JP2006333869A - 遺伝子多型の簡易検出方法および検出用試薬 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 野生型検出用オリゴヌクレオチドおよび変異型検出用オリゴヌクレオチドのうち少なくともいずれか一方と核酸特異標識を用いて増幅を行うことにより、遺伝子多型を検出する方法において、同一の増幅条件で少なくとも2箇所の異なった変異箇所の配列を検出することを特徴とする遺伝子多型の検出方法。
【選択図】 なし
Description
また、特に試料中に存在する2種類以上のチトクローム2C19(CYP2C19)と略することがある)遺伝子多型の同時検出方法に関する。
さらには、チトクローム2D6およびチトクローム2C19の遺伝子多型の同時検出法に関する。
また、さらには2種類以上のN−アセチルトランスフェラーゼ2(NAT2と略することがある)の遺伝子多型の同時検出法に関する。
一方、遺伝子の点突然変異により引き起こされる遺伝病が種々知られており、それらの中には、遺伝子のどの部位がどのように点突然変異することにより遺伝病が引き起こされるかわかっているものも少なくない。
また、ヒトチトクロームP4502C19の多型はHelicobacter pyloriの除菌治療との関連が知られているなど、臨床的にも意義が高い。
NAT2の多型は主に結核の治療薬であるイソニアジドの代謝に関連すると言われており、この点で臨床的な意義が高い。
1.3‘末端が標的遺伝子と相補的である野生型検出用オリゴヌクレオチドおよび/または3‘末端が標的遺伝子と相補的である変異型検出用オリゴヌクレオチドを用いて増幅を行うことにより、N−アセチルトランスフェラーゼ2遺伝子多型を検出する方法において、同一の増幅条件で同一の遺伝子上の少なくとも2箇所の異なった変異箇所の配列を検出することを特徴とするN−アセチルトランスフェラーゼ2遺伝子多型の検出方法。
2.変異箇所以外に少なくとも1箇所のミスマッチを有するオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする1のN−アセチルトランスフェラーゼ2遺伝子多型の検出方法。
3.オリゴヌクレオチドの3‘末端が標的遺伝子と相補的であり、3‘末端から2番目のヌクレオチドが野生型または変異型配列のヌクレオチドと相補的に対応するように設計されたオリゴヌクレオチドであることを特徴とする1または2のN−アセチルトランスフェラーゼ2遺伝子多型の検出方法。
4.増幅反応がPCR、NASBA、LCR、SDA、RCRおよびTMAよりなる群から選ばれたいずれかの方法であることを特徴とする1〜3のいずれかのN−アセチルトランスフェラーゼ2遺伝子多型の検出方法。
5.オリゴヌクレオチドが予め標識されていることを特徴とする1〜4のいずれかのN−アセチルトランスフェラーゼ2遺伝子多型の検出方法。
6.核酸特異標識により検出することを特徴とする1〜5のいずれかのN−アセチルトランスフェラーゼ2遺伝子多型の検出方法。
7.3‘末端が標的遺伝子と相補的である野生型検出用オリゴヌクレオチドおよび3‘末端が標的遺伝子と相補的である変異型検出用オリゴヌクレオチドのうち少なくともいずれか一方を用いて増幅を行うことにより、N−アセチルトランスフェラーゼ2遺伝子多型を検出するための試薬において、同一の増幅条件で同一の遺伝子上の少なくとも2箇所の異なった変異箇所の配列を検出できるよう調整されたことを特徴とするN−アセチルトランスフェラーゼ2遺伝子多型の検出試薬。
8.オリゴヌクレオチドの3‘末端が標的遺伝子と相補的であり、3‘末端から2番目のヌクレオチドが野生型または変異型配列のヌクレオチドと相補的に対応するように設計されたオリゴヌクレオチドであることを特徴とする7のN−アセチルトランスフェラーゼ2遺伝子多型の検出試薬。
9.増幅反応がPCR、NASBA、LCR、SDA、RCRおよびTMAよりなる群から選ばれたいずれかの方法であることを特徴とする7または8のN−アセチルトランスフェラーゼ2遺伝子多型の検出試薬。
10.核酸特異標識により検出することを特徴とする7〜9のいずれかのN−アセチルトランスフェラーゼ2遺伝子多型の検出試薬。
3番目に人為的ミスマッチを用いた場合、伸長反応を期待しない核酸配列を鋳型とした時には、塩基多型部位と併せて2塩基のミスマッチとなり、伸長反応が強く阻害される。
