JP2017532980A - シーケンスに基づく検出方法 - Google Patents

Abstract

本発明では、遺伝子座を解析するための、マルチサンプルおよびマルチローカス方法が提供される。特に、本発明では、プローブの設計、前増幅、ビオチン標識、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、バーコード特異的プライマー伸長、シーケンスおよびＳＮＰ部位の解析を含む、ＳＮＰの検出およびハイスループットシーケンスに基づく解析方法が提供される。解析に用いられるプローブセットも提供される。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１４年１１月１０日に出願され、２０１５年２月２５日にＣＮ１０４３７２０９３Ａとして公開された中国特許出願第２０１４１０６４３４９７．９号の優先権を主張するものであり、その内容は、すべての目的のために、参照により全体として本明細書に取り込まれる。

（技術分野）
本出願はバイオテクノロジーの分野、特にハイスループットシーケンスまたは第二世代シーケンスといった、シーケンス技術に基づいたＳＮＰまたは突然変異の検出方法に関連する。

ＳＮＰは、分子診断、臨床試験、病原体検出、法医学、遺伝病研究、個別療法および医薬品、およびその他の多くの分野において、極めて重要な価値がある（Gayet-Ageron et al., 2009）。ＳＮＰの検出は現在の遺伝子診断の主要な内容のひとつである。同時に、ＳＮＰによって示される遺伝子診断は、新生児または遺伝病の特定の集団をスクリーニングする重要な手段となっている。したがって、操作しやすく、低コストで高スループットのＳＮＰ検出法が遺伝子検査の鍵である。

その他のハイスループット遺伝子検出技術に比べ、第二世代ハイスループットシーケンス技術はより正確で、感受性が高く、より高い処理能力を備える。より低価格で応用の幅が広く、生命科学や医学研究のさまざまな側面に関連がある。ハイスループットＳＮＰ検出のためのハイスループットシーケンス技術の使用は、現在の研究焦点のひとつである。

現在、シーケンスライブラリーの構築のために、第二世代シーケンス技術が必要とされている。そのとき、シーケンスライブラリーは、シーケンスに使用される。一般的なステップは、ＤＮＡ抽出、ＤＮＡ断片化、ライブラリーの構築（コネクターの追加、増幅、およびその他のステップを含む）を含む。機械シーケンスの最後のステップは、データ解析である。これらのステップのなかで、ライブラリーの構築には最も多くの時間と労力がかかり、データベースを構築するステップでは、サンプル遺伝子は何度も増幅され、そのためバイアスがかかりやすい。この方法を用いてデータベースを構築すると、すべてのゲノム断片はシーケンスされる機会が同じだけある。そのため、この方法はゲノムシーケンスに適している。もしいくつかの遺伝子のうちのひとつまたは配列の特定の部分のみを検出する場合、この方法はシーケンススペースの無駄であり、データ解析の困難を増加させるであろう。それに加え、この方法で処理されたサンプルは煩雑なステップを必要とし、膨大で複雑なシーケンスデータを必要とし、核酸の初期量が多く必要で、サンプルの大規模シーケンスを同時に行うことが困難である。

いくつかの特定の遺伝子において（例えば、エキソン、いくつかの単一遺伝子病原性遺伝子）、シーケンス（配列決定）はデータベース標的配列の濃縮を構築するための、追加のステップを必要とする。現在最も広く使われている方法は、ハイブリダイゼーションにより標的配列の濃縮物を得ることである。広く使われている、標的配列を得る技術は、主に固相ハイブリダイゼーション（Chei et al. 2009）またはキャプチャのための液相ハイブリダイゼーションキャプチャ技術（Bainbridge et al. 2010）に基づくものである。既存のカスタムキャプチャの市販のキット（ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ シーケンスキャプチャアレイ、またはＡｇｌｉｅｎｔ Ｓｕｒｅｓｅｌｅｃｔ ターゲットエンリッチメントシステムなど）を使うことができるが、これらの市販のカスタムシーケンスキャプチャキットは一般的に高価で、一度チップをカスタマイズすると、検出する標的配列は固定化され、変更できない。遺伝子シーケンス研究のための標的配列キャプチャ技術の使用に加え、非ハイブリッドシーケンスキャプチャ技術に基づくＰＣＲ技術が応用されているが、マルチプレックスＰＣＲに基づく技術の欠点がある。例えば、いくつかの領域は効率的に増幅されないであろう。その一方、ポリメラーゼによるエラーの増幅やすべての遺伝子断片が混合され増幅されることにより、シーケンスの結果は検証が困難である。

Ｉｌｌｕｍｉｎａは、データベースの構築のために、異なるＰＣＲ増幅方法を提供している（ＴｒｕＳｅｑ ｃｕｓｔｏｍ ａｍｐｌｉｃｏｎ）。プローブと標的特異的配列ハイブリダイゼーションにより、２つのプローブは標的配列の３’と５’末端に係留される。ＤＮＡポリメラーゼは、２つのプローブ間の隙間（例えば、目的の配列）を埋めるように伸長し、そののちシーケンスする。この方法は、遺伝子配列のための異なる測定プローブの設定を必要とする。この方法は複雑で、データベースの品質はハイブリダイゼーション効率に大いに影響される。低頻度の突然変異を検出するためにこの方法を使用するとき、シーケンスされた大部分は野生型の配列となるために、シーケンススペースの無駄が多くなるだろう。感受性の要件を満たすためには、シーケンスの読み深度を増やす必要がある。大規模集団突然変異遺伝子スクリーニングのためにこの方法を使用すると、野生型の配列はシーケンススペースの大部分を占め、その結果、シークエンシングのコストが増加する。それに加え、この方法の使用は、各サンプルが最大数百ｎｇの核酸を必要とし、核酸シーケンスの希少なまたは入手が困難なサンプルの濃度を下げるのには、役に立たない。

これらの方法の欠点に対処するために、ＳＮＰ検出のためのライブラリーを構築するための、ハイスループットシーケンス方法が必要とされている。

概要は、特許請求の範囲を限定するために使用されることを意図していない。特許請求された主題のその他の特徴、詳細、有用性、および利点は、添付の図面および添付の特許請求の範囲に開示された形態を含む、詳細な説明から明らかになるであろう。

一形態において、ここで開示されるのは、標的ポリヌクレオチド配列の遺伝子座を解析するためのプローブセットであって、（１）前記遺伝子座の上流の前記標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合する第１ハイブリダイゼーション配列、および、（２）前記第１ハイブリダイゼーション配列の上流にあり、前記標的ポリヌクレオチド配列に結合しない第１プライマー配列を含む、１以上の第１プローブと、（ｉ）前記遺伝子座の下流の前記標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合する第２ハイブリダイゼーション配列、および、（ｉｉ）前記第２ハイブリダイゼーション配列の下流にあり、前記標的ポリヌクレオチド配列に結合しない第２プライマー配列を含む、１以上の第２プローブと、を備え、前記第１プローブおよび前記第２プローブの伸長方向は同じであり、前記第１プローブおよび前記第２プローブは連結すると遺伝子座を含む配列を形成する、プローブセットである。

ある実施形態において、ここで示されるプローブセットは、前記遺伝子座はＳＮＰまたは点突然変異を含み、前記１以上の第１プローブの第１ハイブリダイゼーション配列は、前記ＳＮＰまたは点突然変異の上流の前記標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、前記１以上の第１プローブの３’末端ヌクレオチドは、前記ＳＮＰまたは点突然変異の位置のヌクレオチドに相補的であり、前記１以上の第２プローブの第２ハイブリダイゼーション配列は、前記ＳＮＰまたは点突然変異の下流の前記標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、
前記１以上の第２プローブの５’末端ヌクレオチドは、前記ＳＮＰまたは点突然変異の位置のすぐ下流のヌクレオチドに相補的である。

他の実施形態において、ここで示されるプローブセットは、前記遺伝子座は野生型標的ポリヌクレオチド配列のｎ番目の塩基に挿入を含み、前記１以上の第１プローブは少なくとも２つの第１プローブを備え、そのうちの一方は、ｎ番目の塩基までで、ｎ番目を含まない野生型標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、もう一方は、前記挿入配列の最後の塩基までを含む標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、前記１以上の第２プローブの第２ハイブリダイゼーション配列は、前記挿入の下流の標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、前記１以上の第２プローブの５’末端ヌクレオチドは、ｎ番目の塩基に相補的である。

他の実施形態において、ここで示されるプローブセットは、前記遺伝子座は野生型標的ポリヌクレオチド配列のｎ番目の塩基に欠損を含み、前記１以上の第１プローブは少なくとも２つの第１プローブを備え、そのうちの一方は、ｎ番目の塩基までで、ｎ番目を含まない野生型標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、もう一方は、前記欠損配列のすぐ上流の塩基までを含む標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、前記１以上の第２プローブの第２ハイブリダイゼーション配列は、前記欠損の下流の標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、前記１以上の第２プローブの５’末端ヌクレオチドは、ｎ番目の塩基に相補的である。

ある形態において、ここで提供されるのは、標的ポリヌクレオチド配列の遺伝子座を解析するためのプローブセットであって、（１）前記遺伝子座の上流または前記遺伝子座を含む前記標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合する第１ハイブリダイゼーション配列、および、（２）前記第１ハイブリダイゼーション配列の上流にあり、前記標的ポリヌクレオチド配列に結合しない第１プライマー配列を含む、１以上の第１プローブと、（ｉ）前記遺伝子座の下流または前記遺伝子座から始まる前記標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合する第２ハイブリダイゼーション配列、および、（ｉｉ）前記第２ハイブリダイゼーション配列の下流にあり、前記標的ポリヌクレオチド配列に結合しない第２プライマー配列を含む、１以上の第２プローブと、を備え、前記第１プローブおよび前記第２プローブの伸長方向は同じであり、前記第１プローブは前記第２プローブの上流にあり、前記第１プローブおよび前記第２プローブは隣接しており、連結すると遺伝子座を含む配列を形成する、プローブセットである。

ある実施形態において、前記遺伝子座はＳＮＰまたは点突然変異を含み、前記１以上の第１プローブの第１ハイブリダイゼーション配列は、前記ＳＮＰまたは点突然変異を含む前記標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、前記１以上の第１プローブの３’末端ヌクレオチドは、前記ＳＮＰまたは点突然変異の位置のヌクレオチドに相補的であり、前記１以上の第２プローブの第２ハイブリダイゼーション配列は、前記ＳＮＰまたは点突然変異の下流の前記標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、前記１以上の第２プローブの５’末端ヌクレオチドは、前記ＳＮＰまたは点突然変異の位置のすぐ下流のヌクレオチドに相補的である、あるいは、前記１以上の第１プローブの第１ハイブリダイゼーション配列は、前記ＳＮＰまたは点突然変異の上流の前記標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、前記１以上の第１プローブの３’末端ヌクレオチドは、前記ＳＮＰまたは点突然変異の位置のすぐ上流のヌクレオチドに相補的であり、前記１以上の第２プローブの第２ハイブリダイゼーション配列は、前記ＳＮＰまたは点突然変異から始まる前記標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、前記１以上の第２プローブの５’末端ヌクレオチドは、前記ＳＮＰまたは点突然変異の位置のヌクレオチドに相補的である。

前に述べた実施形態のいずれかにおいて、前記１以上の第２プローブの５’末端はリン酸化され得る。前に述べた実施形態のいずれかにおいて、前記１以上の第１プローブの第１プライマー配列は、ユニバーサルプライマー配列であり得る。

前に述べた実施形態のいずれかにおいて、前記１以上の第１プローブの第１プライマー配列は、ＳＮＰまたは突然変異の位置の塩基に特異的であり得る。

前に述べた実施形態のいずれかにおいて、前記１以上の第２プローブの第２プライマー配列は、ユニバーサルプライマー配列であり得る。

一形態において、前記遺伝子座は欠損または挿入を含む。

前に述べた実施形態のいずれかにおいて、前記遺伝子座は野生型標的ポリヌクレオチド配列のｎ番目の塩基に挿入を含み得、前記１以上の第１プローブは少なくとも２つの第１プローブを備えることができ、そのうちの一方は、ｎ番目の塩基までで、ｎ番目を含まない野生型標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、もう一方は、前記挿入配列の最後の塩基までを含む標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、前記１以上の第２プローブの第２ハイブリダイゼーション配列は、前記挿入の下流の標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、前記１以上の第２プローブの５’末端ヌクレオチドは、ｎ番目の塩基に相補的である、あるいは、前記１以上の第２プローブは少なくとも２つの第２プローブを備えることができ、そのうちの一方は、ｎ番目の塩基から始まる野生型標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、もう一方は、前記挿入配列の最初の塩基から始まる標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、前記１以上の第１プローブの第１ハイブリダイゼーション配列は、前記挿入の上流の標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、前記１以上の第１プローブの３’末端ヌクレオチドは、野生型標的ポリヌクレオチドのｎ番目の塩基のすぐ上流の塩基に相補的である。

前に述べた実施形態のいずれかにおいて、前記遺伝子座は野生型標的ポリヌクレオチド配列のｎ番目の塩基に欠損を含み得、前記１以上の第１プローブは少なくとも２つの第１プローブを備えることができ、そのうちの一方は、ｎ番目の塩基までで、ｎ番目を含まない野生型標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、もう一方は、前記欠損配列のすぐ上流の塩基までを含む標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、前記１以上の第２プローブの第２ハイブリダイゼーション配列は、前記欠損の下流の標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、前記１以上の第２プローブの５’末端ヌクレオチドは、ｎ番目の塩基に相補的である、あるいは、前記１以上の第２プローブは少なくとも２つの第２プローブを備えることができ、そのうちの一方は、ｎ番目の塩基から始まる野生型標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、もう一方は、前記欠損配列の最初の塩基から始まる標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、前記１以上の第１プローブの第１ハイブリダイゼーション配列は、前記欠損の上流の標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、前記１以上の第１プローブの５’末端ヌクレオチドは、野生型標的ポリヌクレオチドのｎ番目の塩基のすぐ上流の塩基に相補的である。

前に述べた実施形態のいずれかにおいて、前記１以上の第１プローブの第１プライマー配列は、ユニバーサルプライマー配列であり得る。前に述べた実施形態のいずれかにおいて、前記２つの第１プローブは、異なる第１プライマー配列を含み得る。前に述べた実施形態のいずれかにおいて、前記１以上の第２プローブの５’末端がリン酸化され得る。前に述べた実施形態のいずれかにおいて、前記１以上の第２プローブの第２プライマー配列は、ユニバーサルプライマー配列であり得る。

前に述べた実施形態のいずれかにおいて、前記遺伝子座が、ＧＪＢ２、ＳＬＣ２６Ａ４または１２ＳｒＲＮＡといった難聴関連遺伝子の中にあってもよく、前記遺伝子座は任意選択として、１４９４Ｃ＞Ｔ、ＩＶＳ７−２Ａ＞Ｇ、２３５ｄｅｌＣ、１７６ＤＥＬ１６、および／または２９９ｄｅｌＡＴを含む。一形態として、１４９４Ｃ＞Ｔに対する前記１以上の第１プローブは、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、および／または配列番号：２４に示すポリヌクレオチド配列を含む。前に述べた実施形態のいずれかにおいて、１４９４Ｃ＞Ｔに対する前記１以上の第２プローブは、配列番号：２５に示すポリヌクレオチド配列を含み得る。前に述べた実施形態のいずれかにおいて、ＩＶＳ７−２Ａ＞Ｇに対する前記１以上の第１プローブは、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、および／または配列番号：１０に示すポリヌクレオチド配列を含み得る。前に述べた実施形態のいずれかにおいて、ＩＶＳ７−２Ａ＞Ｇに対する前記１以上の第２プローブは、配列番号：１１に示すポリヌクレオチド配列を含み得る。前に述べた実施形態のいずれかにおいて、２３５ｄｅｌＣに対する前記１以上の第１プローブは、配列番号：１５、および／または配列番号：１６に示すポリヌクレオチド配列を含み得る。前に述べた実施形態のいずれかにおいて、２３５ｄｅｌＣに対する前記１以上の第２プローブは、配列番号：１７に示すポリヌクレオチド配列を含み得る。１７６ＤＥＬ１６に対する前記１以上の第１プローブは、配列番号：１２、および／または配列番号：１３に示すポリヌクレオチド配列を含み得る。前に述べた実施形態のいずれかにおいて、１７６ＤＥＬ１６に対する前記１以上の第２プローブは、配列番号：１４に示すポリヌクレオチド配列を含み得る。前に述べた実施形態のいずれかにおいて、２９９ｄｅｌＡＴに対する前記１以上の第１プローブは、配列番号：１８、および／または配列番号：１９に示すポリヌクレオチド配列を含み得る。前に述べた実施形態のいずれかにおいて、２９９ｄｅｌＡＴに対する前記１以上の第２プローブは、配列番号：２０に示すポリヌクレオチド配列を含み得る。

