JP2007525998A - 脆弱x症候群などのstrpの検出 - Google Patents
脆弱x症候群などのstrpの検出 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2007525998A JP2007525998A JP2007502004A JP2007502004A JP2007525998A JP 2007525998 A JP2007525998 A JP 2007525998A JP 2007502004 A JP2007502004 A JP 2007502004A JP 2007502004 A JP2007502004 A JP 2007502004A JP 2007525998 A JP2007525998 A JP 2007525998A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- cgg
- hybridized
- target
- product
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
脆弱X症候群などの短鎖縦列反復配列多型(STRP)を検出するための方法であり、PCRを用いて、対象の全てのSTR、およびそのSTRに隣接する核酸の実質的な近接セグメントを含むゲノムDNAにおける染色体上の核酸を増幅させる。次いで、1本鎖の産物を得て、(i)STR、および(ii)近接DNAセグメントを標的とする比色標識したオリゴヌクレオチドを、この1本鎖の産物とハイブリダイズし、次いで1本鎖の産物を固相に結合させ、標的材料の残部から分離する。この標識したオリゴヌクレオチドの標的材料を塩基で処理することにより回収し、次いでそれに相補的な適切なオリゴヌクレオチドプローブを含む複数のスポットを有するマイクロアレイにハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの後、マイクロアレイ上の特定のスポットに存在するハイブリダイズした標識標的材料の比色強度を測定して個々の値を得、その値を既知の対照サンプルからの結果と比較して、分析したDNAの対象の領域におけるSTRの数を正確に定量する。
Description
本発明は、一般的に、遺伝性または散発性の遺伝的欠損のための診断アッセイに関し、より詳しくは短鎖縦列反復配列(STR)により引き起こされる疾患または欠損のためのアッセイに関し、さらにより詳しくはヒト、胎児、および胚で脆弱X症候群を引き起こす遺伝的欠損に対するアッセイに関する。これらのSTRPのアッセイは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用し、その後マイクロアレイへのハイブリダイゼーション、および分析を行う。
真核生物のDNAには、短鎖縦列反復配列多型(STRP)と呼ばれる非常に短い単純な配列の縦列反復を有する。反復多型には、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、およびテトラヌクレオチドの反復が含まれる。トリヌクレオチドおよびテトラヌクレオチドの反復は、3および4ヌクレオチドの反復である。ますます多くの疾患が、トリヌクレオチドのSTRの伸長と関連していることが知られている(例えば、非特許文献1、非特許文献2、非特許文献3参照)。これらの疾患では、反復ブロックのサイズは一般に、疾患の重症度および発症の年齢と相互関連があり、その結果これらを示す。いくつかの疾患、例えば、ハンチントン病、脊髄小脳失調症I型、球脊髄性筋萎縮症、マシャドジョセフ病、および歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症は、反復ブロックのサイズのわずかな増加と相互関連している。A型脆弱X、E型脆弱X、および筋緊張性ジストロフィーなどの他の疾患は、通常のSTRの最高100倍の伸長を伴うことがある。
例えば、非特許文献4、非特許文献5、非特許文献6、非特許文献7など、ヒトゲノムに存在する高度に多型のクラスまたは反復のDNAの増幅および検出に基づく、ある種の診断アッセイおよび法医学的アッセイが提案されている。通常、反復配列を含むDNAのセグメントは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅され、次いで変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりサイズで分けられる。
この手法は、そのサイズおよびゲノム分布により診断上のおよびマッピングの応用で特に関心が高い、いわゆる「短鎖縦列反復配列」すなわち「STR」反復のDNAを標的としている。このクラスのDNAにおける反復ユニットの長さは通常2から6ヌクレオチドであり、PCR増幅および電気泳動分離に好都合な標的となっている。特許文献1は、1つまたは複数の染色体特異的STRを同時に増幅するための、増幅されたSTRを電気泳動でサイズにより分離するための、および存在する増幅されたSTRDNAのそれぞれの量を求めるための方法を開示しており、この方法を用いて選択された染色体の異数性を判定する。特許文献2は、非特許文献8を引用し、これらの反復のフランキング領域に対応するオリゴヌクレオチドを、DNAの小サンプル上のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)用のプライマーとして使用してもよいことを示唆している。放射能または蛍光などで標識したヌクレオチドを有するDNAを増幅することにより、サンプルを配列ゲル上で分離し、オートラジオグラフィーまたは蛍光検出などの周知の方法により可視化してもよい。これらの多型は、長さが数塩基ペアしか異ならないことがある対立遺伝子からなるので、これらは、一般に、伝統的なRFLP分析で用いられるような従来のサザンブロッティングにより検出されないことがあると指摘されている。特許文献3は、少なくとも3ヌクレオチドの増幅されたSTRを用いて、異数性を検出することができると述べている。増幅されたDNAを電気泳動でサイズにより分離し、スペクトルに分解できる蛍光標識の使用により相対的濃度を求める。
STRPのカテゴリーに入る遺伝性疾患はかなりの数が存在する。これらの中には、筋緊張性ジストロフィー−CTG反復、ハンチントン病および脊髄小脳失調症−CAG反復、および脆弱X−CGG反復が含まれる。脆弱X症候群は、浸透度が減少するX連鎖優性疾患であり、遺伝性精神遅滞の最も一般的な形態の1つである。この病状は、およそ1250人に1人の男性、およそ2000人に1人の女性が罹患する。認知の、行動の、および身体の表現型は性別により異なり、突然変異がX連鎖遺伝であるので、男性の方が重度に罹患する。
その名称が含意するように、脆弱Xは、X染色体に連鎖した病状である。脆弱Xの表現型はX染色体の末端近くの遺伝子座q27.3における肉眼で見える狭窄を特徴とし、組織培養では、ある条件下でX染色体の先端が折れる傾向がある。研究者らは、この病状に関連するゲノムの領域を同定し、脆弱X症候群に関連するDNA配列(FRAXA遺伝子)を特許文献4で述べている。障害を引き起こす突然変異は、Xq27.3に位置するFRAXAの5’の非翻訳領域でCGG反復の増幅をもたらす。脆弱X−CGG反復には、4つの形態:通常(6〜40反復)、中間(41〜60反復)、前変異(61〜200反復)、および全変異(>230反復)がある。最終的に脆弱Xの表現型をもたらす突然変異は一般的に、段階的に生じる。初期の段階では、遺伝子は完全に欠損しておらず、むしろ「前変異」が存在し、前変異の保有者は正常の表現型を有することがある。しかし、女性の保有者に突然変異が生じる可能性があり、その女性はその子孫に表現型を産することがある。CGG反復の数の増加の結果は、異常行動から精神遅滞までの範囲である。正常な範囲(6から40)を超えたCGG反復の数により、症候群の重症度が判定される。
長年、脆弱X症候群を診断する唯一の方法は、組織培養で細胞を増殖し処理を行った後、罹患している個体の染色体を顕微鏡で検査することによるものだった。このような検査では、検査室で、X染色体の先端が破れたことを確認するために検査していた。ゲノムのレベルでCGG反復配列を直接同定するためのPCRベースの方法を開発する初期の試みの中には、不成功もあった(例えば、非特許文献9を参照されたい)。
より最近の診断方法は、PCRおよびゲル電気泳動分離を用いて、分子量に基づいた同定を実現している。例えば、Bunnらの特許文献5は、競合的な方法による定量PCRの方法を開示しており、DNA増幅に影響を及ぼすパラメーター、およびテンプレートの(試験および対照両方の)比率およびコピー数の差を区別する機構を論じている。体細胞の突然変異を検出するのにこれを用いてもよいことが述べられている。Bunnらは、DNAプライマーおよびそれらのそれぞれのプライマーの結合部位の性質から大部分が生じる増幅プロセスに対する様々なパラメーターの影響を述べている。しかし、このシステムは、標的に十分に近いスタンダードを使用するように制限されており、標的とサンプルはPCRにより同じ比率で増幅される。さらに、スタンダードの長さは酵素の作用により後で変更されうるから、したがってスタンダードおよび標的が分離でき電気泳動により定量できるように、スタンダードは、標的とは異ならなければならない。
Caskeyの特許文献6は、正常および罹患していない個体におけるFMR−1遺伝子の発現を測定して比較する方法を記載しており、正常な個体における発現の変異と比べた罹患した個体における発現の変異は、脆弱X症候群に対する突然変異を示すものである。この方法は、しばしば不正確な診断をもたらすことがある、安定なゲノムDNAではなく、不安定なmRNAの定量を試みるものである。Dasの特許文献7は、脆弱X症候群を有する男性を同定するためにメチル化特異的PCRを用いている。しかし、この方法は、200反復を超える全変異を診断するのに、実際、制限されている。Sutherlandの特許文献8は、ヒト脆弱X遺伝子座を含む精製され単離されたDNA分子を記載しており、ゲノムDNAを特徴付けるのに用いられる増幅産物に相補的なプローブでハイブリダイズさせることにより、CGG反復のPCR増幅産物を検出することを教示している。しかし、これは、続く十分な診断を実現するのに必要な方法で反復の数を特異的に定量する方法を教示しておらず、適当なストリンジェンシーのもとで異常な配列にハイブリダイズするプローブを使用することを示唆しているにすぎない。特許文献9および特許文献10は、dGTPの類似体を使用したPCRを用いた後に最終的にゲル電気泳動を行う、脆弱X症候群を検出するための方法を開示している。