本発明において、オリゴヌクレオチドの伸長方法は、基本的には、従来の方法を用いて行うことができる。通常、一本鎖に変性させた特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、4種類のデオキシヌクレオシド三リン酸(dNTP)及びDNAポリメラーゼと共に、野生型検出用オリゴヌクレオチドと、1種又は2種の変異型検出用オリゴヌクレオチドを同時又はそれぞれ別個に用いて作用させることで、標的核酸を鋳型としてオリゴヌクレオチドが伸長する。
SDAは、その配列に制限酵素サイトを有する鋳型と相補的に結合するオリゴヌクレオチドを用い、伸長反応と制限酵素処理を繰り返すことによって核酸を増幅させる方法である。
RCAは、環状の標的核酸に対し相補的なオリゴヌクレオチドとDNAポリメラーゼを作用させることによって、新たに生成したオリゴヌクレオチドが、鋳型から離されながら、連続的に標的核酸を増幅させる方法である。
さらには上述の箇所に加えて、チトクローム2A6の少なくとも1箇所の遺伝子多型の同時検出を行ってもよい。
その他にも、電気泳動による方法、ハイブリダイゼーションによる方法等増幅反応の有無を検出できる方法であれば用いることができる。
例えば、該検出は、該各オリゴヌクレオチドを、予め酵素、ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射性物質および発光団などによって標識しておき、伸長又は増幅反応後に、反応したオリゴヌクレオチドの標識を検出することによって、遺伝子多型の検出を行うことができる。酵素としては、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。蛍光物質としては、FITC,6−FAM,HEX,TET,TAMRA,テキサスレッド、Cy3、Cy5などが挙げられる。2本鎖核酸特異的結合物質としては、エチレンブロマイド、SYBR Green Iなどが挙げられる。ハプテンとしては、ビオチン、ジゴキシゲニンなどが挙げられる。放射性物質としては、32P、35Sなどが挙げられる。
発光団としては、ルテニウムなどが挙げられる。該標識は、オリゴヌクレオチドの伸長反応に影響を与えることがなければオリゴヌクレオチドのどの位置に結合させてもよい。フォワード側プライマーとして用いる場合は、好ましくは、5’ 部位である。
逆に、野生型検出用オリゴヌクレオチドおよび変異型検出用オリゴヌクレオチドの両方とも増幅が認められない場合には、オリゴヌクレオチド、塩類、DNAポリメラーゼ、等の濃度を上げることが好ましい。また、増幅すべき方の濃度のみ上げることも好ましい。
なお、緩衝液、dNTPの濃度は、野生型検出用オリゴヌクレオチドおよび変異型検出用オリゴヌクレオチドや対象の変異箇所にかかわらず、同一であることが好ましい。
これまで知られているオリゴヌクレオチドを用いて変異箇所を検出する方法では、各変異箇所の周辺の塩基配列は全く同じではないため、異なった条件で増幅反応を行うことが必要である他、標的核酸部位を特異的に増幅させるために、増幅産物の塩基数は各変異箇所に応じて異なっていたため、複数の変異箇所を同じ温度及び時間サイクル条件では増幅が行えないと考えられていた。本発明では、各変異箇所に特異的なオリゴヌクレオチドを用いること、および反応液を適宜調整することによって従来の課題を克服し、本発明を完成するに至った。
本発明において、キットとしては、野生型検出用オリゴヌクレオチド及び1種又は2種の変異型検出用オリゴヌクレオチド、リバースオリゴヌクレオチド、DNAポリメラーゼ、4種類のデオキシヌクレオシド三リン酸(dNTP)を含む遺伝子多型検出用試薬キットを含むものである。
また、該各オリゴヌクレオチドは、予め上述したような酵素、ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射性物質および発光団などによって標識されていてもよい。
キットとしては、反応容器内にそれぞれの野生型検出用オリゴヌクレオチド及び/又は変異型検出用オリゴヌクレオチド、リバースプライマー、DNAポリメラーゼ、4種類のデオキシヌクレオシド三リン酸(dNTP)、塩類など、試料以外の増幅に必要なものがすべて溶解された状態か、もしくは一定量の水を加えるのみで後は試料を加えるだけの反応液となる状態であることが好ましい。
