JP4638419B2 - 遺伝子変異検出方法及び遺伝子変異検出用キット - Google Patents
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Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオインフォマティクス（生命情報科学）分野において特に有用な遺伝子変異検出方法及びその方法を用いた遺伝子変異検出用キットに関し、特に遺伝子配列における一塩基置換等を簡便且つ迅速に検出する遺伝子変異検出方法及び遺伝子変異検出用キットに関する。
【０００２】
本出願は、日本国において２００４年３月１９日に出願された日本特許出願番号２００４−０８０７０３を基礎として優先権を主張するものであり、この出願は参照することにより、本出願に援用される。
【背景技術】
【０００３】
ヒトゲノム配列が解読された今日の研究目標の１つは、遺伝子の同定、機能の解析、さらに遺伝子発現や機能に影響して個体差を決める遺伝子の多様性である。ここで、核酸塩基配列中の一塩基の違いから生じる遺伝子の個体差のことを一塩基変異と呼ぶ。この一塩基変異の中でも頻度の多い変異のことを一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＳＮＰ）と呼び、遺伝子中に点在するＳＮＰが各種疾患と強く関連することが明らかとなっている。
【０００４】
現在、ＳＮＰを含む遺伝子変異の検出方法としては、制限酵素で切断したＤＮＡ断片をゲルにより分離した後、色素でＤＮＡ断片を染色・検出するという電気泳動法が挙げられる。この方法は汎用されているものの、分離や染色に必要な時間が長く、迅速性に欠けるという問題があった。
【０００５】
また、マイクロアレイ技術によって所定のＤＮＡが微細配列された、いわゆるＤＮＡチップと呼ばれるバイオアッセイ用の集積基板も、遺伝子変異の検出に利用され始めている。このＤＮＡチップは、ガラス基板やシリコン基板上に多種多数のＤＮＡオリゴヌクレオチド鎖やｃＤＮＡ等が集積されていることから、一度に多数の遺伝子検査が可能であり、臨床検査現場等への適用が期待されている。しかしながら、核酸塩基のミスマッチ形成に由来する二本鎖ＤＮＡの安定性を原理とする手法であるため、塩基配列によってはその温度制御が困難であり、さらに放射性物質や蛍光色素を被検体自体に修飾する前処理が必要である等の問題があった。
【０００６】
さらに、被検体の増幅と検出を同時に行うリアルタイムＰＣＲ法が、核酸増幅法による一段階の迅速な定量測定の技術として、近年普及しつつある。しかしながら、増幅反応における複雑な温度制御、プローブの導入も含めた各遺伝子配列に適用するプライマーの設計が複雑である上に、増幅装置や条件によって結果が異なる場合も少なからずあり、再現性の面においても課題を残している。また、シグナルの経時変化を利用して検出を行うため、若干操作性に欠けるという問題があった。
【０００７】
このように、従来の遺伝子変異を検出する技術は、精密な温度制御や煩雑な被検体の前処理が必要である、或いは測定までの時間が長い等の問題があり、簡便且つ迅速に遺伝子検査を行うことが不可能であった。
【０００８】
そこで、本件発明者らは、文献「Ｋ．Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ，Ｓ．Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ｍ．Ｍｉｎａｇａｗａ ａｎｄ Ｎ．Ｔｅｒａｍａｅ，“Ｕｓｅ ｏｆ Ａｂａｓｉｃ Ｓｉｔｅ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＤＮＡ Ｓｔｒａｎｄｓ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｉｎ Ｗａｔｅｒ”，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００３，１２５，ｐｐ．８９８２−８９８３」（以下、文献１という。）において、一塩基置換部位を有する一本鎖の標的ＤＮＡと、この標的ＤＮＡと相補的であり、且つ一塩基置換部位に対応する対応塩基を除いて脱塩基部位（ＡＰ ｓｉｔｅ）とした一本鎖の検出用ＤＮＡとで二本鎖核酸を形成させ、この二本鎖核酸に水素結合性及び発蛍光性を有するレセプター分子を添加して一塩基置換部位と水素結合を形成させ、このレセプター分子の蛍光強度変化を測定することにより、一塩基置換を効果的に検出する技術を提案している。
【０００９】
この文献１記載の技術は、被検体となる標的ＤＮＡのラベル化や熱制御等の煩雑な操作が原則的に不要であるため工程数が非常に少なく、また、原理上二本鎖ＤＮＡ自体の熱的な安定性に依存しないため、検出までの時間が非常に短時間であり、再現性にも優れている。また、ＵＶランプを用いた目視による確認も可能であるため、特別な設備を持たない状況下においても検出が可能である。
【００１０】
しかしながら、この文献１記載の技術では、検出用ＤＮＡを蛍光標識する等の化学修飾は必要ないものの、脱塩基部位という特殊な部位を導入する必要があり、これが厳密な意味では化学修飾に相当してしまうという問題があった。また、脱塩基部位を導入するため、検出用ＤＮＡを合成する際のコストが高くなるという問題があった。
【発明の開示】
【００１１】
本発明は、このような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、標的ＤＮＡ及び検出用ＤＮＡに対する化学修飾を行うことなく、簡便且つ迅速に遺伝子変異を検出する遺伝子変異検出方法及び遺伝子変異検出用キットを提供することを目的とする。
【００１２】
上述した目的を達成するために、本発明に係る遺伝子変異検出方法は、１塩基からなる標的塩基を有する一本鎖の標的核酸と、上記標的塩基を挟む２種類の部分配列について相補的な２種類の一本鎖の検出用核酸とで、二本鎖核酸を形成する工程と、上記二本鎖核酸に水素結合性及び発蛍光性を示すレセプターを挿入させ、上記標的塩基と水素結合を形成させる工程と、上記レセプターが挿入された上記二本鎖核酸の蛍光強度を測定する工程とを有する。
【００１３】
また、上述した目的を達成するために、本発明に係る遺伝子変異検出用キットは、１塩基からなる標的塩基を有する一本鎖の標的核酸における上記標的塩基を挟む２種類の部分配列について相補的な２種類の一本鎖の検出用核酸と、水素結合性及び発蛍光性を示し、上記標的核酸と２種類の上記検出用核酸とで形成された二本鎖核酸に挿入されて上記標的塩基と水素結合を形成するレセプターとを有する。
【００１４】
このような遺伝子変異検出方法及び遺伝子変異検出用キットでは、標的核酸と２種類の検出用核酸とで二本鎖核酸を形成することにより二本鎖核酸に意図的にギャップ部位を構築し、この二本鎖核酸に水素結合性及び発蛍光性を示すレセプターを添加してギャップ部位にレセプターを挿入させ、標的塩基と水素結合を形成させた後、レセプターが挿入された二本鎖核酸の蛍光強度を測定することにより、標的塩基に生じた遺伝子変異を検出する。
【００１５】
なお、上記レセプターとしては、例えばナフチリジン誘導体、キノリン誘導体、プテリジン誘導体、クマリン誘導体、インダゾール誘導体、アロキサジン誘導体、或いはアミロライドが使用可能である。
【００１６】
ここで、上記レセプターは、基板に固定化されていても構わない。
【００１７】
すなわち、上述した目的を達成するために、本発明に係る遺伝子変異検出方法は、水素結合性を示すレセプターが固定化された基板に、１塩基からなる標的塩基を有する一本鎖の標的核酸と上記標的塩基を挟む２種類の部分配列について相補的な２種類の一本鎖の検出用核酸とを滴下することにより、上記標的核酸と２種類の上記検出用核酸とで二本鎖核酸を形成させると共に、上記標的塩基と上記レセプターとで水素結合を形成させる工程と、上記標的塩基と上記レセプターとの結合に基づいて上記標的塩基を識別する工程とを有する。
【００１８】
また、上述した目的を達成するために、本発明に係る遺伝子変異検出用キットは、１塩基からなる標的塩基を有する一本鎖の標的核酸における上記標的塩基を挟む２種類の部分配列について相補的な２種類の一本鎖の検出用核酸と、水素結合性を示し、上記標的核酸と２種類の上記検出用核酸とで形成された二本鎖核酸に挿入されて上記標的塩基と水素結合を形成するレセプターと、上記レセプターが固定化された基板とを有する。
【００１９】
このような遺伝子変異検出方法及び遺伝子変異検出用キットでは、標的核酸と２種類の検出用核酸とで二本鎖核酸を形成することにより二本鎖核酸に意図的にギャップ部位を構築し、水素結合性を示すレセプターが固定化された基板にこの二本鎖核酸を滴下することによりギャップ部位にレセプターを挿入させて標的塩基と水素結合を形成させた後、標的塩基とレセプターとの結合に基づいて標的塩基に生じた遺伝子変異を検出する。この場合、レセプターが発蛍光性を示すものであればレセプターが挿入された二本鎖核酸の蛍光強度変化に基づいて標的塩基を識別することができる。また、標的塩基とレセプターとの結合に基づく表面プラズモン共鳴の信号強度変化、又は水晶振動子の共振周波数変化に基づいて標的塩基を識別することも可能である。
【００２０】
また、上記２種類の検出用核酸の一方は、基板に固定化されていても構わない。
【００２１】
すなわち、上述した目的を達成するために、本発明に係る遺伝子変異検出方法は、１塩基からなる標的塩基を有する一本鎖の標的核酸における上記標的塩基を挟む２種類の部分配列について相補的な２種類の一本鎖の検出用核酸のうち一方の検出用核酸が固定化された基板に、上記標的核酸と、他方の検出用核酸と、水素結合性を示すレセプターとを滴下することにより、上記標的核酸と２種類の上記検出用核酸とで二本鎖核酸を形成させると共に、上記標的塩基と上記レセプターとで水素結合を形成させる工程と、上記標的塩基と上記レセプターとの結合に基づいて上記標的塩基を識別する工程とを有する。
【００２２】
また、上述した目的を達成するために、本発明に係る遺伝子変異検出用キットは、１塩基からなる標的塩基を有する一本鎖の標的核酸における上記標的塩基を挟む２種類の部分配列について相補的な２種類の一本鎖の検出用核酸と、水素結合性を示し、上記標的核酸と２種類の上記検出用核酸とで形成された二本鎖核酸に挿入されて上記標的塩基と水素結合を形成するレセプターと、２種類の上記検出用核酸の一方が固定化された基板とを有する。
【００２３】
このような遺伝子変異検出方法及び遺伝子変異検出用キットでは、２種類の検出用核酸のうち一方の検出用核酸が固定化された基板に、標的核酸と、他方の検出用核酸と、水素結合性を示すレセプターとを滴下することにより、標的核酸と２種類の検出用核酸とで二本鎖核酸を形成させて二本鎖核酸に意図的にギャップ部位を構築し、このギャップ部位にレセプターを挿入させて標的塩基と水素結合を形成させた後、標的塩基とレセプターとの結合に基づいて標的塩基に生じた遺伝子変異を検出する。この場合、レセプターが発蛍光性を示すものであれば、レセプターが挿入された二本鎖核酸の蛍光強度変化に基づいて標的塩基を識別することができる。
【００２４】
本発明のさらに他の目的、本発明によって得られる具体的な利点は、以下に説明される実施例の説明から一層明らかにされるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
図１は、本実施の形態における遺伝子変異検出の原理を説明する図である。
