KR20090081260A - 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법 - Google Patents

마이크로 어레이 혼성화 검출 방법 Download PDF

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KR20090081260A
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Abstract

목적 시료 및 프로브 간의 혼성화 정도를 측정하는 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법이 제공된다. 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법은 복수의 프로브가 형성된 마이크로 어레이를 제공하고, 복수의 프로브에 목적 시료와 임의의 서열로 이루어진 랜덤 프라이머를 혼성화하고, 각 프로브의 자유 말단 및 랜덤 프라이머의 각 프로브측 일단을 연결하고, 각 프로브와 혼성화된 목적 시료를 제거하고, 잔존하는 랜덤 프라이머의 강도를 측정하는 것을 포함한다.
마이크로 어레이, 혼성화, 랜덤 프라이머

Description

마이크로 어레이 혼성화 검출 방법{Assay method of microarray hybridization}
본 발명은 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 검출 효율이 향상된 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법에 관한 것이다.
최근 들어 게놈 프로젝트가 발전하면서 다양한 유기체의 게놈 뉴클레오티드 서열이 밝혀짐에 따라 마이크로 어레이에 대한 관심이 증가하고 있다. 마이크로 어레이는 지지체인 기판 상에 복수의 프로브를 배열한 것으로, 목적 시료가 마이크로 어레이 상의 프로브와 혼성화 되었는지 여부를 관찰함으로써 목적 시료가 소정의 염기 서열을 포함하는 지 확인할 수 있다.
일반적으로, 목적 시료 및 프로브의 혼성화 여부를 검출할 때에는, 목적 시료의 말단에 형광 물질을 연결하고, 혼성화된 목적 시료의 형광 물질을 관찰하였다. 그러나, 목적 시료의 비특이적 결합으로 인한 검출 효율 감소가 문제되어 목적 시료의 말단에 감지 서열(detection sequence)을 형성하고, 상기 감지 서열에 상보적인 서열을 포함하는 프라이머를 결합하고, 상기 프라이머와 프로브를 연결함으로써 목적 시료의 비특이적 결합으로 인한 검출 효율 감소를 방지하려는 연구가 진행되었다.
그런데, 목적 시료의 길이가 프로브의 길이에 비하여 상대적으로 길기 때문에, 단일 가닥(single strand)인 목적 시료가 안정한 2차 구조를 형성하는 경우가 많았다. 이로 인해 프라이머가 목적 시료의 말단에서부터 프로브와 혼성화된 위치까지 신장(extension)하지 못함으로써 마이크로 어레이의 혼성화 검출의 검출 효율이 감소하는 어려움이 있었다.
이에, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 검출 효율이 향상된 마이크로 어레이의 혼성화 검출 방법을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 어레이의 혼성화 검출 방법은 복수의 프로브가 형성된 마이크로 어레이를 제공하고, 상기 복수의 프로브에 목적 시료와 임의의 서열로 이루어진 랜덤 프라이머를 혼성화하고, 상기 각 프로브의 자유 말단 및 랜덤 프라이머의 상기 각 프로브측 일단을 연결하고, 상기 각 프로브와 혼성화된 상기 목적 시료를 제거하고, 잔존하는 상기 랜덤 프라이머의 강도를 측정하는 것을 포함한다.
상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 다른 실시예에 따른 마이크로 어레이의 혼성화 검출 방법은 목적 시료 및 임의의 서열로 이루어진 랜덤 프라이머와 혼성화된 복수의 프로브를 포함하는 마이크로 어레이를 제공하고, 중합효소 (polymerase), 및 리가아제(ligase)를 포함하는 연결 용액으로 상기 마이크로 어레이를 처리하고, 상기 마이크로 어레이를 세정하고, 상기 마이크로 어레이의 혼성화 정도를 측정하는 것을 포함한다.
기타 실시예의 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
따라서, 몇몇 실시예에서, 잘 알려진 공정 단계들, 잘 알려진 구조 및 잘 알려진 기술들은 본 발명이 모호하게 해석되는 것을 피하기 위하여 구체적으로 설명되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 명세서에서 사용되는 포함한다(comprises) 및/또는 포함하는(comprising)은 언급된 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자 이외의 하나 이상의 다른 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자의 존재 또는 추가를 배제하지 않는 의미로 사용한다. 그리고, "및/또는"은 언급된 아이템들의 각각 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다.
또한, 본 명세서에서 기술하는 실시예들은 본 발명의 이상적인 예시도인 단면도 및/또는 개략도들을 참고하여 설명될 것이다. 따라서, 제조 기술 및/또는 허용 오차 등에 의해 예시도의 형태가 변형될 수 있다. 따라서, 본 발명의 실시예들은 도시된 특정 형태로 제한되는 것이 아니라 제조 공정에 따라 생성되는 형태의 변화도 포함하는 것이다. 또한 본 발명에 도시된 각 도면에 있어서 각 구성 요소들은 설명의 편의를 고려하여 다소 확대 또는 축소되어 도시된 것일 수 있다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다.
본 발명의 몇몇 실시예들에 따른 마이크로 어레이의 혼성화 검출 방법은 바이오 시료에 포함되어 있는 바이오 분자(biomolecule)를 분석함으로써, 유전자 발현 분석(gene expression profiling), 유전자형 분석(genotyping), SNP(Single Nucleotide Polymorphism)와 같은 돌연 변이(mutation) 및 다형(polymorphism)의 검출, 단백질 및 펩티드 분석, 잠재적인 약의 스크리닝, 신약 개발과 제조 등을 하는 데에 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 몇몇 실시예들에 적용 가능한 마이크로 어레이는 분석하고자 하는 바이오 시료의 대상에 따라 그에 맞는 프로브들을 채용할 수 있다. 마이크로 어레이에 채용될 수 있는 프로브의 예는 DNA 프로브, 효소나 항체/항원, 박테리오로돕신(bacteriorhodopsin) 등과 같은 단백질 프로브, 미생물 프로브, 신경세포 프로브 등을 포함한다. 각각 채용되는 프로브의 종류에 따라 마이크로 어레이는 DNA칩, 단백질칩, 세포칩, 뉴런칩 등으로도 지칭될 수 있다.
