至第二反应室中的每一个。

本发明的其它特征和优点将从以下详细描述和图以及从权利要求书中显而易见。

图示简单说明

图1A-1D描绘了用于对经由样品模块被递送至核酸扩增装置的样品进行完全自动化巢式RPA的系统的组件。

图2A-2E描绘了图1中所描绘的系统的替代工作流程。

图3A和3B描绘了样品模块的接收器模块部分的透视图。

图4A和4B描绘了样品模块的传送模块部分的透视图。

图5A-5G描绘了用于将样品提供至具有连接的接收器模块和传送模块的样品模块的工作流程。

图6A-6H描绘了用于将样品提供至具有分开的接收器模块和传送模块的样品模块的工作流程。

图7描绘了铰接的样品模块的透视图。

图8A和8B描绘了替代样品模块的视图。

图9A-9E描绘了用于将样品提供至图8A和8B中描绘的样品模块的工作流程。

图10描绘了用于检测光学探针的微流体核酸扩增装置的分解图。

图11描绘了图10中描绘的微流体核酸扩增装置的工作组件。

图12描绘了用于检测电化学探针的微流体核酸扩增装置的分解图。

图13描绘了图12中描绘的微流体核酸扩增装置的中间层的顶视图。

图14描绘了穿过图12中描绘的微流体核酸扩增装置的感测器层的顶视图。

图15描绘了插入分析器中的核酸扩增装置的透视图。

图16描绘了光学分析器的透视图。

图17描绘了图16中描绘的光学分析器中的光导管的详图。

图18A-18C描绘了关于图16中描绘的光学分析器所描述的激发和发射坐标系。

图19A-19D描绘了如本文所述的巢式RPA扩增的结果。

发明详述

图1A-1D描绘了用于对被提供至微流体核酸扩增装置的样品进行完全自动化巢式RPA的系统100的组件。图1A描绘了样品模块102，样品模块102包括接收器模块104和传送模块106。图1B描绘了微流体核酸扩增装置110。如图1C中所描绘，样品模块102和核酸扩增装置108连接形成核酸扩增组合件110。图1D描绘了系统100，其包括核酸扩增组合件110，核酸扩增组合件110插入分析器112中，分析器112用于评定从样品模块102提供至核酸扩增装置108的样品中靶核酸的存在。

系统100用于评定被提供至样品模块102的接收器模块104的样品中靶核酸的存在。样品模块102的接收器模块104和传送模块106以及核酸扩增装置108含有进行第一轮RPA、接着后续第二轮RPA以使靶核酸扩增(如果存在于样品中)所需要的试剂。样品模块102与核酸扩增装置108连接在样品模块与核酸扩增装置之间产生流体通路，允许RPA反应混合物递送至核酸扩增装置。在一些情况下，系统100用于评定样品中两种或更多种靶核酸的存在。在一个实例中，系统100用于评定样品中甲型流感病毒和乙型流感病毒的存在。在某些情况下，样品模块102和核酸扩增装置108被配置成用于进行三轮或更多轮的巢式RPA。

图2A-2E描绘了系统100的替代工作流程。如图2A中所描绘，核酸扩增装置108被插入分析器112中。在图2B中，样品模块102朝向分析器中的核酸扩增装置108前进。在连接前分析器112界面上的配准特征在二维上限制样品模块102，允许样品模块和核酸扩增装置108配对形成允许流体从样品模块流至核酸扩增装置以及允许流体从核酸扩增装置流至样品模块的通道。图2C描绘了分析器112中的核酸扩增组合件110。样品模块102连接至核酸扩增装置108可以开启反应物从样品模块至核酸扩增装置的流动，从而开始评定样品中靶核酸的存在。一旦评定完成，如图2D中所描绘，分析器112中的配准特征可以啮合以释放核酸扩增组合件110。图2E描绘了从分析器112释放后的核酸扩增组合件110。在从分析器112释放后，可以丢弃核酸扩增组合件110。

图3A和3B描绘了样品模块102的接收器模块104的一实施方案的透视图。图3A描绘了接收器模块104的透视图，其具有用于容纳样品、含有试剂或两者的室300。接收器模块104还包括用于将所述接收器模块与传送模块106对准的配准特征302。图3B描绘了与图3A相对的透视图，其描绘了室300的底部304的外视图。

图4A和4B描绘了被配置成与接收器模块104配对的传送模块106的一实施方案的透视图。图4A描绘了具有室400的传送模块106的透视图，每个室具有进入口402和排出口404。传送模块106还包括用于将所述传送模块与接收器模块104对准的配准特征406。图4B描绘了与图4A相对的透视图，其描绘了底部408以及室400的进入口402和排出口404的外视图。

图5A-5G描绘了用于将样品提供至具有连接的接收器模块502和传送模块504的样品模块500的工作流程。如图5A中所描绘，样品模块500可以提供于密封小袋506中。密封小袋506可以是箔袋。图5B描绘了从小袋506移出后的样品模块500，其中铰链508打开以分别暴露接收器模块502和传送模块504上的密封封条510和512。

如图5C中所描绘，封条510可以从接收器模块502去除以暴露样品室514和空白室516。样品室514和空白室516典型地包括液体介质，例如缓冲溶液。样品(例如体液)可以经由装置518(例如拭子)递送至样品室514，从而将样品引入样品室514中的液体介质中。空白室516可以用咬合元件520覆盖以防样品插入空白室中。垫圈522和524可以分别位于样品室514和空白室516的外部周围，以在样品置于样品室514中后促进接收器模块502与传送模块504之间形成密封。接收器模块502上的配准特征526被配置成与传送模块504上的对应的配准特征配对。

如图5D和5E中所描绘，封条512可以从传送模块504去除以暴露样品室528和空白室530。保持元件532和534可以分别位于样品室528和空白室530中，以将固体试剂保持在样品室、空白室或两者中。在一个实例中，保持元件532将试剂球粒保持在样品室528中。试剂球粒可以包括用于RPA反应的寡聚物。在一些情况下，球粒为冷冻干燥的球粒。空白室530可以不含固体试剂。保持元件532和534典型地界定孔口，例如小孔。在一些情况下，保持元件532和534为玻璃料。可以对玻璃料进行选择以促进流体从接收器模块502传送至传送模块504。在一个实例中，保持元件532和534为亲水性玻璃料。传送模块504包括配准特征536，配准特征536被配置成与接收器模块502的配准特征526配对。

在从传送模块504去除封条512后，如图5F中所描绘，传送模块可以绕铰链508旋转并固定至接收器模块502，其中保持元件532和534分别保持存在于样品室528和空白室530中的试剂。当接收器模块502和传送模块504被按压在一起时，如图5G中所描绘，配准特征526和536锁定地啮合，垫圈522将样品室514和528一起密封，且垫圈524将空白室516和530一起密封。当样品模块502如所描绘取向成传送模块504在接收器模块502上方时，在发生倒转前，样品室514和空白室516中的液体介质保持在接收器模块中且分别不朝传送模块504中的样品室528和空白室530流动。配准特征526和536可以被配置成不可逆地密封接收器模块502和传送模块504，使得在无意下无法打开样品模块500。

在样品模块500连接至核酸扩增装置前，使样品模块倒转以使接收器模块502中的液体介质朝传送模块504移动，从而与传送模块中的固体试剂水合，形成水合反应混合物。在一个实例中，传送模块中的冷冻干燥的RPA试剂水合形成水合反应混合物。

图6A-6H描绘了用于将样品提供至具有分开的接收器模块602和传送模块604的样品模块600的替代工作流程。如图6A中所描绘，接收器模块602和传送模块604各可以提供于分开的密封小袋606、606’。密封小袋606可以是箔袋。