他の一形態において、ここで提供されるのは、前に述べた実施形態のいずれかのプローブセットを備える、遺伝子座を解析するキットである。一形態において、１７６ｄｅｌ１６、２９９ｄｅｌＡＴ、および／または２３５ｄｅｌＣを増幅するプライマー対をさらに備える。他の形態において、前記１７６ｄｅｌ１６、２９９ｄｅｌＡＴ、および／または２３５ｄｅｌＣを増幅するプライマー対は、配列番号：２８および配列番号：２９に示すポリヌクレオチド配列を含む。前に述べた実施形態のいずれかにおいて、１４９４Ｃ＞Ｔを増幅するプライマー対をさらに備え得る。一形態において、前記１４９４Ｃ＞Ｔを増幅するプライマー対は、配列番号：２６および配列番号：２７に示すポリヌクレオチド配列を含む。前に述べた実施形態のいずれかにおいて、ＩＶＳ７−２Ａ＞Ｇを増幅するプライマー対をさらに備え得る。一形態において、前記ＩＶＳ７−２Ａ＞Ｇを増幅するプライマー対は、配列番号：３０および配列番号：３１に示すポリヌクレオチド配列を含む。前に述べた実施形態のいずれかにおいて、前記プライマー対の片方または両方のプライマーはラベルされ得る。一形態において、前記ラベルはビオチンを含む。

前に述べた実施形態のいずれかにおいて、バーコード特異的プライマーおよび／または共通プライマーをさらに備え得る、キット。一形態において、前記バーコード特異的プライマーは配列番号：３２に示すポリヌクレオチド配列を含み、前記共通プライマーは配列番号：３３に示すポリヌクレオチド配列を含む。

また、ここで開示されるのは、少なくとも第１遺伝子座および第２遺伝子座を解析するための組成物であって、第１遺伝子座に対応する前に述べた実施形態のいずれか１つに記載の第１プローブセットと、第２遺伝子座に対応する前に述べた実施形態のいずれか１つに記載の第２プローブセットを備える。一形態において、前記第１プローブセットのプローブは等モル量であり、前記第２プローブセットのプローブは等モル量である。

前に述べた実施形態のいずれかにおいて、前記第１遺伝子座はＳＮＰまたは点突然変異を含み得、前記第２遺伝子座は欠損および／または挿入を含み得る。ある実施形態において、前記ＳＮＰまたは点突然変異は１４９４Ｃ＞Ｔおよび／またはＩＶＳ７−２Ａ＞Ｇを含み、前記欠損および／または挿入は２３５ｄｅｌＣ、１７６ＤＥＬ１６、および／または２９９ｄｅｌＡＴを含む。

前に述べた実施形態のいずれかにおいて、前記第１プローブセットおよび前記第２プローブセットは、下記のうち少なくとも２つのプローブセットを含み得る。（１）配列番号：２１に示すポリヌクレオチド配列を含むプローブと、配列番号：２１に示すポリヌクレオチド配列を含む１以上のプローブ；（２）配列番号：１１に示すポリヌクレオチド配列を含むプローブと、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９または配列番号：１０に示すポリヌクレオチド配列を含む１以上のプローブ；（３）配列番号：１７に示すポリヌクレオチド配列を含むプローブと、配列番号：１５または配列番号：１６に示すポリヌクレオチド配列を含む１以上のプローブ；（４）配列番号：１４に示すポリヌクレオチド配列を含むプローブと、配列番号：１２または配列番号：１３に示すポリヌクレオチド配列を含む１以上のプローブ；（５）配列番号：２０に示すポリヌクレオチド配列を含むプローブと、配列番号：１８または配列番号：１９に示すポリヌクレオチド配列を含む１以上のプローブ。

一形態において、ここで提供されるのは、遺伝子座を含む標的ポリヌクレオチド配列を含むサンプルを解析する方法であって、（ａ）サンプルをプローブセットと接触させ、前記プローブセットは（１）前記遺伝子座の上流または前記遺伝子座を含む前記標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合する第１ハイブリダイゼーション配列、および（２）前記第１ハイブリダイゼーション配列の上流にあり、前記標的ポリヌクレオチド配列に結合しない第１プライマー配列を含む、１以上の第１プローブと、（ｉ）前記遺伝子座の下流または前記遺伝子座から始まる前記標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合する第２ハイブリダイゼーション配列、および、（ｉｉ）前記第２ハイブリダイゼーション配列の下流にあり、前記標的ポリヌクレオチド配列に結合しない第２プライマー配列を含む、１以上の第２プローブと、を備え、前記第１プローブおよび前記第２プローブの伸長方向は同じであり、前記第１プローブは前記第２プローブの上流にあり、（ｂ）標的ポリヌクレオチド配列に結合した第１プローブおよび前記第２プローブを連結させて、遺伝子座を含む配列を形成し、（ｃ）遺伝子座を含む配列を決定し、それにより、遺伝子座の配列を決定する、方法である。一形態において、前記遺伝子座はＳＮＰまたは点突然変異を含み、前記１以上の第１プローブの第１ハイブリダイゼーション配列は、前記ＳＮＰまたは点突然変異を含む前記標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、前記１以上の第１プローブの３’末端ヌクレオチドは、前記ＳＮＰまたは点突然変異の位置のヌクレオチドに相補的であり、前記１以上の第２プローブの第２ハイブリダイゼーション配列は、前記ＳＮＰまたは点突然変異の下流の前記標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、前記１以上の第２プローブの５’末端ヌクレオチドは、前記ＳＮＰまたは点突然変異の位置のすぐ下流のヌクレオチドに相補的である、あるいは、前記１以上の第１プローブの第１ハイブリダイゼーション配列は、前記ＳＮＰまたは点突然変異の上流の前記標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、前記１以上の第１プローブの３’末端ヌクレオチドは、前記ＳＮＰまたは点突然変異のすぐ上流のヌクレオチドに相補的であり、前記１以上の第２プローブの第２ハイブリダイゼーション配列は、前記ＳＮＰまたは点突然変異から始まる前記標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、前記１以上の第２プローブの５’末端ヌクレオチドは、前記ＳＮＰまたは点突然変異の位置のヌクレオチドに相補的である。前に述べた実施形態のいずれかにおいて、前記１以上の第２プローブの５’末端がリン酸化され得る。前に述べた実施形態のいずれかにおいて、第１プローブの第１プライマー配列は、ユニバーサルプライマー配列であり得る。前に述べた実施形態のいずれかにおいて、前記１以上の第１プローブの第１プライマーは、前記ＳＮＰまたは突然変異の位置の塩基に特異的であり得る。前に述べた実施形態のいずれかにおいて、前記１以上の第２プローブの第２プライマー配列は、ユニバーサルプライマー配列であり得る。

ここで開示される方法の一形態において、前記遺伝子座は、欠損または挿入を含む。

一形態において、前記遺伝子座は野生型標的ポリヌクレオチド配列のｎ番目の塩基に挿入を含み、前記１以上の第１プローブは少なくとも２つの第１プローブを備え、そのうちの一方は、ｎ番目の塩基までで、ｎ番目を含まない野生型標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、もう一方は、前記挿入配列の最後の塩基までを含む標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、前記１以上の第２プローブの第２ハイブリダイゼーション配列は、前記挿入の下流の標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、前記１以上の第２プローブの５’末端ヌクレオチドは、ｎ番目の塩基に相補的である、あるいは、前記１以上の第２プローブは少なくとも２つの第２プローブを備え、そのうちの一方は、ｎ番目の塩基から始まる野生型標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、もう一方は、前記挿入配列の最初の塩基から始まる標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、前記１以上の第１プローブの第１ハイブリダイゼーション配列は、前記挿入の上流の標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、前記１以上の第１プローブの３’末端ヌクレオチドは、野生型標的ポリヌクレオチドのｎ番目の塩基のすぐ上流の塩基に相補的である。他の形態において、前記遺伝子座は野生型標的ポリヌクレオチド配列のｎ番目の塩基に欠損を含み、前記１以上の第１プローブは少なくとも２つの第１プローブを備え、そのうちの一方は、ｎ番目の塩基までで、ｎ番目を含まない野生型標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、もう一方は、前記欠損配列のすぐ上流の塩基までを含む標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、前記１以上の第２プローブの第２ハイブリダイゼーション配列は、前記欠損の下流の標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、前記１以上の第２プローブの５’末端ヌクレオチドは、ｎ番目の塩基に相補的である、あるいは、前記１以上の第２プローブは少なくとも２つの第２プローブを備え、そのうちの一方は、ｎ番目の塩基から始まる野生型標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、もう一方は、前記欠損配列の最初の塩基から始まる標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、前記１以上の第１プローブの第１ハイブリダイゼーション配列は、前記欠損の上流の標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、前記１以上の第１プローブの５’末端ヌクレオチドは、野生型ポリヌクレオチドのｎ番目の塩基のすぐ上流の塩基に相補的である。

前に述べた実施形態のいずれかにおいて、前記１以上の第１プローブの第１プライマー配列は、ユニバーサルプライマー配列であり得る。前に述べた実施形態のいずれかにおいて、前記２つの第１プローブは、異なる第１プライマー配列を含み得る。前に述べた実施形態のいずれかにおいて、前記１以上の第２プローブの５’末端がリン酸化され得る。前に述べた実施形態のいずれかにおいて、前記１以上の第２プローブの第２プライマー配列は、ユニバーサルプライマー配列であり得る。前に述べた実施形態のいずれかにおいて、前記遺伝子座が、ＧＪＢ２、ＳＬＣ２６Ａ４または１２ＳｒＲＮＡといった難聴関連遺伝子の中にあり、前記遺伝子座は任意選択として、１４９４Ｃ＞Ｔ、ＩＶＳ７−２Ａ＞Ｇ、２３５ｄｅｌＣ、１７６ＤＥＬ１６、および／または２９９ｄｅｌＡＴを含み得る。

前に述べた実施形態のいずれかにおいて、１４９４Ｃ＞Ｔに対する前記１以上の第２プローブは、配列番号：２５に示すポリヌクレオチド配列を含み得る。前に述べた実施形態のいずれかにおいて、ＩＶＳ７−２Ａ＞Ｇに対する前記１以上の第１プローブは、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、および／または配列番号：１０に示すポリヌクレオチド配列を含み得る。前に述べた実施形態のいずれかにおいて、ＩＶＳ７−２Ａ＞Ｇに対する前記１以上の第２プローブは、配列番号：１１に示すポリヌクレオチド配列を含み得る。前に述べた実施形態のいずれかにおいて、２３５ｄｅｌＣに対する前記１以上の第１プローブは、配列番号：１５、および／または配列番号：１６に示すポリヌクレオチド配列を含み得る。前に述べた実施形態のいずれかにおいて、２３５ｄｅｌＣに対する前記１以上の第２プローブは、配列番号：１７に示すポリヌクレオチド配列を含み得る。前に述べた実施形態のいずれかにおいて、１７６ＤＥＬ１６に対する前記１以上の第１プローブは、配列番号：１２、および／または配列番号：１３に示すポリヌクレオチド配列を含み得る。前に述べた実施形態のいずれかにおいて、１７６ＤＥＬ１６に対する前記１以上の第２プローブは、配列番号：１４に示すポリヌクレオチド配列を含み得る。前に述べた実施形態のいずれかにおいて、２９９ｄｅｌＡＴに対する前記１以上の第１プローブは、配列番号：１８、および／または配列番号：１９に示すポリヌクレオチド配列を含み得る。前に述べた実施形態のいずれかにおいて、２９９ｄｅｌＡＴに対する前記１以上の第２プローブは、配列番号：２０に示すポリヌクレオチド配列を含み得る。

前に述べた実施形態のいずれかにおいて、前記方法は、さらに前記接触ステップの前に、標的ポリヌクレオチドの前増幅を備え得る。前に述べた実施形態のいずれかにおいて、前記前増幅は、ＧＪＢ２、ＳＬＣ２６Ａ４、または１２ＳｒＲＮＡといった難聴関連遺伝子を増幅させるためのプライマー対の使用を含み得る。前に述べた実施形態のいずれかにおいて、前記遺伝子座は、１４９４Ｃ＞Ｔ、ＩＶＳ７−２Ａ＞Ｇ、２３５ｄｅｌＣ、１７６ＤＥＬ１６、および／または２９９ｄｅｌＡＴを含み得る。

前に述べた実施形態のいずれかにおいて、前記前増幅は、１７６ＤＥＬ１６、２９９ｄｅｌＡＴ、および／または２３５ｄｅｌＣを増幅するために、配列番号：２８、および配列番号：２９に示すポリヌクレオチド配列を有するプライマー対の使用を含み得る。前に述べた実施形態のいずれかにおいて、前記前増幅は、１４９４Ｃ＞Ｔを増幅するために、配列番号：２６、および配列番号：２７に示すポリヌクレオチド配列を有するプライマー対の使用を含み得る。前に述べた実施形態のいずれかにおいて、前記前増幅は、ＩＶＳ７−２Ａ＞Ｇを増幅するために、配列番号：３０、および配列番号：３１に示すポリヌクレオチド配列を有するプライマー対の使用を含み得る。前に述べた実施形態のいずれかにおいて、前記プライマー対の片方または両方のプライマーはラベルされ得る。前に述べた実施形態のいずれかにおいて、前記ラベルはビオチンを含み得る。

前に述べた実施形態のいずれかにおいて、前記連結ステップは、標的ポリヌクレオチド配列に結合した、前記第１プローブと前記第２プローブとのライゲーションを含み得る。前に述べた実施形態のいずれかにおいて、前記決定ステップは、前記連結配列の増幅および／またはシーケンスを含み得る。前に述べた実施形態のいずれかにおいて、前記増幅および／またはシーケンスはバーコード特異的プライマーおよび／または共通プライマーの使用を含み得る。前に述べた実施形態のいずれかにおいて、前記バーコード特異的プライマーは配列番号：３２に示すポリヌクレオチド配列を含み、前記共通プライマーは配列番号：３３に示すポリヌクレオチド配列を含み得る。

図１は本発明の一形態による検出方法の概略図である。 図２Ａ−２ＥはプラスミドグループＩの試験結果である。図２Ａは１４９４野生型プラスミドの試験結果である。図２ＢはＩＶＳ７−２野生型プラスミドの試験結果である。図２Ｃは１７６野生型プラスミドの試験結果である。図２Ｄは２３５野生型プラスミドの試験結果である。図２Ｅは２９９野生型プラスミドの試験結果である。 図３Ａ−３ＥはプラスミドグループＩＩの試験結果である。図３Ａは１４９４部位（Ｃ：Ｔ＝１：１）の試験結果である。図３ＢはＩＶＳ７−２部位（Ａ：Ｇ＝１：１）の試験結果である。図３Ｃは１７６部位（ＷＴ：ＭＴ＝３：１）の試験結果である。図３Ｄは２３５部位（ＷＴ：ＭＴ＝３：１）の試験結果である。図３Ｅは２９９部位（ＷＴ：ＭＴ＝３：１）の試験結果である。 図４Ａ−４ＥはプラスミドグループＩＩＩの試験結果である。図４Ａは１４９４変異プラスミドの試験結果である。図４ＢはＩＶＳ７−２変異プラスミドの試験結果である。図４Ｃは１７６部位（ＷＴ：ＭＴ＝２：１）の試験結果である。図４Ｄは２３５部位（ＷＴ：ＭＴ＝２：１）の試験結果である。図４Ｅは２９９部位（ＷＴ：ＭＴ＝２：１）の試験結果である。 図５は、２３５野生型ゲノムＤＮＡと２３５ｄｅｌＣホモ接合型突然変異ゲノムＤＮＡの試験結果である。