본 발명의 몇몇 실시예들에 따른 마이크로 어레이는 프로브로서 올리고머 프로브를 포함할 수 있다. 상기 올리고머 프로브는 채용되는 프로브의 모노머 수가 올리고머 수준임을 암시한다. 여기서, 올리고머는 공유 결합된 두 개 이상의 모노머(monomer)로 이루어진 폴리머(polymer) 중 분자량이 대략 10000 이하의 것을 지칭하는 의미로 사용될 수 있다. 구체적으로 약 2-500개의 모노머, 바람직하기로는 10-80개의 모노머를 포함하는 것일 수 있다. 그러나, 올리고머 프로브의 의미가 상기 수치에 제한되는 것은 아니다.
올리고머 프로브를 구성하는 모노머는 분석 대상이 되는 바이오 시료의 종류에 따라 변형 가능하며, 예를 들면 뉴클레오사이드, 뉴클레오티드, 아미노산, 펩티드 등일 수 있다.
뉴클레오사이드 및 뉴클레오티드는 공지의 퓨린 및 피리미딘 염기를 포함할 뿐만 아니라 메틸화된 퓨린 또는 피리미딘, 아실화된 퓨린 또는 피리미딘 등을 포 함할 수 있다. 또, 뉴클레오사이드 및 뉴클레오티드는 종래의 리보스 및 디옥시리보스 당을 포함할 뿐만 아니라 하나 이상의 하이드록실기가 할로겐 원자 또는 지방족으로 치환되거나 에테르, 아민 등의 작용기가 결합한 변형된 당을 포함할 수 있다.
아미노산은 자연에서 발견되는 아미노산의 L-, D-, 및 비키랄성(nonchiral)형 아미노산뿐만 아니라 변형 아미노산(modified amino acid), 또는 아미노산 유사체(Snalog) 등일 수 있다.
펩티드란 아미노산의 카르복실기와 다른 아미노산의 아미노기 사이의 아미드 결합에 의해 생성된 화합물을 지칭한다.
특별히 다른 언급이 없는 한, 이하의 실시예들에서 예시적으로 상정되는 프로브는 DNA 프로브로서, 약 20-30개의 뉴클레오티드의 모노머가 공유 결합된 올리고머 프로브이다. 그러나, 본 발명이 그에 제한되는 것은 아니며, 상술한 다양한 프로브들이 적용될 수 있음은 물론이다.
이하, 첨부된 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예들에 대해 설명한다.
도 1 및 도 2을 참조하여 본 발명의 몇몇 실시예들에 따른 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법에 대해 설명한다. 도 1 및 도 2는 본 발명의 몇몇 실시예들에 따른 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법을 설명하기 위한 중간 구조물의 단면도들이다.
먼저, 도 1을 참조하여 복수의 프로브(130)가 형성된 마이크로 어레이(100)를 제공한다.
도면 상에 도시하지 않았으나, 기판(110) 상에 복수의 프로브(130)를 고정하여 마이크로 어레이(100)를 형성할 수 있다.
기판(110)은 복수의 프로브 셀 영역(Probe Cell Region, A) 및 비프로브 셀 영역(Non Probe Cell Region, B)을 포함한다. 프로브 셀 영역(A)과 비프로브 셀 영역(B)의 구별 기준은 고정될 프로브(130)의 유무에 따른다. 즉, 기판(110)의 프로브 셀 영역(A)은 기판 상면(111)에 복수의 프로브가 고정될 기판(110)의 영역을 의미하고, 비프로브 셀 영역(B)은 기판 상면(111)에 프로브가 고정되어 있지 않을 기판(110)의 영역을 의미한다.
하나의 프로브 셀 영역(A)의 기판 상면(111) 상에는 동일한 서열의 프로브가 고정될 수 있다. 그러나, 서로 다른 프로브 셀 영역들 사이에서는 기판 상면(111)에 고정되는 프로브의 서열이 서로 상이할 수 있다.
서로 다른 프로브 셀 영역(A)은 비프로브 셀 영역(B)에 의해 분리되어 있다. 따라서, 각 프로브 셀 영역(A)은 비프로브 셀 영역(B)에 의해 둘러싸인 형상으로 형성될 수 있다. 예를 들어, 복수의 프로브 셀 영역(A)은 매트릭스 형상으로 배열될 수 있다. 그러나, 상기 매트릭스 형상 배열이 반드시 규칙적인 피치(pitch)를 가져야 하는 것은 아니다. 또한, 서로 독립적인 프로브 셀 영역(A)과는 반대로 비프로브 셀 영역(B)은 하나로 연결되도록 형성할 수 있다. 예를 들어 비프로브 셀 영역(B)은 격자(lattice)형으로 형성할 수 있다.
또한, 기판(110)은 예를 들어, 투명 기판 또는 불투명 기판일 수 있다. 적용되는 불투명 웨이퍼의 예로는 나일론, 니트로셀룰로오스 등의 멤브레인 또는 플라 스틱 필름 등의 가요성 기판이나 반도체 웨이퍼 등과 같은 강성 기판을 들 수 있다. 특히, 반도체 웨이퍼는 반도체 소자의 제조 공정에서 이미 안정적으로 확립되어 적용되는 다양한 박막의 제조 공정 및 사진 식각 공정 등을 그대로 적용할 수 있다는 장점이 있다. 투명 웨이퍼의 예로는 소다 석회 유리로 이루어진 투명 유리 웨이퍼를 들 수 있다.