図２は、レセプター分子が基板に固定化されている場合の遺伝子変異検出の原理を説明する図である。
図３は、検出用核酸の一方が基板に固定化されている場合の遺伝子変異検出の原理を説明する図である。
図４は、標的塩基がグアニン、シトシンである場合について、ＡＭＮＤ添加後の蛍光スペクトルを示す図である。
図５は、標的塩基がグアニン、シトシンである場合について、ＡＭＮＤ添加後の蛍光を示す図である。
図６は、標的塩基がグアニン、シトシン、アデニン、チミンである場合について、ＡＭＮＤ添加後の蛍光消光効率を示す図である。
図７は、標的塩基がグアニン、シトシン、アデニン、チミンである場合について、ＤｉＭｅ−ｐｔｅｒｉｄｉｎｅ添加後の蛍光消光効率を示す図である。
図８は、標的塩基がグアニン、シトシン、アデニン、チミンである場合について、アミロライド添加後の蛍光消光効率を示す図である。
図９は、ＰＣＲ増幅した標的核酸の標的塩基がグアニン、シトシン、アデニン、チミンである場合について、ＡＭＮＤ添加後の蛍光消光効率を示す図である。
図１０は、標的塩基がグアニン、シトシン、アデニン、チミンである場合について、ＡＭＮＤ−ＤＰＡを固定化したセンサーチップのＳＰＲ信号強度を示す図である。
図１１は、標的塩基がグアニン、シトシン、アデニン、チミンである場合について、ＡｃＭＮＤ−Ｃ５Ａを固定化したセンサーチップのＳＰＲ信号強度を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
一般に、水素結合を利用する核酸塩基認識では、レセプター分子の水素結合様式や数を変化させることで、比較的容易に高い塩基選択性を獲得できる特徴を持つ。この際、完全水溶液中では水素結合形成に基づく認識機能の発現は期待できないため、従来の研究の多くは、クロロホルム中のような無極性溶媒環境下に限定されていたが、溶媒中の核酸が変性、沈殿する要因ともなっていた。
【００２７】
そこで、本実施の形態では、図１に概念的に示すように、ＳＮＰ等に関連する標的塩基１１を有する一本鎖の標的核酸１０を含む溶液と、標的塩基１１を挟む部分配列について相補的な２種類の一本鎖の検出用核酸２０ａ，２０ｂを含む溶液とを混合し、標的核酸１０と検出用核酸２０ａ，２０ｂとをハイブリダイゼーションさせることで、標的塩基１１と対向する部位に意図的にギャップ部位２１を構築する。そして、疎水場空間であるこのギャップ部位２１に水素結合性を示すレセプター分子３０を挿入し、標的塩基１１と水素結合を形成させる。
【００２８】
このように、疎水場空間であるギャップ部位２１に水素結合性を示すレセプター分子３０を挿入し、標的塩基１１と水素結合を形成させることで、完全水溶液中においても効果的に核酸塩基認識を行い、標的塩基１１の変異を検出することができる。
【００２９】
また、標的核酸１０の複数塩基を挟む部分配列について相補的な２種類の一本鎖の検出用核酸２０ａ，２０ｂを含む溶液を用いるようにすれば、複数塩基の変異を検出することができる。この場合、例えば２塩基分をギャップ部位２１とすると、このギャップ部位２１には２分子のレセプター分子３０が挿入される。
【００３０】
ここで、本実施の形態で分析可能な標的核酸１０としては、例えばヒトを含む哺乳類や植物由来のＤＮＡ、ｃＤＮＡ等が挙げられるが、特に限定されず、必要に応じて希釈、濃縮、増幅を行う。
【００３１】
また、水素結合性を示すレセプター分子３０としては、水素結合部位を有し、発蛍光性を示す試薬が望ましい。具体的には、水素結合部位を少なくとも一段、好ましくは複数段有し、ギャップ部位２１に隣接する核酸塩基とスタッキングできるような複素環式芳香族基を有する試薬が望ましい。特に水溶性の試薬が好ましいが、非水溶性の場合には有機溶媒を微量用いることにより、対応が可能である。このようなレセプター分子３０としては、例えばナフチリジン誘導体、キノリン誘導体、プテリジン誘導体、クマリン誘導体、インダゾール誘導体、アロキサジン誘導体、或いはアミロライド等が挙げられる。
【００３２】
なお、上述の例では、遊離した標的核酸１０と遊離した検出用核酸２０ａ，２０ｂとを溶液中で反応させるものとして説明したが、これに限定されるものではない。
【００３３】
例えば、図２に模式的に示すように、リンカー分子４１を介してレセプター分子３０を基板４０に固定化し、この基板４０上に標的核酸１０及び検出用核酸２０ａ，２０ｂを含む溶液を滴下するようにしても構わない。また、図３に模式的に示すように、リンカー分子４１を介して検出用核酸２０ａを基板４０に固定化し、この基板４０上に標的核酸１０及び検出用核酸２０ｂとレセプター分子３０とを含む溶液を滴下するようにしても構わない。
【００３４】
このようにして、レセプター分子３０又は検出用核酸２０ａを基板４０上に多数集積したセンサーチップ（マイクロアレイ）を作製し、遺伝子変異検出用キットとして用いることで、従来の欠点を克服したハイスループットな検出が可能となる。
【００３５】
図２に示す構成の場合、蛍光強度の変化ではなく、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ；ＳＰＲ）の信号強度の変化を利用して遺伝子変異を検出することも可能である（例えば文献「Ｋａｚｕｈｉｋｏ Ｎａｋａｔａｎｉ，Ｓｈｉｎｓｕｋｅ Ｓａｎｄｏ，ａｎｄ Ｉｓａｏ Ｓａｉｔｏ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００１，１９，ｐｐ．５１−５５」、文献「Ａｋｉｏ Ｋｏｂｏｒｉ，Ｓｏｕｔａ Ｈｏｒｉｅ，Ｈｉｔｏｓｈｉ Ｓｕｄａ，Ｉｓａｏ Ｓａｉｔｏ，ａｎｄ Ｋａｚｕｈｉｋｏ Ｎａｋａｔａｎｉ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００４，１２６，ｐｐ．５５７−５６２」を参照。）。また、図２に示す構成の場合、水晶振動子の共振周波数の変化を利用して遺伝子変異を検出することも可能である。
【００３６】
以下、本発明の具体的な実施例について図面を参照しながら詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能であることは勿論である。
【実施例】
【００３７】
（第１の実施例）
第１の実施例では、レセプター分子として、以下の化学式に示すようなナフチリジン誘導体である２−アミノ−７−メチル−１，８−ナフチリジン（ＡＭＮＤ）を用いた。このＡＭＮＤは、文献「Ｅ．Ｖ．Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．３０，ｐ１６０７，１９６５」を参考にして、２，６−ジアミノピリジンから合成したものである。
【００３８】
【化１】
【００３９】
このＡＭＮＤは発蛍光性を示し、後述するように、２種類の検出用ＤＮＡ間のギャップ部位に挿入されたときに標的塩基と相互作用し、標的塩基の違いに基づき蛍光強度が変化するため、蛍光強度を測定することで一塩基置換を検出することができる。特に、このＡＭＮＤは標的塩基としてのＣ（シトシン）と選択的に相互作用するため、Ｃ（シトシン）が関与する全ての一塩基置換（Ｃ／Ｔ，Ｃ／Ｇ，Ｃ／Ａ）を検出することができる。
【００４０】
ここで、ＤＮＡとＡＭＮＤとを混合する際、ＡＭＮＤは、該ＡＭＮＤを含有する溶液の形態で混合してもよく、粉末や固形状の形態で混合してもよい。また、蛍光測定は、ＵＶランプを用いて目視で行ってもよく、蛍光分光器、蛍光顕微鏡、デンシトメーター等の機器を用いてもよい。
【００４１】
本実施例では、ＡＭＮＤによる一塩基置換検出（Ｃ／Ｇ）の効果を検証するために、以下のような２３ｍｅｒの標的ＤＮＡ（配列ａ）とそれぞれ１１ｍｅｒの２種類の検出用ＤＮＡ（配列ｂ，ｃ）とをモデル配列として準備した。ここで、配列ａ中、ＳはＧ（グアニン）又はＣ（シトシン）を示す。
（配列ａ）５’−ＴＣＴＣＣＧＣＡＣＡＣＳＴＣＴＣＣＣＣＡＣＡＣ−３’（配列番号１）
（配列ｂ）５’−ＧＴＧＴＧＣＧＧＡＧＡ−３’（配列番号２）
（配列ｃ）５’−ＧＴＧＴＧＧＧＧＡＧＡ−３’（配列番号３）
【００４２】
具体的に、本実施例では、被検体となる６００μＭの標的ＤＮＡ溶液（上記配列ａ）とそれぞれ６００μＭの２種類の検出用ＤＮＡ溶液（上記配列ｂ，ｃ）とをそれぞれ２５μｌ、イオン強度調整剤として５００ｍＭ ＮａＣｌ溶液を５０μｌ、ｐＨ緩衝剤として５ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ カコジル酸ナトリウム溶液を５０μｌ、１５０μＭ ＡＭＮＤ溶液を５０μｌ混合し、ＭｉｌｌｉＱ水を加えて全量を２５０μｌとした。得られたＤＮＡ溶液についてサーマルサイクラーでアニーリング処理を行い、蛍光強度を測定した。蛍光測定には、光路長２ｍｍ×１０ｍｍの蛍光測定用セルを用いた。
【００４３】
標的ＤＮＡを加えなかった場合（ＤＮＡ ｆｒｅｅ）の蛍光スペクトルと、標的ＤＮＡの標的塩基ＳがＧ（グアニン），Ｃ（シトシン）である場合の蛍光スペクトルとを図４に示す。ここで、図４における励起波長は３５０ｎｍである。図４に示すように、標的塩基ＳがＣ（シトシン）である場合に蛍光が著しく消光している。これは、ＡＭＮＤがギャップ部位に隣接する核酸塩基とスタッキングし、さらに標的塩基（Ｃ）との水素結合形成により安定な会合体を形成しているためと考えられる。このように、消光の有無を検出することで、標的塩基ＹがＧ（グアニン）であるかＣ（シトシン）であるかを知ることができる。
【００４４】
同じＤＮＡ溶液をポリプロピレン製の透明チューブに入れ、励起波長３５０ｎｍのＵＶランプを用いて蛍光を目視検出した結果を図５に示す。図５には、標的ＤＮＡ及び検出用ＤＮＡのみが含まれた溶液とＡＭＮＤのみが含まれた溶液とをそれぞれ透明チューブに入れた場合の蛍光も併せて示す。図５に示すように、標的塩基ＳがＣ（シトシン）である場合に蛍光が著しく消光しており、目視でも確認可能である。
【００４５】
（第２の実施例）
第２の実施例では、レセプター分子として第１の実施例と同様のＡＭＮＤを用いて、Ｃ（シトシン）が関与する全ての一塩基置換検出（Ｃ／Ｔ，Ｃ／Ｇ，Ｃ／Ａ）への適用性を評価した。
【００４６】
本実施例では、ＡＭＮＤによる一塩基置換検出（Ｃ／Ｔ，Ｃ／Ｇ，Ｃ／Ａ）の効果を検証するために、以下のような１０７ｍｅｒの標的ＤＮＡ（配列ｄ）とそれぞれ１５ｍｅｒの検出用ＤＮＡ（配列ｅ，ｆ）とをモデル配列として準備した。ここで、配列ｄ中、ＮはＧ（グアニン），Ｃ（シトシン），Ａ（アデニン）又はＴ（チミン）を示す。
（配列ｄ）５’−ＣＴＡＴＴＧＴＴＧＧＡＴＣＡＴＡＴＴＣＧＴＣＣＡＣＡＡＡＡＴＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴＴＡＧＣＴＧＴＡＴＣＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡＣＧＣＣＡＮＣＡＧＣＴＣＣＡＡＣＴＡＣＣＡＣＡＡＧＴＴＴＡＴＡＴＴＣＡＧＴＣ−３’（配列番号４）
（配列ｅ）５’−ＴＧＧＣＧＴＡＧＧＣＡＡＧＡＧ−３’（配列番号５）
（配列ｆ）５’−ＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧ−３’（配列番号６）
【００４７】
具体的に、本実施例では、被検体となる５μＭの標的一本鎖ＤＮＡ溶液（上記配列ｄ）５μｌに、５μＭの検出用ＤＮＡ溶液（上記配列ｅ，ｆ）を５μｌ添加し、さらにイオン強度調整剤として５００ｍＭ ＮａＣｌ溶液を１０μｌ、ｐＨ緩衝剤として５ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ カコジル酸ナトリウム溶液を１０μｌ、５μＭ ＡＭＮＤ溶液を５μｌ添加し、ＭｉｌｌｉＱ水を加えて全量を５０μｌとした。得られたＤＮＡ溶液についてサーマルサイクラーを用いてアニーリング処理を行い、蛍光強度を測定した。蛍光測定には、光路長３ｍｍ×３ｍｍの蛍光測定用セルを用いた。