特許請求された主題の１つ以上の実施形態の詳細な説明は、特許請求された主題の原理を示す添付の図と共に以下に提供される。特許請求される主題は、そのような実施形態に関連して説明されるが、特定の実施形態に限定されない。特許請求された主題は、様々な形態で実施することができ、多数の代替物、修正物および均等物を包含することが理解されるべきである。したがって、ここで開示された特定の詳細は、限定として解釈されるのではなく、むしろ請求項の基礎として、および特許請求された主題を実質的に任意の適度に詳細なシステム、構造、または方法で実施することを当業者に教示するための代表的な基礎として解釈される。本開示の完全な理解を提供するために、多くの具体的な詳細が以下の説明に示される。これらの詳細は、例示目的のために提供され、特許請求の主題は、これらの特定の詳細の一部または全部を伴わずに、請求項に従って実施することができる。特許請求された主題の範囲から逸脱することなく、他の実施形態を使用することができ、構造的変更を行うことができることを理解されたい。個々の実施形態の１つ以上に記載された様々な特徴および機能は、その適用性においてそれらが記載された特定の実施形態に限定されないと理解されるべきである。むしろ、そのような実施形態が記載されているかどうか、またそのような特徴が記載された実施形態の一部として提示されるか否かにかかわらず、開示された１つ以上の他の実施形態に、単独でまたは組み合わせて適用され得る。明瞭化のために、特許請求された主題に関連する技術分野において知られている技術的材料は、特許請求された主題が不必要に不明瞭にならないように詳細には記載されていない。

他に定義されない限り、ここで使用される技術分野のすべての用語、表記および他の技術的および科学的用語、または専門用語は、特許請求される主題が関係する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有することが意図される。場合によっては、一般的に理解される意味をもった用語は、明瞭化および/または容易な参照のためにここで定義され、このような定義を含むことは、当技術分野で一般的に理解されるものと実質的な相違を表すと解釈されるべきではない。ここで記載または参照される技術および手順の多くは、当業者による従来の方法論を使用してよく理解され、一般的に実施される。

本出願で参照された全ての刊行物は、個々の刊行物が個々に参照により組み込まれているのと同程度に、あらゆる目的のためにその全体が参考として組み込まれる。

すべての見出しは読者の便宜のためであり、特定されない限り、見出しに続く本文の意味を限定するために使用されるべきではない。

本開示を通じて、特許請求される主題の様々な態様が範囲形式で提示される。範囲の形式の記述は、便宜上のもの、および簡潔さのためのものであり、特許請求する主題の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことを理解されたい。従って、ある範囲の説明は、その範囲内の全ての可能な下位範囲及び個々の数値を具体的に開示したものとみなされるべきである。例えば、ある範囲の値が与えられている場合、その範囲の上限と下限との間のそれぞれの介在値およびその記載された範囲内の他の記載または介在する値は、請求される主題内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立して、より小さい範囲に含まれてもよく、記載された範囲内の任意の具体的に除外された限界を条件として、請求される主題内に包含されてもよい。記載された範囲に限度の１つまたは両方が含まれる場合、含まれる限度のいずれかまたは両方を除外した範囲も請求された主題に含まれる。これは範囲の幅に関係なく適用されます。例えば、１〜６のような範囲の記載は、１〜３，１〜４，１〜５，２〜４，２〜６，３〜６など、ならびにその範囲内の個々の数字、例えば、１，２，３，４，５および６を含む。

提供された実施形態の実施は、他に示されない限り、有機化学、ポリマー技術、分子生物学（組換え技術を含む）、細胞生物学、生化学およびシーケンス技術の従来の技術および説明を使用し、これらは当業者の技術分野の範囲内である。そのような従来技術には、ポリペプチドおよびタンパク質の合成および修飾、ポリヌクレオチド合成および修飾、ポリマーアレイ合成、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよびライゲーション、ならびに標識を用いたハイブリダイゼーションの検出が含まれる。適切な技術の特定の例は、本明細書の実施例を参照することによって得ることができる。しかし、他の同等の従来の手順ももちろん使用することができる。そのような従来の技術および説明は、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｅｄｓ．、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ（Ｖｏｌ．Ｉ−ＩＶ）（１９９９）；Ｗｅｉｎｅｒ、Ｇａｂｒｉｅｌ、Ｓｔｅｐｈｅｎｓ、Ｅｄｓ．、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２００７）；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ、Ｄｖｅｋｓｌｅｒ、Ｅｄｓ．、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２００３）；Ｂｏｗｔｅｌｌ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｍａｎｕａｌ（２００３）；Ｍｏｕｎｔ、Ｂｉｏｉｎｆｏｍａｔｉｃｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｚｖｓｉｓ（２００４）； Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｒｏｍ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２００６）；およびＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２００２）（すべてＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓから）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、ｅｄｓ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）；Ｔ．Ｂｒｏｗｎ編、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ； Ｇｏｅｄｄｅｌ編、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９１）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａ．Ｂｏｔｈｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．、ｅｄｓ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｅｓ（１９９０）、Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌ．；Ｍ．Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（１９９０）、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ；Ｒ． Ｗｕ ｅｔ ａｌ．編、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（１９８９）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｍ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、ＰＣＲ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９１）、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｓｔｒｙｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（４ｔｈ Ｅｄ。）（１９９５）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｎ．Ｙ．Ｇａｉｔ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（２００２）、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ；Ｎｅｌｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｘ、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０００）３ｒｄ Ｅｄ．、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｕｂ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．；Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００２）５ｔｈ Ｅｄ．、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｕｂ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．のような標準的な実験室マニュアルに見出すことができる。これらの全ては、そのすべての目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用されるように、単数形（「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、他に示されない限り、複数の参照を含む。例えば、（単数形の）「ａ」サンプルは、１以上のサンプルを含む。

本明細書に開示された態様および実施形態は、「からなる」、および/または「実質的にからなる」態様および実施形態を含むことが理解される。

本明細書で、「結合」という用語は、分子が互いに非常に近接している安定した会合をもたらす、２つの分子間の誘因力の強い相互作用を指すために使用される。 分子結合は、以下のタイプ：非共有、可逆的共有および不可逆共有結合に分類することができる。分子結合に関与することができる分子には、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、脂質、および医薬化合物のような有機小分子が含まれる。他の分子と安定な複合体を形成するポリペプチドはしばしば受容体と呼ばれ、その結合パートナーはリガンドと呼ばれる。ポリヌクレオチドはまた、それら自身または他のもの、例えばＤＮＡ−タンパク質複合体、ＤＮＡ−ＤＮＡ複合体、ＤＮＡ−ＲＮＡ複合体と安定な複合体を形成することもできる。

用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指すために本明細書では互換的に使用され、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、その類似体、それらの混合物を含んでもよい。この用語は、分子の一次構造のみを指す。したがって、この用語は、三本鎖、二本鎖および一本鎖デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）ならびに三本鎖、二本鎖および一本鎖リボ核酸（「ＲＮＡ」）を含む。それはまた、例えば、アルキル化、および／またはキャッピングといった修飾、および修飾されていない形態のポリヌクレオチドを含む。より具体的には、用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）（ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈＲＮＡ、スプライシングされているまたはされていないｍＲＮＡ、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−またはＣ−グリコシドである任意の他のタイプのポリヌクレオチド、およびノルヌクレオシド主鎖を含む他のポリマー、例えばポリアミド（例えば、ペプチド核酸（「ＰＮＡ」」））およびポリモルフォルノ（Ｎｅｕｇｅｎｅとして、Ａｎｔｉ−Ｖｉｒａｌｓ、Ｉｎｃ．Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ、ＯＲ．から市販されている）ポリマー、およびポリマーがＤＮＡやＲＮＡに見られるような塩基対の形成や積み重ねを可能にする形態で核酸塩基を含むことを提供する他の合成配列特異的核酸ポリマーなどがある。したがって、これらの用語は、例えば、３’−デオキシ−２’、５’−ＤＮＡ、オリゴデオキシリボヌクレオチドＮ３’−Ｐ５’ホスホラミデート、２’−Ｏ−アルキル置換ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡのハイブリッド、またはＰＮＡとＤＮＡまたはＲＮＡのハイブリッドを含む。また、既知の修飾、例えば、ラベル化、アルキル化、「キャップ」、１つ以上のヌクレオチドの類似体による置換、例えば、非荷電結合（例えば、メチルスルホン化、ホスホトリエステル化、ホスホロアミノ酸化、カルバミン酸化など）、負電荷結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）および正電荷結合（例えば、アミノアルキルホスホラミデート、アミノアルキルホスホトリエステレート）を有するもの、ペンダント部分を含むもの、例えば、タンパク質（酵素（例えばヌクレアーゼ）を含む）、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレートを含むもの（例えば、金属、放射性金属、ホウ素酸化金属など）、アルキル化剤を含むもの、修飾された結合を有するもの（例えば、アルファアノマー核酸など）、といったヌクレオチド間の修飾、ならびにポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの未修飾形態を含む。

本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」は、既知のプリンおよびピリミジン塩基だけでなく、修飾された他の複素環塩基も含む部分を含むことが理解される。 そのような修飾には、メチル化プリンまたはピリミジン、アシル化プリンまたはピリミジン、または他の複素環が含まれる。修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドはまた、例えば、ヒドロキシル基の１つ以上がハロゲン、脂肪族基で置換されているか、またはエーテル、アミンなどとして官能化されている糖部分の修飾を含むことができる。用語「ヌクレオシド単位」は、ヌクレオシドおよびヌクレオチドを包含することを意図する。

「核酸プローブ」および「プローブ」は交換可能に使用され、対応する標的に結合することができる核酸配列を含む、上で定義したポリヌクレオチドを含む構造を指す。プローブのポリヌクレオチド領域は、ＤＮＡ、および／またはＲＮＡ、および／または合成ヌクレオチド類似体から構成され得る。

本明細書中で使用される場合、「相補的または適合される」とは、２つの核酸配列が少なくとも５０％の配列同一性を有することを意味する。好ましくは、２つの核酸配列は、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。「相補的または適合する」はまた、２つの核酸配列が低、中および／または高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得ることを意味する。配列同一性または相同性のパーセンテージは、参照配列の対応する部分に整列されたときに、互いに比較することによって計算される。

本明細書で使用される「実質的に相補的または実質的に一致する」とは、２つの核酸配列が少なくとも９０％の配列同一性を有することを意味する。好ましくは、２つの核酸配列は、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の相同性を有することを意味する。あるいは、「実質的に相補的または実質的に一致する」とは、２つの核酸配列が高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができることを意味する。配列同一性または相同性のパーセンテージは、参照配列の対応する部分に整列されたときに、互いに比較することによって計算される。

一般に、ハイブリッドの安定性は、イオン濃度および温度との相関関係である。典型的には、ハイブリダイゼーション反応は、より低いストリンジェンシーの条件下で行われ、その後、様々であるがより高いストリンジェンシーの洗浄が行われる。中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーションとは、プローブなどの核酸分子が相補的な核酸分子に結合することを可能になる条件をいう。ハイブリダイズした核酸分子は、一般に、例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を含む、少なくとも６０％の同一性を有する。中程度のストリンジェント条件は、４２℃で５０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中でハイブリダイゼーションした後、４２℃で０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳで洗浄するのと同等の条件である。高ストリンジェンシー条件は、例えば、５０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中、４２℃でのハイブリダイゼーション、次いで６５℃で０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳ中での洗浄によって提供することができる。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションとは、２２℃で１０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、６×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳでハイブリダイゼーションした後、３７℃で１×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳで洗浄するのと同等の条件を指す。デンハルト溶液は、１％Ｆｉｃｏｌｌ、１％ポリビニルピロリドン、および１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する。２０×ＳＳＰＥ（塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））は、３Ｍ塩化ナトリウム、０．２Ｍリン酸ナトリウム、および０．０２５Ｍ ＥＤＴＡを含有する。他の適切な中程度のストリンジェンシーおよび高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションバッファーおよび条件は、当業者に周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、 Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ（１９８９）； およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９９）に記載されている。

あるいは、ＲＮＡまたはＤＮＡ鎖が選択的ハイブリダイゼーション条件下でその相補体にハイブリダイズする場合、実質的相補性が存在する。典型的には、選択的ハイブリダイゼーションは、少なくとも１４〜２５ヌクレオチドの長さで、少なくとも約６５％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約９０％の相補性が存在する場合に起こる。Ｍ．Ｋａｎｅｈｉｓａ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：２０３（１９８４）を参照されよ。

本明細書で使用する用語「相同な」、「実質的に相同な」および「実質的な相同性」は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の同一性を有するアミノ酸の配列を意味し、アミノ酸の参照配列と比較した。配列同一性または相同性のパーセンテージは、参照配列の対応する部分にアライメントされたときに互いに比較することによって計算される。

１つの態様においては、ここで提供されるのは、試料中のＳＮＰまたは突然変異を検出するための、ハイスループットシーケンスのようなシーケンスに基づく方法である。いくつかの実施形態では、突然変異は、点突然変異、欠損、挿入、インデル、またはそれらの組み合わせを含み得る。

一実施形態では、この方法は、ＳＮＰおよび／または突然変異部位を含む１つ以上の標的配列を検出するために、１つ以上のプローブおよび／または１つ以上の前増幅プライマー対を設計することを含む。先に述べた実施形態のいずれかにおいて、突然変異部位は、ＳＮＰ、点突然変異、挿入、および／または欠損であり得る。

いくつかの実施形態では、１つ以上のプローブは、１つ以上の検出プローブを含む。先に述べた実施形態のいずれかにおいて、１つ以上の検出プローブは、ＳＮＰまたは点突然変異を検出するための１つ以上の検出プローブＡを含むことができる。先に述べた実施形態のいずれかにおいて、１つまたは複数の検出プローブは、挿入および／または欠損を検出するための１つまたは複数の検出プローブＢをさらに含むことができる。

先に述べた実施形態のいずれかにおいて、各検出プローブＡは、ＳＮＰまたは点突然変異に対応し、特異的に検出することができる。例えば、ＳＬＣ２６Ａ１遺伝子中のＩＶＳ７−２部位の検出プローブＡおよび１２ＳｒＲＮＡ遺伝子の１４９４部位の検出プローブＡは、試料中の対応するＳＮＰまたは点突然変異を検出するための１回以上の反応操作に使用することができる。特定のＳＮＰまたは点突然変異位置の検出プローブＡは、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧで終わる１つまたは複数のプローブを含むことができる。

先に述べた実施形態のいずれかにおいて、各検出プローブＢは、挿入または欠損に対応して特異的に検出することができる。

先に述べた実施形態のいずれかにおいて、１つ以上のＳＮＰ部位を検出するための検出プローブＡは、１つ以上の上流ジェノタイピングプローブＡＳＯ−Ａおよび１つ以上の下流部位特異的プローブＬＳＯ−Ａを含み得る。いくつかの実施形態では、ＡＳＯ−ＡプローブおよびＬＳＯ−Ａプローブは、同じ伸長方向である。先に述べた実施形態のいずれかにおいて、ＡＳＯ−Ａプローブの３’末端は、ＳＮＰ部位の標的配列（野生型または変異体のいずれか）と同一または相補的であり得る。例えば、２つのＡＳＯ−Ａプローブを使用することができ、一方はＳＮＰ部位の野生型標的配列と同一または相補的な３’末端を有し、他方はＳＮＰ部位の変異型標的配列と同一または相補的な３’末端を有する。

先に述べた実施形態のいずれかにおいて、ＡＳＯ−Ａプローブの３’末端ヌクレオチドは、野生型または変異型ＳＮＰ部位のヌクレオチドと同一または相補的であり得る。先に述べた実施形態のいずれかにおいても、ＡＳＯ−Ａプローブの５’末端は、ＳＮＰ部位の標的配列から遊離していてもよい。別の態様では、ＡＳＯ−Ａプローブの５’末端は標的配列とは離れている。いくつかの様態においては、ＡＳＯ−Ａプローブは、標的配列と同一または相補的ではない５’末端配列を含み、５’末端配列は標的配列またはその相補配列にハイブリダイズしない。いくつかの態様において、５’末端配列は、共通プローブ配列Ｐ１を含む。

先に述べた実施形態のいずれかにおいて、各ＳＮＰまたは突然変異は、ＡＳＯ−Ａプローブに対応し得る。例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧの４つすべてが可能な点突然変異部位については、４つのＡＳＯ−Ａプローブをサンプル中の部位を解析するために設計し得る。４つのＡＳＯ−Ａプローブのいずれか１つ以上を反応に使用することができる。したがって、４つのＡＳＯ−Ａプローブの３’末端の塩基は、それぞれＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり得る。各ＡＳＯ−Ａプローブの５’末端は、標的配列とは遊離しており、ユニバーサルプローブＰ１を含む。