しかし、これらの方法は、CGG反復の数を求め、したがって正確な診断を提供するのに限られた能力しかない。これは、一般的に、PCRがCGG反復の領域を増幅するのが困難であるからであり、検出に著しい量を必要とする正確なゲル電気泳動分析を可能にするのに十分なPCR産物が産生されないことが多い。
したがって、STRPに起因する疾患および欠損のための、特に脆弱X症候群のための、簡単で信頼できる正確なアッセイを求めて探索が続いている。
FRAXA遺伝子の5’非翻訳領域におけるCGG反復など、ゲノムDNAに存在するSTRのコピー数を正確に推定することができる、高感度の比色検出を用いた方法が現在開発されている。STR、および内部対照として働く近接領域またはセグメントを含むDNA領域が選択され、したがってこれらはPCRを用いてゲノムDNAのサンプルから共増幅される。脆弱X症候群に対し、内部対照をコードするDNA領域がCGG反復領域の5’または3’のいずれかのX染色体上に位置するように選択され、CGG反復領域およびこの内部スタンダードセグメントが近接する限り、これらは常に共増幅される。サンプルをPCR増幅した後、1本鎖の産物を得るための適当な手段がとられる。次いで、標識されたCCG標的および標識された内部スタンダードの標的の両方が提供され、これらの標識された標的は1本鎖のPCR増幅産物とハイブリダイズする。洗浄して非ハイブリダイズの標的を除去した後、PCR産物とハイブリダイズした、残りの標識されたオリゴヌクレオチド標的が得られ、これらはCGGプローブおよび内部対照プローブを含むマイクロアレイと引き続きハイブリダイズさせることにより定量される。次いでこのような未知サンプルのCGG反復のコピー数を、CGG反復領域プローブにおけるシグナル強度の、内部対照プローブのシグナル強度に対する比を求め、この比を、既知の対照サンプルから前に生成された値と比較することにより正確に推定する。内部対照として用いるための妥当な染色体の近接セグメントを適切に選択し、それとSTR領域とを共増幅することにより、他のSTRPに対し同様の分析を行う。
特定の一態様では、本発明は、脆弱X症候群を示す突然変異を検出するための方法を提供し、この方法は、(a);試験するゲノムDNAを得るステップと、(b);PCRを用いて、FRAXA遺伝子の非翻訳部分の全てのCGG反復、および前記CGG反復に隣接する核酸の実質的な近接セグメントを含むゲノムDNAにおけるX染色体上の核酸を増幅するステップと、(c);ステップ(b)の増幅した核酸から1本鎖の産物を得るステップと、(d);(i)(CGG)反復、および(ii)前記近接核酸セグメント、を標的にする比色標識したオリゴヌクレオチドをステップ(c)の前記1本鎖の産物とハイブリダイズさせるステップと、(e);ステップ(c)の前記1本鎖の産物を固相に結合するステップと、(f);ステップ(d)の前記ハイブリダイズした産物を、標的材料の残部から分離するステップと、(g);ステップ(f)の分離した産物から標識標的材料を回収するステップと、(h);次いで、ステップ(g)の回収した標識標的材料を、それに相補的な適切なオリゴヌクレオチドプローブを含む複数のスポットを有するマイクロアレイにハイブリダイズさせるステップと、(i);マイクロアレイへのハイブリダイゼーションの後、マイクロアレイ上の特定のスポットに存在するハイブリダイズした標識標的材料の比色強度を測定してそれに対する個々の値を得るステップと、(j);ステップ(i)の結果を既知の対照サンプルからの結果と比較して、得られたゲノムDNAのFRAXA遺伝子におけるCGG反復の数を正確に定量するステップとを含む。
特定の別の態様では、本発明は脆弱X症候群を示す突然変異を検出するための方法を提供し、この方法は、(a);試験するゲノムDNAを得るステップと、(b);PCR、ならびにフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて、全てのCGG反復、および翻訳されたFRAXA遺伝子の近接部分を含むゲノムDNAにおけるX染色体上の核酸を増幅させるステップであって、前記フォワードプライマーがその5’末端にアンカー部分を有するステップと、(c);ステップ(b)の2本鎖の産物を精製するステップと、(d):エキソヌクレアーゼでそのアンチセンス鎖を消化することによりステップ(c)から1本鎖の産物を得るステップと、(e);ステップ(d)の産物を、(CGG)反復に対する、およびFRAXA遺伝子の近接部分に対する蛍光標識したアンチセンス標的とハイブリダイズさせるステップと、(f);ステップ(d)の前記ハイブリダイズした産物を、前記フォワードプライマーの5’末端の前記アンカー部分により固相と結合させることにより非ハイブリダイズの標的の残部から分離するステップと、(g);ステップ(g)の産物を、適切なプローブを含むマイクロアレイとハイブリダイズし、前記マイクロアレイへのハイブリダイゼーションの後、蛍光標識した存在する標的の材料の蛍光強度を測定して、その個々の値を得るステップと、(h);得られたDNAのFRAXA遺伝子におけるCGG反復の数を正確に定量するために、ステップ(g)の結果を以下の式:N=30+(A−1.03)66.4を用いて既知の対照サンプルからの結果と比較するステップであり、式中、Nは反復の数であり、Aは、近接セグメントに対するプローブとハイブリダイズした標的のFIに対するCGGプローブとハイブリダイズした標的のFIの比率である、既知の対照サンプルの結果と比較するステップとを含む。 さらなる特定の一態様では、本発明は、短鎖縦列反復配列多型(STRP)を検出するための方法を提供し、この方法は、(a);試験するゲノムDNAを得るステップと、(b);PCRを用いて、対象の全てのSTR、および前記STRに隣接する核酸の実質的な近接セグメントを含むゲノムDNAにおける染色体上の核酸を増幅するステップと、(c);ステップ(b)の増幅したDNAから1本鎖の産物を得るステップと、(d);(i)STRおよび(ii)前記近接核酸セグメントを標的とする比色標識したオリゴヌクレオチドを、ステップ(c)の前記1本鎖の産物とハイブリダイズさせるステップと、(e);ステップ(c)の前記1本鎖の産物を固相に結合させるステップと、(f);ステップ(d)の前記ハイブリダイズした産物を、標識標的材料の残部から分離するステップと、(g);ステップ(f)の産物から標識標的材料を回収するステップと、(h);次いで、回収されたステップ(g)の標識された標的材料を、それに相補的な適切なオリゴヌクレオチドプローブを含む複数のスポットを有するマイクロアレイにハイブリダイズさせるステップと、(i);マイクロアレイへのハイブリダイゼーションの後、マイクロアレイ上の特定のスポットに存在するハイブリダイズした標識された標的材料の比色強度を測定して、それに対する個々の値を得るステップと、(j);ステップ(i)の結果を既知の対照サンプルからの結果と比較して、得られたDNAの対象の領域におけるSTRの数を正確に定量するステップとを含む。
またさらなる特定の一態様では、本発明は、脆弱X症候群を示す突然変異を検出するためのキットを提供し、このキットは、(a);哺乳動物のゲノムDNAを増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)でフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして機能する1対のDNAオリゴヌクレオチドであって、フォワードプライマーは、FRAXA遺伝子の非翻訳領域の5’であるそれらの位置上で、X染色体のアンチセンス鎖の3’ヌクレオチド配列に相補的であり、リバースプライマーがFRAXA遺伝子またはそれらの3’内の位置に相補的であり、前記フォワードプライマーは、その5’末端に共有結合したアンカー部分を有し、前記リバースプライマーは、その5’末端にリン酸塩を有し、前記プライマーオリゴヌクレオチドの対は、全てのCGG反復、および内部対照として働く実質的な近接セグメントを含むゲノムDNAの領域を増幅するのに特異的である、1対のDNAオリゴヌクレオチドと、(b);前記CGG反復領域および前記内部対照セグメントを別々に標的とする標識されたオリゴヌクレオチドと、(c);(i)PCR、(ii)アンチセンス鎖の消化、(iii)DNA−DNAハイブリダイゼーションおよび洗浄、(iv)ハイブリダイズされた標識されたオリゴヌクレオチド標的の解離、および(v)比色定量を行うためのバッファーおよび酵素、(d);スポットが、それぞれ前記標識されたオリゴヌクレオチド標的の1つに相補的なDNAプローブに付着している、複数のスポットを有する少なくとも1つのマイクロアレイと、(e);前記マイクロアレイの比色スキャニングの結果、および対照サンプルからの前に生成されたデータを用いてCGG反復の数の診断を行うための手段とを含む。
またさらなる特定の一態様では、本発明は、STRPを示す突然変異を検出するためのキットを提供し、このキットは、(a);哺乳動物のゲノムDNAを増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)でフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして機能する1対のDNAオリゴヌクレオチドであって、前記プライマーのオリゴヌクレオチドの対は、全てのSTR、および内部対照として働く実質的な近接セグメントを含むゲノムDNAの選択された領域を増幅するのに特異的であり、フォワードプライマーは染色体の選択された領域のアンチセンス鎖の3’ヌクレオチド配列に相補的であり、リバースプライマーは選択された領域のセンス鎖の3’末端に相補的であり、前記フォワードプライマーは、その5’末端に共有結合しているアンカー部分を有し、前記リバースプライマーの5’末端の伸長が阻止されている、1対のDNAオリゴヌクレオチドと、(b);前記STR領域および前記内部対照セグメントを別々に標的とする標識されたオリゴヌクレオチドと、(c);(i)PCR、(ii)アンチセンス鎖の消化、(iii)DNA−DNAハイブリダイゼーションおよび洗浄、(iv)ハイブリダイズされた標識されたオリゴヌクレオチド標的の解離、および(v)比色定量を行うためのバッファーおよび酵素と、(d);スポットが、それぞれ前記標識されたオリゴヌクレオチド標的の1つに相補的なDNAプローブにそこで付着している、複数のスポットを有する少なくとも1つのマイクロアレイと、(e);前記マイクロアレイの比色スキャニングの結果、および対照サンプルからの前に生成されたデータを用いてSTRの数の診断を行うための手段とを含む。