【００４８】
標的ＤＮＡの標的塩基ＮがＧ（グアニン），Ｃ（シトシン），Ａ（アデニン）又はＴ（チミン）である場合の蛍光消光効率（％）を図６に示す。ここで、蛍光消光効率は、標的ＤＮＡが存在しない場合の蛍光強度をＦｆｒｅｅとし、標的ＤＮＡが存在する場合の蛍光強度をＦｏｂｓとしたとき、（（Ｆｆｒｅｅ−Ｆｏｂｓ）／Ｆｆｒｅｅ）×１００で表される。また、図６における励起波長は３５０ｎｍであり、検出波長は４００ｎｍである。図６に示すように、標的塩基ＮがＣ（シトシン）である場合にのみ蛍光が著しく消光している。このように、消光の有無を検出することで、標的塩基ＮがＣ（シトシン）であるか否かを知ることができる。すなわち、ＡＭＮＤをレセプター分子として用いることにより、Ｃ（シトシン）が関与する全ての一塩基置換検出が可能である。
【００４９】
（第３の実施例）
第３の実施例では、レセプター分子として、以下の化学式に示すようなプテリジン誘導体である２−アミノ−６，７−ジメチル−４−ヒドロキシプテリジン（ＤｉＭｅ−ｐｔｅｒｉｄｉｎｅ）を用いた。
【００５０】
【化２】
【００５１】
このＤｉＭｅ−ｐｔｅｒｉｄｉｎｅは発蛍光性を示し、後述するように、２種類の検出用ＤＮＡ間のギャップ部位に挿入されたときに標的塩基と相互作用し、標的塩基の違いに基づき蛍光強度が変化するため、蛍光強度を測定することで一塩基置換を検出することができる。特に、このＤｉＭｅ−ｐｔｅｒｉｄｉｎｅは標的塩基としてのＧ（グアニン）と選択的に相互作用するため、Ｇ（グアニン）が関与する全ての一塩基置換（Ｇ／Ｃ，Ｇ／Ａ，Ｇ／Ｔ）を検出することができる。
【００５２】
本実施例では、ＤｉＭｅ−ｐｔｅｒｉｄｉｎｅによる一塩基置換検出（Ｇ／Ｃ，Ｇ／Ａ，Ｇ／Ｔ）の効果を検証するために、以下のような２３ｍｅｒの標的ＤＮＡ（配列ｇ）と上述した１１ｍｅｒの検出用ＤＮＡ（配列ｂ）とをモデル配列として準備した。ここで、配列ｇ中、ＮはＧ（グアニン），Ｃ（シトシン），Ａ（アデニン）又はＴ（チミン）を示す。なお、本実施例における配列ｇは、標的塩基Ｎの前後の配列が同じであるため、１種類の検出用ＤＮＡ（配列ｂ）を標的ＤＮＡ（配列ｇ）に対して２当量加えることで、標的塩基Ｎと対向する部位にギャップ部位を構築した。
（配列ｇ）５’−ＴＣＴＣＣＧＣＡＣＡＣＮＴＣＴＣＣＧＣＡＣＡＣ−３’（配列番号７）
【００５３】
具体的に、本実施例では、被検体となる５μＭの標的一本鎖ＤＮＡ溶液（上記配列ｇ）１０μｌに、１０μＭの検出用ＤＮＡ溶液（上記配列ｂ）を１０μｌ添加し、さらにイオン強度調整剤として５００ｍＭ ＮａＣｌ溶液を１０μｌ、ｐＨ緩衝剤として５ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ カコジル酸ナトリウム溶液を１０μｌ、１μＭ ＤｉＭｅ−ｐｔｅｒｉｄｉｎｅ溶液を５μｌ添加し、ＭｉｌｌｉＱ水を加えて全量を５０μｌとした。得られたＤＮＡ溶液についてサーマルサイクラーを用いてアニーリング処理を行い、蛍光強度を測定した。蛍光測定には、光路長３ｍｍ×３ｍｍの蛍光測定用セルを用いた。
【００５４】
標的ＤＮＡの標的塩基ＮがＧ（グアニン），Ｃ（シトシン），Ａ（アデニン）又はＴ（チミン）である場合の蛍光消光効率（％）を図７に示す。ここで、図７における励起波長は３４３ｎｍであり、検出波長は４３５ｎｍである。図７に示すように、標的塩基ＮがＧ（グアニン）である場合にのみ蛍光が著しく消光している。このように、消光の有無を検出することで、標的塩基ＮがＧ（グアニン）であるか否かを知ることができる。すなわち、ＤｉＭｅ−ｐｔｅｒｉｄｉｎｅをレセプター分子として用いることにより、Ｇ（グアニン）が関与する全ての一塩基置換検出が可能である。
【００５５】
（第４の実施例）
第４の実施例では、レセプター分子として、以下の化学式に示すようなアミロライド（Ｎ−ａｍｉｄｉｎｏ−３，５−ｄｉａｍｉｎｏ−６−ｃｈｌｏｒｏｐｙｒａｚｉｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を用いた。
【００５６】
【化３】
【００５７】
このアミロライドは発蛍光性を示し、後述するように、２種類の検出用ＤＮＡ間のギャップ部位に挿入されたときに標的塩基と相互作用し、標的塩基の違いに基づき蛍光強度が変化するため、蛍光強度を測定することで一塩基置換を検出することができる。特に、このアミロライドは標的塩基としてのＴ（チミン）と選択的に相互作用するため、Ｔ（チミン）が関与する全ての一塩基置換（Ｔ／Ｇ，Ｔ／Ｃ，Ｔ／Ａ）を検出することができる。
【００５８】
本実施例では、アミロライドによる一塩基置換検出（Ｔ／Ｇ，Ｔ／Ｃ，Ｔ／Ａ）の効果を検証するために、上述した２３ｍｅｒの標的ＤＮＡ（配列ｇ）と上述した１１ｍｅｒの検出用ＤＮＡ（配列ｂ）とをモデル配列として準備した。なお、本実施例においても、１種類の検出用ＤＮＡ（配列ｂ）を標的ＤＮＡ（配列ｇ）に対して２当量加えることで、標的塩基Ｎと対向する部位にギャップ部位を構築した。
【００５９】
具体的に、本実施例では、被検体となる５μＭの標的一本鎖ＤＮＡ溶液（上記配列ｇ）１０μｌに、１０μＭの検出用ＤＮＡ溶液（上記配列ｂ）を１０μｌ添加し、さらにイオン強度調整剤として５００ｍＭ ＮａＣｌ溶液を１０μｌ、ｐＨ緩衝剤として５ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ カコジル酸ナトリウム溶液を１０μｌ、１μＭ アミロライド溶液を５μｌ添加し、ＭｉｌｌｉＱ水を加えて全量を５０μｌとした。得られたＤＮＡ溶液についてサーマルサイクラーを用いてアニーリング処理を行い、蛍光強度を測定した。蛍光測定には、光路長３ｍｍ×３ｍｍの蛍光測定用セルを用いた。
【００６０】
標的ＤＮＡの標的塩基ＮがＧ（グアニン），Ｃ（シトシン），Ａ（アデニン）又はＴ（チミン）である場合の蛍光消光効率（％）を図８に示す。ここで、図８における励起波長は３６１ｎｍであり、検出波長は４１５ｎｍである。図８に示すように、標的塩基ＮがＴ（チミン）である場合にのみ蛍光が著しく消光している。このように、消光の有無を検出することで、標的塩基ＮがＴ（チミン）であるか否かを知ることができる。すなわち、アミロライドをレセプター分子として用いることにより、Ｔ（チミン）が関与する全ての一塩基置換検出が可能である。
【００６１】
（第５の実施例）
第５の実施例では、レセプター分子として第１の実施例と同様のＡＭＮＤを用いて、ＰＣＲ産物への適用性を評価した。
【００６２】
本実施例では、ＡＭＮＤによるＰＣＲ産物への適用性を検証するために、上述した１０７ｍｅｒの標的ＤＮＡ（配列ｄ）と上述したそれぞれ１５ｍｅｒの検出用ＤＮＡ（配列ｅ，ｆ）とをモデル配列として準備した。
【００６３】
ここで、本実施例における標的ＤＮＡ（配列ｄ）は、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のｃｏｄｏｎ１２を含む領域で、以下のようなフォワードプライマー（配列ｈ）及びリバースプライマー（配列ｉ）を用いて、そのアンチセンス鎖を増幅したものである。
（配列ｈ）５’−ＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧ−３’（配列番号８）
（配列ｉ）５’−ＣＴＡＴＴＧＴＴＧＧＡＴＣＡＴＡＴＴＣＧ−３’（配列番号９）
【００６４】
ＰＣＲ溶液は、ＴａＫａＲａ Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社製）のプロトコルを参考にして調製した。ＰＣＲ反応溶液の組成は以下の通りである。
フォワードプライマー ２０ｐｍｏｌ（最終濃度０．２μＭ）
リバースプライマー ３００ｐｍｏｌ（最終濃度３．０μＭ）
標的ＤＮＡ（配列ｄ） ０．５ｎｇ
ＴａＫａＲａ Ｔａｑ（ＤＮＡポリメラーゼ） ２．５Ｕ
１０×ＰＣＲバッファ １０μｌ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ８μｌ
【００６５】
これらを０．２ｍｌ ＰＣＲチューブ中で混合し、さらにオートクレイブ処理したＭｉｌｌｉＱ水を加えて全量１００μｌとした。そして、９４℃・５分→（９４℃・３０秒→５２℃・３０秒→７２℃・３０秒）×４０サイクル→７２℃・７分→４℃まで冷却、というプロトコルでＰＣＲ反応を行い、標的ＤＮＡ（配列ｄ）を増幅した。
【００６６】
上述したＰＣＲ反応を行った後、このＰＣＲ反応溶液４０μｌに、ｐＨ緩衝剤（２Ｍ カコジル酸ナトリウム、３３ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ＝７．０）を２．５μｌ、それぞれ１００μＭの検出用ＤＮＡ溶液（上記配列ｅ，ｆ）を２．５μｌ、１μＭのＡＭＮＤ溶液を５μｌ添加し、全量を５０μｌとした。得られたＤＮＡ溶液について、光路長３ｍｍ×３ｍｍの蛍光測定用セルを用いて蛍光強度を測定した。なお、測定温度は５℃である。
【００６７】
標的ＤＮＡの標的塩基ＮがＧ（グアニン），Ｃ（シトシン），Ａ（アデニン）又はＴ（チミン）である場合の蛍光消光効率（％）を図９に示す。ここで、図９における励起波長は３５０ｎｍであり、検出波長は４００ｎｍである。図９に示すように、標的塩基ＮがＣ（シトシン）である場合にのみ蛍光が著しく消光している。このように、消光の有無を検出することで、標的塩基ＮがＣ（シトシン）であるか否かを知ることができる。また、本実施例では、ＤＮＡポリメラーゼやｄＮＴＰなどの除去作業や精密な温度制御などが一切不要であるため、ＰＣＲ産物の迅速且つ簡便な解析が可能である。
【００６８】
（第６の実施例）
第６の実施例では、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法による一塩基置換検出について評価した。レセプター分子としては、以下の化学式に示すようなＡＭＮＤ−ＤＰＡ（Ｎ−（３−Ａｍｉｎｏ−ｐｒｏｐｙｌ）−Ｎ’−（７−ｍｅｔｈｙｌ−［１，８］ｎａｐｈｔｈｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ）−ｐｒｏｐａｎｅ−１，３−ｄｉａｍｉｎｅ）を用い、これを金基板上に固定化したセンサーチップ（マイクロアレイ）を作製した。
【００６９】
【化４】
【００７０】
ＡＭＮＤ−ＤＰＡは、金基板上に固定化するためにアミノ基を末端に有するアルキル鎖をＡＭＮＤの基本骨格に導入したもので、２，６−ジアミノピリジンから合成したものである。このＡＭＮＤ−ＤＰＡは、金基板上において２種類の検出用ＤＮＡの間のギャップ部位に挿入されたときにＣ（シトシン）と選択的に相互作用する。この際、標的塩基の違いに基づきＳＰＲの信号強度が変化するため、信号強度を測定することでＣ（シトシン）が関与する全ての一塩基置換（Ｃ／Ｔ，Ｃ／Ｇ，Ｃ／Ａ）を検出することができる。
【００７１】
本実施例では、ＡＭＮＤ−ＤＰＡを固定化したセンサーチップによる一塩基置換検出の効果を検証するために、上述した２３ｍｅｒの標的ＤＮＡ（配列ｇ）と上述した１１ｍｅｒの検出用ＤＮＡ（配列ｂ）とをモデル配列として準備した。なお、本実施例においても、１種類の検出用ＤＮＡ（配列ｂ）を標的ＤＮＡ（配列ｇ）に対して２当量加えることで、標的塩基Ｎと対向する部位にギャップ部位を構築した。
【００７２】