いくつかの実施形態では、４つのＡＳＯ−Ａプローブのうちの３つを使用することができる。例えば、２つのＡＳＯ−Ａプローブの３’末端の塩基は、それぞれ野生型または変異状態のＳＮＰ部位に相補的である。第３のＡＳＯ−Ａプローブは、最初の２つのＡＳＯ−Ａプローブの３’末端ヌクレオチドとは異なる３’末端ヌクレオチドを含む。各ＡＳＯ−Ａプローブの５’末端は、標的配列から遊離しており、ユニバーサルプローブＰ１を含む。

いくつかの実施形態では、４つのＡＳＯ−Ａプローブのうちの２つを使用することができる。例えば、２つのＡＳＯ−Ａプローブの３’末端の塩基は、それぞれ野生型または変異状態のＳＮＰ部位に相補的である。各ＡＳＯ−Ａプローブの５’末端は、標的配列から分離しており、ユニバーサルプローブＰ１を含む。

いくつかの実施形態では、４つのＡＳＯ−Ａプローブのうちの１つが使用される。ＡＳＯ−Ａプローブの３’末端ヌクレオチドは、検出されるＳＮＰまたは突然変異のヌクレオチドと同一または相補的である。

先の実施形態のいずれかにおいて、ＬＳＯ−Ａプローブの５’末端は、標的配列と同一または相補的であり得る。一態様では、ＬＳＯ−Ａプローブの５’末端ヌクレオチドは、プローブ伸長の方向でＳＮＰ部位のすぐ下流の標的配列の最初のヌクレオチドと同一または相補的である。

先に述べた実施形態のいずれかにおいても、ＬＳＯ−Ａプローブの３’末端は、ＳＮＰ部位の標的配列を含まなくてもよい。別の態様では、ＬＳＯ−Ａプローブの３’末端は標的配列から離れている。いくつかの態様において、ＬＳＯ−Ａプローブは、標的配列と同一または相補的ではない３’末端配列を含み、３’末端配列は標的配列またはその相補配列にハイブリダイズしない。いくつかの態様では、３’末端配列は共通プローブ配列Ｐ２を含む。

先に述べた実施形態のいずれかにおいて、ＬＳＯ−Ａプローブの５’末端はリン酸化され得る。一態様では、ＬＳＯ−Ａプローブの５’末端ヌクレオチドはリン酸化される。

先に述べた実施形態のいずれにおいても、挿入／欠損変異部位を検出するための検出プローブＢは、挿入／欠損変異を検出するための上流ジェノタイピングプローブＡＳＯ−Ｂ、野生型配列を検出するための上流ジェノタイピングプローブＡＳＯ−Ｂ、および下流部位特異的プローブＬＳＯ−Ｂを含む。３つのプローブは同じ伸長方向であり得る。

１つの局面において、挿入／欠損変異を検出するための上流ジェノタイピングプローブＡＳＯ−Ｂは、挿入を検出するための上流ジェノタイピングプローブＡＳＯ−Ｂおよび／または欠損を検出するための上流ジェノタイピングプローブＡＳＯ−Ｂを含む。

先に述べた実施形態のいずれかにおいて、挿入を検出するための上流ジェノタイピングプローブＡＳＯ−Ｂプローブの３’末端は、標的配列と同一または相補的な配列、および／または挿入配列と同一または相補的な配列を含むことができる。一態様では、ＡＳＯ−Ｂプローブの３’末端ヌクレオチドは、挿入された配列の最後のヌクレオチド、例えば、挿入された配列の５’末端ヌクレオチドと同一であるかまたは相補的である。

野生型配列を検出するための上流ジェノタイピングプローブＡＳＯ−Ｂプローブの３’末端は、挿入されていない野生型標的配列と同一または相補的であってもよく、一態様では、ＡＳＯ−Ｂプローブの３’末端ヌクレオチドは、挿入部位のすぐ上流の野生型配列のヌクレオチドと同一または相補的である。

先に述べた実施形態のいずれかにおいて、欠損を検出するための上流ジェノタイピングプローブＡＳＯ−Ｂプローブの３’末端は、欠損配列の上流の標的配列と同一または相補的な配列、および／または欠損配列の下流の標的配列と同一または相補的な配列を含み得る。一態様では、ＡＳＯ−Ｂプローブの３’末端ヌクレオチドは、欠損配列の最初のヌクレオチドのすぐ５’である野生型配列のヌクレオチドと同一または相補的である。一態様では、ＡＳＯ−Ｂプローブの３’末端ヌクレオチドは、欠損配列の最初のヌクレオチドのすぐ上流（５’から３’方向の）にある野生型配列のヌクレオチドと同一または相補的である。一態様では、ＡＳＯ−Ｂプローブの３’末端ヌクレオチドは、欠損部位の次の第１上流ヌクレオチドと同一または相補的である。

いくつかの様態において、挿入／欠損変異部位の標的配列は、ｎ番目の塩基の前に挿入または欠損を有する野生型標的配列である。

先に述べた実施形態のいずれかにおいて、下流部位特異的プローブＬＳＯ−Ｂの５’末端は、野生型部位の標的配列と同一または相補的であってもよく、５’末端ヌクレオチドは、プローブ伸長方向で野生型部位配列のｎ番目のヌクレオチドに同一または相補的であり得る。

先に述べた実施形態のいずれかにおいて、ＬＳＯ−Ｂプローブの３’末端は標的配列を含まず、ユニバーサルプローブＰ２を含むことができる。

先に述べた実施形態のいずれかにおいて、ＳＮＰまたは突然変異部位の上流ジェノタイピングプローブＡＳＯおよび対応する下流部位特異的プローブＬＳＯは、分析されるべき遺伝子座を含む配列を得るために、重複またはギャップなしで互いに連結され得る。一態様では、配列は標的配列の逆相補配列を含む。

先に述べた実施形態のいずれかにおいて、第１プローブと第２プローブとの連結は、ライゲーションによって行うことができる。他の実施形態では、１つ以上のアダプター（例えば、第１プローブと第２プローブとの間の標的配列にハイブリダイズするアダプター配列）を用いて、その後、第１のプローブをアダプターに連結し、アダプターを第２のプローブに連結してカップリングを行うことができる。

先に述べた実施形態のいずれかにおいて、前増幅プライマー対は、１つ以上の前増幅プライマー対を含むことができる。一態様では、前増幅プライマー対は、１つ以上の標的ＳＮＰまたは突然変異部位を含む標的配列を増幅することができる。

先に述べた実施形態のいずれかにおいて、各前増幅プライマー対の一方のプライマーの５’末端は、例えばビオチンで標識することができる。

先に述べた実施形態のいずれかにおいて、本明細書中に開示される方法は、例えば、標的配列が標識されたポリヌクレオチドを得るために、本明細書中に開示される１以上の前増幅プライマー対を用いて試験サンプルを前増幅するステップを含み得る。

先に述べた実施形態のいずれかにおいて、本明細書中に開示される方法は、標的配列の前増幅されたポリヌクレオチド（例えば、ビオチン標識された核酸）とハイブリダイズし、ハイブリダイゼーション産物を得るために、１つ以上の検出プローブＡ、検出プローブＡの混合物、１つ以上の検出プローブＢ、および／または検出プローブＢの混合物を使用するステップをさらに含み得る。

先に述べた実施形態のいずれかにおいて、本明細書中に開示される方法は、ＤＮＡリガーゼを用いてハイブリダイゼーション産物を連結して、１以上のシーケンス標的配列を得るステップをさらに含み得る。

先に述べた実施形態のいずれかにおいて、本明細書中に開示される方法は、標的増幅産物のシーケンス結果を得るために、バーコード特異的プライマーおよび共通プライマーを用いて、標的配列を増幅および配列決定するステップをさらに含み得る。１つの態様において、バーコードプライマーおよび共通プライマーの３’末端の２０塩基は、ユニバーサルプローブ配列Ｐ１またはＰ２にそれぞれ相補的である。別の態様では、バーコード特異的プライマーは、Ａ、Ｔ、Ｃ、およびＧのランダムヘキサマー配列であるバーコード配列ＸＸＸＸＸＸを含み、各組み合わせを用いて異なるサンプルを同定することができる。

先に述べた実施形態のいずれかにおいて、本明細書中に開示される方法は、試験サンプルが変異部位を含有するかどうかおよび／または変異部位の遺伝子型を決定するために、シーケンス結果を解析するステップをさらに含み得る。

試験サンプルが変異部位を含むかどうかを決定する、または変異部位遺伝子型を決定するためのシーケンス結果の解析は、変異を含む標的配列の逆相補配列とシーケンス結果との比較を含み得る。標的配列の逆相補配列と同じ配列を有するシーケンス結果中の配列の数は、変異のコピー数として記録される。シーケンス結果の総数における変異コピー数の比率が計算される。次いで、その比に基づいてサンプル中の部位の遺伝子型情報を決定することができる。

一態様では、部位の遺伝子型情報を解析することは、既知の情報および統計解析に基づいて、適切な閾値を設定し、閾値に従って位置の情報を決定することによって行われる。

一実施形態では、変異部位の比率が９０％より大きい場合、試験サンプルは変異部位を含むか、または含む可能性が高く、または試験サンプルの遺伝子型は変異部位のホモ接合体またはホモ接合変異部位の候補である。変異部位の比率が２０〜９０％である場合、試験サンプルは変異部位を含むか、または含む可能性が高く、または試験サンプルの遺伝子型はヘテロ接合変異部位またはヘテロ接合変異部位の候補である。変異部位比が２０％未満である場合、試験サンプルは変異部位を含有していないか、または含有していない可能性が高く、または試験サンプルの遺伝子型は野生型または野生型試料の候補である。

シーケンス結果の解析は、野生型標的配列の逆相補配列をシーケンス結果と比較することを含むことができる。野生型標的配列の逆相補配列と同じ配列を有するシーケンス結果中の配列の数を野生型配列のコピー数として記録する。シーケンス結果の総数における野生型コピー数の比が計算される。次いで、その比に基づいて試料中の部位の遺伝子型情報を決定することができる。配列決定の結果の総数は、野生型コピー数と突然変異コピー数の合計に等しい。

先の実施形態のいずれかにおいて、突然変異部位は、ＳＮＰ部位および／または挿入／欠損変異部位であり得る。

先の実施形態のいずれかにおいて、検出プローブは、（ＳＮＰまたは点突然変異遺伝子座のための）複数の検出プローブＡおよび／または（欠損および／または挿入のための）複数の検出プローブＢを含むことができる。

先の実施形態のいずれかにおいて、各プローブは等モル比で混合され得る。

先の実施形態のいずれかにおいて、前増幅プライマーは、複数の前増幅プライマー対の等モル混合物を含むことができる。

先の実施形態のいずれかにおいて、サンプルは１つ以上のサンプルであり得、各バーコード特異的プライマーは１つのサンプルに対応し得る。

先の実施形態のいずれかにおいて、検出プローブＡは等モル比の複数の検出プローブＡの混合物であってもよい。

先の実施形態のいずれかにおいて、検出プローブＢは等モル比の複数の検出プローブＢの混合物であってもよい。

先の実施形態のいずれかにおいて、前増幅の後、本方法は、例えば、ビオチン標識核酸を得るために、システム内の前増幅プライマーおよびｄＮＴＰを除去するために、前増幅産物にエキソヌクレアーゼＩおよび／またはアルカリホスファターゼを添加することをさらに備えることができる。

先の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、ハイブリダイゼーション産物を吸着および捕捉するために、磁気ビーズを用いるステップをさらに含むことができる。

先の実施形態のいずれかにおいて、シーケンスステップは、第２世代シーケンス法を用いることを含むことができる。

先の実施形態のいずれかにおいて、検出プローブは、ＳＮＰまたは突然変異を検出するための２つの検出プローブＡおよび欠損および／または挿入を検出するための３つの検出プローブＢを含むことができる。

先の実施形態のいずれかにおいて、ＳＮＰ部位は１４９４Ｃ＞Ｔおよび／またはＩＶＳ７−２Ａ＞Ｇであり得る。

先の実施形態のいずれかにおいて、欠損または挿入変異部位は、２３５ｄｅｌＣ、１７６ＤＥＬ１６および／または２９９ｄｅｌＡＴであり得る。

先の実施形態のいずれかにおいて、検出プローブＡは１４９４Ｃ＞Ｔに対するプローブを含むことができる。一態様では、プローブは、配列番号：２１に示すポリヌクレオチド配列を含むＡＳＯ−Ａプローブ、配列番号：２２に示すポリヌクレオチド配列を含むＡＳＯ−Ａプローブ、配列番号：２３に示すポリヌクレオチド配列を含むＡＳＯ−Ａプローブ、および／または配列番号：２４に示すポリヌクレオチド配列を含むＡＳＯ−Ａプローブを含むことができる。先の実施形態のいずれかにおいて、プローブは、ＬＳＯ−Ａプローブ、例えば、配列番号：２５に示すポリヌクレオチド配列を含むプローブを含むことができる。

先の実施形態のいずれかにおいて、検出プローブＡは、ＩＶＳ７−２Ａ＞Ｇに対するプローブを含むことができる。一態様では、プローブは、配列番号：７に示すポリヌクレオチド配列を含むＡＳＯ−Ａプローブ、配列番号：８に示すポリヌクレオチド配列を含むＡＳＯ−Ａプローブ、配列番号：９に示すポリヌクレオチド配列を含むＡＳＯ−Ａプローブ、および／または配列番号：１０に示すポリヌクレオチド配列を含むＡＳＯ−Ａプローブを含むことができる。先の実施形態のいずれかにおいて、プローブは、ＬＳＯ−Ａプローブ、例えば、配列番号：１１に示すポリヌクレオチド配列を含むプローブを含むことができる。

先の実施形態のいずれかにおいて、検出プローブＢは、２３５ｄｅｌＣに対するプローブを含むことができる。一態様では、プローブは、配列番号：１５に示すポリヌクレオチド配列を含むＡＳＯ−Ｂプローブ、および／または配列番号：１６に示すポリヌクレオチド配列を含むＡＳＯ−Ｂプローブを含むことができる。先の実施形態のいずれかにおいて、プローブは、ＬＳＯ−Ｂプローブ、例えば、配列番号：１７に示すポリヌクレオチド配列を含むプローブを含むことができる。

先の実施形態のいずれかにおいて、検出プローブＢは、１７６ＤＥＬ１６に対するプローブを含むことができる。一態様では、プローブは、配列番号：１２に示すポリヌクレオチド配列を含むＡＳＯ−Ｂプローブ、および／または配列番号：１３に示すポリヌクレオチド配列を含むＡＳＯ−Ｂプローブを含むことができる。先の実施形態のいずれかにおいて、プローブは、ＬＳＯ−Ｂプローブ、例えば、配列番号：１４に示すポリヌクレオチド配列を含むプローブを含むことができる。

先の実施形態のいずれかにおいて、検出プローブＢは、２９９ｄｅｌＡＴに対するプローブを含むことができる。一態様では、プローブは、配列番号：１８に示すポリヌクレオチド配列を含むＡＳＯ−Ｂプローブ、および／または配列番号：１９に示すポリヌクレオチド配列を含むＡＳＯ−Ｂプローブを含むことができる。先の実施形態のいずれかにおいて、プローブは、ＬＳＯ−Ｂプローブ、例えば、配列番号：２０に示すポリヌクレオチド配列を含むプローブを含むことができる。

先の実施形態のいずれにおいても、前増幅プライマーは、１７６ｄｅｌ１６，２９９ｄｅｌＡＴおよび／または２３５ｄｅｌＣを増幅するためのプライマー対を含むことができる。

先の実施形態のいずれかにおいて、前増幅プライマーは、１４９４Ｃ＞Ｔを増幅するためのプライマー対を含むことができる。

先の実施形態のいずれかにおいて、前増幅プライマーは、ＩＶＳ７−２Ａ＞Ｇを増幅するためのプライマー対を含むことができる。

先の実施形態のいずれかにおいて、前増幅プライマーは、配列番号：２８の一本鎖ポリヌクレオチド配列を含むプライマーと、配列番号：２９の一本鎖ポリヌクレオチド配列を含む別のプライマーを有するプライマー対を含むことができる。

先の実施形態のいずれかにおいて、前増幅プライマーは、配列番号：２６の一本鎖ポリヌクレオチド配列を含むプライマーと、配列番号：２７の一本鎖ポリヌクレオチド配列を含む別のプライマーを有するプライマー対を含むことができる。

先の実施形態のいずれかにおいて、前増幅プライマーは、配列番号：３０の一本鎖ポリヌクレオチド配列を含むプライマーと、配列番号：３１の一本鎖ポリヌクレオチド配列を含む別のプライマーを有するプライマー対を含むことができる。