以下に述べる詳細な説明をよりよく理解するために、以下の用語および略称語の定義を定める。
ハイブリダイゼーションは、溶液中または固相のいずれかで行われるDNAの相補鎖間での2重構造の形成を示すのに用いられ、2本鎖のうち1本が固体表面またはマトリックス上に固定されている。
アニーリングは、本明細書では、ゆっくり低下する温度または単一の温度の、プローブまたはプライマーが分析物の核酸内のその相補配列と結合できるようにしたハイブリダイゼーション条件下で、1本鎖のまたは熱変性した2本鎖の核酸の分析物を、オリゴヌクレオチドのプローブまたはプライマーとインキュベートすることを意味するのに用いられる。
分析物または分析物の核酸は、分析の対象であるDNAサンプルにおける化合物を表すために用いられる。
標識または検出可能の標識(または「タグ」)は、ある核酸配列に付着することができ、その検出および/または定量を可能にする置換基を意味する。例として、32P、33P、および35Sなどの放射標識;蛍光、化学発光または着色化合物などの比色指示薬;ビオチンなどのリガンド;ならびに質量または他の分光器の性質により識別可能な化学基が含まれる。適切な標識のより詳しい例には、キサンチン色素、ローダミン色素、ナフチルアミン、ベンズオキサジアゾール、スチルベン、ピレン、アクリジン、シアニン3、およびシアニン5が含まれる。標識は、化学反応、酵素反応(ポリメラーゼ、キナーゼ、もしくはリガーゼを含む)による標識されたヌクレオチドの組込み、または分析物の核酸と標識されたプローブのハイブリダイゼーションまたはアニーリングを含む様々な手段により、分析物の核酸中に導入してよい。
プローブは、ハイブリダイゼーション反応により分析物の核酸によって決定された、その相補配列に結合するための試薬として用いられる核酸配列を意味する。
配列は、特定の順序および鎖長で相互に結合している、DNAにおけるA、G、C、T残基を含む核酸中の一連の塩基を意味する。
相補的、または相補配列は、2本鎖(2重)の構造を形成することができる2つの配列を意味する。
標識されたプローブは、本明細書では、核酸分析物中のその相補配列に結合することができ、その検出および/または定量を可能にする、1つまたは複数の検出可能な標識またはタグを有するオリゴヌクレオチドを意味するのに用いられる。
キャプチャープローブは、本明細書では、一端が固体表面に結合しており(すなわち、係留しており)、ハイブリダイゼーション反応において相補配列を含む核酸またはオリゴヌクレオチドの、固体表面上への捕獲を可能にする特定の配列のオリゴヌクレオチドを意味するのに用いられる。
標的、標的とする配列、標的とする鎖、または標的とする核酸は、本明細書では、例えば、特定のDNAプローブとのハイブリダイゼーションにより、その存在が検出の対象となる核酸配列を意味するのに用いられる。「標的とする配列」は、広義には、DNAプローブにより結合している核酸分子またはフラグメントを意味するのに用いられることがあり、あるいは、限定的な意味では、相補的な塩基対によりDNAプローブに結合している標的とする核酸に由来する特定のヌクレオチド配列を意味するのに用いられる。
係留されている、または表面が係留されているは、本明細書では、表面上の官能基とDNAプローブの一端の官能基との間に形成されている共有結合または他の方法の強力な結合により、一端である表面に結合しているオリゴヌクレオチドDNAプローブを意味するのに用いられる。
固相ハイブリダイゼーションは、2重構造の形成に関与する2本の「反応を受ける鎖」のうちの1本が固体の支持体上に固体されているところで行われるハイブリダイゼーション反応を意味する。
ボーダー配列またはフランキング配列は、選択されたDNA配列および染色体の末端に近く、隣接し、かつ/またはそれを含む核酸セグメントを意味するのに用いられる。
オリゴヌクレオチドは、通常約100ヌクレオチドまでの長さの、化学合成することができる短いDNA鎖を意味する。
遺伝子は、タンパク質、遺伝子内に散在するイントロン(非コード)配列、および遺伝子の調節で機能するさらなる配列をコードする配列を含む、遺伝機能の単位を意味する。
ゲノムは、遺伝子、遺伝子間配列、および生物体または自律複製物質を含む他の遺伝子エレメントの相補体全体を意味する。マイクロアレイまたはDNAチップは、表面上に形成されている表面が係留されているDNAプローブの2次元のアレイを意味し、通常、小型化したフォーマットで、1ミリメートル未満の中心から中心の間隙に配列されている個々のDNAプローブとの多くのハイブリダイゼーション反応の同時分析を可能にしている。
プライマーは、遊離の3’−OH終末を有するオリゴヌクレオチドを意味し、「テンプレート鎖」と塩基対を成し、したがってポリメラーゼ酵素により伸長することができる。例えば、DNAテンプレートとアニールしたオリゴヌクレオチドプライマーは、DNAポリメラーゼの基質として(デオキシヌクレオシド5’−三リン酸と共に)働くことができ、PCR反応におけるように「プライマーの伸長」をもたらす。プライマー対は、核酸セグメントの反対側の鎖に結合する2個のプライマーを意味する。
PCRフラグメントは、ポリメラーゼ連鎖反応によって形成された、規定された長さ(テンプレート上の開始部分の間の間隙によって規定される)のDNAのフラグメントを意味する。
変性、または変性しているは、2重らせんを不安定にする条件下で、最も一般的には高温の条件下での(「熱変性」)、2重の核酸分子の2本鎖の分離(解離)を意味する。反復、または反復配列は、短鎖反復配列の配列、特に、CGGCGGCGGを意味する。
5’末端/終末は、そのデオキシリボース上の非エステル化炭素−5を有するヌクレオチドを含む核酸の鎖の末端を意味する。
3’末端/終末は、そのデオキシリボース上の非エステル化炭素−3を有するヌクレオチドを含む核酸の鎖の末端を意味する。
CCD−電荷結合素子
CI−比色強度
FI−蛍光強度
PCR−ポリメラーゼ連鎖反応
SSC−標準クエン酸食塩水、塩化ナトリウム150mMおよびクエン酸ナトリウム150mMを含む溶液
STR−短鎖縦列反復配列
STRP−短鎖縦列反復配列多型
CI−比色強度
FI−蛍光強度
PCR−ポリメラーゼ連鎖反応
SSC−標準クエン酸食塩水、塩化ナトリウム150mMおよびクエン酸ナトリウム150mMを含む溶液
STR−短鎖縦列反復配列
STRP−短鎖縦列反復配列多型
出願者の診断方法は、PCRを利用して、全ゲノムDNAに比べて少ない量で存在する特定のDNA配列を最初に増幅する。PCRを用いることにより、特定のDNA配列を10万倍以上に増幅して、出発のDNAに存在する場合にはその検出を容易にすることができる。
その開示が本明細書に参照として組み入れられる特許文献11、特許文献12、特許文献3、および特許文献14は、本発明が利用している、現在よく知られているPCRプロセスの詳細を提供するものである。PCRは、対象の特別な領域に隣接する配列に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用することにより、数時間でDNA配列を数オーダー増幅して、反対方向および重複方向にプライマーが誘導するDNA合成をもたらす。高温のテンプレート変性、オリゴヌクレオチドプライマーの再アニーリング、およびポリメラーゼが介在する伸長の反復サイクルを用いることにより、DNA配列を数10万倍正確に増幅することができる。一般的に、PCRは、1つはセンス鎖を生成するためのフォワードプライマー、1つはアンチセンス鎖を生成するためのリバースプライマーという、各テンプレートに対する2つの異なるプライマーをデザインできるように、増幅されるテンプレートの5’末端および3’末端両方の配列を知る必要がある。
本発明におけるPCRプロセスは、望ましいDNA合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを含む、単一の対のプライマーを用いることが好ましい。オリゴヌクレオチドプライマーは、それぞれ核酸テンプレートにハイブリダイズする際に望ましいテンプレートの3’末端に対して陥没しており、したがって核酸ポリマーの重合の合成の開始部位として働く、遊離の3’OH基を有しており、その配列は(a)デオキシリボヌクレオチド基質、(b)DNA複製を行うことができる適切な酵素、ならびに(c)適切な温度、および望ましいpHを提供するバッファーの存在下でテンプレート鎖に相補的である。プライマーは、便宜上、合成で製造されることが好ましい。PCRは、選択された核酸テンプレートに結合する2つのプライマーを使用するが、2つのプライマーのそれぞれは増幅する2重のセグメントの2つの3’末端のうちの1つまたはボーダーに相補的である。これらは、通常、フォワードプライマーおよびリバースプライマーと呼ばれる。これらのプライマーは、プライマーの伸長を引き起こす条件下で他のPCR試薬と、すなわち、4つの異なるヌクレオシド三リン酸(またはその類似物質)、適切なポリメラーゼ、および適切なバッファー(「バッファー」は、pHおよびイオン強度を求める物質、補助因子などを含む)と適切な温度で結合する。ポリメラーゼがTaqポリメラーゼであるPCR法では、バッファーは、マグネシウム塩、好ましくはMgCl2を1.5〜2mM、各ヌクレオシド三リン酸を15〜200μM、各プライマーを1μM、ならびに、例えばKCl 50mM、pH8.4のTrisバッファー10mM、およびゼラチン100μg/mlを含んでもよい。PCR増幅を行うためのこのようなキットは、多くの業者から市販されている。
各プライマーは、適切なポリメラーゼ、および上記に記載したものなどの他の試薬の存在下で、伸長DNA産物の合成を始め、または開始するのに十分長くなければならない。適切なプライマーの長さは、よく知られているように多くの要因に依存し、通常、出願者の方法で実行するには15〜30ヌクレオチド残基を含むプライマーが用いられる。プライマー分子が短いと、鎖の伸長反応を支持するプライマー−テンプレート複合体を形成し維持するために、一般に、より低い反応温度が必要とされる。