图6B描绘了从密封小袋606’移出后的传送模块604。传送模块604用封条612密封。图6C描绘了从小袋606移出的接收器模块602。接收器模块602用封条610密封。在从接收器模块602去除封条610后，如图6D中所描绘，暴露样品室614和空白室616。样品室614和空白室616典型地包括液体介质，例如缓冲溶液。样品(例如体液)可以经由装置618(例如拭子)递送至样品室614，从而将样品引入样品室中的液体介质中。空白室616可以用咬合元件620覆盖以防样品插入空白室中。垫圈622和624可以分别位于样品室614和空白室616的外部周围，以促进接收器模块602与传送模块604之间形成密封。接收器模块602上的配准特征626被配置成与传送模块604上的对应的配准特征配对。

如图6E中所描绘，可以从传送模块604去除封条612。从传送模块604去除封条612使样品室和空白室(未显示)暴露。保持元件(未显示)可以分别位于样品室和空白室中，以将固体试剂保持在样品室、空白室或两者中。在一个实例中，固体试剂包括用于RPA反应的寡聚物。在一些情况下，固体试剂为冷冻干燥的球粒。空白室可以不含固体试剂。所述保持元件典型地界定了孔口，例如小孔。在一些情况下，保持元件为玻璃料。可以对玻璃料进行选择以促进流体从接收器模块602传送至传送模块604。在一个实例中，保持元件为亲水性玻璃料。传送模块602包括配准特征636，配准特征636被配置成与接收器模块602的配准特征626配对。

在从传送模块604去除封条612后，如图6F中所描绘，传送模块可以倒转以对准配准特征626和636。在此倒转期间，传送模块604中的保持元件保持存在于传送模块的样品室和空白室中的试剂。当接收器模块602和传送模块604被按压在一起时，如图6G中所描绘，配准特征626和636锁定地啮合，垫圈622将接收器的样品室和传送模块一起密封，且垫圈624将接收器的空白室和传送模块一起密封。在如图6G中所描绘，传送模块604在接收器模块602上方时，样品室614和空白室616中的液体介质保持在接收器模块中且分别不朝传送模块中的样品室和空白室流动。配准特征626和636可以被配置成不可逆地密封接收器模块602和传送模块604，如图6H中所描绘，使得在无意下无法打开样品模块600。

在样品模块600连接至核酸扩增装置前，可以使样品模块倒转以使接收器模块602中的液体介质朝传送模块604移动，从而与传送模块中的固体试剂水合，形成水合反应混合物。在一个实例中，传送模块中的冷冻干燥的RPA试剂水合形成水合反应混合物。

图7为样品模块500的透视图。传送模块500可以用封条700包裹，覆盖被配置成连接至核酸扩增装置的传送模块的部分。封条700可以是箔封条，其提供不透明的表面来覆盖进入口702和704和排出口706和708的孔口。在倒转时封条700可以保持样品模块500中的水合反应混合物。在一些情况下，从样品模块500去除封条700，核酸扩增装置连接至样品装置，且样品模块500在相对于核酸扩增装置密封后首先倒转。进入口702和704和排出口706和708可以具有锥形末端(例如低剖面路厄连接器)，所述锥形末端被配置成插入核酸扩增装置中。在一些情况下，垫圈710、712、714和716可以分别位于进入口702、704、706和708上，与核酸扩增装置形成气密密封。

图8A和8B描绘了样品模块的替代实施方案。图8A为包括接收器模块802和传送模块804的样品模块800的透视图。图8B为样品模块800的横截面透视图。如图8B中所描绘，接收器模块802界定了具有孔口808的样品室806。样品室806保存液体介质810。液体介质810可以是缓冲溶液。接收器模块802包括进入口812和排出口814。接收器模块802还包括配准特征816，所述配准特征816被配置成啮合传送模块804的配准特征。

传送模块804包括外壳818，外壳818具有延长部分820且界定了被配置成接纳接收器模块802的样品室806的孔口822。冲头824位于外壳内，其中延长部分820位于冲头的臂826中。臂826位于弹簧828内，且弹簧用释放锁扣830保持在加载位置。多孔元件832位于冲头824与孔口822之间。多孔元件832含有固体试剂(例如冷冻干燥的RPA试剂)。配准特征834被配置成与接收器模块802的配准特征816啮合，且垫圈836形成接收器模块与传送模块804之间的密封。如所描绘，接收器模块802位于传送模块804的孔口822中。配准特征816和834锁定地啮合以经由垫圈836密封接收器模块802和传送模块804。配准特征816和834可以被配置成不可逆地密封接收器模块802和传送模块804，使得在无意下无法打开样品模块800。

图9A-9E描绘了用于将样品提供至样品模块800的工作流程。在图9A中，从接收器模块802去除封条900。在图9B中，经由孔口808将样品提供至接收器模块802的样品室806中的液体介质810。在图9C中，传送模块804朝向接收器模块802前进以锁定地啮合配准特征816和834。在经由垫圈836使接收器模块802相对于传送模块804密封后，可以对释放锁扣830施加力以释放弹簧加载的冲头824，如图9D中所描绘。释放弹簧加载的冲头824使多孔元件832穿过孔口822前进，使得多孔元件中的固体试剂在接收器模块802的液体介质810中水合。图9E描绘了密封的样品模块800，其中冲头824搁在接收器模块802中，迫使多孔元件832中的固体试剂进入液体介质810中。密封的样品模块800可以连接至核酸扩增装置以评定被提供至接收器模块802的样品中靶核酸的存在。

图10描绘了用于光学检测的核酸扩增装置1000的分解图。核酸扩增装置1000为一种层状微流体装置，其包括顶层1002、中间层1004和基层1006。基层1006可以包括超过一个组件。如所描绘，基层1006包括两个组件1008和1010。

中间层1004包括进入口1012和1014和排出口1016和1018，所述进入口和排出口分别连接至样品模块的排出口和进入口。中间层1004典型地包括试剂，例如RPA试剂。如图10中所描绘，主要反应室1020包括固体试剂1022(例如呈乙酸镁形式的Mg²⁺)。中间层1004包括试剂贮存器1024和1026，试剂贮存器1024和1026含有固体试剂1028和1030。在一个实例中，固体试剂1028包括干燥(例如冷冻干燥)的寡聚物且固体试剂1030包括Mg²⁺(例如呈乙酸镁形式)。次要反应室1032也可以充当检测室，其中通过分析器，经由光信号来检测靶核酸。次要反应室1032具有光学上透明的盖板，使得可以通过核酸扩增装置被配置成插入其中的分析器中的光学传感器检测当荧光团和猝灭剂经由外切核酸酶分离时所产生的荧光信号。配准特征1036允许分析器中核酸扩增装置1000的对准。

中间层1004还可以包括流动检测室1034，每个流动检测室具有透明盖板，通过分析器在光学上监测穿过盖板的流体的存在以检测液体的流动。被配置成接纳核酸扩增装置1000的分析器包括指向所配置的每个流动检测室的光源。分析器被配置成用于检测(例如经由光散射)每个流动检测室中液体的存在。流动检测室中液体的检测可以触发多种操作(例如开始或停止泵送)，且分析器中的控制器可以被配置成用于基于流动检测室中液体的检测来执行多种参数(例如泵送时间、反应时间、混合时间、流动时间)，使得试剂以预定体积提供且允许反应进行预定时间。

核酸扩增装置1000可以包括图10中未描绘的额外特征，例如泵和微流体通路。泵中的一个或多个可以是蠕动泵或注射泵。基于流逝的时间或由光学分析器中的光学传感器检测到的流体穿过流动检测室的流动，泵可以选择性地驱动试剂从样品模块和主要反应室1020至次要反应室1032，按需要计量等分试样。