また、キットのオリゴヌクレオチドの種類以外は同じ組成、含有量であることが好ましいが、本発明の、同一の増幅条件で少なくとも2箇所の異なった変異箇所の配列を検出するためには、塩類等の濃度を前述のように適宜変えることもできる。
実施例における各オリゴヌクレオチドはパーキンエルマー社製DNAシンセサイザー392型を用いて、ホスホアミダイト法にて合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で55℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社OPCカラムにて実施した。
もしくはDNA合成受託会社((株)日本バイオサービス、(株)サワディー、GENSET KK、アマシャムファルマシア バイオテク(株)等)に依頼した。
以下の試薬を含む25μl溶液を調製した。
Taq DNAポリメラーゼ反応液a
オリゴヌクレオチド(フォワード側プライマー) 5 pmol
オリゴヌクレオチド(リバース側プライマー) 5 pmol
×10緩衝液 2.5 μl
2mM dNTP 2.5 μl
25mM MgCl2 1.5 μl
Taq DNAポリメラーゼ 1.3 U
抽出DNA溶液 100 ng
95℃・5分
95℃・30秒、65℃・30秒、72℃、30秒(35サイクル)
72℃・2分。
それぞれの増幅反応液3μlを10000倍に希釈されたSyberGreenI(Molecular Probe製)の溶液100μlに加えて、室温にて攪拌後に暗室中で蛍光プレートリーダー(大日本製薬社)で蛍光強度量を測定した。所要時間は約5分であった。
得られた蛍光強度から、以下の計算式を用いて試料の蛍光強度量を算出した。
FL(試料の蛍光強度)=FLs − FLb (式1)
FLb:Negative Control (試料が未添加)の蛍光強度
FLs:各試料の蛍光強度
(1)CYP2D6遺伝子の100番目及び2850番目の多型を検出するオリゴヌクレオチド
オリゴ1は3’末端から2番目に野生型(C)のヌクレオチド配列、および3番目に人為的ミスマッチ(C→A)を有し、オリゴ2は3’末端から2番目に変異型(T)のヌクレオチド配列、および3番目に人為的ミスマッチ(C→A)を有し、オリゴ3がアンチセンス鎖であり、オリゴ1、2と組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。なお、オリゴ1、2、3は必要により標識して使用される。
オリゴ4は3’末端から2番目に野生型(C)のヌクレオチド配列、および3番目に人為的ミスマッチ(C→A)を有し、オリゴ5は3’末端から2番目に変異型(T)のヌクレオチド配列、および3番目に人為的ミスマッチ(C→A)を有し、オリゴ6がアンチセンス鎖であり、オリゴ4、5と組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。なお、オリゴ4、5、6は必要により標識して使用される。
さらに、オリゴ3およびオリゴ6は伸長反応の有無を検出するのに適当な長さ等を基準に決めたものであって、対象となる遺伝子の適当な部分に対応するものであれば、本実施例の配列に限定されるものではない。
1. PCR法による増幅反応
ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記オリゴヌクレオチドを含む試薬を添加して、前記条件によりCYP2D6*2、CYP2D6*10遺伝子多型を解析した。なお、反応は反応液a、b、c、dとも同じ条件で同時に行った。
オリゴ1およびオリゴ3
反応液1−bのオリゴヌクレオチド
オリゴ2およびオリゴ3
反応液1−cのオリゴヌクレオチド
オリゴ4およびオリゴ6
反応液1−dのオリゴヌクレオチド
オリゴ5およびオリゴ6
(1)CYP2D6遺伝子の1846番目及びExon9 conversionの多型を検出するオリゴヌクレオチド
オリゴ7及び8はCYP2D6遺伝子の1846番目の多型を検出するためのものである。
オリゴ7は3’末端から2番目に野生型(G)のヌクレオチド配列、および3番目に人為的ミスマッチ(C→A)を有し、オリゴ8は3’末端から2番目に変異型(A)のヌクレオチド配列、および3番目に人為的ミスマッチ(C→A)を有し、オリゴ9がアンチセンス鎖であり、オリゴ7、8と組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。なお、オリゴ7、8、9は必要により標識して使用される。