기판(110)은 기판 상면(111)을 포함할 수 있으며, 기판 상면(111)에는 링커(120)가 형성될 수 있다. 링커(120)의 일단은 기판 상면(111)과 커플링되고, 링커(120)의 타단은 프로브(130)와 커플링될 수 있다. 링커(120)는 예를 들어, 딥핑(dipping) 공정에 의해 형성될 수 있으나, 이에 한정되지 않음은 물론이다.
기판(110)이 예를 들어, 유리 등으로 이루어진 경우, 일단은 기판(110)의 SiOH와 반응하여 실록산(Si-O) 결합을 생성할 수 있는 실리콘기를 포함하고, 타단은 프로브(프로브용 모노머를 포함하며, 이하 동일함)와 커플링할 수 있는 작용기를 포함하는 링커(120)를 사용할 수 있다. 구체적으로, 링커(120) 물질은 N-(3-(트리에톡시실릴)-프로필)-4-하이드록시부티르아미드(N-(3-(triethoxysilyl)-propyl)-4-hydroxybutyramide), N,N-비스(하이드록시에틸)아미노프로필-트리에톡시실란(N,N-bis(hydroxyethyl) aminopropyl-triethoxysilane), 아세톡시프로필-트리에톡시실란(Scetoxypropyl-triethoxysilane), 3-글리시독실 프로필트리메톡시실란(3-Glycidoxy propyltrimethoxysilane), 국제 공개 특허 WO 00/21967호에 개시된 실리콘 화합물 등을 예로 들 수 있으며, 상기 공개 특허의 내용은 본 명세서에 충분히 개시된 것처럼 원용되어 통합된다.
링커(120)는 타겟 샘플과의 자유로운 상호작용이 가능하도록 공간적 마진(margin)을 제공하는 스페이서를 포함할 수 있다. 만약, 링커(120)의 길이가 공간적 마진을 제공할 수 있을 정도로 충분히 길다면 도면에 예시된 바와 같이 스페이서를 포함하지 않을 수 있다.
복수의 프로브(130)를 기판(110) 상에 형성하되, 링커(120)를 매개하여 기판 상면(111)에 형성할 수 있다. 그러나, 링커(120)를 매개하지 않고, 기판 상면(111)에 직접 형성할 수도 있다.
복수의 프로브(130)는 각각 3' 말단 및 5' 말단을 포함한다. 각 프로브(130)의 일단, 즉 3' 말단 또는 5' 말단 중 어느 하나는 기판 상면(111)과 직접 또는 링커(120)를 매개하여 고정된다. 각 프로브(130)의 나머지 하나의 말단은 기판(110)에 고정되지 않으며, 따라서 자유 말단(free terminal)이라고 지칭할 수 있다. 구체적으로, 3' 말단이 기판(110) 상에 고정되면 5' 말단은 자유 말단이 되고, 5' 말단이 기판 상면(111)에 고정되면 3' 말단이 자유 말단이 될 수 있다. 3' 말단 및 5' 말단 중 어느 것이 기판 상면(111)에 고정되었는가에 따라, 중합효소(polymerase)에 의한 연장(extension)의 방향도 달라지며, 이에 관한 상세한 설명은 후술하기로 한다.
이어서, 도 2를 참조하여 복수의 프로브(130)에 목적 시료(target sample; 140)를 혼성화한다.
구체적으로, 복수의 프로브(130)가 형성된 마이크로 어레이(100)에 목적 시료(140)를 처리함으로써, 목적 시료(140)를 상보적인 염기 서열을 가지는 프로 브(131)와 혼성화할 수 있다. 이 때, 목적 시료(140)는 목적 시료(140)에 상보적인 서열을 포함하는 프로브(131)와만 혼성화하고, 상보적인 서열을 포함하지 않는 프로브(132)와는 혼성화하지 않는다. 따라서, 서로 상이한 서열을 가진 프로브(131, 132)가 고정된 서로 다른 프로브 셀 영역(A; 예를 들어, A1 및 A2)간에 혼성화 여부의 차이가 발생할 수 있다. 또한, 마이크로 어레이(100) 상에는 복수 개의 프로브 셀 영역들이 형성되고, 목적 시료(160)도 복수의 프로브(130)가 포함하는 다양한 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 중복 포함할 수 있으므로, 서로 다른 서열을 갖는 둘 이상의 프로브 셀 영역(A) 상의 프로브(130)와 혼성화될 수도 있다.
목적 시료(140)는 마이크로 어레이(100) 상에 형성된 프로브(130), 또는 마이크로 어레이(100)의 용도에 따라 다양한 물질일 수 있다. 예를 들어, DNA, RNA, 항체/항원, 단백질 등일 수 있으며, 이에 한정되지 않음은 물론이다.
또한, 목적 시료(140)의 길이는 후술할 목적 시료(140) 및 랜덤 프라이머의 결합(annealing)이 가능하도록 하는 길이일 수 있다. 예를 들어, 목적 시료(140)는 프로브(130)와 혼성화된 부분 외의 여분의 길이가 적어도 약 9머(mer) 이상, 바람직하게는 15머 이상의 길이를 가질 수 있다. 가장 바람직하게는 80 내지 100머의 길이를 가질 수 있다.
복수의 프로브(130) 및 목적 시료(140)를 혼성화하기 위한 조건, 예를 들어, 온도, 처리 시간 등의 혼성화 조건은 프로브(130) 및 목적 시료(140)의 성질에 따라 다양하게 조절될 수 있다. 예를 들어, 온도의 파라미터와 관련하여, 단일 가닥 의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)는 상대적으로 더 낮은 온도에서 또 다른 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드와 더욱 높은 결합 가능성을 가질 수 있다.