用いたプライマーは、増幅すべき選択された配列を含む核酸に実質的に相補的である必要があり、すなわち、プライマーは選択された配列(またはその相補体)を含む核酸と結合し、すなわちハイブリダイズしなければならない。プライマー配列は、テンプレートの完全に正確な相補体である必要はない。例えば、非相補的なヌクレオチドフラグメントまたは他の部分は、プライマーの5’末端に付着していてもよく、プライマー配列の残部が選択された核酸配列に相補的である。選択された核酸配列に完全に相補的であるプライマーが好ましく、通常用いられる。
一般的に、配列の両末端の十分な数の塩基が十分詳しく知られている限り、任意の特定の核酸配列をPCRプロセスにより増幅することができ、その結果、核酸配列上の望ましい相対的な位置に位置する望ましい配列の様々な鎖にハイブリダイズする2つのオリゴヌクレオチドプライマーを調製することができる。その結果、1つのプライマーから合成された伸長産物が、そのテンプレート(相補体)から分離された後、次のサイクルで他のプライマーが規定された長さの核酸に伸長するためのテンプレートとして働く。
STRPを診断するための本発明の好ましい一実施形態では、1対のプライマーが用いられる。一方のプライマー、すなわちフォワードプライマーは、選択されたDNA領域のアンチセンスの3’末端に近く、隣接し、かつ/またはそれを含む配列に相補的である。他方のプライマー、すなわちリバースプライマーは、選択されたDNA領域の3’末端の配列の相補体に近く、隣接し、かつ/またはそれを含む配列の相補体を含む。
アッセイが方向付けられるSTRPに応じて、増幅すべき、関連する染色体上の核酸の長さに関する決定を最初に行う。ヒトゲノムのシークエンシングが完結した結果、これらのSTRPの部位は現在知られており、したがって、その部位が表れる遺伝子座に注意が向けられている。次いで、全てのSTRセグメント、および内部対照として働くSTRセグメントの3’または5’のいずれかの近接セグメントを全て含むフランキング配列を選択する上で判断がなされる。脆弱X症候群では、STR領域の3’にある近接配列をこのようにして選ぶことが好ましいが、代替のその5’領域も使用してもよい。増幅すべき核酸セグメントの長さを選択した後、STR領域全て、および内部対照として用いる選択された近接セグメントの共増幅を行う適切なオリゴヌクレオチドプライマー対をデザインする。プライマーは、その領域が、選択された核酸セグメントの特定の末端に近く、隣接し、かつ/またはそれを含む核酸のそれぞれの鎖の3’領域に相補的であるようにデザインされる。
一般的に、プライマーは、約15ヌクレオチドと約30ヌクレオチドの間の長さであり、好ましくは約18ヌクレオチドと約27ヌクレオチドの間の長さである。プライマーは、生じるであろう望ましい位置のハイブリダイゼーションを最大にするように、ゲノムにおける独特のDNA配列にハイブリダイズするように選択されることが好ましい。
STR領域はアッセイが目指す長さにおける変異であるので、増幅される問題の染色体上の核酸の長さは、もちろんSTR領域の長さによって決まる。一般的に、通常のヒトの染色体では約350ヌクレオチドと2000ヌクレオチドの間の核酸の長さが選択され、より好ましくは約500ヌクレオチドと1000ヌクレオチドの間の核酸の長さが選択される。
アッセイを速やかに進めるために、必要な道具を全て含むキットが提供される。例えば、脆弱X症候群を示す突然変異を検出するためのキットは、哺乳動物のゲノムDNAを増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)でフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして機能する1対のDNAオリゴヌクレオチドを含まなければならず、フォワードプライマーは、CGG反復が位置するFRAXA遺伝子の非翻訳領域の5’上の位置でX染色体のアンチセンス鎖の3’ヌクレオチド配列に相補的であり、リバースプライマーはFRAXA遺伝子内の、すなわち反復領域の3’内の位置に相補的である。フォワードプライマーは、その5’末端に共有結合しているアンカー部分を有さなければならず、この場合リバースプライマーは、その5’末端にリン酸塩を有する。この配列は、所望により逆転してもよい。このような対のオリゴヌクレオチドは、したがって、CGG反復全て、および内部対照として働く実質的に近接セグメントを含むゲノムDNAの領域を増幅するのに特異的である。CGG反復領域および内部対照領域を別々に標的にする標識されたオリゴヌクレオチドが、(i)PCR、(ii)アンチセンス鎖の消化、(iii)DNA−DNAハイブリダイゼーションおよび洗浄、(iv)ハイブリダイズされた標識されたオリゴヌクレオチド標的の解離、および(v)比色定量を行うためのバッファーおよび酵素と共に提供される。このキットは、複数のスポットを有するマイクロアレイを含み、これらのスポットはそれぞれ、標識されたオリゴヌクレオチド標的の1つに相補的なDNAプローブに付着している。マイクロアレイの、例えば比色の、スキャニングの結果を用いて、CGG反復の数の診断を行うための手段をさらに含むが、その診断は、前に対照サンプルから生成されたデータに基づく。
好ましく用いられる対のプライマーのフォワードプライマーには、各プライマーの5’末端に共有結合しているアンカー部分がある。リバースプライマーは、5’末端のリン酸塩で誘導体化されている。以下に説明するアッセイにおける分離のステップでは、このアンカー部分を利用する。一般的に、オリゴヌクレオチドを固体の表面または固相に結合する働きをするあらゆるアンカー部分を用いることができる。
当技術分野ではよく知られているが、様々な固相材料を用いることができる。例えば、Amersham Biosciences、BioRad、およびSigmaから市販されているもののような一般的に使用されている任意の広範な材料から、固体支持材料を選択することができる。これは、粒子、プレート、マトリックス、繊維などの形態であることができ、シリカ、セルロース、アガロースビーズ、多孔質ガラス、ポリマービーズ、ゲルビーズ、または磁気ビーズでできていてもよい。磁気ビーズが好ましいが、これは磁気ビーズのようなものを使用すると、磁場を直接適用することにより上清からの引き続いての分離を促進するからである。これは、フローチャンバーを用いて、または単純なピペット操作により行うことができる。このような磁気ビーズ、例えば、Dynalビーズとして販売されているもの、またはAdvanced Magneticsより販売されているものなどを使用して、生物学的サンプルおよびPCR材料の残部、ならびに反応生成物から、洗浄により増幅したDNAを分離することができる。この同じ性質をやはり用いて、アッセイ手順のより後の段階で、減結合した標的材料を分離するのに利用する。ビーズ形態の粒子は、能力および取扱いのために好まれるが、他の形をした粒子または基質を代わりに使用してもよい。このような市販の磁気ビーズは、一般的に、望ましい磁気特性を提供するために磁鉄鉱の層でコーティングされ、次いで外部コーティングでコーティングされている無孔性の小球である。これらの目的で市販されている磁気ビーズは、様々な方法で製造され、金属酸化物などの常磁性の金属を、ポリマーまたはケイ酸塩などの適切なコーティング材料と共にカプセル化して、直径約1μm〜100μmの被覆されたビーズを製造することが多い。
相補的であり互いに結合するアンカー部分およびカップリング剤は、このような固体の支持体に増幅されたDNAを付着させるための連結法として用いられる。多くの種類の結合対が、当技術分野ではよく知られており、適切に使用することができる。アンカー部分は、固相に、より一般的には、固相により運搬される相補的なカップリング剤に直接つながることができる。好ましい結合システムは、アビジンまたはストレプトアビジン、およびビオチンを使用するものである。例えば、ストレプトアビジンは、固体の支持体、例えば磁気ビーズの外部表面に共有結合し、次に、ビオチン化したDNAに強力に結合する。対象の応用に適するこのような磁気ビーズは、数々の業者から市販されている。ビーズ表面に結合しているストレプトアビジンを有するビーズは、直径約1ミクロンの公称寸法を有し、カリフォルニアのActive Motif of Carlsbadにより販売されている。他の結合対、例えば、抗体−抗原などを、このような中間連結法として代わりに用いてもよい。このような誘導体化したビーズを、上記の品目(iii)で述べたように洗浄を促進するためのバッファーと共に、キットの任意の部分として供給してもよい。
分類されたキットの部分の一部として供給される他の品目は、市販され、あらゆるPCRキットの部分として一般的に含まれる、よく知られた品目である。これらは、現在よく知られているPCRプロセスの詳細を提供する4つの米国参考文献の群に、詳しく記載されている。
キットの重要な品目は、CGG反復領域、および内部対照として選択された領域を別々に標的にするようにデザインされた、標識されたオリゴヌクレオチドのセットである。用いられる標識は、指示色素、放射性核種、抗体、酵素などを含めた、核酸を標識するために市販されている広範な材料から選択された、一般的に用いられている品目のあらゆるものであることができる。標識が比色指示薬であるのが好ましく、最終のアッセイを単純化するための蛍光色素であるのがより好ましいが、アルカリ性のリン酸塩、過酸化水素水、β−ガラクトシダーゼ(ベータ−ガラクトシダーゼ)、ならびにジゴキシンおよびジゴキシゲニンなどのハプテン、ならびに化学発光成分などの品目も用いてもよい。当技術分野でよく知られているように標識が標的のハイブリダイゼーションを妨害しないように短いリンカーを用いてもよいが、一般に標識は標的に直接連結している。好ましい比色指示薬は、Cy−3蛍光色素である。