一態様では、本明細書に開示されるのは、１つ以上のＳＮＰまたは突然変異部位を検出するためのキットである。一実施形態では、キットは、１４９４Ｃ＞Ｔを検出するための１つ以上の検出プローブＡ、ＩＶＳ７−２Ａ＞Ｇを検出するための１つ以上の検出プローブＡ、２３５ｄｅｌＣを検出するための１つ以上の検出プローブＢ，１７６ＤＥＬ１６を検出するための１つ以上の検出プローブＢおよび／または２９９ｄｅｌＡＴを検出するための１つ以上の検出プローブＢを含む。先の実施形態のいずれかにおいて、キットは、１７６ｄｅｌ１６，２９９ｄｅｌＡＴおよび／または２３５ｄｅｌＣを増幅するための前増幅プライマー対、１４９４Ｃ＞Ｔを増幅するための前増幅プライマー対、ＩＶＳ７−２Ａ＞Ｇを増幅するための前増幅プライマー対をさらに含む。

先の実施形態のいずれかにおいて、突然変異部位は１４９４Ｃ＞Ｔ、ＩＶＳ７−２Ａ＞Ｇ、２３５ｄｅｌＣ、１７６ＤＥＬ１６および／または２９９ｄｅｌＡＴを含み得る。

先の実施形態のいずれかにおいて、バーコードプライマーヌクレオチド配列は、配列番号：３２のポリヌクレオチド配列を含むことができる。

先の実施形態のいずれかにおいて、共通プライマーヌクレオチド配列は、配列番号：３３のポリヌクレオチド配列を含むことができる。

先の実施形態のいずれかにおいて、複数のＳＮＰおよび／または突然変異の検出は、本明細書中に開示される方法を用いて実施され得る。例えば、サンプル中の異なる標的ポリヌクレオチドを増幅するために、複数の前増幅プライマーを混合することができる。別の態様では、複数の検出プローブを混合し、サンプル中の異なる標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせることができる。

先の実施形態のいずれかにおいて、変異部位は、２３５ｄｅｌＣ（Ｃの欠損）、１７６ｄｅｌ１６（１６ｂｐの欠損）、２９９ｄｅｌＡＴ（ＡＴの欠損）、ＩＶＳ７−２Ａ＞Ｇ（ＡがＧに変異した）および／または１４９４Ｃ＞Ｔ（ＣがＴに変異した）を含むことができる。

先の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、ハイブリダイゼーションおよびビーズによるハイブリダイゼーション産物の捕捉をさらに含み得る。１つの態様では、適切な濃度の検出プローブＡＳＯおよびＬＳＯ、ならびにサンプル（前処理あり、または、前処理なし）を反応系に添加する。別の態様では、適切な塩濃度を有するハイブリダイゼーション溶液または結合緩衝液を添加する。次いで、反応物を高温下で変性させ、次いで低温でアニーリングすることにより、ＡＳＯおよびＬＳＯプローブ配列とＳＮＰまたは変異部位周辺の標的ポリヌクレオチド中の配列は完全にハイブリダイズされる。アニーリングが完了した後、ビーズを加え、反応を適当な温度でインキュベートする。インキュベーションの完了後、洗浄バッファーおよびＴａｑライゲーションバッファーを用いてビーズを洗浄して、ハイブリダイズしていないプローブを除去する。

洗浄が完了した後、ＤＮＡリガーゼを用いて、標的配列に結合したプローブを適切な温度でライゲーションする。一態様では、ライゲーションが完了した後にプローブを連結した後、ライゲーション溶液を廃棄し、ビーズを適切な量のｄｄＨ_２Ｏに再懸濁する。次いで、再懸濁したビーズを加熱して、ライゲーションされたプローブを解離させる。

１つの局面において、ライゲーションされたプローブは、バーコードプライマーおよび／または共通プライマーを使用して、例えばＰＣＲによって増幅および／またはシーケンスされる。

１つの態様において、サンプルは、ハイブリダイゼーションのために２つに分けることができる。これらのうちの１つについては、に野生型配列の検出プローブのみがハイブリダイゼーションのために添加される。他方については、ハイブリダイゼーションのために、突然変異配列の検出プローブ（例えば、ＳＮＰまたは点突然変異については、野生型プローブを除く他の３つのプローブ）を加える。次いでサンプルをライゲーションに供し、バーコードプライマーおよび／または共通プライマーを用いて増幅する。増幅産物を定量することができ、その部分を既知の比に従って混合することができ、次いでこの混合物をシーケンス、例えばハイスループットシーケンスに供する。このように、大規模ＳＮＰ突然変異スクリーニングを低頻度突然変異の検出に使用する場合、突然変異特異的プローブは突然変異座を検出するためにのみ使用でき、それによりシーケンススペースを効果的に使用し、シーケンスのコストを節約することができる。

いくつかの態様では、本明細書の方法によって提供される技術的改善は、以下を含む。
（１）前増幅ステップの導入は、５０コピー未満の核酸が検出され得るように系の感度を大きく増加させる。

（２）試料標識ステップが簡単である。追加の標識ステップを必要とせずに、前増幅の進行中に試料を標識することができる。

（３）前増幅後、検出のための特異的プローブが使用され、濃縮される。アンプリコンシーケンス法と比較して、本方法は、前増幅における非特異的増幅産物の影響を排除する。これは、データ解析に有用である。

（４）データベースを構築する方法が簡便である。ゲノム断片や人工的な連結などの煩わしい作業が不要である。

（５）ＤＮＡリガーゼを使用することで、ＳＮＰヌクレオチドを直接区別し、伸長によって生じるランダムな変異のプロセスを回避し、それによってシーケンスの精度を向上させる。

（６）プローブは、大規模なサンプルスクリーニングに用いることができ、シーケンスのコストを大幅に低減する。

（７）全ての配列が既知であるため、データ解析が容易である。

（８）部位選択の融通が利く。この方法は、適度な数の突然変異の大規模なサンプルスクリーニングを行うには理想的である。

一態様では、ＤＮＡリガーゼの特徴に基づいて、本開示は、ＳＮＰ部位情報に従って２つの隣接するプローブを設計するライブラリー構築方法を提供する。一態様では、プローブのうちの１つの３'末端はＳＮＰ部位に対応する。一態様では、２つの隣接するプローブがＳＮＰ部位配列に対して完全に相補的である場合、それらはＤＮＡリガーゼによって連結され得る；それ以外の場合はライゲーションされない。プローブ中のユニバーサルプライマー配列を用いることにより、ＰＣＲ増幅およびライブラリー構築を行うことができる。その後、ＳＮＰサイト配列情報のハイスループットシーケンスおよび解析のために、第２世代シーケンス技術を使用することができる。一態様では、複数の部位を検出するための異なるプローブの組み合わせによって、複数の遺伝子座の同時分析を達成することができる。バーコードプライマーを使用して、サンプルを混合することができ、各サンプルはバーコードプライマーによって同定される。例えば、サンプルは既知の比に従って混合し、その後同時にシーケンスされ、マルチサイト、マルチサンプルおよびハイスループット試験を達成する。遺伝子突然変異の大規模な集団スクリーニングを行う場合、より効率的なシーケンススペースの使用とより低コストでの検出のために、変異プローブは単独で使用される。

本開示の装置における様々な実施形態は、漸進的に説明される。様々な実施形態間の差異は、明細書において強調されているが、その共通の構造は、明細書から引用することができる。

実施形態１：試験サンプル中の変異部位を検出するためのハイスループットシーケンスに基づく方法であって、以下のステップを含む方法。

１）既知の突然変異部位の標的配列を検出するためのプローブおよび前増幅プライマー対を設計する。前記突然変異部位はＳＮＰ部位および挿入／欠損である。前記検出プローブは、ＳＮＰ遺伝子座を検出するための１以上の検出プローブＡおよび／または挿入または欠損を検出するための１以上の検出プローブＢである。前記各プローブＡまたはプローブＢは前記突然変異部位の１つに対応し、前記ＳＮＰ部位を検出するための前記検出プローブＡは、上流ジェノタイピングプローブＡＳＯ−Ａおよび下流部位特異的プローブＬＳＯ−Ａを含み；前記ＡＳＯ−Ａプローブおよび前記ＬＳＯ−Ａプローブは同じ伸長方向を有する。前記ＡＳＯ−Ａプローブの３’末端は、野生型または変異体のＳＮＰ部位の標的配列と同一または相補的であり；前記ＡＳＯ−Ａプローブの３’末端ヌクレオチドは野生型または変異体のＳＮＰ部位と同一または相補的であり；前記ＡＳＯ−Ａプローブの５’末端は、野生型または変異体のＳＮＰ部位の標的配列を含まず、ユニバーサルプローブＰ１である。前記各ＳＮＰ突然変異は、ＡＳＯ−Ａプローブに対応する。前記ＬＳＯ−Ａプローブの５’末端は、野生型または変異体のＳＮＰ部位の標的配列と同一または相補的であり；前記ＬＳＯ−Ａプローブの５’末端ヌクレオチドは、末端ヌクレオチドリン酸化を伴い、プローブ伸長方向でＳＮＰ部位の標的配列の第１のヌクレオチドと同一または相補的であり、前記ＬＳＯ−Ａプローブの３’末端は標的配列を含まず、ユニバーサルプローブＰ２である。挿入／欠損変異部位を検出するための前記検出プローブＢは、挿入／欠損変異を検出するための上流ジェノタイピングプローブＡＳＯ−Ｂ、野生型検出用の上流ジェノタイピングプローブＡＳＯ−Ｂ、および下流部位特異的プローブＬＳＯ−Ｂを含む。前記３つのプローブは同じ伸長方向を有し、挿入／欠損変異を検出するための上流ジェノタイピングプローブＡＳＯ−Ｂは、挿入を検出するための上流ジェノタイピングプローブＡＳＯ−Ｂまたは欠損を検出するための上流ジェノタイピングプローブＡＳＯ−Ｂである。挿入を検出するための前記上流ジェノタイピングプローブＡＳＯ−Ｂプローブの３’末端は、野生型または変異体における挿入部位の標的配列と同一または相補的であり；前記ＡＳＯ−Ｂプローブの３’末端ヌクレオチドは挿入部位の最後のヌクレオチドと同一または相補的であり；欠損を検出するための前記上流ジェノタイピングプローブＡＳＯ−Ｂプローブの３’末端は、野生型または変異体の欠損部位の標的配列と同一または相補的であり；前記ＡＳＯ−Ｂプローブの３’末端ヌクレオチドは、欠損部位の次の第１上流ヌクレオチドと同一または相補的であり；挿入／欠損変異部位の標的配列は、ｎ番目の塩基の前に挿入または欠損を有する野生型標的配列である。下流部位特異的プローブＬＳＯ−Ｂの５’末端は野生型部位の標的配列と同一または相補的であり、５’末端ヌクレオチドはプローブの延伸方向で野生型部位配列のｎ番目のヌクレオチドと同一または相補的である。前記ＬＳＯ−Ｂプローブの３’末端は標的配列を含まず、ユニバーサルプローブＰ２である；突然変異部位の各上流ジェノタイピングプローブＡＳＯおよび対応する下流部位特異的プローブＬＳＯは、重複またはギャップなしで相互に連結され、標的配列の逆相補配列を得る。前記前増幅プライマー対は１つ以上の前増幅プライマー対であり、前記前増幅プライマー対は前記１つ以上の標的突然変異部位を増幅することができ、前記前増幅プライマー対の各々の５’末端はビオチンで標識される；
２）ビオチン標識された核酸を得るために、１以上の前増幅プライマー対によって、試験サンプルを前増幅する；
３）前記検出プローブＡの１つ、複数の前記検出プローブＡの混合物、前記検出プローブＢの１つ、および／または複数の前記検出プローブＢの混合物を用いて、前記ビオチン標識された核酸とハイブリダイズし、ハイブリダイゼーション産物を得る；
４）前記ハイブリダイゼーション産物をＤＮＡリガーゼを用いて連結し、シーケンス標的配列を得る；
５）標的増幅産物のシーケンス結果を得るために、バーコード特異的プライマーおよび共通プライマーによって標的配列を増幅およびシーケンスする。バーコードプライマーおよび共通プライマーの３’末端の２０塩基は、ユニバーサルプローブＰ１またはＰ２に相補的である。前記バーコード特異的プライマーは、Ａ、Ｔ、ＣおよびＧのランダム配列であるバーコード配列ＸＸＸＸＸＸサンプルを含有し、異なる組み合わせに基づいて異なるサンプルを決定する；
６）シーケンス結果を分析して、試験サンプルが突然変異部位を含むかどうかを決定する、または突然変異部位の遺伝子型を決定する。

実施形態２：実施形態１に記載の方法であって、ステップ１）において、前記検出プローブは、前記ＳＮＰを検出するための複数の検出プローブＡおよび欠損または挿入変異部位を検出するための複数の検出プローブＢを備え、各プローブは等モル比で混合され；ステップ２）において、前記複数の前記前増幅プライマーは、前記複数の前増幅プライマー対の等モル混合物であり、前記試験サンプルは１つ以上であり、各バーコード特異的プライマーは１つの試験サンプルに対応し；ステップ３）において、前記複数の検出プローブＡの混合物は等モル比の複数の検出プローブであり、前記複数の検出プローブＢの混合物は等モル比の複数の検出プローブＢである、方法。

実施形態３：実施形態１または２に記載の方法であって、ステップ２）において、前増幅の後、エキソヌクレアーゼＩおよびアルカリホスファターゼを前記前増幅産物に添加して、前増幅プライマーおよびｄＮＴＰを反応系から除去し、ビオチン標識核酸を得るステップをさらに含む、方法。

実施形態４：実施形態１〜３のいずれか１つに記載の方法であって、ステップ３）において、ハイブリダイゼーションの間に、磁気ビーズがハイブリダイゼーション産物を吸着および捕捉する、方法。

実施形態５：実施形態１〜４のいずれか１つに記載の方法であって、ステップ５）において、第２世代シーケンス機器を用いるシーケンスを含む、方法。

実施形態６：実施形態１〜５のいずれか１つに記載の方法であって、前記検出プローブが、ＳＮＰを検出するための２つの検出プローブＡと、欠損または挿入を検出するための３つの検出プローブＢとをさらに含む、方法。前記ＳＮＰ部位は１４９４Ｃ＞ＴおよびＩＶＳ７−２Ａ＞Ｇであり、前記欠損または挿入変異部位は２３５ｄｅｌＣ、１７６ＤＥＬ１６および２９９ｄｅｌＡＴであり；１４９４Ｃ＞Ｔに対応する前記検出プローブＡは、配列番号：２１に示されるプローブＡＳＯ−Ａ、配列番号：２２に示されるプローブＡＳＯ−Ａ、配列番号：２３に示されるプローブＡＳＯ−Ａ、配列番号：２４に示されるプローブＬＳＯ−Ａと、および配列番号：２５に示されるプローブＬＳＯ−Ａとを含む。ＩＶＳ７−２Ａ＞Ｇに対応する前記検出プローブＡは、配列番号：７に示されるプローブＡＳＯ−Ａ、配列番号：８に示されるプローブＡＳＯ−Ａ、配列番号：９に示されるプローブＡＳＯ−Ａ、配列番号：１０に示されるプローブＡＳＯ−Ａ、および配列番号：１１に示されるプローブＬＳＯ−Ａとを含む。２３５ｄｅｌＣに対応する前記検出プローブＡは、配列番号：１５に示されるＡＳＯ−Ｂプローブ、配列番号：１６に示されるＡＳＯ−Ａプローブ、および配列番号：１７に示されるＬＳＯ−Ｂプローブを含む。１７６ＤＥＬ１６に対応する前記検出プローブＡは、配列番号：１２に示されるＡＳＯ−Ｂプローブ、配列番号：１３に示されるＡＳＯ−Ａプローブ、および配列番号：１４に示されるＬＳＯ−Ｂプローブを含む。２９９ｄｅｌＡＴに対応する前記検出プローブＡは、配列番号：１８に示すＡＳＯ−Ｂプローブ、配列番号：１９に示されるＡＳＯ−Ａプローブ、および配列番号：２０に示すＬＳＯ−Ｂプローブを含む。前記前増幅プライマーは、１７６ｄｅｌ１６、２９９ｄｅｌＡＴおよび２３５ｄｅｌＣを増幅するためのプライマー対１、１４９４Ｃ＞Ｔを増幅するためのプライマー対２、およびＩＶＳ７−２Ａ＞Ｇを増幅するためのプライマー対３を含む。前記プライマー対１は、配列番号：２８に示される一本鎖ＤＮＡおよび配列番号：２９に示される一本鎖ＤＮＡを含み、前記プライマー対２は、配列番号：２６に示される一本鎖ＤＮＡおよび配列番号：２７に示される一本鎖ＤＮＡを含み、前記プライマー対３は、配列番号：３０に示される一本鎖ＤＮＡおよび配列番号：３１に示される一本鎖ＤＮＡを含む。