根据图11描述具有样品模块的核酸扩增装置1000的操作。当样品模块连接至核酸扩增装置1000时，样品模块的排出口连接至核酸扩增装置的进入口1012和1014，且样品模块的进入口连接至核酸扩增装置的排出口1016和1018。样品模块中的试剂经由样品模块的排出口流入核酸扩增装置1000的进入口1012和1014，且从核酸扩增模块排出的流体(例如气体、液体或两者)经由核酸扩增模块的排出口1016和1018流入样品模块的进入口。

更详细地，样品和缓冲液从接收器模块的样品室穿过排出口流入进入口1012，以与传送模块的样品室中的RPA试剂(例如干燥的寡聚物)水合。第一泵1040使此主要反应混合物穿过第一流动检测室1042前进。

主要反应混合物从流动检测室被吸入第一泵，穿过混合室1044，到达第二流动检测室1046并到达主要反应室1020。主要反应室1020包括RPA试剂1022(例如呈乙酸镁形式的Mg²⁺)并连接至加热器和混合器。混合器可以呈磁力混合器1048存在。在足够混合时间后，第一泵1040使主要反应室1020中形成的产物前进至第三流动检测室1050。从第三流动检测室1050，空气和来自主要反应室的主要RPA反应的一部分产物经由排出口1016流向样品模块。

第二泵1054从旁路1052吸出来自主要反应室1020的产物的等分试样且流向第四流动检测室1056。第三泵1058将次要RPA反应的试剂(例如缓冲液)从传送模块的空白室经由传送模块的排出口吸入核酸扩增装置1000的进入口1014，并穿过第五流动检测室1060。第四流动检测室1056和第五流动检测室1060在Y接合点1062相接，将选定量的来自第一RPA反应的产物与次要RPA反应的试剂混合。此混合物由第二泵1054和第三泵1058泵送过第一系列混合元件1064和第二系列混合元件1066。在通过混合元件1066后，混合物在接合点1068分叉，并在接合点1070再次分叉，得到反应混合物的四个物流。每个物流流过第一试剂贮存器1024，其中混合圆筒1072被配置成用于将反应混合物与试剂1028(例如呈乙酸镁形式的Mg²⁺)混合。从第一试剂贮存器1024，每个混合物流过含有试剂1030的第二试剂贮存器1026。第二试剂贮存器1026中的试剂1030可以相同或不同。在一个实例中，试剂1030中的至少两种包括用于所关注的具体标靶如甲型流感病毒和乙型流感病毒的不同RPA引物。

从第二试剂贮存器1026，第三泵1058驱动混合物穿过混合元件1074并进入次要反应室1032。次要扩增发生在次要反应室1032中。次要反应室1032还可以充当检测室。在核酸扩增装置1000中，次要反应室1032具有光学上透明的盖板，使得可以在核酸扩增装置被配置成插入其中的分析器，例如关于图15-18所述的分析器中光学上检测当荧光团和猝灭剂经由外切核酸酶分离时所产生的荧光信号。

图12描绘了用于电化学检测的核酸扩增装置1200的分解图。核酸扩增装置1200为一种层状微流体装置，其包括感测器层1201、顶层1202、中间层1204和基层1006。基层1206可以包括超过一个组件。如所描绘，基层1206包括两个组件1208和1210。

中间层1204包括进入口1212和1214和排出口1216和1218，所述进入口和排出口分别连接至样品模块的排出口和进入口。中间层1204典型地包括试剂，例如RPA试剂。如图12中所描绘，主要反应室1220包括固体试剂1222(例如呈乙酸镁形式的Mg²⁺)。搅拌器1223可以嵌入固体试剂1222中。在一个实例中，搅拌器为磁性圆盘。次要反应室1232还可以充当检测室，其中顶层1202中的孔口1225允许反应室中的液体接触感测器层1201的下侧上的电极。中间层1204还可以包括流动检测室1234，其中由叠加在顶层1202中的孔口上的感测器层1201中的电极电学上监测流体的存在，使得流过流动检测室的液体接触电极。配准特征1236允许分析器中核酸扩增装置1200的对准。

核酸扩增装置1200可以包括图12中未描绘的额外特征，例如泵和微流体通路。泵中的一个或多个可以是蠕动泵或注射泵。基于流逝的时间或由电分析器中的感测器检测到的流体穿过流动检测室的流动，泵可以选择性地驱动试剂从样品模块和主要反应室1220至次要反应室1232，按需要计量等分试样。

根据图13描述具有样品模块的核酸扩增装置1200的操作，图13描绘了中间层的顶视图。当样品模块连接至核酸扩增装置1200时，样品模块的排出口连接至核酸扩增装置的进入口1212和1214，且样品模块的进入口连接至核酸扩增装置的排出口1216和1218。样品模块中的试剂经由样品模块的排出口流入核酸扩增装置1200的进入口1212和1214，且从核酸扩增模块排出的流体(例如气体、液体或两者)经由核酸扩增模块的排出口1216和1218流入样品模块的进入口。

更详细地，样品和缓冲液从接收器模块的样品室穿过排出口，流入进入口1212，以与传送模块的样品室中的RPA试剂(例如干燥的寡聚物)水合。第一泵1240使此主要反应混合物前进穿过第一流动检测室1242，进入第一泵，穿过混合室1244，到达第二流动检测室1246并到达主要反应室1220。主要反应室1220包括RPA试剂1222(例如呈乙酸镁形式的Mg²⁺)并连接至加热器和混合器。混合器可以呈磁力混合器1248存在。在足够混合时间后，第一泵1240使主要反应室1220中形成的产物前进至第三流动检测室1250。从第三流动检测室1250，空气和来自主要反应室的主要RPA反应的一部分产物经由排出口1216流向样品模块。

第二泵1254从旁路1252吸出来自主要反应室1220的产物的等分试样且流向第四流动检测室1256。第三泵1258将次要RPA反应的试剂(例如缓冲液)从传送模块的空白室经由传送模块的排出口吸入核酸扩增装置1200的进入口1214，并穿过第五流动检测室1260。第四流动检测室1256和第五流动检测室1260在Y接合点1262相接，将选定量的来自第一RPA反应的产物与次要RPA反应的试剂混合。此混合物由第二泵1254和第三泵1258泵送过第一系列混合元件1264和第二系列混合元件1266。在通过混合元件1266后，混合物在接合点1268分叉，并在接合点1270再次分叉，得到反应混合物的四个物流。每个物流流过第一试剂贮存器1224，其中混合圆筒1272被配置成用于将反应混合物与试剂1228(例如呈乙酸镁形式的Mg²⁺)混合。从第一试剂贮存器1224，每个混合物流过含有试剂1230的第二试剂贮存器1226。第二试剂贮存器1226中的试剂1230可以相同或不同。在一个实例中，试剂1230中的至少两种包括用于所关注的具体标靶如甲型流感病毒和乙型流感病毒的不同RPA引物。

从第二试剂贮存器1226，第三泵1258驱动混合物穿过混合元件1274并进入次要反应室1232。次要扩增发生在次要反应室1232中。次要反应室1232还可以充当检测室。在核酸扩增装置1200中，次要反应室1232中的液体接触感测器层1201的下侧上的电极，使得核酸扩增装置被配置成插入其中的分析器检测到由例如美国序号62/300,242中所述的氧化还原活性化合物的氧化产生的电子，所述氧化还原活性化合物从用氧化还原活性化合物标记的RPA探针裂解。