2つの分離し標識されたオリゴヌクレオチド標的のうち、1つの標的はSTR切片にハイブリダイズするようにデザインされている。これらのオリゴヌクレオチドは、約3個および7個のトリプレットを含み、好ましくは約4個と約6個の間のトリプレットを含み、すなわち、約12ヌクレオチドと約18ヌクレオチドの間の長さであるべきである。内部対照用の標識された標的材料は、一般的に21ヌクレオチドと54ヌクレオチドの間の長さであり、好ましくは、約30ヌクレオチドと約45ヌクレオチドの間の長さである。これは、選択された近接核酸セグメント、例えば翻訳されたFRAXA遺伝子のセグメントのセンス鎖に相補的であるように選択されているにすぎない。標識されたSTR標的の量は、内部対照の標的の量の少なくとも約5倍であることが好ましく、少なくとも約10倍の量であることがより好ましく、少なくとも約20倍であることが最も好ましい。
キットには、選択されたDNAプローブをそれに付着させる複数のマイクロスポットを有するマイクロアレイも含まれ、プローブは標識された標的の1つに相補的である。標的に対するプローブが平面の基質に、またはマイクロタイタープレートのウェルで直接結合する2次元のアッセイのものを含めた、標識されたDNA標的に対する開発された無数のアレイの任意のものを用いることができるが、特許文献15に記載され、および「3次元フォーマットのバイオチップ(Three Dimensional Format Biotips)」のタイトルで特許文献16で公表されたものなどの、3次元のバイオチップを提供することが好ましい。このような3次元のアレイでは、プローブはプレートにおけるウェルの固体表面、またはスライドガラスもしくは他のプレートに連結していないが、その代わりに、重合したヒドロゲルのマイクロスポットに付着することにより3次元のアレイに提示される。このように配置することによりプローブが固体の基質から分離され、この配置は、プローブを提示し、標識された標的の分子を最終的に捕獲するために、拡張された表面領域を提示する。アッセイで使用する異なる標的のそれぞれに対して、このような複数の3−Dのマイクロスポットを各スライドガラス上、またはマイクロウェルプレートの各ウェル中に提供することが好ましい。
アンカー部分がフォワードプライマーに共有結合し、次いでフォワードプライマーがセンス鎖に組み込まれる好ましい実施形態では、プローブは最初に選択された核酸のセンス鎖の切片にすぎず、これらは、マイクロアレイプレートに、または好ましい配置においてはマイクロアレイプレートに接着しているヒドロゲルスポットに、共役しまたは結合するように誘導体化されている。あらゆる適切なリンカーを用いることができ、好ましくは、当技術分野で一般的に知られているようにC−6アミノリンカーを使用する。STR切片のプローブは、複数のCGGトリプレット、好ましくは約6個と約20個の間のトリプレット、より好ましくは約8個と約15個の間のトリプレットを含まなければならず、プローブには標的材料に存在する少なくとも約2倍のトリプレットが存在することが好ましい。内部対照の標的材料に対するオリゴヌクレオチドプローブは同様に、単に適切な長さの選択された近接領域由来の核酸のセンス鎖のセグメントである。これは、標的材料と少なくとも同じ長さであることが好ましく、本明細書で内部対照標的材料に示したものとおよそ同じ長さであることが好ましい。
上記で述べたように、キットはハイブリダイゼーション反応を促進するのに適当な化学物質を含む。ハイブリダイゼーション溶液をスライドガラスまたはウェルでインキュベートした後、非結合の標識標的材料を除去するために洗浄を行う。得られたスライドを、蛍光色素を用いた場合は蛍光検出器を用いるなどにより、あらゆる適切な方法で観察することができる。他の適切な検出器を、もちろん、標的に付着するために選択した特殊な標識の性質に応じて代わりに使用する。次いで、キットに備えられている適当な演算式または他の手段を用いて、マイクロアレイの比色スキャニングの結果を解明する。これらは対照サンプルから前に生成されたデータを発展させ、それをもとにしているものである。
STRPの存在を検出するためのアッセイ手順の例として、少量の未知のゲノムDNAを最初に得る。例えば、約10ngで十分であるとみなされる。この未知のサンプルを、50マイクロリットルの容積を有する反応チャンバーでPCRにかける。STR切片を含む選択された核酸セグメントに対するフォワードプライマーおよびリバースプライマーを約1μMずつ、および選択された核酸の近接セグメントを、適当なデオキシリボヌクレオシド基質、適当な酵素、およびバッファーを含む市販のPCRシステムの成分と共に加える。一般的に、約5サイクルと約40サイクルの間の温度サイクルのPCR複製プロセスを行って、望ましい量の増幅された選択された核酸配列を生成する。PCR増幅が完了したら、標準の手段を用いて2本鎖の産物を精製して、未反応のプライマーおよびヌクレオチド基質などを除去する。このような精製キットは市販されており、次いで適当量のDI水で溶出を行う。
次いで、精製したDNAのアンチセンス鎖を、ラムダエキソヌクレアーゼ(NEB)などの適切なヌクレアーゼで消化する。このような消化の後に、最初に選択した核酸のセンス鎖のヌクレオチド配列を有するビオチン化した1本鎖のDNAが残る。次いで、これを、STR切片および内部対照セグメントの両方に対して標識標的材料と混合する。STR切片に対する標識した標的のオリゴヌクレオチドを約200nM、および内部対照切片を約10nM、ならびに適切な市販のバッファー系を使用する。混合物を約95℃の変性温度に約10分間さらし、次いで適当な時間、例えば、ハイブリダイゼーションを促進するために連続振とうなどを用いて約2から5時間、約35℃から40℃の温度でインキュベートする。
インキュベートの後、増幅したDNA鎖のビオチンアンカー部分により、ハイブリダイズしたサンプル材料をストレプトアビジンビーズまたは他の適切な固体基質に固定化する。室温で約15分間、適切なバッファー中で振とうするなどしてインキュベートすることにより固定化を行う。ビーズとビオチン化DNAの間の付着が完了する時間を提供した後、ビーズを洗浄して、特異的にハイブリダイズされなかった標識された標的を含む他の成分を全て除去する。一般的に、場合により厳密さを増して、複数回の洗浄を使用する。
これらの洗浄の後、0.1M NaOHまたは匹敵する塩基で処理し室温で約5分間インキュベートすることにより、標識した標的を、固体の支持体に結合している鎖から溶出する。溶出後、液体の上清を磁気引力により固定化されているビーズから分離し、それを回収し、中性化する。次いで、標識された標的を含む液体の溶液を、適切なマイクロアレイに直接かける。
マイクロアレイへのハイブリダイゼーションは、適当な温度、例えば40℃から50℃で、通常少なくとも約12時間の間、適切なバッファーを含む溶液中で行う。ハイブリダイゼーションの後、適切なバッファーを含む溶液を用いてマイクロアレイを複数回洗浄し、次いで比色分析にかける。好ましいように標識が蛍光である場合には、増幅された核酸にハイブリダイズする異なる標的材料に特異的であるプローブから発せられる蛍光シグナルの強度が記録される。以下に詳しく説明するように、これらの値を増幅されたPCR産物で共増幅されたことが見出された内部対照の量と比べることにより、特定のSTRセグメントの相対的な長さの定量的な指標が提供される。
アッセイの最初の部分におけるいくつかのステップは、所望の通り様々な配列で行うことができる。例えば、ビオチン化した、増幅した2本鎖DNAは、アンチセンス鎖が消化される前にストレプトアビジンを担持する磁気ビーズと最初に結合してもよく、または代わりに、標識された標的を混合物に加える前にそのように連結してもよい。しかし、アッセイを行う好ましい方法は上記に示した通りであるが、2本鎖の産物を最初に処理してアンチセンス鎖を消化してから、標識した標的すなわち蛍光標識を担時するDNAオリゴヌクレオチドを加え、次いで、1本鎖のDNA標的が、増幅されたDNAの相補配列にハイブリダイズしてからストレプトアビジンを担持する磁気ビーズなどに付着させるような、ハイブリダイゼーションを行える条件下に混合物を維持する。ビーズを洗浄した後、水酸化ナトリウム溶液などのアルカリで室温で処理して蛍光標識した合成の標的を遊離させてもよい。次いで、増幅したDNAサンプルとハイブリダイズしたが、そのようなアルカリ処理の結果現在は遊離されている2つの標的に対する適切なアッセイで、得られた水溶液を直接用いることができるが、最初に中性化することが好ましい。
本発明の明細書を、今度は、脆弱X症候群と呼ばれるSTRPの検出に焦点を当てるようにデザインされた分析の実施例の観点から記載する。脆弱X症候群に関して分析される未知のサンプルからの結果を解釈する手段を提供するために、上記に記載した方法を最初に用いて、それぞれ30個のCGG反復および117個のCGG反復を有することがわかっている2つの対照サンプルを試験する。用いた標識は蛍光であり、したがってマイクロアレイ上のそれぞれの各プローブで測定される比色強度は蛍光強度(FI)である。以下の結果が得られた。
1. 30反復を有することがわかっている対照サンプルでは、
CGGプローブのFI=17,598
内部対照プローブのFI=17,008
(CGGのFI)/(内部対照のFI)=1.03
2. 117反復を有することがわかっている対照サンプルでは、
CGGプローブのFI=11,005
内部対照プローブのFI=4,708
(CGGのFI)/(内部対照のFI)=2.34
CGGプローブのFI=17,598
内部対照プローブのFI=17,008
(CGGのFI)/(内部対照のFI)=1.03
2. 117反復を有することがわかっている対照サンプルでは、
CGGプローブのFI=11,005
内部対照プローブのFI=4,708
(CGGのFI)/(内部対照のFI)=2.34
これらの対照サンプルから得られた結果は比例しており、これらの結果から引き出された等式を用いてあらゆる未知サンプルにおける反復数を求めるのに用いることができる手段が提供される。より詳しくは、このような2つの対照サンプルからの結果を用いて、このような未知のサンプルにおける反復数を計算するために未知のサンプルから後で得られる、FIまたは他の比較できる比色の値をその時使用できるようにする演算式を作り出すことができることが見出されている。
脆弱X(FRAXA)遺伝子などの特定の遺伝子におけるSTRに対する試験データに基づき、以下の演算式が開発され、次いでこれから単純化された等式が、この特定のSTRPに対して引き出される:
N=K+(A−B)×Q/(C−B)
N=未知サンプルにおけるSTRの計算された数
K=反復数が少ない対照サンプルにおけるSTRの数
CI=比色強度