実施形態７：実施形態６において、１４９４Ｃ＞Ｔを検出するための検出用プローブＡ、ＩＶＳ７−２Ａ＞Ｇを検出するための検出用プローブＡ、２３５ｄｅｌＣを検出するための検出用プローブＢ、１７６ＤＥＬ１６を検出するための検出用プローブＢ、２９９ｄｅｌＡＴを検出するための検出用プローブＢ、１７６ｄｅｌ１６，２９９ｄｅｌＡＴおよび２３５ｄｅｌＣを増幅するための前増幅プライマー対１、１４９４Ｃ＞Ｔを増幅するための前増幅プライマー対２およびＩＶＳ７−２Ａ＞Ｇを増幅するための前増幅プライマー対３、を含むキット。前記突然変異部位は１４９４Ｃ＞Ｔ、ＩＶＳ７−２Ａ＞Ｇ、２３５ｄｅｌＣ、１７６ＤＥＬ１６および２９９ｄｅｌＡＴである。

下記の実施例に使用されるすべての方法は、特に指定がない限り、一般的な方法である。下記の実施例に使用されるすべての材料および試薬は、特に指定がない限り、市販のものを使用できる。本発明は下記の実施例によって説明されるが、これに限定されるものではない。下記の実施例の定量的な試験は、３度の反復実験として行われ、結果は平均化されている。図１は本発明の検出方法を示す例である。

混合されたプラスミドサンプル中における、ハイスループットシーケンス技術に基づく、５つの難聴変異部位（ＳＮＰ）の検出。

本実施例においては、複数の難聴部位が検出され、難聴部位を検出するためのプラスミドは、キャピタルバイオコーポレーション（ＣａｐｉｔａｌＢｉｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によって構築された。プラスミドの配列はシークエンシング検証によって確められている。プラスミドの情報は表１に示され、突然変異は、ＳＮＰ、欠損、および／または挿入を含む。

［ｐＧＥＮＴ−２９９ＷＴプラスミドの構築］
２３５、１７６、２９９部位を含む２９９ＷＴ遺伝子断片を得るために、ＸＰＭＳ０２２９Ｆ／ＸＰＭＳ０２２９Ｒプライマーを用いて、ヒトゲノムＤＮＡを増幅した。次いで、２９９ＷＴ断片をｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙベクターにクローニングした。

２３５ｄｅｌＣ（ＧＪＢ２遺伝子の２３５Ｃが欠損している。参照配列ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．：ＫＦ６３８２７５．１、２０１３年１１月３０日提出）、１７６ｄｅｌ１６（ＧＪＢ２遺伝子の１７６〜１９１部位の１６塩基が欠損している。参照配列ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．：ＫＦ６３８２７５．１、２０１３年１１月３０日提出）、２９９ｄｅｌＡＴ（ＧＪＢ遺伝子の２９９〜３００ＡＴ塩基が欠損している。参照配列ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．：ＫＦ６３８２７５．１、２０１３年１１月３０日提出）、を得るために、２９９ＷＴ断片の２３５、１７６、または２９９部位に突然変異を導入した。次いで、ｐＣＭＶ−２３５ｄｅｌＣ，ｐＣＭＶ−１７６ｄｅｌ１６、およびｐＣＭＶ−２９９ＡＴプラスミドを得るために、断片をＰＣＭＶプラスミドにクローニングした。

［ｐＧＥＭＴ−ＩＶＳＡプラスミドの構築］
ＩＶＳ７−２部位（ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子のＩＶＳ７−２部位、参照配列ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．：ＮＧ＿００８４８９、２０１３年７月２５日提出）を含むＩＶＳＡ遺伝子断片を得るために、ＸＰＭＳ０９１９Ｆ／ＸＰＭＳ０９１９Ｒプライマーを用いて、ヒトゲノムＤＮＡを増幅した。次いで、断片をｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙベクターにクローニングした。

ＩＶＳ７−２Ａ＞Ｇ断片（ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子のＩＶＳ７−２部位にＡ＞Ｇの突然変異がある。参照配列ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．：ＮＧ＿００８４８９、２０１３年７月２５日提出）を得るために、ＩＶＳ７−２断片のＩＶＳＡ部位に突然変異を導入した。次いで、ｐＣＭＶ−ＩＶＳＧプラスミドを得るために、断片をＮａｅＩを用いてＰＣＭＶプラスミドにクローニングした。

［ｐＧＥＭＴ−１５５５ＷＴプラスミドの構築］
１４９４部位（ミトコンドリア遺伝子１２ＳｒＲＮＡの１４９４部位、参照配列ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．：Ｊ０１４１５．２、２０１３年７月１７日提出）を含む１４９４ＷＴ遺伝子断片を得るために、ＸＰＭＳ１５５５Ｆ／ＸＰＭＳ１５５５ＦＲプライマーを用いて、ヒトゲノムＤＮＡを増幅した。次いで、断片をｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙベクターにクローニングした。

１４９４Ｃ＞Ｔ断片（ミトコンドリア遺伝子１２ＳｒＲＮＡの１４９４部位にＣ＞Ｔの突然変異がある。参照配列ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．：Ｊ０１４１５．２、２０１３年７月１７日提出）を得るために、１４９４ＷＴ断片の１４９４部位に突然変異を導入した。次いで、ｐＣＭＶ−１４９４Ｃ＞Ｔプラスミドを得るために、断片をＮａｅＩを用いてＰＣＭＶプラスミドにクローニングした。

（Ｉ）プローブと前増幅プライマーの設計
（１）試験サンプルの準備
表１のプラスミドの定量後、プラスミドを下記のように混合した。

実験群Ｉ：ｐＧＥＭＴ−２９９ＷＴ、ｐＧＥＭＴ−ＩＶＳＡ、およびｐＧＥＭＴ−１５５５ＷＴプラスミドを等コピー数（例えば５×１０^３コピー）ずつ、混合した。すなわち、２３５ＷＴ、１７６ＷＴ、２９９ＷＴ、ＩＶＳ７−２ＷＴ、および１４９４ＷＴプラスミドのコピー数は５×１０^３である。したがって、５つのプラスミドは混合物中で等濃度で存在する。そして、混合されたプラスミドを、各プラスミドのコピー数がそれぞれ５×１０^３、１０^３、５×１０^２、１０^２、５×１０^１、および１０^１である６つの試験サンプルを得るために、希釈した。

実験群ＩＩ：ｐＧＥＭＴ−２９９ＷＴ、ｐＧＥＭＴ−ＩＶＳＡ、ｐＧＥＭＴ−１５５５ＷＴ、ｐＣＭＶ−２３５ｄｅｌＣ、ｐＣＭＶ−２９９ｄｅｌＡＴ、ｐＣＭＶ−１７６ｄｅｌ１６、ｐＣＭＶ−１４９４Ｃ＞Ｔ、およびｐＣＭＶ−ＩＶＳＧをそれぞれ５×１０^３コピーずつ、混合した。そして、混合されたプラスミドを、各プラスミドのコピー数がそれぞれ５×１０^３、１０^３、５×１０^２、１０^２、５×１０^１、および１０^１である６つの試験サンプルを得るために、希釈した。

実験群ＩＩにおいて、部位情報によると、混合プラスミド中で、５×１０^３、１０^３、５×１０^２、１０^２、５×１０^１、および１０^１の希釈勾配で、ＳＬＣ２６Ａ４プラスミドの５０％は、変異のあるｐＣＭＶ−ＩＶＳＧプラスミドである（なぜなら、ｐＧＥＭＴ−ＩＶＳＡとｐＣＭＶ−１４９４Ｃ＞Ｔは、等コピー数であるから）。５×１０^３、１０^３、５×１０^２、１０^２、５×１０^１、および１０^１の希釈勾配で、１２ＳｒＲＮＡプラスミドの５０％は、変異のあるｐＣＭＶ−１４９４Ｃ＞Ｔプラスミドである（なぜなら、ｐＧＥＭＴ−１５５５ＷＴとｐＣＭＶ−１４９４Ｃ＞Ｔは、等コピー数であるから）。ｐＧＥＭＴ−２９９ＷＴ、ｐＣＭＶ−２３５ｄｅｌＣ、ｐＣＭＶ−２９９ｄｅｌＡＴ、およびｐＣＭＶ−１７６ｄｅｌ１６プラスミドは、等コピー数であるため、１０^４、２×１０^３、４×１０^２、２×１０^２、および４×１０^１のそれぞれの変異体の希釈勾配で、各プラスミドはＧＪＢ２プラスミドの２５％に相当する。

実験群ＩＩＩ：ｐＣＭＶ−２３５ｄｅｌＣ、ｐＣＭＶ−２９９ｄｅｌＡＴ、ｐＣＭＶ−１７６ｄｅｌ１６、ｐＣＭＶ−１４９４Ｃ＞Ｔ、およびｐＣＭＶ−ＩＶＳＧプラスミドをそれぞれ５×１０^３コピーずつ、混合した。そして、混合されたプラスミドを、各プラスミドのコピー数がそれぞれ５×１０^３、１０^３、５×１０^２、１０^２、５×１０^１、および１０^１である６つの試験サンプルを得るために、希釈した。

実験群ＩＩＩにおいて、部位情報によると、混合プラスミド中で、５×１０^３、１０^３、５×１０^２、１０^２、５×１０^１、および１０^１の希釈勾配で、ＳＬＣ２６Ａ４プラスミドの１００％は変異のあるｐＣＭＶ−ＩＶＳＧプラスミドである。５×１０^３、１０^３、５×１０^２、１０^２、５×１０^１、および１０^１の希釈勾配で、１２Ｓｒプラスミドの１００％は変異のあるｐＣＭＶ−１４９４Ｃ＞Ｔプラスミドである。ｐＣＭＶ−２３５ｄｅｌＣ、ｐＣＭＶ−２９９ｄｅｌＡＴ、およびｐＣＭＶ−１７６ｄｅｌ１６プラスミドは、等コピー数であるため、７．５×１０^３、３×１０^３、１．５×１０^３、３×１０^２、１．５×１０^２および３×１０^１のそれぞれの変異体の希釈勾配で、各プラスミドはＧＪＢ２プラスミドの３３％に相当する。

（２）プローブと前増幅プライマーの設計
１）プローブの設計
原則：
検出プローブは、突然変異部位、例えば、ＳＮＰや挿入および／または欠損に隣接する４０ｂｐのヌクレオチドに従って設計され得る。検出プローブＡはＳＮＰ部位の検出に使用され、検出プローブＢは挿入および／または欠損の検出に使用される。それぞれの検出プローブは約１３ｂｐから約２５ｂｐの間である。

ＳＮＰを検出するための検出プローブＡは、上流ジェノタイピングプローブＡＳＯ−Ａおよび下流部位特異的プローブＬＳＯ−Ａを含み得、ＡＳＯ−ＡとＬＳＯ−Ａプローブは同じ伸長方向である。

一形態において、ＡＳＯ−Ａプローブの３’末端は、ＳＮＰ部位に野生型または変異の塩基が存在する標的配列と同一または相補的である。ＡＳＯ−Ａプローブの３’末端ヌクレオチドは、ＳＮＰ部位の野生型または変異の塩基と同一または相補的である。他の形態において、ＡＳＯ−Ａプローブの５’末端は、ＳＮＰ部位に野生型または変異の塩基が存在する標的配列と離れている。いくつかの形態において、ＡＳＯ−Ａプローブは、標的配列と同一または相補的でない５’末端配列を含み、５’末端配列は標的配列またはその相補配列にハイブリダイズしない。いくつかの形態において、５’末端配列は共通プローブ配列Ｐ１を含む。

ＡＳＯ−Ａプローブは、ＳＮＰ部位の各野生型または変異塩基に一致するように提供され得る。例えば、ＡＳＯ−Ａプローブは１２ＳｒＲＮＡ遺伝子の１４９４Ｃに一致するように提供され、他のＡＳＯ−Ａプローブは１２ＳｒＲＮＡの１４９４Ｔに一致するように提供され得る。

ＬＳＯ−Ａプローブの５’末端は標的配列と同一または相補的である。ＬＳＯ−Ａプローブの５’末端ヌクレオチドは、末端ヌクレオチドリン酸化されており、プローブ伸長方向で、ＳＮＰ部位の下流の標的配列の最初のヌクレオチドに同一または相補的である。一形態において、ＬＳＯ−Ａプローブの３’末端は、ＳＮＰ部位が存在する標的配列から離れている。いくつかの形態において、ＬＳＯ−Ａプローブは、標的配列と同一または相補的でない３’末端配列を含み、３’末端配列は標的配列またはその相補配列にハイブリダイズしない。いくつかの形態において、ＬＳＯ−Ａプローブの３’末端配列はユニバーサルプローブ配列Ｐ２を含み、例えば、配列番号：１１の５’末端から２２〜４２番目のヌクレオチドである。

挿入／欠損を検出するための検出プローブＢは、挿入および／または欠損変異を検出するための、上流ジェノタイピングプローブＡＳＯ−Ｂ（１）、野生型配列を検出するための、上流ジェノタイピングプローブＡＳＯ−Ｂ（２）、および下流部位特異的プローブＬＳＯ−Ｂを含み得る。３つのプローブはすべて同じ伸長方向である。

挿入および／または欠損変異を検出するための、上流ジェノタイピングプローブＡＳＯ−Ｂは、挿入を検出するためのＡＳＯ−Ｂプローブと欠損を検出するためのＡＳＯ−Ｂプローブを含み得る。

一形態において、挿入を検出するためのＡＳＯ−Ｂプローブの３’末端は、挿入配列が存在する標的配列と同一または相補的である。ＡＳＯ−Ｂプローブの３’末端ヌクレオチドは、挿入配列の末端ヌクレオチドと同一または相補的である。

一形態において、欠損を検出するためのＡＳＯ−Ｂプローブの３’末端は、欠損配列が存在する標的配列と同一または相補的である。ＡＳＯ−Ｂプローブの３’末端ヌクレオチドは、欠損部位のすぐ上流の最初のヌクレオチドと同一または相補的である。

挿入／欠損変異部位の標的配列は、ｎ番目の前の塩基の挿入および／または欠損を伴う野生型標的配列である。

下流部位特異的プローブＬＳＯ−Ｂの５’末端は野生型部位の標的配列と同一または相補的である。５’末端ヌクレオチドは、プローブの伸長方向で、野生型部位の配列のｎ番目のヌクレオチドと同一または相補的である。

一形態において、ＬＳＯ−Ｂプローブの３’末端は標的配列とは離れている。いくつかの形態において、ＬＳＯ−Ｂプローブは、標的配列と同一または相補的でない３’末端配列を含み、３’末端配列は標的配列またはその相補配列にハイブリダイズしない。いくつかの形態において、ＬＳＯ−Ｂの３’末端配列は、ユニバーサルプローブ配列Ｐ２を含む。

いくつかの形態において、各上流ジェノタイピングプローブＡＳＯと、変異部位に対応する下流部位特異的プローブＬＳＯとは、塩基の重複やギャップはなく、互いに連結され得る。つながった配列は、野生型または変異のどちらかの標的配列の逆相補配列を提供し得る。

例えば、図１に示すように、検出プローブＡは４つの上流ジェノタイピングプローブ（ＡＳＯ）と１つの下流部位特異的プローブ（ＬＳＯ）を含み得る。ＡＳＯとＬＳＯは同じ伸長方向であり、標的配列の逆相補配列を得るために、重複やギャップなく連結され得る。

図１において、４つのＡＳＯ−ＡプローブはＳＮＰを検出するために、使用され得る。４つのＡＳＯ−Ａプローブの３’末端ヌクレオチドはそれぞれＡ、Ｔ、Ｃ，およびＧであり、ＡＳＯ−Ａプローブの５’末端は標的配列とは離れており、ユニバーサルプローブＰ１（例えば、配列番号：７の５’末端の１〜２０番目のヌクレオチド）を含む。