图14描绘了核酸扩增装置1200的顶视图，其中感测器层1201中的电极叠加在顶层1202和中间层1204中的孔口上。电极位于感测器层1201的下侧上以接触流动传感检测器1246、1250、1256和1260以及反应室1232中的液体。在一个实例中，传感电极以及将传感电极电连接至与分析器电连通的终端的导电迹线可以通过将第一导电层布置在感测器层上来形成。在另一个实例中，第一导电层可以布置在感测器层上的第二导电层上。电极可以通过遮蔽导电层并将电介质层布置在暴露区域上而电绝缘。在一个实例中，第一导电材料包括碳。在另一个实例中，第二导电材料包括银。如本文所用，“布置”包括印刷方法，例如丝网印刷。当镀银层置于碳层下时，与使用单独碳形成的导电迹线相比，所得导电迹线典型地具有较低电阻。在两个实例中，电化学测量在碳表面上进行。

流动传感检测器1246和1250每一个电连接至两个液体传感电极。对于流动传感检测器1246，液体传感电极1400和1402电连接至电线1404和1406，电线1404和1406分别电连接至接头1408和1410。流动传感检测器1256和1260每一个电连接至四个液体传感电极。对于流动传感检测器1260，液体传感电极1412和1414电连接至电线1420和1422，电线1420和1422分别电连接至接头1428和1430，且电极1416和1418电连接至电线1424和1426，电线1424和1426分别电连接至接头1432和1434。每个检测室1232连接至三个测量电极，包括参考电极1436、工作电极1438和反电极1440，且每个电极经由电线电连接至接头。电线可以是包括导电材料(例如银)的导电迹线。接头被配置成啮合分析器中的终端。

液体传感电极依照导电性原则操作。即，在终端上施加电压，且当流体接触相应的室内的传感电极时，电流通过液体，且分析器检测电流的流动。对于测量电极，在反电极与工作电极之间施加电势；参考电极用于确保所施加的电势如所预期。当以测量电流模式操作时，电流流动，与接触工作电极的电活性物质的浓度成比例(实际上，电子接受或送出取决于在指定电势下发生靶物质的氧化还是还原)。在差示脉冲伏安法模式中，扫除从一个电压至另一个电压的电势，且记录所得电流，作为电活性物质氧化或还原的结果，得到峰和或谷。

图15描绘了核酸扩增系统1500，其包括插入分析器1504中的核酸扩增装置1502。核酸扩增装置1502和分析器可以被配置成用于RPA产物的光学或电化学检测。在一些情况下，核酸扩增装置插入分析器中开启对被提供至核酸扩增装置的样品中靶核酸的存在的评定。在其它情况下，随后样品模块连接至核酸扩增装置开启对样品中靶核酸的存在的评定。在其它情况下，对被提供至核酸扩增装置的样品中的靶核酸的存在的评定由使用者在将核酸扩增装置或组合件插入分析器后开始。

如图16中所描绘，核酸扩增装置1502和分析器1504被配置成用于RPA产物的光学探测。具体地说，分析器1504被配置成用于检测来自与核酸扩增装置1502的检测室中的RPA产物连接的荧光探针的荧光。分析器1504包括光源、与每个光源相对应的激发光导1600、与每个发射光导相对应的发射光导1602和光检测器。光源典型地为发光二极管(lightemitting diode，LED)，对发光二极管进行选择以实现LED发射峰与靶荧光标记的吸收之间的良好匹配。分析器1504并入偏斜几何形状，以允许使用单一光学发射过滤器从多个反应单元进行荧光测量。

图17描绘了图16的一部分的放大图。如图17中所描绘，分析器1504包括四个光源以允许从核酸扩增装置1502中的四个检测室1700进行荧光测量。激发光导1600将来自光源的光引导至检测室1700，且发射光导1602经由滤光器将来自检测室的荧光发射引导至常用光电二极管。通过四个光源的时分多路复用来区分四个测量通道。每个激发光导1600被配置成用于将来自一个光源的入射光引导至平面中的标靶，使得入射光与平面之间的角度在介于30°与60°之间的范围内(例如40°)，且每个发射光导1602被配置成用于将来自标靶的发射光引导至光检测器，使得发射光之间的角度介于40°与60°之间(例如30°)。分析器1504典型地包括与每个光源相对应的第一透镜和第二透镜，其中每个相对应的激发光导被配置成用于使从相对应的光源穿过第一透镜传播的光准直，并经由全内反射引导准直光，使其相对于第二透镜成一定角度。

图18A-18C描绘了分析器1504的偏斜几何形状。图18A-18C中描绘的角度为例示性的，且是为了便于说明而选择，但是这些角度在分析器1500的实施方案中可以改变。如图18A中所描绘，旋转轴以相对于连接反应室1700的中心的线45°取向。此配置有助于避免激发光导与发射光导之间的位置碰撞。图18B描绘了相对于检测室表面法线成30°的激发光轴(在x平面中绕y轴旋转)。图18C描绘了相对于检测室表面法线成40°的发射光轴(绕旋转正交轴，即在yz平面中绕x轴旋转)。旋转中心在正常液体表面位置下方(例如下方0.1至1mm)。以下表1中列出斜角的其它组合。激发光导和发射光导中的最大弯角典型地为45°或更小。

表1.激发光导和发射光导的斜角

发射光导角度(°)	激发光导角度(°)
		20	45
30	40
		34	34
40	30
		45	20

分析器1504包括可操作地连接至光源和光检测器的控制器。控制器使光源开始产生入射光，且开始从检测室收集发射光。分析器1504典型地包括可操作地位于发射光导与光检测器之间的单一光检测器和单一发射过滤器；但是，在一些实施方案中，可以存在一个或多个额外光检测器、发射过滤器或两者。

虽然本文中的装置和方法已经被描述为重组酶聚合酶扩增(RPA)技术的应用，但在本文所述的装置中还可以执行用于扩增和检测靶核酸的其它等温技术，例如切口产生与延伸扩增反应(NEAR)技术。如本文所述的RPA扩增和检测RPA扩增产物的方法详细描述美国专利No.7,399,590、8,580,507、7,270,981、7,399,590、7,666,598、7,435,561、9,469,867、9,057,097、8,071,308、8,637,253和8,062,850中。NEAR方法描述于美国专利申请公布No.2009/0081670和2009/0017453中。每个前述参考文献都以引用的方式整体并入本文中且视为本公开的一部分。

如这里所述，RPA采用被称为重组酶的酶，此酶能够使寡核苷酸引物与模板双链核酸中的同源序列成对。RPA引入以下：用于将两个引物插入双链体DNA中的模板中的重组酶；用于稳定DNA的替换链并防止引物被替换的单链DNA结合蛋白；和用于延伸结合于模板DNA的引物的替换链聚合酶。以这种方式，DNA合成针对模板双链核酸中的界定点。使用两种或更多种序列特异性(例如基因特异性)引物，如果存在模板核酸，那么开始指数扩增反应。反应进展迅速且使模板双链核酸内存在的序列在几分钟内从模板核酸仅仅几个拷贝特异性扩增至可检测水平的扩增产物。RPA过程在等温条件下在生理温度(例如37-42℃)下进行。RPA方法公开于例如US 7,270,981、US 7,399,590、US 7,666,598、US 7,435,561、US 2009/0029421和WO 2010/141940中，所有这些都以引用的方式并入本文中。

RPA并入细胞DNA复制和修复机构的组件，并建立具有足够维持在特定拥挤试剂的存在下实现的高水平的重组活性的重组酶负载和卸载速率的‘动力学’重组环境。RPA的优点在于其组合了PCR的灵敏性、特异性和大部分其它特征，但不需要热循环且具有非凡的速度和断开温度设置的稳固性。RPA得益于以下：多种核酸加工酶的潜在使用，例如已知的修复核酸内切酶，其至少部分由于需要热稳定的同等物而未被其它过程使用；在无辅助蛋白如单链DNA结合蛋白下调节较差；或其组合。