이하, 도 3 내지 도 7을 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법에 대하여 설명한다. 도 3 내지 도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법을 설명하기 위한 중간 구조물의 단면도들이다. 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법은 앞서 설명한 본 발명의 몇몇 실시예들에 따른 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법에 뒤따르는 공정을 설명한 것이며, 도면에 도시한 바와 같이 이하에서는 목적 시료와 혼성화된 프로브를 중심으로 설명하기로 한다.
도 3을 참조하여, 목적 시료(140)에 랜덤 프라이머(150)를 결합(annealing)한다.
구체적으로, 랜덤 프라이머(150)를 포함하는 결합 용액(annealing solution)으로 기판 상면(111)에 목적 시료(140)와 혼성화된 프로브(131)를 처리함으로써, 랜덤 프라이머(150)를 목적 시료(140)에 결합할 수 있다. 목적 시료(140)에 대한 랜덤 프라이머(150)의 결합도를 향상시키기 위해, 예를 들어 45 ℃ 조건 하에서 1시간 동안 결합 과정을 진행할 수 있다.
도면에 도시하지는 않았으나, 상기 결합 용액의 처리를 수행하기 전에 프로브(131)와 혼성화되지 않은 목적 시료를 제거하는 세정 과정을 거칠 수 있다. 세정 과정은 예를 들어, PBST 버퍼 용액(buffer solution, 2X PBS (phosphate buffered saline), 0.1% Tween-20) 등을 이용할 수 있다.
랜덤 프라이머(random primer, 150)는 임의의 서열로 이루어진 단편(short segment)을 의미할 수 있으며, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드라고도 하는 단일 가닥 DNA(single strand DNA; ssDNA)를 의미할 수 있다. 랜덤 프라이머(150)는 복수 개의 뉴클레오티드를 포함하며, 이들은 모든 가능한 염기의 조합을 형성할 수 있다. 예를 들어, 랜덤 프라이머(150)가 8 뉴클레오티드(nucleotides), 즉 8 머(mer)의 뉴클레오티드로 이루어진 경우, 48 = 65,536 가지의 다양한 조합의 프라이머를 형성할 수 있다.
랜덤 프라이머(150)가 65,536 가지의 다양한 서열을 가질 수 있기 때문에, 랜덤 프라이머(150)는 목적 시료(140)의 임의의 위치(site)에 결합(annealing)할 수 있다. 더욱 구체적으로, 랜덤 프라이머(150)는 프로브(131)에 근접한 위치에서 목적 시료(140)와 결합할 수 있다. 랜덤 프라이머(150)가 프로브(131)의 자유 말단(131_a)에 근접한 위치에 결합할수록, 목적 시료(140)는 안정한 이차 구조를 형성할 수 있는 공간적 마진이 부족해질 수 있다. 이로 인해, 랜덤 프라이머(150) 및 프로브(131)가 연결될 가능성이 높아지고, 목적 시료(140)와 혼성화된 프로브(131)의 존재 여부를 더욱 정확히 검출할 수 있다. 즉, 목적 시료(140)가 프로브(131)와 혼성화 되었으나 프라이머와 연결되지 못하여 혼성화 검출에서 누락되는 경우를 줄일 수 있어, 목적 시료(140)에 포함된 임의의 서열이 존재하는지 여부를 더욱 정확히 검출할 수 있다. 따라서, 마이크로 어레이 혼성화 검출의 검출 효율을 더욱 향상시킬 수 있다.
본 발명의 몇몇 실시예에 따른 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법에서, 프로브(131) 및 목적 시료(140)와의 상호 관계를 비롯하여, 혼성화 검출의 신속성, 정확성 등을 고려할 때, 랜덤 프라이머(150)는 약 4 뉴클레오티드 이상 10 뉴클레오티드 이하인 것이 바람직할 수 있다. 더욱 구체적으로 4 뉴클레오티드 이상 10 뉴클레오티드 이하 일 수 있으며, 더욱 구체적으로는, 약 8 뉴클레오티드일 수 있다. 이에 대한 상세한 설명은 실험예를 통하여 설명하기로 한다.
랜덤 프라이머(150)는 프로브(131)측을 향하는 일단(150_a) 및 그의 반대측인 타단(150_b)을 포함한다. 랜덤 프라이머(150)의 일단(150_a)은 후속 과정에서 프로브(131)의 자유 말단(131_a)과 연결된다.
랜덤 프라이머(150)의 타단(150_b)에는 표시 물질(160)을 연결할 수 있다. 표시 물질(160)은 혼성화 검출을 용이하게 하는 물질로서, 검출 방법에 따라 다양한 물질을 사용할 수 있다. 검출 방법은 예를 들어, 형광 검출법, 전기화학적 검출법, 질량 변화를 이용한 검출법, 전하량 변화를 이용한 검출법, 또는 광학적 성질의 차이를 이용한 검출법 등을 포함할 수 있다. 형광 검출법을 이용할 경우, 표시 물질(160)은 예를 들어 형광 물질일 수 있다. 형광 물질은 예를 들어, 플로오르세인(fluorescein), FITC, FAM, TAMRA, Cy3, Cy5, 또는 유로퓸(europium) 등일 수 있다. 그러나, 랜덤 프라이머(150)에 표시 물질(160)을 연결하는 것은 하나의 예시일 뿐이며, 이 외에도 본 발명의 기술 분야에서 널리 알려진 여러가지 방법을 이용할 수 있음은 물론이다.
이 때, 기판(110) 상에 형성된 프로브(131)의 3' 말단은 기판(110) 상에 커 플링된 고정 말단(131_b)이고, 5' 말단은 기판(110)에 고정되지 않은 자유 말단(131_a)이다.