A=未知サンプルの、STRプローブのCIを内部対照プローブのCIで割った比
B=K反復を有する対照サンプルに対するCIの比
Q=反復数の多い対照サンプルと、反復数の少ない対照サンプルとの間の反復数の差
C=反復数の多い対照サンプルの、STRプローブのCIを内部対照プローブのCIで割った比
N=K+(A−B)×Q/(C−B)
N=未知サンプルにおけるSTRの計算された数
K=反復数が少ない対照サンプルにおけるSTRの数
CI=比色強度
A=未知サンプルの、STRプローブのCIを内部対照プローブのCIで割った比
B=K反復を有する対照サンプルに対するCIの比
Q=反復数の多い対照サンプルと、反復数の少ない対照サンプルとの間の反復数の差
C=反復数の多い対照サンプルの、STRプローブのCIを内部対照プローブのCIで割った比
次いで、この演算式を用いて、疑わしい脆弱X症候群の分析に対する特定の等式を引き出す。30反復および117反復を有する2つの対照サンプルを試験した結果、K、B、C、およびQの値が現在わかっている。したがって、演算式を脆弱Xに対する以下の等式に単純化することができる:
N=30+(A−1.03)66.4
N=30+(A−1.03)66.4
この分析の妥当性を試験するために、次に、未知サンプルで実施する。このような未知のアッセイの詳細を、以下の実施例でこれ以降に述べる。しかし、これらは例示的なものであり、本発明を限定するものではないとみなすべきであり、本発明の範囲はここに添付する特許請求の範囲で規定される。
ゲノムDNAを10ng、およびFRAXA遺伝子配列の遺伝子座におけるX染色体の選択された核酸セグメントに対する各プライマーを1μM含む、全容積50μlでPCRを行った。選択されたセグメントはCGG反復切片全体、およびそれに近接する3’内部対照セグメントを含む。RocheからのGCリッチのPCRシステムを用いる。用いるFRAXAのフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、ヌクレオチド塩基配列配列番号1および2(表を参照)を有するオリゴヌクレオチドである。フォワードプライマーの長さは21ヌクレオチドであり、リバースプライマーは長さ27ヌクレオチドである。これらは、「正常の」X−染色体において少なくとも長さ254ヌクレオチドの全ての遺伝子セグメントに及ぶ。フォワードPCRプライマーは、5’ビオチン化し、リバースプライマーは5’リン酸化した。使用したPCR温度サイクル条件は、95℃で2分間、その後95℃で1.5分間、56℃で1分間、72℃で2分間を25サイクルであった。最終の伸長を72℃で7分間行った。
増幅したDNAをQIAquick PCR精製キット(Qiagen)で精製し、次いで、DI水50μlで溶出した。精製したDNAのアンチセンス鎖を、次いで、ラムダエキソヌクレアーゼ(NEB)で消化した。
残りの、ビオチン化した1本鎖DNAを、2つの異なる5’−Cy3−で標識した標的のオリゴヌクレオチド:(CCG)nを含むBiocept#3584(配列番号3)、および選択された3’FRAXA内部対照に相補的なBiocept#3595(配列番号4)にハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは、1×B&Wバッファー(5mM Tris−HCl、pH8、0.5mM EDTA、1M NaCl)中で行った。サンプルを95℃で10分間変性させ、その後、振とう機中37℃で3時間インキュベートした。
ハイブリダイズした標的材料を、次いで、1×B&Wバッファー中、室温で15分間、振とう機上でインキュベートすることにより、ビオチン化したセンス鎖とカップリングさせてストレプトアビジンビーズ(Active Motif)に固定化した。DNA/ビーズ複合体を、1×B&Wで3回洗浄し、次いで、0.1M NaOHを加え室温で5分間インキュベートすることにより、結合した1本鎖DNAから標識した標的のオリゴヌクレオチドを分離した。放出された、標識された標的のオリゴヌクレオチドを含む上清を回収し、中性化した。
次いで、標識された標的のオリゴヌクレオチドを、2つのプローブ:Biocept#3594(配列番号5)およびBiocept#3686(配列番号6)を含むHydro Arrayマイクロアレイにハイブリダイズさせた。これらのプローブは、それぞれ、FRAXA内部対照、およびCGG反復に対する標識された標的に相補的であった(表を参照)。マイクロアレイでのハイブリダイゼーションは、3×SSCおよび0.1%TriotnX−100を含む溶液中、45℃で約14時間行った。アレイを、2×SSCおよび0.1%TritonX−100を含む溶液中、37℃で各15分間3回洗浄した。比色標識はここでは蛍光標識であり、したがって蛍光画像がレーザースキャナーで得られた(ScanArray(登録商標)Lite、Perkin Elmer)。
FRAXAプローブ(#3594)における比色強度、ここでは蛍光強度(FI)は、共増幅された内部対照として働き、PCRの効果の指標も提供する。プローブ#3586および#3594における蛍光強度を比較して、所望の比が得られた。FIの比、すなわちSTRプローブのFIを内部対照プローブのFIで割った比は、1.78であることがわかった。前述の導き出された等式に1.78を代入すると、STRの数の以下の計算がもたらされる:
反復数=30+(1.78−1.03)66.4=80
したがって、未知サンプルにおけるCGG反復数の結果は80という計算値になる。
反復数=30+(1.78−1.03)66.4=80
したがって、未知サンプルにおけるCGG反復数の結果は80という計算値になる。
試験を実証するために、PCRおよび配列分析を用いて、冗長にCGG反復の数を直接求め、結果は約80から85であることが見出された。試験手順は、したがって、完全に正確であると思われる。
現時点で本発明者に知られている、本発明を実施するための最良の形態を構成するいくつかの好ましい実施形態に関して本発明を記載したが、ここに添付する特許請求の範囲で述べる本発明の範囲から逸脱することなしに、様々な変更および修正を行ってもよいことを理解されたい。
Claims (21)
- (a)試験するゲノムDNAを得るステップと、
(b)PCRを用いて、FRAXA遺伝子の非翻訳部分の全てのCGG反復、および前記CGG反復に隣接する、核酸の実質的な近接セグメントを含むゲノムDNAにおけるX染色体上の核酸を増幅するステップと、
(c)ステップ(b)の増幅した核酸から1本鎖の産物を得るステップと、
(d)(i)(CGG)反復、および(ii)前記近接核酸セグメントを標的にする比色標識したオリゴヌクレオチドを、ステップ(c)の前記1本鎖の産物とハイブリダイズさせるステップと、
(e)ステップ(c)の前記1本鎖産物を固相に結合するステップと、
(f)ステップ(d)の前記ハイブリダイズした産物を、標的材料の残部から分離するステップと、
(g)標識標的材料を、ステップ(f)の分離した産物から回収するステップと、
(h)次いで、ステップ(g)の回収した標識標的材料を、それに相補的な適切なオリゴヌクレオチドプローブを含む複数のスポットを有するマイクロアレイにハイブリダイズさせるステップと、
(i)マイクロアレイへのハイブリダイゼーションの後、マイクロアレイ上の特定のスポットに存在するハイブリダイズした標識標的材料の比色強度を測定してそれに対する個々の値を得るステップと、
(j)ステップ(i)の結果を既知の対照サンプルからの結果と比較して、得られたゲノムDNAのFRAXA遺伝子におけるCGG反復の数を正確に定量するステップと
を含むことを特徴とする、脆弱X症候群を示す突然変異を検出するための方法。 - CGG反復の数が、以下の式:
N=30+(A−1.03)66.4
を用いて求められる、請求項1に記載の方法であって、
式中、Nは反復の数であり、Aは、近接する核セグメントに対するプローブにハイブリダイズした標的のCIに対するCGGプローブとハイブリダイズした標的のCIの比であることを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 増幅された前記核酸は、X染色体上のCGG反復切片、および少なくともFRAXA遺伝子の3’の翻訳されたセグメントの実質的な部分を含むことを特徴とする、請求項1または2のいずれかに記載の方法。
- 前記の、CGG反復に対してハイブリダイズする標的は3個と7個の間のトリプレットを含み、CGG反復プローブは6個と20個の間のトリプレット、および前記反復ターゲットの少なくとも2倍のトリプレットを含むことを特徴とする、請求項1、2、および3のいずれか一項に記載の方法。
- 標識された標的は、その5’末端に蛍光色素を有することを特徴とする、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(b)は、DNA領域の3’ボーダーに相補的なフォワードプライマーおよびリバースプライマーの対を使用し、DNAの3’ボーダーがCGG反復切片全体を含み、核酸の前記近接セグメントが少なくとも30ヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記近接セグメントはCGG反復切片の3’であり、FRAXA遺伝子の翻訳セグメントの少なくとも実質的な部分を含むことを特徴とする、請求項6に記載の方法。
- DNA領域のアンチセンス鎖の3’ボーダーに相補的である、ステップ(b)で用いられるフォワードプライマーは、その5’末端にアンカー部分を有することを特徴とする、請求項6に記載の方法。
- リバースプライマーの5’末端にリン酸塩があり、ステップ(c)で得られた前記1本鎖の産物はエキソヌクレアーゼで2本鎖のPCR産物のアンチセンス鎖を消化することによって得られることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
- アンカー部分はビオチンであり、ステップ(e)および(f)はステップ(d)の後に行われ、かつ前記ハイブリダイズした産物を、固相に付着しているアビジンに結合させ洗浄することにより分離することを特徴とする、請求項9に記載の方法。
- ステップ(d)でハイブリダイズした前記標識標的材料は、前記鎖を変性させるためにステップ(d)の前記ハイブリダイズした産物を処理し、上清を回収することによりステップ(g)で回収されることを特徴とする、請求項10に記載の方法。