简单地说，RPA包括以下步骤：首先，使重组酶剂与第一核酸引物和第二核酸引物接触以形成第一核蛋白引物和第二核蛋白引物。其次，使第一核蛋白引物和第二核蛋白引物与双链靶序列接触以在第一链的第一部分形成第一双链结构，且在第二链的第二部分形成双链结构，因此所述第一核酸引物和所述第二核酸引物的3’端在所给出的模板DNA分子上面向彼此。第三，所述第一核蛋白引物和第二核蛋白引物的3’端通过DNA聚合酶延伸，以产生第一双链核酸和第二双链核酸以及核酸的第一替换链和第二替换链。重复第二步和第三步，直至到达所需程度的扩增。

本公开还提供了一种在微流体筒或装置内进行巢式RPA的方法。在巢式RPA中，核酸的第一区域由RPA扩增，形成第一扩增区域。然后完全在第一扩增区域内的核酸的第二区域使用RPA扩增，形成第二扩增区域。此过程可以重复多次。举例来说，完全在第二区域内的核酸的第三区域可以由RPA从第二扩增区域扩增。

本文公开的RPA试剂可以含有一组扩增靶核酸序列的引物。引物可以包括与靶核酸序列互补或在一个或多个位置不同于靶核酸序列的序列。如本文所述，利用在一个或多个位置不同于靶核酸序列的引物的RPA扩增产物可以在一个或多个位置不同于靶序列。本文所述的RPA反应的扩增产物可以包括靶裂解序列。

此组RPA引物可以扩增靶核酸序列或引入在一个或多个位置不同于靶核酸序列的序列。此引入的序列可以由靶裂解序列组成。第一引物可以与靶核酸序列互补。第二引物可以包括与靶核酸序列互补的第一部分和在一个或多个位置不同于靶核酸序列的第二部分。当两种引物扩增核酸序列时，第二引物将一个或多个不同位置并入扩增产物中。此扩增区域在一个或多个位置不同于靶核酸序列，且可以由靶裂解序列组成。

本文公开的RPA组合物含有可能来源于原核、病毒或真核来源的重组酶。例示性重组酶包括RecA和UvsX(例如从任何物种获得的RecA蛋白或UvsX蛋白)和其片段或突变体以及其组合。RecA和UvsX蛋白可以从任何物种获得。RecA和UvsX片段或突变蛋白还可以使用可利用的RecA和UvsS蛋白和核酸序列以及分子生物学技术产生(参见例如美国专利No.8,071,308中描述的UvsX的突变形式)。例示性UvsX蛋白包括源自于以下的UvsX蛋白：肌尾噬菌体科(myoviridae)噬菌体，例如T4、T2、T6、Rb69、Aeh1、KVP40、不动杆菌属(Acinetobacter)噬菌体133、气单胞菌属(Aeromonas)噬菌体65、噬蓝藻体(cyanophage)P-SSM2、噬蓝藻体PSSM4、噬蓝藻体S-PM2、Rb14、Rb32、气单胞菌属噬菌体25、弧菌属(Vibrio)噬菌体nt-1、phi-1、Rb16、Rb43、噬菌体31、噬菌体44RR2.8t、Rb49、噬菌体Rb3和噬菌体LZ2。其它例示性重组酶蛋白质包括古细菌RADA和RADB蛋白和真核(例如植物、哺乳动物和真菌)Rad51蛋白(例如RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D、DMC1、XRCC2、XRCC3和recA)(参见例如Lin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103:10328-10333,2006)。

在本公开的任何过程中，重组酶(例如UvsX)可以是突变或杂交重组酶。在一些实施方案中，突变UvsX为在Rb69UvsX氨基酸序列中包括至少一个突变的Rb69UvsX，其中突变是选自由以下组成的组：(a)在位置64上氨基酸不是组氨酸、位置64上丝氨酸、一个或多个谷氨酸残基添加在C端、一个或多个天冬氨酸残基添加在C端以及其组合。在其它实施方案中，突变UvsX为在T6UvsX氨基酸序列中包括至少一个突变的T6UvsX，其中突变是选自由以下组成的组：(a)在位置66上氨基酸不是组氨酸；(b)位置64上丝氨酸；(c)一个或多个谷氨酸残基添加在C端；(d)一个或多个天冬氨酸残基添加在C端；以及(e)其组合。在使用杂交重组酶蛋白质的情况下，杂交蛋白可以例如为包括至少一个包括源自于不同UvsX物种的氨基酸序列的区域的UvsX蛋白。所述区域可以是例如UvsX的DNA结合环-2区域。

本文公开的DNA聚合酶可以是真核或原核聚合酶。真核聚合酶的实例包括pol-α、pol-β、pol-δ、pol-ε和其突变体或片段或其组合。原核聚合酶的实例包括大肠杆菌DNA聚合酶I(例如克列诺片段(Klenow fragment))、噬菌体T4gp43DNA聚合酶、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)聚合酶I大片段、Phi-29DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)Pol I、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Pol I、大肠杆菌DNA聚合酶I、大肠杆菌DNA聚合酶II、大肠杆菌DNA聚合酶III、大肠杆菌DNA聚合酶IV、大肠杆菌DNA聚合酶V和其突变体或片段或其组合。在一些实施方案中，DNA聚合酶缺乏3'-5'外切核酸酶活性。在一些实施方案中，DNA聚合酶具有链替换特性，例如pol I或pol V类原核聚合酶的大片段。

另外，一种或多种单链DNA结合蛋白可以用于在反应中进行的多种交换反应期间稳定核酸。一种或多种单链DNA结合蛋白可以源自于或获自任何物种，例如原核、病毒或真核物种。非限制性例示性单链DNA结合蛋白包括大肠杆菌SSB和源自于以下的DNA结合蛋白：肌尾噬菌体科噬菌体，例如T4、T2、T6、Rb69、Aeh1、KVP40、不动杆菌属噬菌体133、气单胞菌属噬菌体65、噬蓝藻体P-SSM2、噬蓝藻体PSSM4、噬蓝藻体S-PM2、Rb14、Rb32、气单胞菌属噬菌体25、弧菌属噬菌体nt-1、phi-1、Rb16、Rb43、噬菌体31、噬菌体44RR2.8t、Rb49、噬菌体Rb3和噬菌体LZ2。单链DNA结合蛋白的其它实例包括反硝化无色杆菌(A.denitrificans)Alide_2047、泰国伯克霍尔德氏菌(Burkholderia thailandensis)BthaB_33951、苍白普雷沃菌(Prevotella pallens)HMPREF9144_0124和真核单链DNA结合蛋白复制蛋白A。

本公开的任一RPA过程可以在拥挤试剂存在下进行。在一些实施方案中，拥挤试剂可以包括聚乙二醇、聚氧化乙烯、聚乙烯醇、聚苯乙烯、Ficoll、葡聚糖、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、Triton-X和白蛋白。在一些实施方案中，拥挤试剂具有小于200,000道尔顿的分子量。在这里描述的任何方面的一些实施方案中，组合物包含选自由以下组成的组的拥挤试剂：聚乙二醇(PEG)(例如PEG1450、PEG3000、PEG8000、PEG10000、PEG14000、PEG15000、PEG20000、PEG250000、PEG30000、PEG35000、PEG40000、分子量介于15,000与20,000道尔顿之间的PEG化合物或其组合)、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、Triton-X和Ficoll。在一些实施方案中，拥挤试剂以按反应混合物的重量或体积计1至15％之间，例如选自1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％、5.5％、6.0％、6.5％、7.0％、7.5％、8.0％、8.5％、9.0％、9.5％、10.0％、10.5％、11.0％、11.5％、12.0％、12.5％、13.0％、13.5％、14.0％、14.5％和15.0％的任两个浓度值之间的浓度存在于反应混合物中。