이어서, 도 4를 참조하여 랜덤 프라이머(150)의 일단(150_a)을 프로브(131)의 자유 말단(131_a) 방향으로 신장(extension; 210)시킨다.
예를 들어, 중합효소(polymerase)를 포함하는 연결 용액(ligation solution)으로 마이크로 어레이를 처리하여, 랜덤 프라이머(150)의 일단(150_a)에서부터 목적 시료(140)에 상보적인 염기를 형성할 수 있다. 따라서, 연결 용액에는 목적 시료(140)에 상보적인 염기를 형성할 염기 재료들, 예를 들어 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP를 포함하는 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 혼합물(dNTPs; deoxiNucleotide TriPhosohate mixture)을 포함할 수 있다.
나아가, 상기 연결 용액에 포함된 물질들, 예를 들어 중합효소, 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 혼합물 등을 앞서 언급했던 결합 용액(도 3의 설명 참조)에 포함시켜 사용할 수도 있다. 이 경우, 상술한 결합(annealing) 및 신장(extension) 과정이 여러 개의 프로브-목적 시료 혼성화 구조(probe-target sample hybridized structure)에서 동시다발적으로 진행될 수 있다.
이어서, 도 5를 참조하여 랜덤 프라이머 신장 영역(170)의 일단(170_a)과 프로브(131)의 자유 말단(131_a)을 연결한다.
상술한 바와 같이, 중합효소에 의하여 랜덤 프라이머(150)로부터 신장된 염기(들)는 랜덤 프라이머 신장 영역(170)을 형성한다. 이와 함께, 랜덤 프라이머 신장 영역(170)의 일단(170_a)을 프로브(131)의 자유 말단(131_a)과 직접 연결한다. 여기서, 직접 연결한다는 것은 추가적인 염기를 합성하지 않고, 양 말단을 화학 결합, 예를 들어 인산에스테르 결합으로 연결하는 것을 의미할 수 있다.
랜덤 프라이머 신장 영역(170)의 일단(170_a) 및 프로브(131)의 자유 말단(131_a)을 연결하는 것은 예를 들어, 리가아제(ligase)를 사용할 수 있다. 리가아제는 에너지를 이용하여 두 개의 분자를 결합시키는 효소로서, 더욱 구체적으로 인산에스테르 결합을 생성하는 DNA 리가아제를 사용할 수 있다. 그러나, 리가아제의 종류는 프로브(131) 및 목적 시료(140)의 종류나 목적에 따라 다양할 수 있으므로, 상기 예들에 한정되지 않는다고 할 것이다.
랜덤 프라이머 신장 영역(170)의 일단 및 프로브(131)의 자유 말단(131_a)을 연결하기 위해서는, 적절한 조건, 예를 들어 약 37 ℃의 온도, 및 약 1 시간의 처리 시간 등의 조건하에서 연결 반응을 유도할 수 있다.
이어서, 도 6을 참조하여 프로브(131)와 혼성화된 목적 시료(140)를 제거하고, 잔존하는 랜덤 프라이머(150)의 강도를 측정한다.
프로브(131)와 혼성화된 목적 시료(140)를 제거하는 것은 프로브(131)와 목적 시료(140) 간의 수소 결합을 제거하는 것을 포함할 수 있다.
상술한 바와 같이, 서로 상이한 서열을 가진 프로브(131, 132)가 고정된 서로 다른 프로브 셀 영역(A; 예를 들어, A1 및 A2)간에는 혼성화 여부의 차이가 발생할 수 있으므로, 임의의 프로브 셀 영역(A1) 상의 프로브(131)와만 목적 시료가 혼성화될 수 있다(도 2 참조). 따라서, 상기의 과정들, 구체적으로 결합(annealing), 신장(extension), 및 연결(ligation) 과정을 거친 후, 목적 시료(140)에 포함된 서열과 상보적인 서열을 가지는 프로브(131)만이 랜덤 프라이머 신장 영역(170), 및 랜덤 프라이머(150)와 연결될 수 있다.
이에 반하여, 목적 시료가 혼성화되지 않은 프로브(132), 다시 말하면 목적 시료(140)에 포함된 서열과 상보적인 서열을 가지지 않는 프로브(132)는 목적 시료를 처리하기 전인 기판 상면(111)에 고정된 프로브(도 1의 130 참조) 상태를 그대로 유지한다.
이어서, 랜덤 프라이머(150)와 연결된 프로브(131)의 강도를 측정하는 것은 랜덤 프라이머(150)의 타단(150_b)과 연결된 표시 물질(160)의 강도를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 그 외에도 랜덤 프라이머(150)와 연결된 프로브(131)의 강도를 측정하는 다양한 방법들이 있으며, 예를 들어, 형광 검출법에서는 표시 물질(160)은 형광 물질을 포함하고 각각의 프로브(131)와 연결된 형광 물질로부터 측정된 형광 강도에 따라 목적 시료가 임의의 서열을 포함하는지 여부를 확인할 수 있다.
또는, 도 7에 도시한 바와 같이, 랜덤 프라이머(150)에 표시 물질(도 5의 160 참조)을 연결하지 않고, 상술한 랜덤 프라이머(150)의 신장 과정에서 사용된 연결 용액에 형광 물질을 포함하는 염기 재료를 포함함으로써, 랜덤 프라이머(150)의 신장과 함께 랜덤 프라이머 형광 신장 영역(172)을 형성할 수 있다. 따라서, 랜덤 프라이머 형광 신장 영역(172)의 강도를 측정하여 목적 시료(140) 및 프로브(131)의 혼성화 강도를 측정하는 방법도 가능하다. 그 외에도 다양한 검출 방법들에 의해 혼성화 강도를 측정할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법에 따르면, 표시 물질과 연결된 랜덤 프라이머를 사용하여 랜덤 프라이머가 프로브에 근접한 위치에서 목적 시료와 결합하도록함으로써, 랜덤 프라이머 신장 영역의 길이를 줄일 수 있는 장점이 있다. 즉, 랜덤 프라이머가 결합한 위치 및 프로브의 자유 말단 사이의 길이가 짧아져서 목적 시료의 안정적인 2차 구조 형성을 방지할 수 있다. 따라서, 랜덤 프라이머로부터 프로브까지의 신장이 원활하게 진행되어 목적 시료와 혼성화된 프로브 및 랜덤 프라이머의 연결이 누락될 가능성이 낮아지므로, 마이크로 어레이 혼성화 검출의 검출 효율이 더욱 향상될 수 있다.