具体的に、本実施例では、被検体となる２５μＭの標的ＤＮＡ溶液（上記配列ｇ）１０μｌに、２０μＭの検出用ＤＮＡ溶液（上記配列ｂ）を２０μｌ添加し、さらにＰＢＳ−ＥＰバッファ（０．６７Ｍ リン酸緩衝溶液、１．５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ ２０、ｐＨ＝６．４）を加えて全量を５００μｌとした。さらに、得られたＤＮＡ溶液についてサーマルサイクラーを用いてアニーリング処理した。
【００７３】
また、センサーチップとしてはセンサーチップＣＭ５（ビアコア株式会社製）を用い、ＡＭＮＤ−ＤＰＡのセンサーチップへの固定化は、アミンカップリングキット（ビアコア株式会社製）を用いて行った。具体的には、センサーチップＣＭ５に５０μｌのＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）／ＥＤＣ（Ｎ−ｅｔｈｙｌ−Ｎ’−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）水溶液をインジェクトし、センサーチップ表面のカルボキシル基をＮＨＳで活性化した。続いて、０．２０ｍｇ／ｍｌ（０．７３ｍＭ）のＡＭＮＤ−ＤＰＡ溶液（１０ｍＭ 酢酸緩衝液で希釈したもの、ｐＨ＝５．５）をインジェクトし、ＡＭＮＤ−ＤＰＡを基板上に固定化した。その後、１Ｍ エタノールアミン水溶液５０μｌをインジェクトすることによって、残存する活性ＮＨＳ基をブロッキングし、さらに８ｍＭ ＮａＯＨ水溶液６０μｌを用いて基板を洗浄した。
【００７４】
標的ＤＮＡの標的塩基ＮがＧ（グアニン），Ｃ（シトシン），Ａ（アデニン）又はＴ（チミン）である場合のＳＰＲの信号強度（ＲＵ：Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｕｎｉｔ）を図１０に示す。ここで、ＳＰＲ測定に用いたＤＮＡ溶液量は９０μｌであり、これを３０μｌ／分の流速でインジェクトした。図１０は、インジェクトの後、１８０秒後のＳＰＲ信号強度を示したものである。なお、ＡＭＮＤ−ＤＰＡの固定化量は約０．２０ｎｇ／ｍｍ２であり、測定温度は５℃である。
【００７５】
図１０に示すように、標的塩基ＮがＣ（シトシン）である場合にＳＰＲ信号強度が最大となっている。これは、ＡＭＮＤ−ＤＰＡがギャップ部位に隣接する核酸塩基とスタッキングし、さらに標的塩基（Ｃ）との水素結合形成により安定な会合体を形成し、その結果、金属板表面近傍の誘電率が変化するためと考えられる。このように、ＳＰＲの信号強度を検出することで、標的塩基ＮがＣ（シトシン）であるか否かを知ることができる。すなわち、ＡＭＮＤ−ＤＰＡを固定化したセンサーチップを用いることにより、Ｃ（シトシン）が関与する全ての一塩基置換検出が可能である。
【００７６】
（第７の実施例）
第７の実施例では、第６の実施例と同様に、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法による一塩基置換検出について評価した。レセプター分子としては、以下の化学式に示すようなＡｃＭＮＤ−Ｃ５Ａ（６−Ａｍｉｎｏ−ｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ（７−ｍｅｔｈｙｌ−［１，８］ｎａｐｈｔｈｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ）−ａｍｉｄｅ）を用い、これを金基板上に固定化したセンサーチップを作製した。
【００７７】
【化５】
【００７８】
ＡｃＭＮＤ−Ｃ５Ａは、金基板上に固定化するためにアミノ基を末端に有するアルキル鎖をＡＭＮＤの基本骨格に導入したもので、２，６−ジアミノピリジンから合成したものである。このＡｃＭＮＤ−Ｃ５Ａは、金基板上において２種類の検出用ＤＮＡの間のギャップ部位に挿入されたときにＧ（グアニン）と選択的に相互作用する。この際、標的塩基の違いに基づきＳＰＲの信号強度が変化するため、信号強度を測定することでＧ（グアニン）が関与する全ての一塩基置換（Ｇ／Ｃ，Ｇ／Ａ，Ｇ／Ｔ）を検出することができる。
【００７９】
本実施例では、ＡｃＭＮＤ−Ｃ５Ａを固定化したセンサーチップによる一塩基置換検出の効果を検証するために、上述した２３ｍｅｒの標的ＤＮＡ（配列ｇ）と上述した１１ｍｅｒの検出用ＤＮＡ（配列ｂ）とをモデル配列として準備した。なお、本実施例においても、１種類の検出用ＤＮＡ（配列ｂ）を標的ＤＮＡ（配列ｇ）に対して２当量加えることで、標的塩基Ｎと対向する部位にギャップ部位を構築した。
【００８０】
具体的に、本実施例では、被検体となる２００μＭの標的ＤＮＡ溶液（上記配列ｇ）５μｌに、４００μＭの検出用ＤＮＡ溶液（上記配列ｂ）を５μｌ添加し、さらにＰＢＳ−ＥＰバッファ（０．６７Ｍ リン酸緩衝溶液、１．５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ ２０、ｐＨ＝６．４）を加えて全量を５００μｌとした。さらに、得られたＤＮＡ溶液についてサーマルサイクラーを用いてアニーリング処理した。
【００８１】
また、センサーチップとしてはセンサーチップＣＭ５（ビアコア株式会社製）を用い、ＡｃＭＮＤ−Ｃ５Ａのセンサーチップへの固定化は、アミンカップリングキット（ビアコア株式会社製）を用いて行った。具体的には、センサーチップＣＭ５に５０μｌのＮＨＳ／ＥＤＣ水溶液をインジェクトし、センサーチップ表面のカルボキシル基をＮＨＳで活性化した。続いて、１．０ｍｇ／ｍｌ（３．７ｍＭ）のＡｃＭＮＤ−Ｃ５Ａ溶液（１０ｍＭ 酢酸緩衝液で希釈したもの、ｐＨ＝５．５）をインジェクトし、ＡｃＭＮＤ−Ｃ５Ａを基板上に固定化した。その後、１Ｍ エタノールアミン水溶液５０μｌをインジェクトすることによって、残存する活性ＮＨＳ基をブロッキングし、さらに８ｍＭ ＮａＯＨ水溶液６０μｌを用いて基板を洗浄した。
【００８２】
標的ＤＮＡの標的塩基ＮがＧ（グアニン），Ｃ（シトシン），Ａ（アデニン）又はＴ（チミン）である場合のＳＰＲの信号強度（ＲＵ：Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｕｎｉｔ）を図１１に示す。ここで、ＳＰＲ測定に用いたＤＮＡ溶液量は６０μｌであり、これを２０μｌ／分の流速でインジェクトした。図１１は、インジェクトの後、１８０秒後のＳＰＲ信号強度を示したものである。なお、ＡｃＭＮＤ−Ｃ５Ａの固定化量は約１．６ｎｇ／ｍｍ２であり、測定温度は５℃である。
【００８３】
図１１に示すように、標的塩基ＮがＧ（グアニン）である場合にＳＰＲ信号強度が最大となっている。これは、ＡｃＭＮＤ−Ｃ５Ａがギャップ部位に隣接する核酸塩基とスタッキングし、さらに標的塩基（Ｇ）との水素結合形成により安定な会合体を形成し、その結果、金属板表面近傍の誘電率が変化するためと考えられる。このように、ＳＰＲの信号強度を検出することで、標的塩基ＮがＧ（グアニン）であるか否かを知ることができる。すなわち、ＡｃＭＮＤ−Ｃ５Ａを固定化したセンサーチップを用いることにより、Ｇ（グアニン）が関与する全ての一塩基置換検出が可能である。
【００８４】
以上、具体的な実施例からも分かるように、本実施の形態における遺伝子変異検出方法によれば、連続した１以上の塩基からなる標的塩基１１を有する一本鎖の標的核酸１０と、この標的塩基１１を挟む２種類の部分配列について相補的な２種類の一本鎖の検出用核酸２０ａ，２０ｂとで二本鎖核酸を形成し、この二本鎖核酸に水素結合性及び発蛍光性を示すレセプター分子３０を添加して標的塩基１１と水素結合を形成させ、レセプター分子３０と結合した二本鎖核酸の蛍光強度を測定することにより、一塩基置換等の遺伝子変異を効果的に検出することができる。
【００８５】
特に、被検体となる標的核酸１０のラベル化や熱制御等の煩雑な操作が不要であるため工程数が非常に少なく、また、原理上二本鎖ＤＮＡ自体の熱的な安定性に依存しないため、検出までの時間が非常に短時間であり、再現性にも優れている。また、ＵＶランプを用いた目視による確認も可能であるため、特別な設備を持たない状況下においても検出が可能である。
【００８６】
さらに、レセプター分子３０又は検出用核酸２０ａを基板上に多数集積したセンサーチップ（マイクロアレイ）を作製し、遺伝子変異検出用キットとして用いることで、従来の欠点を克服したハイスループットな検出が可能となる。
【００８７】
なお、上述した実施の形態では、標的塩基を挟む２種類の部分配列と相補的な２種類の検出用核酸と標的核酸とをハイブリダイゼーションさせることで、意図的にギャップ部位を導入したが、このギャップ部位は、ＤＮＡの修復過程にも生じることが知られている（文献「Ｅｒｌｉｎｇ Ｓｅｅｂｅｒｇ，Ｌａｒｓ Ｅｉｄｅ ａｎｄ Ｍａｇｎａｒ Ｂｊｏｒａｓ，Ｔｒｅｎｄ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１９９５，２０（１０），ｐｐ．３９１−３９７」を参照。）。そこで、図２に示したようにレセプター分子が固定化された基板に二本鎖ＤＮＡ溶液を滴下して反応させることで、ＤＮＡの損傷の有無を検出することも可能である。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
上述した本発明によれば、標的核酸と２種類の検出用核酸とで二本鎖核酸を形成して標的塩基と対向する位置にギャップ部位を構築し、このギャップ部位に挿入されたレセプターと標的塩基とで水素結合を形成させることにより、標的塩基に生じた一塩基置換等の遺伝子変異を効果的に検出することができる。
【００８９】
また、レセプター又は２種類の検出用核酸の一方を基板上に固定化し、遺伝子変異検出用キットとして用いることで、従来の欠点を克服したハイスループットな検出が可能となる。
【０００１】
本発明は、バイオインフォマティクス（生命情報科学）分野において特に有用な遺伝子変異検出方法及びその方法を用いた遺伝子変異検出用キットに関し、特に遺伝子配列における一塩基置換等を簡便且つ迅速に検出する遺伝子変異検出方法及び遺伝子変異検出用キットに関する。
【０００２】
本出願は、日本国において２００４年３月１９日に出願された日本特許出願番号２００４−０８０７０３を基礎として優先権を主張するものであり、この出願は参照することにより、本出願に援用される。
【背景技術】
【０００３】
ヒトゲノム配列が解読された今日の研究目標の１つは、遺伝子の同定、機能の解析、さらに遺伝子発現や機能に影響して個体差を決める遺伝子の多様性である。ここで、核酸塩基配列中の一塩基の違いから生じる遺伝子の個体差のことを一塩基変異と呼ぶ。この一塩基変異の中でも頻度の多い変異のことを一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＳＮＰ）と呼び、遺伝子中に点在するＳＮＰが各種疾患と強く関連することが明らかとなっている。
【０００４】
現在、ＳＮＰを含む遺伝子変異の検出方法としては、制限酵素で切断したＤＮＡ断片をゲルにより分離した後、色素でＤＮＡ断片を染色・検出するという電気泳動法が挙げられる。この方法は汎用されているものの、分離や染色に必要な時間が長く、迅速性に欠けるという問題があった。
【０００５】
また、マイクロアレイ技術によって所定のＤＮＡが微細配列された、いわゆるＤＮＡチップと呼ばれるバイオアッセイ用の集積基板も、遺伝子変異の検出に利用され始めている。このＤＮＡチップは、ガラス基板やシリコン基板上に多種多数のＤＮＡオリゴヌクレオチド鎖やｃＤＮＡ等が集積されていることから、一度に多数の遺伝子検査が可能であり、臨床検査現場等への適用が期待されている。しかしながら、核酸塩基のミスマッチ形成に由来する二本鎖ＤＮＡの安定性を原理とする手法であるため、塩基配列によってはその温度制御が困難であり、さらに放射性物質や蛍光色素を被検体自体に修飾する前処理が必要である等の問題があった。