オリゴ10は野生型(2D6 Exon9)のヌクレオチド配列を有し、オリゴ11は変異型(2D7 Exon9)のヌクレオチド配列を有し、オリゴ12がアンチセンス鎖であり、オリゴ10、11と組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。なお、オリゴ10、11、12は必要により標識して使用される。
1. PCR法による増幅反応
ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記オリゴヌクレオチドを含む試薬を添加して、前記条件によりCYP2D6*4、CYP2D6*36遺伝子多型を解析した。なお、反応は反応液a、b、c、dとも同じ条件で同時に行った。
オリゴ7およびオリゴ9
反応液2−bのオリゴヌクレオチド
オリゴ8およびオリゴ9
反応液2−cのオリゴヌクレオチド
オリゴ10およびオリゴ12
反応液2−dのオリゴヌクレオチド
オリゴ11およびオリゴ12
(1)CYP2D6遺伝子の1846番目の多型を検出するオリゴヌクレオチド
オリゴ13は3’末端から2番目に野生型(G)に相補的なヌクレオチド配列、および3番目に人為的ミスマッチ(C→A)を有し、オリゴ14は3’末端から2番目に変異型(A)に相補的なヌクレオチド配列、および3番目に人為的ミスマッチ(C→A)を有し、オリゴ15がアンチセンス鎖であり、オリゴ13、14と組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。なお、オリゴ13、14、15は必要により標識して使用される。
(2)CYP2D6遺伝子の1758番目の多型を検出するオリゴヌクレオチド
オリゴ16は3’末端から2番目に野生型(G)に相補的なヌクレオチド配列、および3番目に人為的ミスマッチ(C→A)を有し、オリゴ17は3’末端から2番目に変異型(A)に相補的なヌクレオチド配列、および3番目に人為的ミスマッチ(C→A)を有し、オリゴ15がアンチセンス鎖であり、オリゴ16、17と組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。なお、オリゴ16、17、15は必要により標識して使用される。
(3)PCR法によるCYP2D6*4、CYP2D6*14遺伝子多型の解析
1. PCR法による増幅反応
ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記オリゴヌクレオチドを含む試薬を添加して、前記条件によりCYP2D6*4、CYP2D6*14遺伝子多型を解析した。なお、反応は反応液a、b、c、dとも同じ条件で同時に行った。
オリゴ13およびオリゴ15
反応液3−bのオリゴヌクレオチド
オリゴ14およびオリゴ15
反応液3−cのオリゴヌクレオチド
オリゴ16およびオリゴ15
反応液3−dのオリゴヌクレオチド
オリゴ17およびオリゴ15
(1)CYP2C19遺伝子の681番目の多型を検出するオリゴヌクレオチド
オリゴ18は3’末端から2番目に野生型(G)に相補的なヌクレオチド配列、および3番目に人為的ミスマッチ(G→A)を有し、オリゴ19は3’末端から2番目に変異型(A)に相補的なヌクレオチド配列、および3番目に人為的ミスマッチ(G→A)を有し、オリゴ20がアンチセンス鎖であり、オリゴ18、19と組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。なお、オリゴ18、19、20は必要により標識して使用される。
オリゴ21は3’末端から2番目に野生型(G)に相補的なヌクレオチド配列、および3番目に人為的ミスマッチ(c→t)を有し、オリゴ22は3’末端から2番目に変異型(A)に相補的なヌクレオチド配列、および3番目に人為的ミスマッチ(c→t)を有し、オリゴ23がアンチセンス鎖であり、オリゴ21、
22と組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。なお、オリゴ21、22、23は必要により標識して使用される。
1. PCR法による増幅反応
ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記オリゴヌクレオチドを含む試薬を添加して前記条件によりCYP2C19*2、CYP2C19*3遺伝子多型を解析した。なお、反応は反応液a、b、c、dとも同じ条件で同時に行った。
オリゴ18およびオリゴ20