- ステップ(b)の後で、エキソヌクレアーゼで処理して1本鎖の標的材料を得る前に、非結合のプライマーを除去するために増幅された核酸の産物を精製することを特徴とする、請求項9に記載の方法。
- 前記フォワードプライマーは配列番号1を含み、前記リバースプライマーは配列番号2を含むことを特徴とする、請求項6から12のいずれか一項に記載の方法。
- (a)試験するゲノムDNAを得るステップと、
(b)PCR、ならびにフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて、全てのCGG反復、および翻訳されたFRAXA遺伝子の近接部分を含むゲノムDNAにおけるX染色体上の核酸を増幅し、前記フォワードプライマーがその5’末端にアンカー部分を有するステップと、
(c)ステップ(b)の2本鎖の産物を精製するステップと、
(d)エキソヌクレアーゼでそのアンチセンス鎖を消化することによりステップ(c)から1本鎖の産物を得るステップと、
(e)ステップ(d)の産物を、(CGG)反復に対する、およびFRAXA遺伝子の近接部分に対する蛍光標識したアンチセンス標的とハイブリダイズさせるステップと、
(f)ステップ(d)の前記ハイブリダイズした産物を、前記フォワードプライマーの5’末端の前記アンカー部分により固相と結合させることにより非ハイブリダイズの標的の残部から分離するステップと、
(g)ステップ(g)の産物を、適切なプローブを含むマイクロアレイとハイブリダイズし、前記マイクロアレイへのハイブリダイゼーションの後、存在する蛍光標識標的材料の蛍光強度を測定してその個々の値を得るステップと、
(h)得られたDNAのFRAXA遺伝子におけるCGG反復の数を正確に定量するために、ステップ(g)の結果を以下の式:
N=30+(A−1.03)66.4
を用いて既知の対照サンプルからの結果と比較するステップであり、式中、Nは反復の数であり、Aは、近接セグメントに対するプローブにハイブリダイズした標的のFIに対するCGGプローブとハイブリダイズした標的のFIの比である、既知の対照サンプルの結果と比較するステップと
を含むことを特徴とする、脆弱X症候群を示す突然変異を検出するための方法。 - (a)試験するゲノムDNAを得るステップと、
(b)PCRを用いて、対象の全てのSTR、および前記STRに隣接する、核酸の実質的な近接セグメントを含むゲノムDNAにおける染色体上の核酸を増幅するステップと、
(c)ステップ(b)の増幅したDNAからの1本鎖の産物を得るステップと、
(d)(i)STR、および(ii)前記近接核酸セグメントを標的とする、比色標識したオリゴヌクレオチドを、ステップ(c)の前記1本鎖の産物とハイブリダイズさせるステップと、
(e)ステップ(c)の前記1本鎖の産物を固相に結合させるステップと、
(f)ステップ(d)の前記ハイブリダイズした産物を、標識標的材料の残部から分離するステップと、
(g)ステップ(f)の産物から標識標的材料を回収するステップと、
(h)次いで、回収されたステップ(g)の標識された標的材料を、それに相補的な適切なオリゴヌクレオチドプローブを含む複数のスポットを有するマイクロアレイにハイブリダイズさせるステップと、
(i)マイクロアレイへのハイブリダイゼーションの後、マイクロアレイの特定のスポットに存在するハイブリダイズした標識標的材料の比色強度を測定してそれに対する個々の値を得るステップと、
(j)ステップ(i)の結果を既知の対照サンプルからの結果と比較して、得られたDNAの対象の領域におけるSTRの数を正確に定量するステップと
を含むことを特徴とする、短鎖縦列反復配列多型(STRP)を検出するための方法。 - 前記の、STRに対してハイブリダイズする標的は3個と7個の間の反復を含み、STRプローブは6個と20個の間の反復、および前記STR標的の少なくとも2倍の反復を含むことを特徴とする、請求項15に記載の方法。
- ステップ(b)は、DNA領域の3’ボーダーに相補的な1対のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを使用し、DNA領域がSTR切片全体を含み、核酸の前記近接セグメントは少なくとも30ヌクレオチドを含み、ステップ(b)で使用するフォワードプライマーはDNA領域のアンチセンス鎖の3’ボーダーに相補的であり、その5’末端にアンカー部分を有し、リバースプライマーの5’末端はリン酸塩であり、前記標識標的材料はその5’末端に蛍光色素を有し、1本鎖の産物は2本鎖のPCR産物のアンチセンス鎖をエキソヌクレアーゼで消化することによりステップ(c)で得られることを特徴とする、請求項15または16のいずれかに記載の方法。
- (a)哺乳動物のゲノムDNAを増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)でフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして機能する1対のDNAオリゴヌクレオチドであって、フォワードプライマーはFRAXA遺伝子の非翻訳領域の5’の位置で、X染色体のアンチセンス鎖の3’ヌクレオチド配列に相補的であり、リバースプライマーはFRAXA遺伝子またはその3’内の位置に相補的であり、
前記フォワードプライマーは、その5’末端に共有結合したアンカー部分を有し、
前記リバースプライマーは、その5’末端にリン酸塩を有し、
前記プライマーのオリゴヌクレオチドの対は、全てのCGG反復、および内部対照として働く実質的な近接セグメントを含むゲノムDNAの領域を増幅するのに特異的である、
1対のDNAオリゴヌクレオチドと、
(b)前記CGG反復領域および前記内部対照セグメントを別々に標的とする標識されたオリゴヌクレオチドと、
(c)(i)PCR、(ii)アンチセンス鎖の消化、(iii)DNA−DNAハイブリダイゼーションおよび洗浄、(iv)ハイブリダイズされた標識されたオリゴヌクレオチド標的の解離、および(v)比色定量、を行うためのバッファーおよび酵素と、
(d)スポットが、それぞれ前記標識されたオリゴヌクレオチド標的の1つに相補的なDNAプローブに付着している、複数のスポットを有する少なくとも1つのマイクロアレイと、
(e)前記マイクロアレイの比色スキャニングの結果、および対照サンプルから前に生成されたデータを用いてCGG反復の数の診断を行うための手段と
を含むことを特徴とする、脆弱X症候群を示す突然変異を検出するためのキット。 - 前記ハイブリダイズする標的は3個と7個の間のCCG反復を含み、CGGプローブは6個と20個の間の反復、および前記相補的な標的の少なくとも2倍の反復を含み、前記フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、CGG反復切片全体、およびその3’であり少なくとも30ヌクレオチドを含む核酸の前記近接セグメントを含むDNA領域の3’ボーダーに相補的であり、フォワードプライマーはアンチセンス鎖の3’ボーダーに相補的でありその5’末端にビオチンを有し、リバースプライマーはその5’末端にリン酸塩を有し、前記標識した標的のオリゴヌクレオチドはその5’末端に蛍光色素を有し、内部対照領域の標的の少なくとも約10倍の量のSTR領域の標的の量が提供され、2本鎖のPCR産物のアンチセンス鎖を消化して1本鎖のPCR産物を得るためにエキソヌクレアーゼを提供することを特徴とする、請求項18に記載のキット。
- (a)哺乳動物のゲノムDNAを増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)でフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして機能する1対のDNAオリゴヌクレオチドであって、前記プライマーオリゴヌクレオチドの対は、全てのSTR、および内部対照として働く実質的な近接セグメントを含むゲノムDNAの選択された領域を増幅するのに特異的であり、フォワードプライマーは染色体の選択された領域のアンチセンス鎖の3’ヌクレオチド配列に相補的であり、リバースプライマーは選択された領域のセンス鎖の3’末端に相補的であり、
前記フォワードプライマーは、その5’末端に共有結合しているアンカー部分を有し、前記リバースプライマーは、その5’末端の伸長が阻止されている、1対のDNAオリゴヌクレオチドと、
(b)前記STR領域および前記内部対照セグメントを別々に標的とする標識されたオリゴヌクレオチドと、
(c)(i)PCR、(ii)アンチセンス鎖の消化、(iii)DNA−DNAハイブリダイゼーションおよび洗浄、(iv)ハイブリダイズされた標識されたオリゴヌクレオチド標的の解離、および(v)比色定量を行うためのバッファーおよび酵素と、
(d)スポットが、それぞれ前記標識されたオリゴヌクレオチド標的の1つに相補的なDNAプローブにそこで付着している、複数のスポットを有する少なくとも1つのマイクロアレイと、
(e)前記マイクロアレイの比色スキャニングの結果、および対照サンプルから前に生成されたデータを用いてSTRの数の診断を行うための手段と
を含むことを特徴とする、STRPを示す突然変異を検出するためのキット。 - 前記アンカー部分に相補的なカップリング剤を有する固相材料を含むことを特徴とする、請求項20に記載のキット。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US10/791,209 US20050191636A1 (en) | 2004-03-01 | 2004-03-01 | Detection of STRP, such as fragile X syndrome |
PCT/US2005/007049 WO2005085476A1 (en) | 2004-03-01 | 2005-02-28 | Detection of strp, such as fragile x syndrome |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2007525998A true JP2007525998A (ja) | 2007-09-13 |
JP2007525998A5 JP2007525998A5 (ja) | 2008-04-03 |
Family
ID=34887577