이하, 도 8 및 도 9를 참조하여, 본 발명의 다른 실시예에 따른 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법을 설명한다. 도 8 및 도 9는 본 발명의 다른 실시예에 따른 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법의 단면도이다. 본 발명의 다른 실시예에 따른 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법은 랜덤 스페이서의 결합 위치에 있어서 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법과 차이가 있다.
따라서, 이하에서는 본 발명의 다른 실시예에 따른 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법을 상기 차이점을 중심으로 도 3 이후의 과정에 대해 설명한다. 동일한 도면 부호는 실질적으로 동일한 구성요소를 지칭하며, 그 설명을 생략하거나 간략화한다.
먼저, 도 8을 참조하여 목적 시료(140)에 랜덤 프라이머(150)를 결합하되, 프로브(131)의 자유 말단(131_a)과 인접한 위치에 결합한다.
여기서, 인접한 위치라고 함은, 랜덤 프라이머(150)의 일단(150_a) 및 프로 브(131)의 자유 말단(131_a) 사이에 추가적인 염기가 형성될 공간이 없으나, 화학적으로 연결되어 있지 않은 상태를 의미할 수 있다. 예를 들어, 목적 시료(140)의 서열이 (3')…G-T-C-A-T-T-C-G-A-T-C-C-G-T-A…(5')라고 가정하면, 랜덤 프라이머(150) 및 프로브(131)의 관계는 아래와 같을 수 있다.
Figure 112008005787717-PAT00001
상기 그림에서 상단은 목적 시료(140)이고, 하단 좌측의 파란색 박스는 랜덤 프라이머(150)이며, 하단 우측의 빨간색 박스는 프로브(131)이다. 상단과 하단을 연결하는 회색 선은 상보적인 염기에 대한 수소 결합을 나타내며, 하이픈(-)은 화학적으로 연결된 상태를 나타낸다. 하단 중앙의 초록색 박스로 표시한 바와 같이, 랜덤 프라이머(150)의 일단(150_a)인 'C' 와 프로브(131)의 자유 말단(131_a)인 'T' 사이에 추가적으로 형성될 염기가 존재하지 않지만, 화학적으로 'C' 와 'T'는 화학적으로 연결되어 있지 않다.
이어서, 도 9을 참조하여 랜덤 프라이머(150)의 일단(150_a)과 프로브(131)의 자유 말단(131_a)을 직접 연결하고, 프로브(131)와 혼성화된 목적 시료(140)를 제거한다.
랜덤 프라이머(150)의 일단(150_a)과 프로브(131)의 자유 말단(131_a)을 직접 연결하는 것은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 어레이의 혼성화 검출 방법과는 달리, 중합 효소에 의한 랜덤 프라이머(150)의 신장 과정이 생략되어 더욱 효율적일 수 있다. 또한, 양자의 연결 반응에서는 리가아제를 사용할 수 있다. 랜덤 프라이머(150)의 일단(150_a) 및 프로브(131)의 자유 말단(131_a)을 연결하기 위해, 적절한 온도 및 시간 조건하에서, 예를 들어 37도에서 30분동안 반응시켜 연결 반응을 유도할 수 있다.
이 후, 프로브(131)와 혼성화된 목적 시료(140)를 제거하고, 표시 물질(160)의 강도를 측정하는 것은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 어레이의 혼성화 검출 방법과 실질적으로 동일하다 할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법에 따르면, 프로브와 인접한 위치에서 랜덤 프라이머가 목적 시료와 결합(annealing)하여 랜덤 프라이머의 신장 과정이 생략된다. 이로써, 목적 시료의 길이가 긴 경우라도 프로브와 랜덤 프라이머가 직접 연결(ligation)될 수 있다. 따라서, 목적 시료에 프로브와 랜덤 프라이머가 각각 결합하는 위치 사이에서 목적 시료의 안정적인 이차 구조가 형성될 수 있는 공간적 마진이 부족하게 되어, 랜덤 프라이머 및 목적 시료와 혼성화된 프로브가 더욱 용이하게 연결될 수 있다. 결국, 목적 시료의 서열이 임의의 서열을 포함하고 있는 지를 더욱 정확히 검출할 수 있다. 즉, 마이크로 어레이 혼성화 검출의 검출 효율이 더욱 향상되는 장점이 있다.
이하, 도 10을 참조하여, 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법을 설명한다. 도 10은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법의 단면도이다. 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법은 프로브의 자유 말단이 5'이라는 점에서 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법과 차이가 있다. 따라서, 이하에서는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법을 상기 차이점을 중심으로 도 3 이후의 과정에 대해 설명한다.
도 10을 참조하여, 프로브(131)의 자유 말단(131_a)을 랜덤 프라이머(150)의 일단(150_a) 방향으로 신장(220)시킨다.
도 4에서 설명한 바와 같이, 예를 들어, 중합효소를 포함하는 연결 용액으로 마이크를 처리하여 프로브(131)를 신장(220)시킬 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법에 있어서, 프로브(131)의 자유 말단(131_a)이 3' 이므로, 중합효소에 의한 신장(220) 방향은 자유 말단(131_a)에서 랜덤 프라이머(150)의 일단(150_a) 방향이 된다.