【０００６】
さらに、被検体の増幅と検出を同時に行うリアルタイムＰＣＲ法が、核酸増幅法による一段階の迅速な定量測定の技術として、近年普及しつつある。しかしながら、増幅反応における複雑な温度制御、プローブの導入も含めた各遺伝子配列に適用するプライマーの設計が複雑である上に、増幅装置や条件によって結果が異なる場合も少なからずあり、再現性の面においても課題を残している。また、シグナルの経時変化を利用して検出を行うため、若干操作性に欠けるという問題があった。
【０００７】
このように、従来の遺伝子変異を検出する技術は、精密な温度制御や煩雑な被検体の前処理が必要である、或いは測定までの時間が長い等の問題があり、簡便且つ迅速に遺伝子検査を行うことが不可能であった。
【０００８】
そこで、本件発明者らは、文献「Ｋ．Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ，Ｓ．Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ｍ．Ｍｉｎａｇａｗａ ａｎｄ Ｎ．Ｔｅｒａｍａｅ，“Ｕｓｅ ｏｆ Ａｂａｓｉｃ Ｓｉｔｅ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＤＮＡ Ｓｔｒａｎｄｓ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｉｎ Ｗａｔｅｒ”，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００３，１２５，ｐｐ．８９８２−８９８３」（以下、文献１という。）において、一塩基置換部位を有する一本鎖の標的ＤＮＡと、この標的ＤＮＡと相補的であり、且つ一塩基置換部位に対応する対応塩基を除いて脱塩基部位（ＡＰ ｓｉｔｅ）とした一本鎖の検出用ＤＮＡとで二本鎖核酸を形成させ、この二本鎖核酸に水素結合性及び発蛍光性を有するレセプター分子を添加して一塩基置換部位と水素結合を形成させ、このレセプター分子の蛍光強度変化を測定することにより、一塩基置換を効果的に検出する技術を提案している。
【０００９】
この文献１記載の技術は、被検体となる標的ＤＮＡのラベル化や熱制御等の煩雑な操作が原則的に不要であるため工程数が非常に少なく、また、原理上二本鎖ＤＮＡ自体の熱的な安定性に依存しないため、検出までの時間が非常に短時間であり、再現性にも優れている。また、ＵＶランプを用いた目視による確認も可能であるため、特別な設備を持たない状況下においても検出が可能である。
【００１０】
しかしながら、この文献１記載の技術では、検出用ＤＮＡを蛍光標識する等の化学修飾は必要ないものの、脱塩基部位という特殊な部位を導入する必要があり、これが厳密な意味では化学修飾に相当してしまうという問題があった。また、脱塩基部位を導入するため、検出用ＤＮＡを合成する際のコストが高くなるという問題があった。
【発明の開示】
【００１１】
本発明は、このような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、標的ＤＮＡ及び検出用ＤＮＡに対する化学修飾を行うことなく、簡便且つ迅速に遺伝子変異を検出する遺伝子変異検出方法及び遺伝子変異検出用キットを提供することを目的とする。
【００１２】
上述した目的を達成するために、本発明に係る遺伝子変異検出方法は、１塩基からなる標的塩基を有する一本鎖の標的核酸と、上記標的塩基を挟む２種類の部分配列について相補的な２種類の一本鎖の検出用核酸とで、二本鎖核酸を形成する工程と、上記二本鎖核酸に水素結合性及び発蛍光性を示すレセプターを挿入させ、上記標的塩基と水素結合を形成させる工程と、上記レセプターが挿入された上記二本鎖核酸の蛍光強度を測定する工程とを有する。
【００１３】
また、上述した目的を達成するために、本発明に係る遺伝子変異検出用キットは、１塩基からなる標的塩基を有する一本鎖の標的核酸における上記標的塩基を挟む２種類の部分配列について相補的な２種類の一本鎖の検出用核酸と、水素結合性及び発蛍光性を示し、上記標的核酸と２種類の上記検出用核酸とで形成された二本鎖核酸に挿入されて上記標的塩基と水素結合を形成するレセプターとを有する。
【００１４】
このような遺伝子変異検出方法及び遺伝子変異検出用キットでは、標的核酸と２種類の検出用核酸とで二本鎖核酸を形成することにより二本鎖核酸に意図的にギャップ部位を構築し、この二本鎖核酸に水素結合性及び発蛍光性を示すレセプターを添加してギャップ部位にレセプターを挿入させ、標的塩基と水素結合を形成させた後、レセプターが挿入された二本鎖核酸の蛍光強度を測定することにより、標的塩基に生じた遺伝子変異を検出する。
【００１５】
なお、上記レセプターとしては、例えばナフチリジン誘導体、キノリン誘導体、プテリジン誘導体、クマリン誘導体、インダゾール誘導体、アロキサジン誘導体、或いはアミロライドが使用可能である。
【００１６】
ここで、上記レセプターは、基板に固定化されていても構わない。
【００１７】
すなわち、上述した目的を達成するために、本発明に係る遺伝子変異検出方法は、水素結合性を示すレセプターが固定化された基板に、１塩基からなる標的塩基を有する一本鎖の標的核酸と上記標的塩基を挟む２種類の部分配列について相補的な２種類の一本鎖の検出用核酸とを滴下することにより、上記標的核酸と２種類の上記検出用核酸とで二本鎖核酸を形成させると共に、上記標的塩基と上記レセプターとで水素結合を形成させる工程と、上記標的塩基と上記レセプターとの結合に基づいて上記標的塩基を識別する工程とを有する。
【００１８】
また、上述した目的を達成するために、本発明に係る遺伝子変異検出用キットは、１塩基からなる標的塩基を有する一本鎖の標的核酸における上記標的塩基を挟む２種類の部分配列について相補的な２種類の一本鎖の検出用核酸と、水素結合性を示し、上記標的核酸と２種類の上記検出用核酸とで形成された二本鎖核酸に挿入されて上記標的塩基と水素結合を形成するレセプターと、上記レセプターが固定化された基板とを有する。
【００１９】
このような遺伝子変異検出方法及び遺伝子変異検出用キットでは、標的核酸と２種類の検出用核酸とで二本鎖核酸を形成することにより二本鎖核酸に意図的にギャップ部位を構築し、水素結合性を示すレセプターが固定化された基板にこの二本鎖核酸を滴下することによりギャップ部位にレセプターを挿入させて標的塩基と水素結合を形成させた後、標的塩基とレセプターとの結合に基づいて標的塩基に生じた遺伝子変異を検出する。この場合、レセプターが発蛍光性を示すものであればレセプターが挿入された二本鎖核酸の蛍光強度変化に基づいて標的塩基を識別することができる。また、標的塩基とレセプターとの結合に基づく表面プラズモン共鳴の信号強度変化、又は水晶振動子の共振周波数変化に基づいて標的塩基を識別することも可能である。
【００２０】
また、上記２種類の検出用核酸の一方は、基板に固定化されていても構わない。
【００２１】
すなわち、上述した目的を達成するために、本発明に係る遺伝子変異検出方法は、１塩基からなる標的塩基を有する一本鎖の標的核酸における上記標的塩基を挟む２種類の部分配列について相補的な２種類の一本鎖の検出用核酸のうち一方の検出用核酸が固定化された基板に、上記標的核酸と、他方の検出用核酸と、水素結合性を示すレセプターとを滴下することにより、上記標的核酸と２種類の上記検出用核酸とで二本鎖核酸を形成させると共に、上記標的塩基と上記レセプターとで水素結合を形成させる工程と、上記標的塩基と上記レセプターとの結合に基づいて上記標的塩基を識別する工程とを有する。
【００２２】
また、上述した目的を達成するために、本発明に係る遺伝子変異検出用キットは、１塩基からなる標的塩基を有する一本鎖の標的核酸における上記標的塩基を挟む２種類の部分配列について相補的な２種類の一本鎖の検出用核酸と、水素結合性を示し、上記標的核酸と２種類の上記検出用核酸とで形成された二本鎖核酸に挿入されて上記標的塩基と水素結合を形成するレセプターと、２種類の上記検出用核酸の一方が固定化された基板とを有する。
【００２３】
このような遺伝子変異検出方法及び遺伝子変異検出用キットでは、２種類の検出用核酸のうち一方の検出用核酸が固定化された基板に、標的核酸と、他方の検出用核酸と、水素結合性を示すレセプターとを滴下することにより、標的核酸と２種類の検出用核酸とで二本鎖核酸を形成させて二本鎖核酸に意図的にギャップ部位を構築し、このギャップ部位にレセプターを挿入させて標的塩基と水素結合を形成させた後、標的塩基とレセプターとの結合に基づいて標的塩基に生じた遺伝子変異を検出する。この場合、レセプターが発蛍光性を示すものであれば、レセプターが挿入された二本鎖核酸の蛍光強度変化に基づいて標的塩基を識別することができる。
【００２４】
本発明のさらに他の目的、本発明によって得られる具体的な利点は、以下に説明される実施例の説明から一層明らかにされるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
図１は、本実施の形態における遺伝子変異検出の原理を説明する図である。
図２は、レセプター分子が基板に固定化されている場合の遺伝子変異検出の原理を説明する図である。
図３は、検出用核酸の一方が基板に固定化されている場合の遺伝子変異検出の原理を説明する図である。
図４は、標的塩基がグアニン、シトシンである場合について、ＡＭＮＤ添加後の蛍光スペクトルを示す図である。
図５は、標的塩基がグアニン、シトシンである場合について、ＡＭＮＤ添加後の蛍光を示す図である。
図６は、標的塩基がグアニン、シトシン、アデニン、チミンである場合について、ＡＭＮＤ添加後の蛍光消光効率を示す図である。
図７は、標的塩基がグアニン、シトシン、アデニン、チミンである場合について、ＤｉＭｅ−ｐｔｅｒｉｄｉｎｅ添加後の蛍光消光効率を示す図である。
図８は、標的塩基がグアニン、シトシン、アデニン、チミンである場合について、アミロライド添加後の蛍光消光効率を示す図である。
図９は、ＰＣＲ増幅した標的核酸の標的塩基がグアニン、シトシン、アデニン、チミンである場合について、ＡＭＮＤ添加後の蛍光消光効率を示す図である。
図１０は、標的塩基がグアニン、シトシン、アデニン、チミンである場合について、ＡＭＮＤ−ＤＰＡを固定化したセンサーチップのＳＰＲ信号強度を示す図である。
図１１は、標的塩基がグアニン、シトシン、アデニン、チミンである場合について、ＡｃＭＮＤ−Ｃ５Ａを固定化したセンサーチップのＳＰＲ信号強度を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
一般に、水素結合を利用する核酸塩基認識では、レセプター分子の水素結合様式や数を変化させることで、比較的容易に高い塩基選択性を獲得できる特徴を持つ。この際、完全水溶液中では水素結合形成に基づく認識機能の発現は期待できないため、従来の研究の多くは、クロロホルム中のような無極性溶媒環境下に限定されていたが、溶媒中の核酸が変性、沈殿する要因ともなっていた。
【００２７】
そこで、本実施の形態では、図１に概念的に示すように、ＳＮＰ等に関連する標的塩基１１を有する一本鎖の標的核酸１０を含む溶液と、標的塩基１１を挟む部分配列について相補的な２種類の一本鎖の検出用核酸２０ａ，２０ｂを含む溶液とを混合し、標的核酸１０と検出用核酸２０ａ，２０ｂとをハイブリダイゼーションさせることで、標的塩基１１と対向する部位に意図的にギャップ部位２１を構築する。そして、疎水場空間であるこのギャップ部位２１に水素結合性を示すレセプター分子３０を挿入し、標的塩基１１と水素結合を形成させる。