反応液4−bのオリゴヌクレオチド
オリゴ19およびオリゴ20
反応液4−cのオリゴヌクレオチド
オリゴ21およびオリゴ23
反応液4−dのオリゴヌクレオチド
オリゴ21およびオリゴ23
(1)CYP2C19遺伝子の681番目及び636番目の多型を検出するオリゴヌクレオチド
オリゴ24及び25はCYP2C19遺伝子の681番目の多型を検出するためのものである。
オリゴ24は3’末端から2番目に野生型(G)のヌクレオチド配列、および3番目に人為的ミスマッチ(G→A)を有し、オリゴ25は3’末端から2番目に変異型(A)のヌクレオチド配列、および3番目に人為的ミスマッチ(G→A)を有し、オリゴ3がアンチセンス鎖であり、オリゴ24、25と組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。なお、オリゴ24、25、26は必要により標識して使用される。
オリゴ27は3’末端から2番目に野生型(G)のヌクレオチド配列、および3番目に人為的ミスマッチ(C→A)を有し、オリゴ28は3’末端から2番目に
変異型(A)のヌクレオチド配列、および3番目に人為的ミスマッチ(C→A)を有し、オリゴ29がアンチセンス鎖であり、オリゴ27、28と組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。なお、オリゴ27、28、29は必要により標識して使用される。
1. PCR法による増幅反応
ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記オリゴヌクレオチドを含む試薬を添加して前記条件によりCYP2C19*2、CYP2C19*3遺伝子多型を解析した。なお、反応は反応液a、b、c、dとも同じ条件で同時に行った。
オリゴ24およびオリゴ26
反応液5−bのオリゴヌクレオチド
オリゴ25およびオリゴ26
反応液5−cのオリゴヌクレオチド
オリゴ27およびオリゴ29
反応液5−dのオリゴヌクレオチド
オリゴ28およびオリゴ29
(1)NAT2遺伝子の481番目の多型を検出するオリゴヌクレオチド
オリゴ30は3’末端から2番目に野生型(C)に相補的なヌクレオチド配列、および3番目に人為的ミスマッチ(A→C)を有し、オリゴ31は3’末端から2番目に変異型(T)に相補的なヌクレオチド配列、および3番目に人為的ミスマッチ(A→C)を有し、オリゴ32がセンス鎖であり、オリゴ30、31と組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。なお、オリゴ30、31、32は必要により標識して使用される。
オリゴ33は3’末端から2番目に野生型(G)に相補的なヌクレオチド配列、および3番目に人為的ミスマッチ(T→A)を有し、オリゴ34は3’末端から2番目に変異型(A)に相補的なヌクレオチド配列、および3番目に人為的ミスマッチ(T→A)を有し、オリゴ32がセンス鎖であり、オリゴ33、34と組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。なお、オリゴ33、34は必要により標識して使用される。
オリゴ35は3’末端から2番目に野生型(G)に相補的なヌクレオチド配列、および3番目に人為的ミスマッチ(T→G)を有し、オリゴ36は3’末端から2番目に変異型(A)に相補的なヌクレオチド配列、および3番目に人為的ミスマッチ(T→G)を有し、オリゴ32がセンス鎖であり、オリゴ35、36と組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。なお、オリゴ35、36は必要により標識して使用される。
1. PCR法による増幅反応
ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記オリゴヌクレオチドを含む試薬を添加して前記条件によりNAT2*5、NAT2*6、NAT2*7遺伝子多型を解析した。なお、反応は反応液a、b、c、d、e、fとも同じ条件で同時に行った。
オリゴ30およびオリゴ32
反応液6−bのオリゴヌクレオチド
オリゴ31およびオリゴ32
反応液6−cのオリゴヌクレオチド
オリゴ33およびオリゴ32
反応液6−dのオリゴヌクレオチド
オリゴ34およびオリゴ32
反応液6−eのオリゴヌクレオチド
オリゴ35およびオリゴ32
反応液6−fのオリゴヌクレオチド