별도의 도면으로 도시하지는 않았으나, 상술한 바와 같이 형광 물질을 포함한 염기를 염기 재료로 사용하여, 랜덤 프라이머(150)의 타단(150_b)을 표시 물질(160)과 결합하지 않을 수도 있다. 또한, 도면에 도시하지 않았으나, 도 8에서 설명한 바와 같이 프로브(131)의 자유 말단(131_a)이 3' 말단이면서, 랜덤 프라이머(150)가 인접하여 형성되면, 중합 효소에 의한 신장없이 랜덤 프라이머(150) 및 프로브(131)의 직접 연결하는 실시예도 가능할 것이다.
이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
< 실험예 >
실험대상이 된 SNP는 9개의 인간 유전자에서 총 11개의 SNP 위치를 포함하는 SNP 넘버(number) 1 내지 11, 총 22 sequence들이었다. 상기 인간 유전자의 염기 서열은 다음과 같았다.
<표 1>
SNP # Gene SNP ID Probe sequence (5' to 3')
1 CAPN10 rs2975760 TGCAGGGCGCTCACGCTTGCTG[C/T]
2 HNF4A rs1800961 AGAATGAGCGGGACCGGATCAGCA[C/T]
3 HNF4A rs13433202 AGTTCCTAACCCCAGGTCTCCTGACA[C/T]
4 HNF4A rs1884614 CAGGGTGTAACTTACCCAGAGCTGCA[C/T]
5 IRS1 rs1801278 AGACTGGGCCCTGCACCTCCC[A/G]
6 KCNJ11 rs5219 GCGGGCACGGTACCTGGGCT[C/T]
7 LEPR rs1137100 GCTCCTTATGTGCAGACAACATTGAAGGAA[A/G]
8 NEUROD1 rs1801262 CAGACAAGAAGGAGGACGACCTCGAA[A/G]
9 TCF2 rs34973944 AGCTATAGGCGTCCATGGCCAGCTT[C/T]
10 TCF7L2 rs7903146 ACTGAACAATTAGAGAGCTAAGCACTTTTTAGATA[C/T]
11 UCP2 rs659366 ACCCGTCCTGTGGGGGTAACTGA[C/T]
목적 시료(100 ㎕ (0.1 ng/㎕))을 포함한 목적 시료 용액으로 마이크로 어레이를 처리하고, 45도에서 1시간동안 처리하여 목적 시료가 프로브에 혼성화되도록 하였다. 이 때, 실험 1에서는 Combimatrix사의 특허문헌 US 20060240443에 개시된 방법에 의하여 5′ Cy5 표지된 올리고뉴클레오티드 검출 프라이머(Oligonucleotide detection primer)(최종농도 2 μM, 5′ /Cy5/GCATCCTAATACGACTCACTATAGG)를, 실험 2 내지 4에서는 각각 4, 6, 8 nucleotides의 5′Cy3 표지된 랜덤 프라이머(최종농도 2 μM)를 혼성화 용액에 섞어 혼성화 시켰다. 이어서, PBST buffer로 1분간 2회, PBS buffer로 1분간 2회, ligase buffer로 1분간 1회 세정하여 마이크로 어레 이를 헹궜다.
세정된 마이크로어레이는 37도에서 30분동안 100 uL의 중합 및 연결 용액(Nuclease-free water 84 ㎕, 10X DNA ligase buffer 10 ㎕, 10mM dNTP 2 ㎕, AmpliTaq® DNA polymerase, Stoffel Fragment 2 ㎕, DNA ligase (E. coli) 2 ㎕)으로 각각 마이크로 어레이를 처리하여 랜덤 프라이머와 목적 시료의 결합(annealing), 신장(extension), 연결(ligation)을 유도하였다.
이어서, 실험 1 내지 4의 방법으로 처리된 각각의 마이크로 어레이의 SNP의 염기를 조사하였으며, 그 결과를 아래 표 1에 나타내었다.
상기 실험 1 내지 4에서는 칩당 4개의 시료를 처리할 수 있는 고객맞춤형 마이크로어레이 (combimatrix, USA)를 사용하였다. 이 마이크로어레이는 11개의 SNP 위치에 대해 각각 A(Adenine, 아데닌), C(Cytosine, 시토신), G(Guanine, 구아닌), T(Thymine, 티민) 네 개의 스팟(spot)을 한 세트로 하며, 이러한 세트는 마이크로어레이상에 서로 다른 위치에 23 개씩 반복적으로 배치되어 존재한다. 그리고 유전자형의 결정은 23개의 동일 프로브에서 검출된 형광신호의 중간 값과 표준 편차를 가지고 통계처리를 통해 하나의 SNP 위치에 속하는 A, C, G, T 스팟들을 상대 비교하여 계산하였다.
<표 2>
SNP # 염기서열분석결과 실험 1 실험 2 실험 3 실험 4
1 C/C no.call no.call no.call no.call
2 C/C C/C no.call C/C C/C
3 T/T T/T no.call T/T T/T
4 C/T no.call no.call no.call C/T
5 C/C A/G no.call no.call A/G
6 C/T no.call no.call C/T C/T
7 G/G G/G no.call no.call G/G
8 A/A A/G no.call G/G no.call
9 G/G G/G no.call G/G G/G
10 C/C C/C no.call C/C C/C
11 T/T T/T no.call T/T T/T
상기 표 2에서 염기 서열 분석 결과열(column)은 표준적인 유전자 염기서열 분석법에 의해 알려진 유전자형을 나타낸 것이고, 실험 1에서 실험 4의열들은 각 마이크로어레이 실험 결과에 따른 유전자형을 나타낸 것이며, 붉은 색의 글씨는 유전자형 검출에 실패했거나(no call) 잘못된 유전자형을 검출한 경우를 나타낸 것이다.