如果使用重组酶负载蛋白，那么重组酶负载蛋白可以是原核、病毒或真核来源。例示性重组酶负载蛋白包括大肠杆菌RecO、大肠杆菌RecR、UvsY和其突变体或片段或其组合。例示性UvsY蛋白包括源自于以下的UvsY蛋白：肌尾噬菌体科噬菌体，例如T4、T2、T6、Rb69、Aeh1、KVP40、不动杆菌属噬菌体133、气单胞菌属噬菌体65、噬蓝藻体P-SSM2、噬蓝藻体PSSM4、噬蓝藻体S-PM2、Rb14、Rb32、气单胞菌属噬菌体25、弧菌属噬菌体nt-1、phi-1、Rb16、Rb43、噬菌体31、噬菌体44RR2.8t、Rb49、噬菌体Rb3和噬菌体LZ2。在本公开的任一过程中，重组酶负载剂可以源自于肌尾噬菌体科噬菌体。肌尾噬菌体科噬菌体可以是例如T4、T2、T6、Rb69、Aeh1、KVP40、不动杆菌属噬菌体133、气单胞菌属噬菌体65、噬蓝藻体P-SSM2、噬蓝藻体PSSM4、噬蓝藻体S-PM2、Rb14、Rb32、气单胞菌属噬菌体25、弧菌属噬菌体nt-1、phi-1、Rb16、Rb43、噬菌体31、噬菌体44RR2.8t、Rb49、噬菌体Rb3或噬菌体LZ2。

适用于本发明方法中的扩增方法包括在多核苷酸在扩增期间不经历足够使双链多核苷酸变性的温度下进行的扩增方法。举例来说，多核苷酸的扩增可以在多核苷酸在扩增期间不经历超过约90℃、约80℃、约70℃或约60℃的温度下进行。在实施方案中，多核苷酸的扩增是在多核苷酸在扩增期间不经历足够使双链多核苷酸变性的条件下进行。举例来说，扩增可以在多核苷酸在扩增期间不经历足够使双链多核苷酸变性的物理、化学或热条件下进行。

适用于本发明方法中的扩增方法包括在多核苷酸首先不经历足够使样品中存在的双链多核苷酸变性的温度下进行的扩增方法。举例来说，多核苷酸的扩增可以在多核苷酸首先不经历超过约90℃、约80℃、约70℃、约60℃或约55℃的温度下进行。在一些实施方案中，多核苷酸和/或其扩增子在首先多核苷酸不经历此类过温下检测。在一些实施方案中，多核苷酸的扩增是在多核苷酸首先不经历足够使样品中存在的双链多核苷酸变性的条件下进行。举例来说，扩增可以在多核苷酸首先不经历足够使样品中存在的双链多核苷酸变性的物理、化学或热条件下进行。

适用于本发明方法中的扩增方法包括在总时间(T)内进行的扩增方法，其从将多核苷酸与足够进行扩增的试剂组合的步骤开始，并在扩增进行了足够允许多核苷酸或其扩增子定性或定量测定的量时结束。在任一这类实施方案中，总时间T可以是约45分钟或更少、约30分钟或更少、约20分钟或更少或约15分钟或更少。

多核苷酸的扩增包括例如多核苷酸扩增至少约10⁶倍、至少约10⁷倍、至少约10⁸倍、至少约10⁹倍、至少约10¹⁰倍、至少约10¹¹倍或至少约10¹²倍。此类扩增可以在时间T内进行。

适用于本发明方法中的扩增方法包括熟练技术人员已知的“实时”或“定量”多核苷酸扩增方法。这类方法在反应进展时实时检测每次扩增循环后多核苷酸扩增产物的累积，从而允许测定扩增动力学。实时方法为定量的，因为到达扩增产物的特定阈值浓度的时间(例如循环次数)直接与标靶核苷酸的初始拷贝数相关。根据一些实施方案，通过电化学检测，使用本文所述的寡核苷酸探针监测扩增反应。

实施例

实施例1：巢式RPA扩增

图19A-19D表示使用在如本文所述的微流体卡上进行巢式RPA的方法进行的分析的结果。结果证明巢式RPA测定能够区分具有不同的已知标靶的样品。从流感阳性和流感阴性样品材料的商业供应商获得样品。使用总共九十个样品进行一系列测量：已知三十个样品对流感A(Inf A)呈阳性，已知十个样品对流感B(Inf B)呈阳性，且已知五十个样品不含流感A或B(阴性)。将每个样品施加于单个测定装置，且从测定卡上的四个检测室中的每一个获得测量结果。

在图19A-19D中所示的每个实验中，使用荧光标记的探针检测反应产物。利用标记探针对RPA试剂的检测如先前所述，且典型地包括至少一个具有可检测标记的探针，用于检测扩增靶(如果存在)。探针可以包括氟和猝灭剂，当探针与互补的多核苷酸序列(如果存在于扩增反应产物中)杂交时氟和猝灭剂在由核酸酶裂解后分离。当使用电化学标记的探针测试样品时，关于样品为流感A阳性、流感B阳性还是阴性对照物的鉴别，利用九十个样品，获得类似结果(未显示)。

荧光与电化学探针测量的组合结果描绘于表2A-2D中。每个表包括使用由流感样品材料的供应商进行的标准商业qPCR测定所进行的比较测量。由样品材料的商业供应商在获得样品时进行qPCR，其结果用于将样品分类为阳性或阴性，以及fluA或fluB；被分类的样品适当地存储并供应在病毒运送培养基(VTM)中。VTM对RPA的性能无明显影响。

表2A.流感A样品的荧光检测

表2B.流感B样品的荧光检测

表2C.流感A样品的电化学检测

表2D.流感B样品的电化学检测

因为已知流感A的核酸序列常常逐年改变，所以所述RPA测定被研发成并入两种针对不同的核苷酸区域的不同引物和探针组，以最大化鉴别出对流感A呈阳性的样品的可能性。

用于如本文所述的RPA测定中的引物和探针在下文中作为SEQ ID NO.1至21列出。在第一轮巢式扩增期间，主要引物序列用于接触第一反应室中的整个样品以进行主要扩增。然后主要扩增产物用于接触个别次要反应室内的次要引物和探针，以使用InfAPA、InfAPB2、InfB PA和IC特异性地扩增相应的靶物质，从而只要fluA或fluB存在于患者样品中就产生信号。当探针用于进行荧光测量时，这些探针被设计成由核酸酶外切核酸酶III(Exo)裂解；用于电化学的探针被设计成用于核酸酶8-氧代基鸟嘌呤DNA糖基酶(fpg)。合适电化学探针的实例描述于2017年2月24日提交的共同未决申请PCT/US2017/019446中且以引用的方式整体并入本文中。

InfA[PA]主要扩增引物

>FluAPAR111

TGCATGTGTGAGGAAGGAGTTGAACCAAG*A(SEQ ID NO.1)

>FluAPAF523

AAATTGCTTCTCATTGTTCAGGCACTTAGGG*A(SEQ ID NO.2)

InfA[PB2]主要扩增引物

>FluAPB2F201

GAACTGAGTAACCTTGCAAARGGGGAAAAGG*C(SE Q ID NO.3)

>FluAPB2F218

GAACTGAGTAACCTTGCAAAAGGGGAAAAAG*C(SE Q ID NO.4)

>FluAPB2R103

AYTAATTGATGGCCATCCGAATTCTTTTGGTCGCT*G(SEQ ID NO.5)

InfB[PA]主要扩增引物

>FluBPAF44

AAGGATTGGCTGATGATTACTTTTGGAAAAAGAAA*G(SE Q ID NO.6)

>FluBPAR42

TAATTCAGCCTGAAGTTCTGTGAGTCTGCTTAG*C(SE Q ID NO.7)

Xcon主要扩增引物

>XConF7

AATCATGAACCTCATGGCATCTTCCCTCGCCGC*C(SEQ ID NO.8)