オリゴ36およびオリゴ32
(1)CYP2A6*3遺伝子の多型を検出するオリゴヌクレオチド
オリゴ37はおよびオリゴ39はCYP2DA6(野生型)に相補的なヌクレオチド配列を有し、オリゴ38およびオリゴ40はCYP2A6*3(変異型)に相補的なヌクレオチド配列を有する。オリゴ37と39、オリゴ38と40は組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。なお、オリゴ37、38、39、40は必要により標識して使用される。
1. PCR法による増幅反応
ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記オリゴヌクレオチドを含む試薬を添加し前記条件によりCYP2A6*3遺伝子多型を解析した。反応は反応液a、bとも同じ条件で同時に行った。
オリゴ37およびオリゴ39
反応液7−bのオリゴヌクレオチド
オリゴ38およびオリゴ40
さらに、リバース側は伸長反応の有無を検出するのに適当な長さ等を基準に決めたものであって、対象となる遺伝子の適当な部分に対応するものであれば、本実施例の配列に限定されるものではない。
Claims (10)
- 3‘末端が標的遺伝子と相補的である野生型検出用オリゴヌクレオチドおよび/または3‘末端が標的遺伝子と相補的である変異型検出用オリゴヌクレオチドを用いて増幅を行うことにより、N−アセチルトランスフェラーゼ2遺伝子多型を検出する方法において、同一の増幅条件で同一の遺伝子上の少なくとも2箇所の異なった変異箇所の配列を検出することを特徴とするN−アセチルトランスフェラーゼ2遺伝子多型の検出方法。
- 変異箇所以外に少なくとも1箇所のミスマッチを有するオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする請求項1に記載のN−アセチルトランスフェラーゼ2遺伝子多型の検出方法。
- オリゴヌクレオチドの3‘末端が標的遺伝子と相補的であり、3‘末端から2番目のヌクレオチドが野生型または変異型配列のヌクレオチドと相補的に対応するように設計されたオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項1または2記載のN−アセチルトランスフェラーゼ2遺伝子多型の検出方法。
- 増幅反応がPCR、NASBA、LCR、SDA、RCRおよびTMAよりなる群から選ばれたいずれかの方法であることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載のN−アセチルトランスフェラーゼ2遺伝子多型の検出方法。
- オリゴヌクレオチドが予め標識されていることを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載のN−アセチルトランスフェラーゼ2遺伝子多型の検出方法。
- 核酸特異標識により検出することを特徴とする請求項1〜5のいずれかに記載のN−アセチルトランスフェラーゼ2遺伝子多型の検出方法。
- 3‘末端が標的遺伝子と相補的である野生型検出用オリゴヌクレオチドおよび3‘末端が標的遺伝子と相補的である変異型検出用オリゴヌクレオチドのうち少なくともいずれか一方を用いて増幅を行うことにより、N−アセチルトランスフェラーゼ2遺伝子多型を検出するための試薬において、同一の増幅条件で同一の遺伝子上の少なくとも2箇所の異なった変異箇所の配列を検出できるよう調整されたことを特徴とするN−アセチルトランスフェラーゼ2遺伝子多型の検出試薬。
- オリゴヌクレオチドの3‘末端が標的遺伝子と相補的であり、3‘末端から2番目のヌクレオチドが野生型または変異型配列のヌクレオチドと相補的に対応するように設計されたオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項7記載のN−アセチルトランスフェラーゼ2遺伝子多型の検出試薬。
- 増幅反応がPCR、NASBA、LCR、SDA、RCRおよびTMAよりなる群から選ばれたいずれかの方法であることを特徴とする請求項7または8記載のN−アセチルトランスフェラーゼ2遺伝子多型の検出試薬。
- 核酸特異標識により検出することを特徴とする請求項7〜9のいずれかに記載のN−アセチルトランスフェラーゼ2遺伝子多型の検出試薬。
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