いくつかの例において、４つのＡＳＯ−Ａプローブのうち３つを使用してもよく、そのＡＳＯ−Ａプローブのうち２つは、それぞれ野生型とＳＮＰの変異塩基と一致する３’末端ヌクレオチドを含み得る。その他のＡＳＯ−Ａプローブの３’末端は野生型とＳＮＰの変異部位とは異なる。ＡＳＯ−Ａプローブの５’末端は標的配列から離れており、ユニバーサルプローブＰ１（例えば、配列番号：７の５’末端の１〜２０番目のヌクレオチド）を含み得る。

あるいは、４つのＡＳＯ−Ａプローブのうち２つを使用してもよく、それぞれは野生型塩基とＳＮＰの変異塩基と一致する３’末端ヌクレオチドを含む。ＡＳＯ−Ａプローブの５’末端は標的配列とは離れており、ユニバーサルプローブＰ１（例えば、配列番号：７の５’末端の１〜２０番目のヌクレオチド）を含み得る。

ある特定のＳＮＰ（すなわち、ＳＮＰ部位の１塩基）を検出するときは、４つのＡＳＯ−Ａプローブのうち１つが使用され得、ＡＳＯ−Ａプローブの３’末端塩基は、検出するＳＮＰ塩基と同一または相補的である。ＡＳＯ−Ａプローブの５’末端は標的配列とは離れており、ユニバーサルプローブＰ１（例えば、配列番号：７の５’末端の１〜２０番目のヌクレオチド）を含み得る。

末端ヌクレオチドリン酸化されたＬＳＯプローブの５’末端は、標的配列に相補的で、ＬＳＯプローブの５’末端塩基は、プローブの伸長方向においてＳＮＰ部位の下流の標的配列の隣の塩基に相補的である。ＬＳＯプローブの３’末端は、標的配列とは離れており、ユニバーサルプローブＰ２（例えば、配列番号：１１の５’末端から２２から４２番目のヌクレオチド）を含み得る。

検出プローブＢは変異配列を検出するための上流ジェノタイピングプローブ（ＡＳＯ）と、野生型配列を検出するための上流ジェノタイピングプローブ（ＡＳＯ）と、下流部位特異的プローブ（ＬＳＯ）と、を含み得る。プローブは同じ伸長方向である。一形態において、変異配列を検出するための上流ジェノタイピングプローブと下流部位特異的プローブは、標的配列の逆相補配列を得るために、重複やギャップなくつなぎ合わされ得る。他の形態において、野生型配列を検出するための上流ジェノタイピングプローブと下流部位特異的プローブは、野生型標的配列の逆相補配列を得るために、重複やギャップなくつなぎ合わされ得る。一形態において、変異型標的配列は、ｎ番目の塩基の前に挿入または欠損を伴う野生型標的配列である。

上記の設計原則に従って、５つの難聴関連変異部位（２３５ｄｅｌＣ、１７６ｄｅｌ１６、２９９ｄｅｌＡＴ、ＩＶＳ７−２Ａ＞Ｇおよび１４９４Ｃ＞Ｔ）の約４０ｂｐ隣接配列について検出プローブを設計した。プローブの感受性と特異性を確保するために、１２ＳｒＲＮＡ遺伝子の１４９４部位では、プローブとテンプレートの結合領域は１３ｎｔであり、ＧｃＣＣＧからＧｇＣＣＧへの変異を伴う。

２）前増幅プライマーの設計
設計の原則：検出すべきヌクレオチド配列に基づき、変異部位を含む標的配列を増幅するように、プライマーを設計する。そののち、プライマーはサンプルの前増幅およびビオチン標識に使用される。

前増幅プライマーは５つの難聴変異部位（ＩＶＳ７−２Ａ＞Ｇ、１７６ｄｅｌ１６（１７６部位に１６ｂｐの欠損）、２９９ｄｅｌＡＴ、２３５ｄｅｌＣおよび１４９４Ｃ＞Ｔ）に従って、設計した。

ＧＪＢ２３４Ｆ１／ＧＪＢ２３４Ｒ１−Ｂの増幅産物は、１７６ｄｅｌ１１６、２９９ｄｅｌＡＴ、および／または２３５ｄｅｌＣを含む配列を含む。１５５５Ｆ１／１５５５Ｒ１−Ｂの増幅産物は１４９４Ｃ＞Ｔ部位を含む配列を含む。ＩＶＳ７−２Ｆ１−Ｂ／ＩＶＳ７−２Ｒ１の増幅産物はＩＶＳ７−２Ａ＞Ｇ部位を含む配列を含む。

上記６プライマーの等モル混合物を、Ｍｕｌｔｉ−Ｐ３と命名した。
（ＩＩ）前増幅
前増幅は、実験群１〜３の各群の６つのサンプルの上記Ｍｕｌｔｉ−Ｐ３を使用して行った。

前増幅システムの容量は１０μＬであり、１μＬ ＤＮＡテンプレート、１μＬ １×ＰＣＲバッファー、０．５Ｕ ＤＮＡポリメラーゼ、１μＬ ビオチン標識化混合プライマーＭｕｌｔｉ−ｐ３（各プライマー５０ｎＭ）２００μＭ ｄＮＴＰ、４．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、水を全容積が１０μＬとなるように加える。

ＰＣＲの条件：まず、９５度（摂氏）で５分間変性ののち、９５度（摂氏）で２０秒間変性、６０度（摂氏）で４分間アニーリングを２０サイクル。ビオチン標識は、前増幅のステップで加える。前増幅後、前増幅システムのプライマーとｄＮＴＰを除くため、終濃度１Ｕ／μＬのエキソヌクレアーゼ（ＥｘｏＩ）と終濃度０．１Ｕ／μＬのアルカリフォスファターゼ（ＡＰ）を増幅産物に加えた。３７度（摂氏）で３時間反応させた後、実験群Ｉの６つのビオチン標識核酸サンプル、実験群ＩＩの６つのビオチン標識核酸サンプル、実験群ＩＩＩの６つのビオチン標識核酸サンプルが得られた。

（ＩＩＩ）ハイブリダイゼーション
検出プローブセットを得るために、表３の１９このプローブを、等モル比で混合した。

上記（ＩＩ）で得られた、各ビオチン標識核酸サンプルを検出プローブセットとハイブリダイズして（各プローブは１００ｆｍｏｌ）、ハイブリダイゼーション産物は磁気ビーズによって、捕獲、吸収された。

例えば、ビオチン標識核酸サンプルのそれぞれ（８μＬ）と検出プローブセット ２μＬ（それぞれのプローブの濃度５０ｐＭ）を２０μＬ ハイブリダイゼーションバッファー（２×）（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％ ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ＝７．６）に加えた。次いで、ＡＳＯおよびＬＳＯプローブが検出部位の隣接配列に完全にハイブリダイズするように、混合物を高温変性にかけ、続いて低温アニーリングした（９５度（摂氏）で５分間、次いで、４５度（摂氏）で１０分間アニーリング）。そののち、磁気ビーズを加え、４５度（摂氏）で２時間インキュベートした。非ハイブリダイズプローブを除くために、１×洗浄バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ＝７．６）およびＴａｑ ライゲーションバッファー（ＮＥＢ）で磁気ビーズを洗浄し、実験群Ｉの６つのハイブリダイゼーション産物、実験群ＩＩの６つのハイブリダイゼーション産物、実験群ＩＩＩの６つのハイブリダイゼーション産物を得た。

（ＩＶ）ライゲーション
実験群Ｉの６つのハイブリダイゼーション産物、実験群ＩＩの６つのハイブリダイゼーション産物、実験群ＩＩＩの６つのハイブリダイゼーション産物に、ＤＮＡリガーゼを加え、ライゲーション反応を行った。完全に一致したプローブをライゲーションした後、ライゲーション反応バッファーを除き、ビーズをｄｄＨ_２Ｏに再懸濁した。ハイブリダイズしたプローブを乖離させるために、反応物を９５度（摂氏）で５分間インキュベートし、実験群Ｉの６つのライゲーション配列、実験群ＩＩの６つのライゲーション配列、実験群ＩＩＩの６つのライゲーション配列を得た。

（Ｖ）増幅とシーケンス
バーコードプライマー：
ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＡＸＸＸＸＸＸＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ（配列番号：３２）。ＸＸＸＸＸＸはサンプルを区別するためのバーコード配列で、６塩基は各サンプルを区別するために、Ａ、Ｔ、Ｃ、およびＧのランダムな組み合わせであってもよい。

共通プライマー：
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ（配列番号：３３）。

バーコードプライマーの３’末端の２０塩基および共通プライマーはそれぞれＰ１およびＰ２に相補的な配列である。バーコードプライマーおよび共通プライマーを用いて、実験群Ｉの６つのライゲーション配列、実験群ＩＩの６つのライゲーション配列、実験群ＩＩＩの６つのライゲーション配列をＰＣＲにより増幅した。次いで、増幅サンプルを抽出し、第二世代ハイスループットシーケンス機器によって、シーケンスを行った。

（ＶＩ）データ解析
配列アライメントは、シーケンス結果と、変異または野生型の標的配列の各々の逆相補配列と、の間で行った。標的配列と一致するシーケンス結果の数が計測され、各サンプル中の変異体の比率を計算した。

変異の比率は全部位に対する、変異の部位の割合とし、全部位は変異部位と野生型部位の合計である。変異の比率を用いて、統計解析および適切な閾値設定によって部位の遺伝子型情報を判定し、閾値によって遺伝子座の遺伝子型情報を判定した。

本例において、変異部位の割合が９０％より大きいとき、試験サンプルは変異部位を含んでいるか、含んでいる可能性が高く、すなわち試験サンプルの遺伝子型は変異部位のホモ接合体またはホモ接合体変異部位の候補である。

実験結果によると、ここで開示された方法を用いると、プラスミドグループＩ（１４９４部位、ＩＶＳ７−２部位、１７６部位、２３５部位、および２９９部位はすべて野生型）では、感受性は５×１０^１コピーであった（図２）。プラスミドグループＩＩ（１４９４部位はすべて変異体、ＩＶＳ７−２部位の５０％は変異体、１７６部位、２３５部位、および２９９部位の２５％は変異体）では、１４９４部位およびＩＶＳ７−２部位の感受性は１０^１コピー、１７６部位、２３５部位または２９９部位の感受性は４×１０^１コピーであった（図３）。プラスミドグループＩＩＩ（ＩＶＳ７−２部位と１４９４部位はすべて変異体、１７６部位、２３５部位および２９９部位の３３．３％は変異体）では、１４９４部位およびＩＶＳ７−２部位の感受性は５×１０^１コピー、１７６部位、２３５部位または２９９部位の感受性は３×１０^１コピーであった（図４）。

ヒトゲノムＤＮＡサンプル中における、ハイスループットシーケンス技術に基づく、ＳＮＰの検出。

プローブおよび前増幅プライマーの設計
１．試験サンプルの準備
難聴患者の血液ゲノムＤＮＡ（ＧＪＢ２遺伝子の２３５塩基に、ホモ接合型突然変異ゲノムＤＮＡが確認されている）と健常ヒト血液ゲノムＤＮＡ（野生型ゲノムＤＮＡ）を用い、各サンプルは３回繰り返し行った。核酸の濃度は、１０ｎｇ／μＬである。

２．プローブおよび前増幅プライマーの設計
１）プローブの設計
設計の原則は、実験例１と同様である。プローブの配列は表５に記載されている。

２）プローブおよび前増幅プライマーの設計
設計の原則は、実験例１と同様である。使用されたプライマーは、ＧＪＢ２３４Ｆ１／ＧＪＢ２３４Ｒ１−Ｂである。

前増幅、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、増幅、およびデータ解析は実施例１と実質的に実施例１と同様の方法で行った。

結果は図５に示す。難聴患者のゲノムＤＮＡは２３５部位にホモ接合型の変異、１７６部位では野生型、２９９部位では野生型であった。この結果はサンプル設定と一致していた。

Claims (76)