상기 표 2를 살펴보면, 각각 실험 1이 6/11(55%), 실험 2가 0/11(0%), 실험 3이 6/11(55%), 및 실험 4가 8/11(73%)의 정확도를 나타내었다. 이를 통해 6머의 랜덤 프라이머를 사용하는 경우에는 적어도 기존 방법과 동등한 정확도를 나타낼 수 있으며, 나아가 8 뉴클레오티드nucleotides 길이의 랜덤 프라이머를 사용하면 기존 방법보다 정확도가 높아질 수 있다는 것을 알 수 있었다.
도 1 및 도 2는 본 발명의 몇몇 실시예들에 따른 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법의 중간 구조물의 단면도들이다.
도 3 내지 도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법의 중간 구조물의 단면도들이다.
도 8 및 도 9는 본 발명의 다른 실시예에 따른 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법의 중간 구조물의 단면도들이다.
도 10은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법의 중간 구조물의 단면도이다.
<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>
110: 기판 111: 기판 상면
120: 링커 130, 131, 132: 프로브
140: 목적 시료 150: 랜덤 프라이머
160: 표시 물질
170: 랜덤 프라이머 신장 영역
171: 프로브 신장 영역
172: 랜덤 프라이머 형광 신장 영역
210, 220: 신장(extension)

Claims (18)

  1. 복수의 프로브가 형성된 마이크로 어레이를 제공하고,
    상기 복수의 프로브에 목적 시료(target sample)와 임의의 서열로 이루어진 랜덤 프라이머를 혼성화하고,
    상기 각 프로브의 자유 말단(free terminal) 및 상기 랜덤 프라이머의 상기 각 프로브측 일단을 연결하고,
    상기 각 프로브와 혼성화된 상기 목적 시료를 제거하고,
    잔존하는 상기 랜덤 프라이머의 강도를 측정하는 것을 포함하는 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법.
  2. 제1 항에 있어서,
    상기 랜덤 프라이머는 4 뉴클레오티드(nucleotides) 이상 10 뉴클레오티드 길이 이하인 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법.
  3. 제2 항에 있어서,
    상기 랜덤 프라이머는 8 뉴클레오티드 길이인 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법.
  4. 제1 항에 있어서,
    상기 랜덤 프라이머의 타단은 표시물질과 연결된 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법.
  5. 제4 항에 있어서,
    상기 표시 물질은 형광 물질인 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법.
  6. 제1 항에 있어서,
    상기 각 프로브의 자유 말단 및 상기 랜덤 프라이머의 상기 각 프로브측 일단을 연결하는 것은,
    리가아제(ligase)를 이용하여 상기 각 프로브의 상기 자유 말단에 상기 랜덤 프라이머의 일단을 직접 연결하는 것인 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법.
  7. 제1 항에 있어서,
    상기 각 프로브의 상기 자유 말단은 5' 말단인 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법.
  8. 제7 항에 있어서,
    혼성화된 상기 각 프로브의 자유 말단 및 상기 랜덤 프라이머의 상기 각 프로브측 일단을 연결하는 것은,
    상기 랜덤 프라이머의 일단으로부터 상기 랜덤 프라이머를 신장하여 상기 목 적 시료에 상보적인 랜덤 프라이머 신장 영역을 형성하고,
    리가아제를 이용하여 상기 각 프로브의 자유 말단과 상기 랜덤 프라이머 신장 영역의 일단을 연결하는 것을 포함하는 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법.
  9. 제1 항에 있어서,
    상기 각 프로브의 상기 자유 말단은 3' 말단인 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법.
  10. 제9 항에 있어서,
    혼성화된 상기 각 프로브의 자유 말단 및 상기 랜덤 프라이머의 상기 각 프로브측 일단을 연결하는 것은,
    상기 각 프로브의 자유 말단으로부터 상기 각 프로브를 신장하여 상기 목적 시료에 상보적인 프로브 신장 영역을 형성하고,
    리가아제를 이용하여 상기 랜덤 프라이머의 일단과 상기 프로브 신장 영역을 연결하는 것을 포함하는 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법.
  11. 제1 항에 있어서,
    상기 목적 시료는 프로브와 혼성화된 부분을 제외한 여분의 길이가 9머 이상인 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법.
  12. 목적 시료 및 임의의 서열로 이루어진 랜덤 프라이머를 와 혼성화된 복수의 프로브를 포함하는 마이크로 어레이를 제공하고,
    리가아제(ligase)를 포함하는 연결 용액으로 상기 마이크로 어레이를 처리하고,
    상기 마이크로 어레이를 세정하고,
    상기 마이크로 어레이의 혼성화 정도를 측정하는 것을 포함하는 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법.
  13. 제12 항에 있어서,
    상기 랜덤 프라이머는 4 뉴클레오티드 이상 10 뉴클레오티드 길이 이하인 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법.
  14. 제13 항에 있어서,
    상기 랜덤 프라이머는 8 뉴클레오티드 길이인 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법.
  15. 제12 항에 있어서,
    상기 랜덤 프라이머는 일단이 형광 물질과 연결된 것을 포함하고,
    상기 형광 물질과 연결된 상기 랜덤 프라이머 및 리가아제를 포함하는 연결 용액으로 상기 마이크로 어레이를 처리하는 것을 포함하는 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법.
  16. 제15 항에 있어서,
    상기 연결 용액은 중합효소(polymerase)를 더 포함하는 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법.
  17. 제 12항에 있어서,
    상기 연결 용액은 중합 효소 및 형광 표지된 염기들을 포함하는 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법.
  18. 제12 항에 있어서,
    상기 목적 시료는 프로브와 혼성화된 부분을 제외한 여분의 길이가 9머 이상인 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법.
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