>XConR6

ACAATGCAATCATATGCTTCTGCTATGTTAAGC*G(SEQ ID NO.9)

InfA[PA]次要扩增引物

>FLUPAF507ii

AACCTGGGACCTTTGATCTTGGGGGGCTATAT*G(SEQ ID NO.10)

>FLUAPAR106ii

ATGTGTTAGGAAGGAGTTGAACCAAGAAGCAT*T(SE Q ID NO.11)

InfA[PA]Exo探针

>FluAPAExoP12dFAM F＝dT-FAM,H＝THF(无碱基位点模拟物),Q＝dT-BHQ-1,3'＝阻断C3间隔子

GAACCAAGATGCATTRAGCAAAACCCAGGGAFHAQTAATCAGGCACTC(SEQ ID NO.12)

InfA[PB2]次要扩增引物

>FluAPB2F403

AATGTGCTAATYGGGCAAGGAGACGTGGTGTTG*G(SEQ ID NO.13)

>FluAPB2R703

GGCCATCCGAATTCTTTTGGTCGCTGTCTGG*C(SEQ ID NO.14)

InfA[PB2]Exo探针

>FluAPB2ExoP2F＝dT-FAM,H＝THF(无碱基位点模拟物),Q＝dT-BHQ-1,3'＝阻断C3间隔子

CGAATTCTTTTGGTCGCTGTCTGGCTGTCAGTAAGFHQGCTAGAGTCCCG(SEQ ID NO.15)

InfB[PA]次要扩增引物

>MSFBPA_F6+1-2

GGAAAAAGAAAGAAAAGCTGGGAAATAGCATG*G(SE Q ID NO.16)

>MSFBPA_R6+1

GCTTAGCACTCTCCCTTTCCCTTCCTCATCCAAT*G(SEQ ID NO.17)

InfB[PA]Exo探针

>MSFBPAx1F＝dT-FAM,H＝THF(无碱基位点模拟物),Q＝dT-BHQ-1,3'＝阻断C3间隔子

ACTGATGATATTCAGCTACAATCAAGACFAHQCGTTAAGTAATGAA(SEQ ID NO.18)

Xcon次要扩增引物

>XConR13

TTCCAGTCAGTCCTAGTCAGAAACGGTCCTTAGAC*G(SEQ ID NO.19)

>APOBEXTF

GCCAGGTTTATAGCACACTTGTCACCTA*C(SEQ ID NO.20)

Xcon Exo探针

>APOB1FAM F＝dT-FAM,H＝THF(无碱基位点模拟物),Q＝dT-BHQ-1,3'＝阻断C3间隔子

GCCAGGTTTATAGCACACTTGTCACCTACAQTHCFGATTGGTGGACTCT(SEQ ID NO.21)

图19A表示当90个样品暴露于InfAPARPA引物和探针时所获得的结果。结果表明InfAPA引物从30个InfA阳性样品中检测出24个；InfB或阴性样品中无一者显示与InfAPA引物反应。图19B展示当暴露于InfAPB2引物和探针时所有InfA样品都提供阳性反应；InfB与阴性样品都未显示与InfAPB2引物和探针的任何反应。图19C展示当暴露于InfB PA引物和探针时所有InfB样品都提供阳性反应；InfA与阴性对照样品都未给出任何反应。图19D指示当使用阴性对照引物(Xcon)和探针时，无样品显示阳性信号。

在图19A-19D中的每一个中，虚线表示基线阈值，其测得为超过最大阴性结果的三个标准偏差。数据展示针对InfAPA和InfAPB2区域的RPA引物和探针的组合使用能够100％鉴别出流感A阳性样品，这证明了本文所述的测定格式能够成功地测定具有不同核苷酸序列的流感病毒的存在。

其它实施方案

已经描述了许多本发明的实施方案。然而，应了解在不脱离本发明的精神和范围下可以进行多种修改。因此，其它实施方案在以下权利要求书的范围内。

Claims (85)

1.一种方法，其包括：

将样品提供至微流体装置；以及

使所述样品中的靶多核苷酸序列扩增，其中所述扩增包括：

对所述样品进行第一轮扩增以得到第一扩增产物；以及

对所述第一扩增产物进行第二轮扩增以得到第二扩增产物，其中所述第二扩增产物包含完全含在所述第一轮扩增期间所产生的所述第一扩增产物内的较小序列。

2.如权利要求1所述的方法，其还包括检测所述第二扩增产物。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述第二扩增产物的检测包括：

将所述第二扩增产物用连接至荧光团和猝灭剂的第一寡核苷酸标记以得到标记的第二产物；

使所述猝灭剂从所述标记的第二扩增产物裂解；以及

光学检测来自所述荧光团的信号，其中可检测信号指示存在所述第二扩增产物。

4.如权利要求3所述的方法，其中使所述猝灭剂裂解是使用核酸酶进行。

5.如权利要求4所述的方法，所述核酸酶靶向双链DNA。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述核酸酶为甲酰胺基嘧啶-DNA糖基酶。

7.如权利要求2所述的方法，其中所述第二扩增产物的检测包括：

将所述第二扩增产物用连接至氧化还原部分的第一寡核苷酸标记以得到标记的第二扩增产物；

使所述氧化还原部分从所述标记的第二扩增产物裂解；以及

电化学检测来自裂解的氧化还原部分的信号，其中可检测信号指示存在所述第二扩增产物。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述氧化还原部分是选自由以下组成的组：吩噻嗪、吩噁嗪、二茂铁、铁氰化物、钌(III)、锇(II)、蒽醌、吩嗪和其衍生物。

9.如权利要求7所述的方法，其中使所述氧化还原部分裂解是使用核酸酶进行。

10.如权利要求9所述的方法，所述核酸酶靶向双链DNA。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述核酸酶为甲酰胺基嘧啶-DNA糖基酶。

12.如权利要求1所述的方法，其还包括：

对所述第二扩增产物进行第三轮扩增以得到第三扩增产物；以及检测所述第三扩增产物，其中所述第三扩增产物包含完全含在所述第二轮扩增期间所产生的所述第二扩增产物内的较小序列。

13.如权利要求1所述的方法，其中所述样品是从动物获得。

14.如权利要求13所述的方法，其中从动物获得的所述样品是从所述动物的血液、痰液、粘液、唾液、泪液或尿液获得。

15.如权利要求13所述的方法，其中所述样品是从人类获得。

16.如权利要求1所述的方法，其中所述靶多核苷酸序列包含在靶核酸内。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述靶核酸是从动物病原体获得。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述动物病原体为单链DNA病毒、双链DNA病毒或单链RNA病毒。

19.如权利要求17所述的方法，其中所述动物病原体为细菌。

20.如权利要求16所述的方法，其中所述靶核酸为双链DNA、单链DNA或RNA。

21.如权利要求16所述的方法，其中所述靶核酸是选自由以下组成的组：基因组DNA、质粒DNA、病毒DNA、线粒体DNA、cDNA、合成双链DNA和合成单链DNA。