1. 標的ポリヌクレオチド配列の遺伝子座を解析するためのプローブセットであって、
   （１）前記遺伝子座の上流または前記遺伝子座を含む前記標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合する第１ハイブリダイゼーション配列、および、
   （２）前記第１ハイブリダイゼーション配列の上流にあり、前記標的ポリヌクレオチド配列に結合しない第１プライマー配列
   を含む、１以上の第１プローブと、
   （ｉ）前記遺伝子座の下流または前記遺伝子座から始まる前記標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合する第２ハイブリダイゼーション配列、および、
   （ｉｉ）前記第２ハイブリダイゼーション配列の下流にあり、前記標的ポリヌクレオチド配列に結合しない第２プライマー配列
   を含む、１以上の第２プローブと、を備え、
   前記第１プローブおよび前記第２プローブの伸長方向は同じであり、
   前記第１プローブは前記第２プローブの上流にあり、
   前記第１プローブおよび前記第２プローブは隣接しており、連結すると遺伝子座を含む配列を形成する、プローブセット。
2. 前記遺伝子座はＳＮＰまたは点突然変異を含み、
   前記１以上の第１プローブの第１ハイブリダイゼーション配列は、前記ＳＮＰまたは点突然変異を含む前記標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、
   前記１以上の第１プローブの３’末端ヌクレオチドは、前記ＳＮＰまたは点突然変異の位置のヌクレオチドに相補的であり、
   前記１以上の第２プローブの第２ハイブリダイゼーション配列は、前記ＳＮＰまたは点突然変異の下流の前記標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、
   前記１以上の第２プローブの５’末端ヌクレオチドは、前記ＳＮＰまたは点突然変異の位置のすぐ下流のヌクレオチドに相補的である、
   あるいは、
   前記１以上の第１プローブの第１ハイブリダイゼーション配列は、前記ＳＮＰまたは点突然変異の上流の前記標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、
   前記１以上の第１プローブの３’末端ヌクレオチドは、前記ＳＮＰまたは点突然変異の位置のすぐ上流のヌクレオチドに相補的であり、
   前記１以上の第２プローブの第２ハイブリダイゼーション配列は、前記ＳＮＰまたは点突然変異から始まる前記標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、
   前記１以上の第２プローブの５’末端ヌクレオチドは、前記ＳＮＰまたは点突然変異の位置のヌクレオチドに相補的である、請求項１に記載のプローブセット。
3. 前記１以上の第２プローブの５’末端がリン酸化されている、請求項１または２に記載のプローブセット。
4. 前記１以上の第１プローブの第１プライマー配列は、ユニバーサルプライマー配列である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のプローブセット。
5. 前記１以上の第１プローブの第１プライマー配列は、ＳＮＰまたは突然変異の位置の塩基に特異的である、請求項２または３に記載のプローブセット。
6. 前記１以上の第２プローブの第２プライマー配列は、ユニバーサルプライマー配列である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のプローブセット。
7. 前記遺伝子座が欠損または挿入を含む、請求項１に記載のプローブセット。
8. 前記遺伝子座は野生型標的ポリヌクレオチド配列のｎ番目の塩基に挿入を含み、
   前記１以上の第１プローブは少なくとも２つの第１プローブを備え、
   そのうちの一方は、ｎ番目の塩基までで、ｎ番目を含まない野生型標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、
   もう一方は、前記挿入配列の最後の塩基までを含む標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、
   前記１以上の第２プローブの第２ハイブリダイゼーション配列は、前記挿入の下流の標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、
   前記１以上の第２プローブの５’末端ヌクレオチドは、ｎ番目の塩基に相補的である、
   あるいは、
   前記１以上の第２プローブは少なくとも２つの第２プローブを備え、
   そのうちの一方は、ｎ番目の塩基から始まる野生型標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、
   もう一方は、前記挿入配列の最初の塩基から始まる標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、
   前記１以上の第１プローブの第１ハイブリダイゼーション配列は、前記挿入の上流の標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、
   前記１以上の第１プローブの３’末端ヌクレオチドは、野生型標的ポリヌクレオチドのｎ番目の塩基のすぐ上流の塩基に相補的である、請求項７に記載のプローブセット。
9. 前記遺伝子座は野生型標的ポリヌクレオチド配列のｎ番目の塩基に欠損を含み、
   前記１以上の第１プローブは少なくとも２つの第１プローブを備え、
   そのうちの一方は、ｎ番目の塩基までで、ｎ番目を含まない野生型標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、
   もう一方は、前記欠損配列のすぐ上流の塩基までを含む標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、
   前記１以上の第２プローブの第２ハイブリダイゼーション配列は、前記欠損の下流の標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、
   前記１以上の第２プローブの５’末端ヌクレオチドは、ｎ番目の塩基に相補的である、
   あるいは、
   前記１以上の第２プローブは少なくとも２つの第２プローブを備え、
   そのうちの一方は、ｎ番目の塩基から始まる野生型標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、
   もう一方は、前記欠損配列の最初の塩基から始まる標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、
   前記１以上の第１プローブの第１ハイブリダイゼーション配列は、前記欠損の上流の標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、
   前記１以上の第１プローブの５’末端ヌクレオチドは、野生型標的ポリヌクレオチドのｎ番目の塩基のすぐ上流の塩基に相補的である、請求項７に記載のプローブセット。
10. 前記１以上の第１プローブの第１プライマー配列は、ユニバーサルプライマー配列である、請求項７〜９のいずれか１項に記載のプローブセット。
11. 前記２つの第１プローブは、異なる第１プライマー配列を含む、請求項８または９に記載のプローブセット。
12. 前記１以上の第２プローブの５’末端がリン酸化されている、請求項７〜１１のいずれか１項に記載のプローブセット。
13. 前記１以上の第２プローブの第２プライマー配列は、ユニバーサルプライマー配列である、請求項７〜１２のいずれか１項に記載のプローブセット。
14. 前記遺伝子座が、ＧＪＢ２、ＳＬＣ２６Ａ４または１２ＳｒＲＮＡなどの難聴関連遺伝子の中にあり、前記遺伝子座は任意に、１４９４Ｃ＞Ｔ、ＩＶＳ７−２Ａ＞Ｇ、２３５ｄｅｌＣ、１７６ＤＥＬ１６、および／または２９９ｄｅｌＡＴを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のプローブセット。
15. １４９４Ｃ＞Ｔに対する前記１以上の第１プローブは、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、および／または配列番号：２４に示すポリヌクレオチド配列を含む、請求項１４に記載のプローブセット。
16. １４９４Ｃ＞Ｔに対する前記１以上の第２プローブは、配列番号：２５に示すポリヌクレオチド配列を含む、請求項１４または１５に記載のプローブセット。
17. ＩＶＳ７−２Ａ＞Ｇに対する前記１以上の第１プローブは、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、および／または配列番号：１０に示すポリヌクレオチド配列を含む、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載のプローブセット。
18. ＩＶＳ７−２Ａ＞Ｇに対する前記１以上の第２プローブは、配列番号：１１に示すポリヌクレオチド配列を含む、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載のプローブセット。
19. ２３５ｄｅｌＣに対する前記１以上の第１プローブは、配列番号：１５、および／または配列番号：１６に示すポリヌクレオチド配列を含む、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載のプローブセット。
20. ２３５ｄｅｌＣに対する前記１以上の第２プローブは、配列番号：１７に示すポリヌクレオチド配列を含む、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載のプローブセット。
21. １７６ＤＥＬ１６に対する前記１以上の第１プローブは、配列番号：１２、および／または配列番号：１３に示すポリヌクレオチド配列を含む、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載のプローブセット。
22. １７６ＤＥＬ１６に対する前記１以上の第２プローブは、配列番号：１４に示すポリヌクレオチド配列を含む、請求項１４〜２１のいずれか１項に記載のプローブセット。
23. ２９９ｄｅｌＡＴに対する前記１以上の第１プローブは、配列番号：１８、および／または配列番号：１９に示すポリヌクレオチド配列を含む、請求項１４〜２２のいずれか１項に記載のプローブセット。
24. ２９９ｄｅｌＡＴに対する前記１以上の第２プローブは、配列番号：２０に示すポリヌクレオチド配列を含む、請求項１４〜２３のいずれか１項に記載のプローブセット。
25. 請求項１〜２４のいずれか１項に記載のプローブセットを備える、遺伝子座を解析するためのキット。
26. １７６ｄｅｌ１６、２９９ｄｅｌＡＴ、および／または２３５ｄｅｌＣを増幅するプライマー対をさらに備える、請求項２５に記載のキット。
27. 前記１７６ｄｅｌ１６、２９９ｄｅｌＡＴ、および／または２３５ｄｅｌＣを増幅するプライマー対は、配列番号：２８および配列番号：２９に示すポリヌクレオチド配列を含む、請求項２６に記載のキット。
28. １４９４Ｃ＞Ｔを増幅するプライマー対をさらに備える、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載のキット。
29. 前記１４９４Ｃ＞Ｔを増幅するプライマー対は、配列番号：２６および配列番号：２７に示すポリヌクレオチド配列を含む、請求項２８に記載のキット。
30. ＩＶＳ７−２Ａ＞Ｇを増幅するプライマー対をさらに備える、請求項２５〜２９のいずれか１項に記載のキット。
31. 前記ＩＶＳ７−２Ａ＞Ｇを増幅するプライマー対は、配列番号：３０および配列番号：３１に示すポリヌクレオチド配列を含む、請求項３０に記載のキット。
32. 前記プライマー対の片方または両方のプライマーはラベルされている、請求項２５〜３１のいずれか１項に記載のキット。
33. 前記ラベルはビオチンを含む、請求項３２に記載のキット。
34. バーコード特異的プライマーおよび／または共通プライマーをさらに備える、請求項２５〜３３のいずれか１項に記載のキット。
35. 前記バーコード特異的プライマーは配列番号：３２に示すポリヌクレオチド配列を含み、前記共通プライマーは配列番号：３３に示すポリヌクレオチド配列を含む、請求項３４に記載のキット。
36. 少なくとも第１遺伝子座および第２遺伝子座を解析するための組成物であって、第１遺伝子座に対応する請求項１〜２４のいずれか１項に記載の第１プローブセットと、第２遺伝子座に対応する請求項１〜２４のいずれか１項に記載の第２プローブセットを備える組成物。
37. 前記第１プローブセットの複数のプローブは等モル量であり、前記第２プローブセットの複数のプローブは等モル量である、請求項３６に記載の組成物。
38. 前記第１遺伝子座はＳＮＰまたは点突然変異を含み、前記第２遺伝子座は欠損および／または挿入を含む、請求項３６または３７に記載の組成物。
39. 前記ＳＮＰまたは点突然変異は１４９４Ｃ＞Ｔおよび／またはＩＶＳ７−２Ａ＞Ｇを含み、前記欠損および／または挿入は２３５ｄｅｌＣ、１７６ＤＥＬ１６、および／または２９９ｄｅｌＡＴを含む、請求項３８に記載の組成物。
40. 前記第１プローブセットおよび前記第２プローブセットは、下記のうち少なくとも２つのプローブセットを含む、請求項３６〜３９のいずれか１項に記載の組成物。
    （１）配列番号：２１に示すポリヌクレオチド配列を含むプローブと、配列番号：２１に示すポリヌクレオチド配列を含む１以上のプローブ；
    （２）配列番号：１１に示すポリヌクレオチド配列を含むプローブと、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９または配列番号：１０に示すポリヌクレオチド配列を含む１以上のプローブ；
    （３）配列番号：１７に示すポリヌクレオチド配列を含むプローブと、配列番号：１５または配列番号：１６に示すポリヌクレオチド配列を含む１以上のプローブ；
    （４）配列番号：１４に示すポリヌクレオチド配列を含むプローブと、配列番号：１２または配列番号：１３に示すポリヌクレオチド配列を含む１以上のプローブ；および
    （５）配列番号：２０に示すポリヌクレオチド配列を含むプローブと、配列番号：１８または配列番号：１９に示すポリヌクレオチド配列を含む１以上のプローブ。
41. 遺伝子座を含む標的ポリヌクレオチド配列を含むサンプルを解析する方法であって、
    （ａ）サンプルをプローブセットと接触させ、前記プローブセットは
    （１）前記遺伝子座の上流の前記標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合する第１ハイブリダイゼーション配列、および
    （２）前記第１ハイブリダイゼーション配列の上流にあり、前記標的ポリヌクレオチド配列に結合しない第１プライマー配列
    を含む、１以上の第１プローブと、
    （ｉ）前記遺伝子座の下流の前記標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合する第２ハイブリダイゼーション配列、および、
    （ｉｉ）前記第２ハイブリダイゼーション配列の下流にあり、前記標的ポリヌクレオチド配列に結合しない第２プライマー配列
    を含む、１以上の第２プローブと、を備え、
    前記第１プローブおよび前記第２プローブの伸長方向は同じであり、
    （ｂ）前記標的ポリヌクレオチド配列に結合した前記第１プローブと前記第２プローブとを連結させて、遺伝子座を含む配列を形成し、
    （ｃ）遺伝子座を含む配列を決定し、それにより、遺伝子座の配列を決定する、方法。
42. 前記遺伝子座はＳＮＰまたは点突然変異を含み、
    前記１以上の第１プローブの第１ハイブリダイゼーション配列は、前記ＳＮＰまたは点突然変異の上流の前記標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、
    前記１以上の第１プローブの３’末端ヌクレオチドは、前記ＳＮＰまたは点突然変異の位置のヌクレオチドに相補的であり、
    前記１以上の第２プローブの第２ハイブリダイゼーション配列は、前記ＳＮＰまたは点突然変異の下流の前記標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、
    前記１以上の第２プローブの５’末端ヌクレオチドは、前記ＳＮＰまたは点突然変異の位置のすぐ下流のヌクレオチドに相補的である、請求項４１に記載の方法。
43. 前記１以上の第２プローブの５’末端がリン酸化されている、請求項４１または４２に記載の方法。
44. 前記１以上の第１プローブの第１プライマー配列は、ユニバーサルプライマー配列である、請求項４１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
45. 前記１以上の第１プローブの第１プライマーは、前記ＳＮＰまたは突然変異の位置の塩基に特異的である、請求項４２または４３に記載の方法。
46. 前記１以上の第２プローブの第２プライマー配列は、ユニバーサルプライマー配列である、請求項４１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
47. 前記遺伝子座が欠損または挿入を含む、請求項４１に記載の方法。
48. 前記遺伝子座は野生型標的ポリヌクレオチド配列のｎ番目の塩基に挿入を含み、
    前記１以上の第１プローブは少なくとも２つの第１プローブを備え、
    そのうちの一方は、ｎ番目の塩基までで、ｎ番目を含まない野生型標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、
    もう一方は、前記挿入配列の最後の塩基までを含む標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、
    前記１以上の第２プローブの第２ハイブリダイゼーション配列は、前記挿入の下流の標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、
    前記１以上の第２プローブの５’末端ヌクレオチドは、ｎ番目の塩基に相補的である、請求項４７に記載の方法。
49. 前記遺伝子座は野生型標的ポリヌクレオチド配列のｎ番目の塩基に欠損を含み、
    前記１以上の第１プローブは少なくとも２つの第１プローブを備え、
    そのうちの一方は、ｎ番目の塩基までで、ｎ番目を含まない野生型標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、
    もう一方は、前記欠損配列のすぐ上流の塩基までを含む標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、
    前記１以上の第２プローブの第２ハイブリダイゼーション配列は、前記欠損の下流の標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、
    前記１以上の第２プローブの５’末端ヌクレオチドは、ｎ番目の塩基に相補的である、請求項４７に記載の方法。
50. 前記１以上の第１プローブの第１プライマー配列は、ユニバーサルプライマー配列である、請求項４７〜４９のいずれか１項に記載の方法。
51. 前記２つの第１プローブは、異なる第１プライマー配列を含む、請求項４８または４９に記載の方法。
52. 前記１以上の第２プローブの５’末端がリン酸化されている、請求項４７〜５１のいずれか１項に記載の方法。
53. 前記１以上の第２プローブの第２プライマー配列は、ユニバーサルプライマー配列である、請求項４７〜５２のいずれか１項に記載の方法。
54. 前記遺伝子座が、ＧＪＢ２、ＳＬＣ２６Ａ４または１２ＳｒＲＮＡといった難聴関連遺伝子の中にあり、前記遺伝子座は任意選択として、１４９４Ｃ＞Ｔ、ＩＶＳ７−２Ａ＞Ｇ、２３５ｄｅｌＣ、１７６ＤＥＬ１６、および／または２９９ｄｅｌＡＴを含む、請求項４１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
55. １４９４Ｃ＞Ｔに対する前記１以上の第１プローブは、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、および／または配列番号：２４に示すポリヌクレオチド配列を含む、請求項５４に記載の方法。
56. １４９４Ｃ＞Ｔに対する前記１以上の第２プローブは、配列番号：２５に示すポリヌクレオチド配列を含む、請求項５４または５５に記載の方法。
57. ＩＶＳ７−２Ａ＞Ｇに対する前記１以上の第１プローブは、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、および／または配列番号：１０に示すポリヌクレオチド配列を含む、請求項５４〜５６のいずれか１項に記載の方法。
58. ＩＶＳ７−２Ａ＞Ｇに対する前記１以上の第２プローブは、配列番号：１１に示すポリヌクレオチド配列を含む、請求項５４〜５７のいずれか１項に記載の方法。
59. ２３５ｄｅｌＣに対する前記１以上の第１プローブは、配列番号：１５、および／または配列番号：１６に示すポリヌクレオチド配列を含む、請求項５４〜５８のいずれか１項に記載の方法。
60. ２３５ｄｅｌＣに対する前記１以上の第２プローブは、配列番号：１７に示すポリヌクレオチド配列を含む、請求項５４〜５９のいずれか１項に記載の方法。
61. １７６ＤＥＬ１６に対する前記１以上の第１プローブは、配列番号：１２、および／または配列番号：１３に示すポリヌクレオチド配列を含む、請求項５４〜６０のいずれか１項に記載の方法。
62. １７６ＤＥＬ１６に対する前記１以上の第２プローブは、配列番号：１４に示すポリヌクレオチド配列を含む、請求項５４〜６１のいずれか１項に記載の方法。
63. ２９９ｄｅｌＡＴに対する前記１以上の第１プローブは、配列番号：１８、および／または配列番号：１９に示すポリヌクレオチド配列を含む、請求項５４〜６２のいずれか１項に記載の方法。
64. ２９９ｄｅｌＡＴに対する前記１以上の第２プローブは、配列番号：２０に示すポリヌクレオチド配列を含む、請求項５４〜６３のいずれか１項に記載の方法。
65. さらに前記接触ステップの前に、標的ポリヌクレオチドの前増幅を備える、請求項４１〜６４のいずれか１項に記載の方法。
66. 前記前増幅は、ＧＪＢ２、ＳＬＣ２６Ａ４、または１２ＳｒＲＮＡなどの難聴関連遺伝子を増幅させるためのプライマー対の使用を含む、請求項６５に記載の方法。
67. 前記遺伝子座は、１４９４Ｃ＞Ｔ、ＩＶＳ７−２Ａ＞Ｇ、２３５ｄｅｌＣ、１７６ＤＥＬ１６、および／または２９９ｄｅｌＡＴを含む、請求項６６に記載の方法。
68. 前記前増幅は、１７６ＤＥＬ１６、２９９ｄｅｌＡＴ、および／または２３５ｄｅｌＣを増幅するために、配列番号：２８、および配列番号：２９に示すポリヌクレオチド配列を有するプライマー対の使用を含む、請求項６７に記載の方法。
69. 前記前増幅は、１４９４Ｃ＞Ｔを増幅するために、配列番号：２６、および配列番号：２７に示すポリヌクレオチド配列を有するプライマー対の使用を含む、請求項６７または６８に記載の方法。
70. 前記前増幅は、ＩＶＳ７−２Ａ＞Ｇを増幅するために、配列番号：３０、および配列番号：３１に示すポリヌクレオチド配列を有するプライマー対の使用を含む、請求項６７〜６９のいずれか１項に記載の方法。
71. 前記プライマー対の片方または両方のプライマーはラベルされている、請求項６７〜７０のいずれか１項に記載の方法。
72. 前記ラベルはビオチンを含む、請求項７１に記載の方法。
73. 前記連結ステップは、標的ポリヌクレオチド配列に結合した、前記第１プローブと前記第２プローブとのライゲーションを含む、請求項４１〜７２のいずれか１項に記載の方法。
74. 前記決定ステップは、前記連結配列の増幅および／またはシーケンスを含む、請求項４１〜７３のいずれか１項に記載の方法。
75. 前記増幅および／またはシーケンスはバーコード特異的プライマーおよび／または共通プライマーの使用を含む、請求項７４に記載の方法。
76. 前記バーコード特異的プライマーは配列番号：３２に示すポリヌクレオチド配列を含み、前記共通プライマーは配列番号：３３に示すポリヌクレオチド配列を含む、請求項７５に記載の方法。