【００２８】
このように、疎水場空間であるギャップ部位２１に水素結合性を示すレセプター分子３０を挿入し、標的塩基１１と水素結合を形成させることで、完全水溶液中においても効果的に核酸塩基認識を行い、標的塩基１１の変異を検出することができる。
【００２９】
また、標的核酸１０の複数塩基を挟む部分配列について相補的な２種類の一本鎖の検出用核酸２０ａ，２０ｂを含む溶液を用いるようにすれば、複数塩基の変異を検出することができる。この場合、例えば２塩基分をギャップ部位２１とすると、このギャップ部位２１には２分子のレセプター分子３０が挿入される。
【００３０】
ここで、本実施の形態で分析可能な標的核酸１０としては、例えばヒトを含む哺乳類や植物由来のＤＮＡ、ｃＤＮＡ等が挙げられるが、特に限定されず、必要に応じて希釈、濃縮、増幅を行う。
【００３１】
また、水素結合性を示すレセプター分子３０としては、水素結合部位を有し、発蛍光性を示す試薬が望ましい。具体的には、水素結合部位を少なくとも一段、好ましくは複数段有し、ギャップ部位２１に隣接する核酸塩基とスタッキングできるような複素環式芳香族基を有する試薬が望ましい。特に水溶性の試薬が好ましいが、非水溶性の場合には有機溶媒を微量用いることにより、対応が可能である。このようなレセプター分子３０としては、例えばナフチリジン誘導体、キノリン誘導体、プテリジン誘導体、クマリン誘導体、インダゾール誘導体、アロキサジン誘導体、或いはアミロライド等が挙げられる。
【００３２】
なお、上述の例では、遊離した標的核酸１０と遊離した検出用核酸２０ａ，２０ｂとを溶液中で反応させるものとして説明したが、これに限定されるものではない。
【００３３】
例えば、図２に模式的に示すように、リンカー分子４１を介してレセプター分子３０を基板４０に固定化し、この基板４０上に標的核酸１０及び検出用核酸２０ａ，２０ｂを含む溶液を滴下するようにしても構わない。また、図３に模式的に示すように、リンカー分子４１を介して検出用核酸２０ａを基板４０に固定化し、この基板４０上に標的核酸１０及び検出用核酸２０ｂとレセプター分子３０とを含む溶液を滴下するようにしても構わない。
【００３４】
このようにして、レセプター分子３０又は検出用核酸２０ａを基板４０上に多数集積したセンサーチップ（マイクロアレイ）を作製し、遺伝子変異検出用キットとして用いることで、従来の欠点を克服したハイスループットな検出が可能となる。
【００３５】
図２に示す構成の場合、蛍光強度の変化ではなく、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ；ＳＰＲ）の信号強度の変化を利用して遺伝子変異を検出することも可能である（例えば文献「Ｋａｚｕｈｉｋｏ Ｎａｋａｔａｎｉ，Ｓｈｉｎｓｕｋｅ Ｓａｎｄｏ，ａｎｄ Ｉｓａｏ Ｓａｉｔｏ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００１，１９，ｐｐ．５１−５５」、文献「Ａｋｉｏ Ｋｏｂｏｒｉ，Ｓｏｕｔａ Ｈｏｒｉｅ，Ｈｉｔｏｓｈｉ Ｓｕｄａ，Ｉｓａｏ Ｓａｉｔｏ，ａｎｄ Ｋａｚｕｈｉｋｏ Ｎａｋａｔａｎｉ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００４，１２６，ｐｐ．５５７−５６２」を参照。）。また、図２に示す構成の場合、水晶振動子の共振周波数の変化を利用して遺伝子変異を検出することも可能である。
【００３６】
以下、本発明の具体的な実施例について図面を参照しながら詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能であることは勿論である。
【実施例】
【００３７】
（第１の実施例）
第１の実施例では、レセプター分子として、以下の化学式に示すようなナフチリジン誘導体である２−アミノ−７−メチル−１，８−ナフチリジン（ＡＭＮＤ）を用いた。このＡＭＮＤは、文献「Ｅ．Ｖ．Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．３０，ｐ１６０７，１９６５」を参考にして、２，６−ジアミノピリジンから合成したものである。
【００３８】
【化１】
このＡＭＮＤは発蛍光性を示し、後述するように、２種類の検出用ＤＮＡ間のギャップ部位に挿入されたときに標的塩基と相互作用し、標的塩基の違いに基づき蛍光強度が変化するため、蛍光強度を測定することで一塩基置換を検出することができる。特に、このＡＭＮＤは標的塩基としてのＣ（シトシン）と選択的に相互作用するため、Ｃ（シトシン）が関与する全ての一塩基置換（Ｃ／Ｔ，Ｃ／Ｇ，Ｃ／Ａ）を検出することができる。
【００４０】
ここで、ＤＮＡとＡＭＮＤとを混合する際、ＡＭＮＤは、該ＡＭＮＤを含有する溶液の形態で混合してもよく、粉末や固形状の形態で混合してもよい。また、蛍光測定は、ＵＶランプを用いて目視で行ってもよく、蛍光分光器、蛍光顕微鏡、デンシトメーター等の機器を用いてもよい。
【００４１】
本実施例では、ＡＭＮＤによる一塩基置換検出（Ｃ／Ｇ）の効果を検証するために、以下のような２３ｍｅｒの標的ＤＮＡ（配列ａ）とそれぞれ１１ｍｅｒの２種類の検出用ＤＮＡ（配列ｂ，ｃ）とをモデル配列として準備した。ここで、配列ａ中、ＳはＧ（グアニン）又はＣ（シトシン）を示す。
（配列ａ）５’−ＴＣＴＣＣＧＣＡＣＡＣＳＴＣＴＣＣＣＣＡＣＡＣ−３’（配列番号１）
（配列ｂ）５’−ＧＴＧＴＧＣＧＧＡＧＡ−３’（配列番号２）
（配列ｃ）５’−ＧＴＧＴＧＧＧＧＡＧＡ−３’（配列番号３）
【００４２】
具体的に、本実施例では、被検体となる６００μＭの標的ＤＮＡ溶液（上記配列ａ）とそれぞれ６００μＭの２種類の検出用ＤＮＡ溶液（上記配列ｂ，ｃ）とをそれぞれ２５μｌ、イオン強度調整剤として５００ｍＭ ＮａＣｌ溶液を５０μｌ、ｐＨ緩衝剤として５ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ カコジル酸ナトリウム溶液を５０μｌ、１５０μＭ ＡＭＮＤ溶液を５０μｌ混合し、ＭｉｌｌｉＱ水を加えて全量を２５０μｌとした。得られたＤＮＡ溶液についてサーマルサイクラーでアニーリング処理を行い、蛍光強度を測定した。蛍光測定には、光路長２ｍｍ×１０ｍｍの蛍光測定用セルを用いた。
【００４３】
標的ＤＮＡを加えなかった場合（ＤＮＡ ｆｒｅｅ）の蛍光スペクトルと、標的ＤＮＡの標的塩基ＳがＧ（グアニン），Ｃ（シトシン）である場合の蛍光スペクトルとを図４に示す。ここで、図４における励起波長は３５０ｎｍである。図４に示すように、標的塩基ＳがＣ（シトシン）である場合に蛍光が著しく消光している。これは、ＡＭＮＤがギャップ部位に隣接する核酸塩基とスタッキングし、さらに標的塩基（Ｃ）との水素結合形成により安定な会合体を形成しているためと考えられる。このように、消光の有無を検出することで、標的塩基ＹがＧ（グアニン）であるかＣ（シトシン）であるかを知ることができる。
【００４４】
同じＤＮＡ溶液をポリプロピレン製の透明チューブに入れ、励起波長３５０ｎｍのＵＶランプを用いて蛍光を目視検出した結果を図５に示す。図５には、標的ＤＮＡ及び検出用ＤＮＡのみが含まれた溶液とＡＭＮＤのみが含まれた溶液とをそれぞれ透明チューブに入れた場合の蛍光も併せて示す。図５に示すように、標的塩基ＳがＣ（シトシン）である場合に蛍光が著しく消光しており、目視でも確認可能である。
【００４５】
（第２の実施例）
第２の実施例では、レセプター分子として第１の実施例と同様のＡＭＮＤを用いて、Ｃ（シトシン）が関与する全ての一塩基置換検出（Ｃ／Ｔ，Ｃ／Ｇ，Ｃ／Ａ）への適用性を評価した。
【００４６】
本実施例では、ＡＭＮＤによる一塩基置換検出（Ｃ／Ｔ，Ｃ／Ｇ，Ｃ／Ａ）の効果を検証するために、以下のような１０７ｍｅｒの標的ＤＮＡ（配列ｄ）とそれぞれ１５ｍｅｒの検出用ＤＮＡ（配列ｅ，ｆ）とをモデル配列として準備した。ここで、配列ｄ中、ＮはＧ（グアニン），Ｃ（シトシン），Ａ（アデニン）又はＴ（チミン）を示す。
（配列ｄ）５’−ＣＴＡＴＴＧＴＴＧＧＡＴＣＡＴＡＴＴＣＧＴＣＣＡＣＡＡＡＡＴＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴＴＡＧＣＴＧＴＡＴＣＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡＣＧＣＣＡＮＣＡＧＣＴＣＣＡＡＣＴＡＣＣＡＣＡＡＧＴＴＴＡＴＡＴＴＣＡＧＴＣ−３’（配列番号４）
（配列ｅ）５’−ＴＧＧＣＧＴＡＧＧＣＡＡＧＡＧ−３’（配列番号５）
（配列ｆ）５’−ＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧ−３’（配列番号６）
【００４７】
具体的に、本実施例では、被検体となる５μＭの標的一本鎖ＤＮＡ溶液（上記配列ｄ）５μｌに、５μＭの検出用ＤＮＡ溶液（上記配列ｅ，ｆ）を５μｌ添加し、さらにイオン強度調整剤として５００ｍＭ ＮａＣｌ溶液を１０μｌ、ｐＨ緩衝剤として５ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ カコジル酸ナトリウム溶液を１０μｌ、５μＭ ＡＭＮＤ溶液を５μｌ添加し、ＭｉｌｌｉＱ水を加えて全量を５０μｌとした。得られたＤＮＡ溶液についてサーマルサイクラーを用いてアニーリング処理を行い、蛍光強度を測定した。蛍光測定には、光路長３ｍｍ×３ｍｍの蛍光測定用セルを用いた。
【００４８】
標的ＤＮＡの標的塩基ＮがＧ（グアニン），Ｃ（シトシン），Ａ（アデニン）又はＴ（チミン）である場合の蛍光消光効率（％）を図６に示す。ここで、蛍光消光効率は、標的ＤＮＡが存在しない場合の蛍光強度をＦｆｒｅｅとし、標的ＤＮＡが存在する場合の蛍光強度をＦｏｂｓとしたとき、（（Ｆｆｒｅｅ−Ｆｏｂｓ）／Ｆｆｒｅｅ）×１００で表される。また、図６における励起波長は３５０ｎｍであり、検出波長は４００ｎｍである。図６に示すように、標的塩基ＮがＣ（シトシン）である場合にのみ蛍光が著しく消光している。このように、消光の有無を検出することで、標的塩基ＮがＣ（シトシン）であるか否かを知ることができる。すなわち、ＡＭＮＤをレセプター分子として用いることにより、Ｃ（シトシン）が関与する全ての一塩基置換検出が可能である。
【００４９】
（第３の実施例）
第３の実施例では、レセプター分子として、以下の化学式に示すようなプテリジン誘導体である２−アミノ−６，７−ジメチル−４−ヒドロキシプテリジン（ＤｉＭｅ−ｐｔｅｒｉｄｉｎｅ）を用いた。
【００５０】
【化２】
このＤｉＭｅ−ｐｔｅｒｉｄｉｎｅは発蛍光性を示し、後述するように、２種類の検出用ＤＮＡ間のギャップ部位に挿入されたときに標的塩基と相互作用し、標的塩基の違いに基づき蛍光強度が変化するため、蛍光強度を測定することで一塩基置換を検出することができる。特に、このＤｉＭｅ−ｐｔｅｒｉｄｉｎｅは標的塩基としてのＧ（グアニン）と選択的に相互作用するため、Ｇ（グアニン）が関与する全ての一塩基置換（Ｇ／Ｃ，Ｇ／Ａ，Ｇ／Ｔ）を検出することができる。
【００５２】
本実施例では、ＤｉＭｅ−ｐｔｅｒｉｄｉｎｅによる一塩基置換検出（Ｇ／Ｃ，Ｇ／Ａ，Ｇ／Ｔ）の効果を検証するために、以下のような２３ｍｅｒの標的ＤＮＡ（配列ｇ）と上述した１１ｍｅｒの検出用ＤＮＡ（配列ｂ）とをモデル配列として準備した。ここで、配列ｇ中、ＮはＧ（グアニン），Ｃ（シトシン），Ａ（アデニン）又はＴ（チミン）を示す。なお、本実施例における配列ｇは、標的塩基Ｎの前後の配列が同じであるため、１種類の検出用ＤＮＡ（配列ｂ）を標的ＤＮＡ（配列ｇ）に対して２当量加えることで、標的塩基Ｎと対向する部位にギャップ部位を構築した。