22.如权利要求16所述的方法，其中所述靶核酸为病毒DNA或病毒RNA。

23.如权利要求17所述的方法，其中所述动物病原体为甲型流感病毒或乙型流感病毒。

24.如权利要求1所述的方法，其中使所述样品中的两个或更多个靶多核苷酸序列扩增。

25.如权利要求24所述的方法，其中使包含甲型流感基因序列的靶多核苷酸序列和包含乙型流感基因序列的靶多核苷酸序列扩增。

26.如权利要求2所述的方法，其中检测两种或更多种第二扩增产物。

27.如权利要求26所述的方法，其中检测包含甲型流感基因序列的第二扩增产物和包含乙型流感基因序列的第二扩增产物。

28.一种诊断卡，其包括：

卡主体，所述卡主体包括：

(i)主要反应室，所述主要反应室被配置成用于对所述反应室中的样品流体进行第一核酸扩增以形成第一扩增产物；和

(ii)一个或多个次要反应室，每个次要反应室被配置成用于对所述第一扩增产物进行第二核酸扩增以形成第二扩增产物；

通道，所述通道用于将所述样品流体供应至所述主要反应室；

一个或多个检测室，所述一个或多个检测室与所述一个或多个次要反应室流体连接；以及

检测模块，所述检测模块与每个检测室相关联。

29.如权利要求28所述的诊断卡，其中所述检测模块为光学模块。

30.如权利要求28所述的诊断卡，其中所述检测模块为荧光检测器。

31.如权利要求30所述的诊断卡，其中所述荧光检测器包括用以将照明光引导至所述一个或多个检测室的单个光导管，和用以接收来自每个检测室的反射光的离散光导管。

32.如权利要求28所述的诊断卡，其中所述检测模块为电极模块。

33.如权利要求32所述的诊断卡，其中所述检测模块包括一系列终结在每个检测室的电极中的导电迹线。

34.如权利要求32所述的诊断卡，其中所述装置包括用以检测液体在微流体卡中的位置的额外导电迹线和电极。

35.如权利要求28所述的诊断卡，其中所述扩增包括重组酶聚合酶扩增(RPA)反应。

36.如权利要求28所述的诊断卡，其还包括混合构件、泵和用于连接至样品模块的连接端口。

37.如权利要求28所述的诊断卡，其中所述主要反应室连接至加热器。

38.如权利要求28所述的诊断卡，其中所述主要反应室包括混合构件，或连接至混合构件。

39.如权利要求28所述的诊断卡，其中每个次要反应室包含试剂。

40.如权利要求39所述的诊断卡，其中所述试剂包含RPA试剂。

41.如权利要求40所述的诊断卡，其中所述RPA试剂是冷冻干燥的。

42.如权利要求28所述的诊断卡，其中所述主要反应室包含试剂。

43.如权利要求42所述的诊断卡，其中所述试剂包含RPA试剂。

44.如权利要求43所述的诊断卡，其中所述RPA试剂是冷冻干燥的。

45.如权利要求28所述的诊断卡，其中所述样品流体为从动物获得的样品。

46.如权利要求45所述的诊断卡，其中从动物获得的所述样品是从所述动物的血液、痰液、粘液、唾液、泪液或尿液获得。

47.如权利要求45所述的诊断卡，其中所述样品流体为从人类获得的样品。

48.如权利要求28所述的诊断卡，其中所述样品流体包含靶核酸。

49.如权利要求48所述的诊断卡，其中所述靶核酸是从动物病原体获得。

50.如权利要求49所述的诊断卡，其中所述动物病原体为单链DNA病毒、双链DNA病毒或单链RNA病毒。

51.如权利要求49所述的诊断卡，其中所述动物病原体为细菌。

52.如权利要求48所述的诊断卡，其中所述靶核酸为双链DNA、单链DNA或RNA。

53.如权利要求48所述的诊断卡，其中所述靶核酸是选自由以下组成的组：基因组DNA、质粒DNA、病毒DNA、线粒体DNA、cDNA、合成双链DNA和合成单链DNA。

54.如权利要求48所述的诊断卡，其中所述靶核酸为病毒DNA或病毒RNA。

55.如权利要求49所述的诊断卡，其中所述动物病原体为甲型流感病毒或乙型流感病毒。

56.如权利要求28所述的诊断卡，其中所述第二扩增产物在所述样品流体递送至所述诊断卡后30分钟或更少时间、15分钟或更少时间、10分钟或更少时间或5分钟或更少时间时产生。

57.如权利要求28所述的诊断卡，其中所述诊断卡为一次性的。

58.如权利要求28所述的诊断卡，其还包括额外反应室，每个额外反应室被配置成用于进行额外一轮核酸扩增反应以形成额外扩增产物，使得来自每个相继n+1轮扩增的所述扩增产物为完全含在前面第n轮的扩增产物内的较小序列。

59.一种读数器，其被配置成用于容纳如权利要求28所述的诊断卡，所述读数器包括检测器，所述检测器被配置成用于检测所述次要反应室中所述第二扩增产物的存在。

60.一种核酸扩增装置，其包括：

第一反应室，所述第一反应室流体连接至第一进入口和第一排出口；

第二反应室，所述第二反应室流体连接至第二进入口和第二排出口；

检测室；

第一泵，其中所述第一进入口经由第一泵流体连接至所述第一反应室且所述第一排出口流体连接至所述第一反应室；

第二泵，其中所述第一反应室经由所述第二泵流体连接至所述第二反应室且所述第二排出口流体连接至所述第二反应室；

第三泵，其中所述第二进入口经由所述第三泵流体连接至所述第二反应室。

61.如权利要求60所述的核酸扩增装置，其中所述核酸扩增装置为微流体装置。

62.如权利要求60所述的核酸扩增装置，其中所述第一反应室包含试剂。

63.如权利要求62所述的核酸扩增装置，其中所述第一反应室包含催化剂。

64.如权利要求63所述的核酸扩增装置，其中所述催化剂包含镁。

65.如权利要求60所述的核酸扩增装置，其还包括试剂贮存器，其中所述第二泵和所述第三泵经由第一试剂贮存器流体连接至每个第二反应室。

66.如权利要求60所述的核酸扩增装置，其中所述第二泵和所述第三泵经由第一试剂贮存器和第二试剂贮存器流体连接至每个第二反应室。

67.如权利要求66所述的核酸扩增装置，其中所述第一试剂贮存器和所述第二试剂贮存器为串联的。

68.如权利要求67所述的核酸扩增装置，其中所述第一试剂贮存器包含寡聚物。

69.如权利要求67所述的核酸扩增装置，其中所述第二试剂贮存器包含镁。

70.如权利要求66所述的核酸扩增装置，其中每个第二反应室为检测室。

71.如权利要求70所述的核酸扩增装置，其中每个检测室的一部分为光学上透明的。

72.如权利要求70所述的核酸扩增装置，其还包括连接至每个检测室的电极。

73.如权利要求72所述的核酸扩增装置，其中三个电极连接至每个检测室。

74.如权利要求60所述的核酸扩增装置，其还包括流体检测区。

75.如权利要求74所述的核酸扩增装置，其中所述第一泵和所述第一反应室经由第一检测区连接。

76.如权利要求74所述的核酸扩增装置，其中所述第二泵和所述第二反应室经由第二检测区连接。

77.如权利要求74所述的核酸扩增装置，其中所述第三泵和所述第二反应室经由第三检测区连接。

78.如权利要求74所述的核酸扩增装置，其中所述第三泵和所述第一反应室经由第四检测区连接。

79.如权利要求74所述的核酸扩增装置，其中每个检测区的一部分为光学上透明的。

80.如权利要求74所述的核酸扩增装置，其还包括连接至每个检测区的流动检测室。

81.如权利要求60所述的核酸扩增装置，其还包括连接至所述第一反应室的加热器。

82.如权利要求60所述的核酸扩增装置，其中所述第一反应室包含搅拌器。

83.如权利要求60所述的核酸扩增装置，其中所述第一泵被配置成用于经由所述第一进入口将被递送至所述核酸扩增装置的样品提供至所述第一反应室。

84.如权利要求60所述的核酸扩增装置，其中所述第二泵和所述第三泵被配置成用于经由所述第二进入口将被递送至所述核酸扩增装置主体的试剂与来自所述第一反应室的产物组合，从而得到反应混合物。

85.如权利要求84所述的核酸扩增装置，其中所述第二泵和所述第三泵被配置成用于将所述反应混合物的一部分提供至所述第二反应室中的每一个。