（配列ｇ）５’−ＴＣＴＣＣＧＣＡＣＡＣＮＴＣＴＣＣＧＣＡＣＡＣ−３’（配列番号７）
【００５３】
具体的に、本実施例では、被検体となる５μＭの標的一本鎖ＤＮＡ溶液（上記配列ｇ）１０μｌに、１０μＭの検出用ＤＮＡ溶液（上記配列ｂ）を１０μｌ添加し、さらにイオン強度調整剤として５００ｍＭ ＮａＣｌ溶液を１０μｌ、ｐＨ緩衝剤として５ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ カコジル酸ナトリウム溶液を１０μｌ、１μＭ ＤｉＭｅ−ｐｔｅｒｉｄｉｎｅ溶液を５μｌ添加し、ＭｉｌｌｉＱ水を加えて全量を５０μｌとした。得られたＤＮＡ溶液についてサーマルサイクラーを用いてアニーリング処理を行い、蛍光強度を測定した。蛍光測定には、光路長３ｍｍ×３ｍｍの蛍光測定用セルを用いた。
【００５４】
標的ＤＮＡの標的塩基ＮがＧ（グアニン），Ｃ（シトシン），Ａ（アデニン）又はＴ（チミン）である場合の蛍光消光効率（％）を図７に示す。ここで、図７における励起波長は３４３ｎｍであり、検出波長は４３５ｎｍである。図７に示すように、標的塩基ＮがＧ（グアニン）である場合にのみ蛍光が著しく消光している。このように、消光の有無を検出することで、標的塩基ＮがＧ（グアニン）であるか否かを知ることができる。すなわち、ＤｉＭｅ−ｐｔｅｒｉｄｉｎｅをレセプター分子として用いることにより、Ｇ（グアニン）が関与する全ての一塩基置換検出が可能である。
【００５５】
（第４の実施例）
第４の実施例では、レセプター分子として、以下の化学式に示すようなアミロライド（Ｎ−ａｍｉｄｉｎｏ−３，５−ｄｉａｍｉｎｏ−６−ｃｈｌｏｒｏｐｙｒａｚｉｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を用いた。
【００５６】
【化３】
このアミロライドは発蛍光性を示し、後述するように、２種類の検出用ＤＮＡ間のギャップ部位に挿入されたときに標的塩基と相互作用し、標的塩基の違いに基づき蛍光強度が変化するため、蛍光強度を測定することで一塩基置換を検出することができる。特に、このアミロライドは標的塩基としてのＴ（チミン）と選択的に相互作用するため、Ｔ（チミン）が関与する全ての一塩基置換（Ｔ／Ｇ，Ｔ／Ｃ，Ｔ／Ａ）を検出することができる。
【００５８】
本実施例では、アミロライドによる一塩基置換検出（Ｔ／Ｇ，Ｔ／Ｃ，Ｔ／Ａ）の効果を検証するために、上述した２３ｍｅｒの標的ＤＮＡ（配列ｇ）と上述した１１ｍｅｒの検出用ＤＮＡ（配列ｂ）とをモデル配列として準備した。なお、本実施例においても、１種類の検出用ＤＮＡ（配列ｂ）を標的ＤＮＡ（配列ｇ）に対して２当量加えることで、標的塩基Ｎと対向する部位にギャップ部位を構築した。
【００５９】
具体的に、本実施例では、被検体となる５μＭの標的一本鎖ＤＮＡ溶液（上記配列ｇ）１０μｌに、１０μＭの検出用ＤＮＡ溶液（上記配列ｂ）を１０μｌ添加し、さらにイオン強度調整剤として５００ｍＭ ＮａＣｌ溶液を１０μｌ、ｐＨ緩衝剤として５ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ カコジル酸ナトリウム溶液を１０μｌ、１μＭ アミロライド溶液を５μｌ添加し、ＭｉｌｌｉＱ水を加えて全量を５０μｌとした。得られたＤＮＡ溶液についてサーマルサイクラーを用いてアニーリング処理を行い、蛍光強度を測定した。蛍光測定には、光路長３ｍｍ×３ｍｍの蛍光測定用セルを用いた。
【００６０】
標的ＤＮＡの標的塩基ＮがＧ（グアニン），Ｃ（シトシン），Ａ（アデニン）又はＴ（チミン）である場合の蛍光消光効率（％）を図８に示す。ここで、図８における励起波長は３６１ｎｍであり、検出波長は４１５ｎｍである。図８に示すように、標的塩基ＮがＴ（チミン）である場合にのみ蛍光が著しく消光している。このように、消光の有無を検出することで、標的塩基ＮがＴ（チミン）であるか否かを知ることができる。すなわち、アミロライドをレセプター分子として用いることにより、Ｔ（チミン）が関与する全ての一塩基置換検出が可能である。
【００６１】
（第５の実施例）
第５の実施例では、レセプター分子として第１の実施例と同様のＡＭＮＤを用いて、ＰＣＲ産物への適用性を評価した。
【００６２】
本実施例では、ＡＭＮＤによるＰＣＲ産物への適用性を検証するために、上述した１０７ｍｅｒの標的ＤＮＡ（配列ｄ）と上述したそれぞれ１５ｍｅｒの検出用ＤＮＡ（配列ｅ，ｆ）とをモデル配列として準備した。
【００６３】
ここで、本実施例における標的ＤＮＡ（配列ｄ）は、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のｃｏｄｏｎ１２を含む領域で、以下のようなフォワードプライマー（配列ｈ）及びリバースプライマー（配列ｉ）を用いて、そのアンチセンス鎖を増幅したものである。
（配列ｈ）５’−ＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧ−３’（配列番号８）
（配列ｉ）５’−ＣＴＡＴＴＧＴＴＧＧＡＴＣＡＴＡＴＴＣＧ−３’（配列番号９）
【００６４】
ＰＣＲ溶液は、ＴａＫａＲａ Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社製）のプロトコルを参考にして調製した。ＰＣＲ反応溶液の組成は以下の通りである。
フォワードプライマー ２０ｐｍｏｌ（最終濃度０．２μＭ）
リバースプライマー ３００ｐｍｏｌ（最終濃度３．０μＭ）
標的ＤＮＡ（配列ｄ） ０．５ｎｇ
ＴａＫａＲａ Ｔａｑ（ＤＮＡポリメラーゼ） ２．５Ｕ
１０×ＰＣＲバッファ １０μｌ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ８μｌ
【００６５】
これらを０．２ｍｌ ＰＣＲチューブ中で混合し、さらにオートクレイブ処理したＭｉｌｌｉＱ水を加えて全量１００μｌとした。そして、９４℃・５分→（９４℃・３０秒→５２℃・３０秒→７２℃・３０秒）×４０サイクル→７２℃・７分→４℃まで冷却、というプロトコルでＰＣＲ反応を行い、標的ＤＮＡ（配列ｄ）を増幅した。
【００６６】
上述したＰＣＲ反応を行った後、このＰＣＲ反応溶液４０μｌに、ｐＨ緩衝剤（２Ｍ カコジル酸ナトリウム、３３ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ＝７．０）を２．５μｌ、それぞれ１００μＭの検出用ＤＮＡ溶液（上記配列ｅ，ｆ）を２．５μｌ、１μＭのＡＭＮＤ溶液を５μｌ添加し、全量を５０μｌとした。得られたＤＮＡ溶液について、光路長３ｍｍ×３ｍｍの蛍光測定用セルを用いて蛍光強度を測定した。なお、測定温度は５℃である。
【００６７】
標的ＤＮＡの標的塩基ＮがＧ（グアニン），Ｃ（シトシン），Ａ（アデニン）又はＴ（チミン）である場合の蛍光消光効率（％）を図９に示す。ここで、図９における励起波長は３５０ｎｍであり、検出波長は４００ｎｍである。図９に示すように、標的塩基ＮがＣ（シトシン）である場合にのみ蛍光が著しく消光している。このように、消光の有無を検出することで、標的塩基ＮがＣ（シトシン）であるか否かを知ることができる。また、本実施例では、ＤＮＡポリメラーゼやｄＮＴＰなどの除去作業や精密な温度制御などが一切不要であるため、ＰＣＲ産物の迅速且つ簡便な解析が可能である。
【００６８】
（第６の実施例）
第６の実施例では、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法による一塩基置換検出について評価した。レセプター分子としては、以下の化学式に示すようなＡＭＮＤ−ＤＰＡ（Ｎ−（３−Ａｍｉｎｏ−ｐｒｏｐｙｌ）−Ｎ’−（７−ｍｅｔｈｙｌ−［１，８］ｎａｐｈｔｈｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ）−ｐｒｏｐａｎｅ−１，３−ｄｉａｍｉｎｅ）を用い、これを金基板上に固定化したセンサーチップ（マイクロアレイ）を作製した。
【００６９】
【化４】
ＡＭＮＤ−ＤＰＡは、金基板上に固定化するためにアミノ基を末端に有するアルキル鎖をＡＭＮＤの基本骨格に導入したもので、２，６−ジアミノピリジンから合成したものである。このＡＭＮＤ−ＤＰＡは、金基板上において２種類の検出用ＤＮＡの間のギャップ部位に挿入されたときにＣ（シトシン）と選択的に相互作用する。この際、標的塩基の違いに基づきＳＰＲの信号強度が変化するため、信号強度を測定することでＣ（シトシン）が関与する全ての一塩基置換（Ｃ／Ｔ，Ｃ／Ｇ，Ｃ／Ａ）を検出することができる。
【００７１】
本実施例では、ＡＭＮＤ−ＤＰＡを固定化したセンサーチップによる一塩基置換検出の効果を検証するために、上述した２３ｍｅｒの標的ＤＮＡ（配列ｇ）と上述した１１ｍｅｒの検出用ＤＮＡ（配列ｂ）とをモデル配列として準備した。なお、本実施例においても、１種類の検出用ＤＮＡ（配列ｂ）を標的ＤＮＡ（配列ｇ）に対して２当量加えることで、標的塩基Ｎと対向する部位にギャップ部位を構築した。
【００７２】
具体的に、本実施例では、被検体となる２５μＭの標的ＤＮＡ溶液（上記配列ｇ）１０μｌに、２０μＭの検出用ＤＮＡ溶液（上記配列ｂ）を２０μｌ添加し、さらにＰＢＳ−ＥＰバッファ（０．６７Ｍ リン酸緩衝溶液、１．５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ ２０、ｐＨ＝６．４）を加えて全量を５００μｌとした。さらに、得られたＤＮＡ溶液についてサーマルサイクラーを用いてアニーリング処理した。
【００７３】
また、センサーチップとしてはセンサーチップＣＭ５（ビアコア株式会社製）を用い、ＡＭＮＤ−ＤＰＡのセンサーチップへの固定化は、アミンカップリングキット（ビアコア株式会社製）を用いて行った。具体的には、センサーチップＣＭ５に５０μｌのＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）／ＥＤＣ（Ｎ−ｅｔｈｙｌ−Ｎ’−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）水溶液をインジェクトし、センサーチップ表面のカルボキシル基をＮＨＳで活性化した。続いて、０．２０ｍｇ／ｍｌ（０．７３ｍＭ）のＡＭＮＤ−ＤＰＡ溶液（１０ｍＭ 酢酸緩衝液で希釈したもの、ｐＨ＝５．５）をインジェクトし、ＡＭＮＤ−ＤＰＡを基板上に固定化した。その後、１Ｍ エタノールアミン水溶液５０μｌをインジェクトすることによって、残存する活性ＮＨＳ基をブロッキングし、さらに８ｍＭ ＮａＯＨ水溶液６０μｌを用いて基板を洗浄した。
【００７４】
標的ＤＮＡの標的塩基ＮがＧ（グアニン），Ｃ（シトシン），Ａ（アデニン）又はＴ（チミン）である場合のＳＰＲの信号強度（ＲＵ：Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｕｎｉｔ）を図１０に示す。ここで、ＳＰＲ測定に用いたＤＮＡ溶液量は９０μｌであり、これを３０μｌ／分の流速でインジェクトした。図１０は、インジェクトの後、１８０秒後のＳＰＲ信号強度を示したものである。なお、ＡＭＮＤ−ＤＰＡの固定化量は約０．２０ｎｇ／ｍｍ２であり、測定温度は５℃である。
【００７５】
図１０に示すように、標的塩基ＮがＣ（シトシン）である場合にＳＰＲ信号強度が最大となっている。これは、ＡＭＮＤ−ＤＰＡがギャップ部位に隣接する核酸塩基とスタッキングし、さらに標的塩基（Ｃ）との水素結合形成により安定な会合体を形成し、その結果、金属板表面近傍の誘電率が変化するためと考えられる。このように、ＳＰＲの信号強度を検出することで、標的塩基ＮがＣ（シトシン）であるか否かを知ることができる。すなわち、ＡＭＮＤ−ＤＰＡを固定化したセンサーチップを用いることにより、Ｃ（シトシン）が関与する全ての一塩基置換検出が可能である。
【００７６】
（第７の実施例）
第７の実施例では、第６の実施例と同様に、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法による一塩基置換検出について評価した。レセプター分子としては、以下の化学式に示すようなＡｃＭＮＤ−Ｃ５Ａ（６−Ａｍｉｎｏ−ｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ（７−ｍｅｔｈｙｌ−［１，８］ｎａｐｈｔｈｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ）−ａｍｉｄｅ）を用い、これを金基板上に固定化したセンサーチップを作製した。
【００７７】
【化５】
ＡｃＭＮＤ−Ｃ５Ａは、金基板上に固定化するためにアミノ基を末端に有するアルキル鎖をＡＭＮＤの基本骨格に導入したもので、２，６−ジアミノピリジンから合成したものである。このＡｃＭＮＤ−Ｃ５Ａは、金基板上において２種類の検出用ＤＮＡの間のギャップ部位に挿入されたときにＧ（グアニン）と選択的に相互作用する。この際、標的塩基の違いに基づきＳＰＲの信号強度が変化するため、信号強度を測定することでＧ（グアニン）が関与する全ての一塩基置換（Ｇ／Ｃ，Ｇ／Ａ，Ｇ／Ｔ）を検出することができる。
【００７９】
本実施例では、ＡｃＭＮＤ−Ｃ５Ａを固定化したセンサーチップによる一塩基置換検出の効果を検証するために、上述した２３ｍｅｒの標的ＤＮＡ（配列ｇ）と上述した１１ｍｅｒの検出用ＤＮＡ（配列ｂ）とをモデル配列として準備した。なお、本実施例においても、１種類の検出用ＤＮＡ（配列ｂ）を標的ＤＮＡ（配列ｇ）に対して２当量加えることで、標的塩基Ｎと対向する部位にギャップ部位を構築した。
【００８０】
具体的に、本実施例では、被検体となる２００μＭの標的ＤＮＡ溶液（上記配列ｇ）５μｌに、４００μＭの検出用ＤＮＡ溶液（上記配列ｂ）を５μｌ添加し、さらにＰＢＳ−ＥＰバッファ（０．６７Ｍ リン酸緩衝溶液、１．５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ ２０、ｐＨ＝６．４）を加えて全量を５００μｌとした。さらに、得られたＤＮＡ溶液についてサーマルサイクラーを用いてアニーリング処理した。
【００８１】
また、センサーチップとしてはセンサーチップＣＭ５（ビアコア株式会社製）を用い、ＡｃＭＮＤ−Ｃ５Ａのセンサーチップへの固定化は、アミンカップリングキット（ビアコア株式会社製）を用いて行った。具体的には、センサーチップＣＭ５に５０μｌのＮＨＳ／ＥＤＣ水溶液をインジェクトし、センサーチップ表面のカルボキシル基をＮＨＳで活性化した。続いて、１．０ｍｇ／ｍｌ（３．７ｍＭ）のＡｃＭＮＤ−Ｃ５Ａ溶液（１０ｍＭ 酢酸緩衝液で希釈したもの、ｐＨ＝５．５）をインジェクトし、ＡｃＭＮＤ−Ｃ５Ａを基板上に固定化した。その後、１Ｍ エタノールアミン水溶液５０μｌをインジェクトすることによって、残存する活性ＮＨＳ基をブロッキングし、さらに８ｍＭ ＮａＯＨ水溶液６０μｌを用いて基板を洗浄した。
【００８２】
標的ＤＮＡの標的塩基ＮがＧ（グアニン），Ｃ（シトシン），Ａ（アデニン）又はＴ（チミン）である場合のＳＰＲの信号強度（ＲＵ：Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｕｎｉｔ）を図１１に示す。ここで、ＳＰＲ測定に用いたＤＮＡ溶液量は６０μｌであり、これを２０μｌ／分の流速でインジェクトした。図１１は、インジェクトの後、１８０秒後のＳＰＲ信号強度を示したものである。なお、ＡｃＭＮＤ−Ｃ５Ａの固定化量は約１．６ｎｇ／ｍｍ２であり、測定温度は５℃である。
【００８３】
図１１に示すように、標的塩基ＮがＧ（グアニン）である場合にＳＰＲ信号強度が最大となっている。これは、ＡｃＭＮＤ−Ｃ５Ａがギャップ部位に隣接する核酸塩基とスタッキングし、さらに標的塩基（Ｇ）との水素結合形成により安定な会合体を形成し、その結果、金属板表面近傍の誘電率が変化するためと考えられる。このように、ＳＰＲの信号強度を検出することで、標的塩基ＮがＧ（グアニン）であるか否かを知ることができる。すなわち、ＡｃＭＮＤ−Ｃ５Ａを固定化したセンサーチップを用いることにより、Ｇ（グアニン）が関与する全ての一塩基置換検出が可能である。
【００８４】
以上、具体的な実施例からも分かるように、本実施の形態における遺伝子変異検出方法によれば、連続した１以上の塩基からなる標的塩基１１を有する一本鎖の標的核酸１０と、この標的塩基１１を挟む２種類の部分配列について相補的な２種類の一本鎖の検出用核酸２０ａ，２０ｂとで二本鎖核酸を形成し、この二本鎖核酸に水素結合性及び発蛍光性を示すレセプター分子３０を添加して標的塩基１１と水素結合を形成させ、レセプター分子３０と結合した二本鎖核酸の蛍光強度を測定することにより、一塩基置換等の遺伝子変異を効果的に検出することができる。
【００８５】
特に、被検体となる標的核酸１０のラベル化や熱制御等の煩雑な操作が不要であるため工程数が非常に少なく、また、原理上二本鎖ＤＮＡ自体の熱的な安定性に依存しないため、検出までの時間が非常に短時間であり、再現性にも優れている。また、ＵＶランプを用いた目視による確認も可能であるため、特別な設備を持たない状況下においても検出が可能である。
【００８６】
さらに、レセプター分子３０又は検出用核酸２０ａを基板上に多数集積したセンサーチップ（マイクロアレイ）を作製し、遺伝子変異検出用キットとして用いることで、従来の欠点を克服したハイスループットな検出が可能となる。
【００８７】
なお、上述した実施の形態では、標的塩基を挟む２種類の部分配列と相補的な２種類の検出用核酸と標的核酸とをハイブリダイゼーションさせることで、意図的にギャップ部位を導入したが、このギャップ部位は、ＤＮＡの修復過程にも生じることが知られている（文献「Ｅｒｌｉｎｇ Ｓｅｅｂｅｒｇ，Ｌａｒｓ Ｅｉｄｅ ａｎｄ Ｍａｇｎａｒ Ｂｊｏｒａｓ，Ｔｒｅｎｄ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１９９５，２０（１０），ｐｐ．３９１−３９７」を参照。）。そこで、図２に示したようにレセプター分子が固定化された基板に二本鎖ＤＮＡ溶液を滴下して反応させることで、ＤＮＡの損傷の有無を検出することも可能である。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
上述した本発明によれば、標的核酸と２種類の検出用核酸とで二本鎖核酸を形成して標的塩基と対向する位置にギャップ部位を構築し、このギャップ部位に挿入されたレセプターと標的塩基とで水素結合を形成させることにより、標的塩基に生じた一塩基置換等の遺伝子変異を効果的に検出することができる。
【００８９】
また、レセプター又は２種類の検出用核酸の一方を基板上に固定化し、遺伝子変異検出用キットとして用いることで、従来の欠点を克服したハイスループットな検出が可能となる。
Claims (11)
- １塩基からなる標的塩基を有する一本鎖の標的核酸と、上記標的塩基を挟む２種類の部分配列について相補的な２種類の一本鎖の検出用核酸とで、二本鎖核酸を形成する工程と、
上記二本鎖核酸に水素結合性及び発蛍光性を示すレセプターを挿入させ、上記標的塩基と水素結合を形成させる工程と、
上記レセプターが挿入された上記二本鎖核酸の蛍光強度を測定する工程と
を有することを特徴とする遺伝子変異検出方法。 - 上記レセプターは、複素環式芳香族基を有し、上記標的塩基との水素結合形成及び該レセプターに隣接する塩基とのスタッキング相互作用により安定化されることで、上記標的塩基と対を形成することを特徴とする請求の範囲第１項記載の遺伝子変異検出方法。
- 上記レセプターは、ナフチリジン誘導体、キノリン誘導体、プテリジン誘導体、クマリン誘導体、インダゾール誘導体、アロキサジン誘導体及びアミロライドからなる群の少なくとも１つであることを特徴とする請求の範囲第２項記載の遺伝子変異検出方法。
- １塩基からなる標的塩基を有する一本鎖の標的核酸における上記標的塩基を挟む２種類の部分配列について相補的な２種類の一本鎖の検出用核酸と、
水素結合性及び発蛍光性を示し、上記標的核酸と２種類の上記検出用核酸とで形成された二本鎖核酸に挿入されて上記標的塩基と水素結合を形成するレセプターと
を有することを特徴とする遺伝子変異検出用キット。 - 水素結合性を示すレセプターが固定化された基板に、１塩基からなる標的塩基を有する一本鎖の標的核酸と、上記標的塩基を挟む２種類の部分配列について相補的な２種類の一本鎖の検出用核酸とを滴下することにより、上記標的核酸と２種類の上記検出用核酸とで二本鎖核酸を形成させると共に、上記標的塩基と上記レセプターとで水素結合を形成させる工程と、
上記標的塩基と上記レセプターとの結合に基づいて上記標的塩基を識別する工程と
を有することを特徴とする遺伝子変異検出方法。 - 上記レセプターは発蛍光性を示すものであり、上記レセプターが挿入された上記二本鎖核酸の蛍光強度変化に基づいて上記標的塩基を識別することを特徴とする請求の範囲第５項記載の遺伝子変異検出方法。
- 上記標的塩基と上記レセプターとの結合に基づく表面プラズモン共鳴の信号強度変化、又は水晶振動子の共振周波数変化に基づいて上記標的塩基を識別することを特徴とする請求の範囲第５項記載の遺伝子変異検出方法。
- １塩基からなる標的塩基を有する一本鎖の標的核酸における上記標的塩基を挟む２種類の部分配列について相補的な２種類の一本鎖の検出用核酸と、
水素結合性を示し、上記標的核酸と２種類の上記検出用核酸とで形成された二本鎖核酸に挿入されて上記標的塩基と水素結合を形成するレセプターと、
上記レセプターが固定化された基板と
を有することを特徴とする遺伝子変異検出用キット。 - １塩基からなる標的塩基を有する一本鎖の標的核酸における上記標的塩基を挟む２種類の部分配列について相補的な２種類の一本鎖の検出用核酸のうち一方の検出用核酸が固定化された基板に、上記標的核酸と、他方の検出用核酸と、水素結合性を示すレセプターとを滴下することにより、上記標的核酸と２種類の上記検出用核酸とで二本鎖核酸を形成させると共に、上記標的塩基と上記レセプターとで水素結合を形成させる工程と、
上記標的塩基と上記レセプターとの結合に基づいて上記標的塩基を識別する工程と
を有することを特徴とする遺伝子変異検出方法。 - 上記レセプターは発蛍光性を示すものであり、上記レセプターが挿入された上記二本鎖核酸の蛍光強度変化に基づいて上記標的塩基を識別することを特徴とする請求の範囲第９項記載の遺伝子変異検出方法。
- １塩基からなる標的塩基を有する一本鎖の標的核酸における上記標的塩基を挟む２種類の部分配列について相補的な２種類の一本鎖の検出用核酸と、
水素結合性を示し、上記標的核酸と２種類の上記検出用核酸とで形成された二本鎖核酸に挿入されて上記標的塩基と水素結合を形成するレセプターと、
２種類の上記検出用核酸の一方が固定化された基板と
を有することを特徴とする遺伝子変異検出用キット。
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