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007502004A Withdrawn JP2007525998A (ja) | 2004-03-01 | 2005-02-28 | 脆弱x症候群などのstrpの検出 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20050191636A1 (ja) |
EP (1) | EP1723261A1 (ja) |
JP (1) | JP2007525998A (ja) |
KR (1) | KR20070011354A (ja) |
CN (1) | CN1926247A (ja) |
WO (1) | WO2005085476A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007535928A (ja) * | 2004-05-05 | 2007-12-13 | バイオセプト インコーポレイテッド | 染色体異常の検出 |
Families Citing this family (34)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6913697B2 (en) | 2001-02-14 | 2005-07-05 | Science & Technology Corporation @ Unm | Nanostructured separation and analysis devices for biological membranes |
CA2500392C (en) | 2002-09-27 | 2012-11-27 | The General Hospital Corporation | Microfluidic device for cell separation and uses thereof |
US20070196820A1 (en) | 2005-04-05 | 2007-08-23 | Ravi Kapur | Devices and methods for enrichment and alteration of cells and other particles |
US8921102B2 (en) | 2005-07-29 | 2014-12-30 | Gpb Scientific, Llc | Devices and methods for enrichment and alteration of circulating tumor cells and other particles |
EP1857548A1 (en) | 2006-05-19 | 2007-11-21 | Academisch Ziekenhuis Leiden | Means and method for inducing exon-skipping |
US20080050739A1 (en) | 2006-06-14 | 2008-02-28 | Roland Stoughton | Diagnosis of fetal abnormalities using polymorphisms including short tandem repeats |
US8137912B2 (en) | 2006-06-14 | 2012-03-20 | The General Hospital Corporation | Methods for the diagnosis of fetal abnormalities |
EP2589668A1 (en) | 2006-06-14 | 2013-05-08 | Verinata Health, Inc | Rare cell analysis using sample splitting and DNA tags |
US20080070792A1 (en) | 2006-06-14 | 2008-03-20 | Roland Stoughton | Use of highly parallel snp genotyping for fetal diagnosis |
US20100184833A1 (en) | 2006-08-11 | 2010-07-22 | Prosenta Technologies B.V. | Methods and means for treating dna repeat instability associated genetic disorders |
JP2010533170A (ja) | 2007-07-12 | 2010-10-21 | プロセンサ テクノロジーズ ビー.ブイ. | 化合物を種々の選択された臓器、組織又は腫瘍細胞に標的化するための分子 |
CA2942716C (en) | 2007-07-12 | 2019-07-09 | Biomarin Technologies B.V. | Molecules for targeting compounds to various selected organs or tissues |
WO2009045467A1 (en) * | 2007-10-02 | 2009-04-09 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Methods and compositions for identifying increased risk of developing fragile x-associated disorders |
AU2008317566B2 (en) | 2007-10-26 | 2014-05-01 | Academisch Ziekenhuis Leiden | Means and methods for counteracting muscle disorders |
USRE48468E1 (en) | 2007-10-26 | 2021-03-16 | Biomarin Technologies B.V. | Means and methods for counteracting muscle disorders |
US8008019B2 (en) * | 2007-11-28 | 2011-08-30 | Luminex Molecular Diagnostics | Use of dual-tags for the evaluation of genomic variable repeat regions |
CN101980726A (zh) | 2008-02-08 | 2011-02-23 | 普罗森那控股公司 | 治疗与dna重复不稳定性相关的遗传病症的方法和装置 |
EP2119783A1 (en) | 2008-05-14 | 2009-11-18 | Prosensa Technologies B.V. | Method for efficient exon (44) skipping in Duchenne Muscular Dystrophy and associated means |
US20090298709A1 (en) * | 2008-05-28 | 2009-12-03 | Affymetrix, Inc. | Assays for determining telomere length and repeated sequence copy number |
EP3751005A3 (en) | 2008-09-20 | 2021-02-24 | The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University | Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by sequencing |
ES2593836T3 (es) | 2009-04-24 | 2016-12-13 | Biomarin Technologies B.V. | Oligonucleótido que comprende una inosina para tratar la DMD |
AU2010271196B2 (en) * | 2009-07-10 | 2015-07-16 | Perkinelmer Health Sciences, Inc. | Detecting multinucleotide repeats |
US9382586B2 (en) | 2010-02-05 | 2016-07-05 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Method to detect repeat sequence motifs in nucleic acid |
GB201116131D0 (en) * | 2011-09-19 | 2011-11-02 | Epistem Ltd | Probe |
US20130183666A1 (en) * | 2012-01-18 | 2013-07-18 | Marc N. Feiglin | Partial genotyping by differential hybridization |
AU2013212758A1 (en) | 2012-01-27 | 2014-08-14 | Biomarin Technologies B.V. | RNA modulating oligonucleotides with improved characteristics for the treatment of Duchenne and Becker muscular dystrophy |
CN102703595B (zh) * | 2012-06-13 | 2014-02-12 | 东南大学 | 一种碱基选择性可控延伸的str序列高通量检测方法及其检测试剂 |
CN102952794B (zh) * | 2012-09-05 | 2015-02-25 | 张家港蓝苏生物工程有限公司 | 靶向基因dna分子探针的制备方法 |
CN104498600A (zh) * | 2014-12-10 | 2015-04-08 | 东南大学 | 一种基于磁珠与核酸水解分离发光标记物的核酸检测方法 |
CN104531851A (zh) * | 2014-12-10 | 2015-04-22 | 东南大学 | 一种基于磁珠与多糖水解分离发光标记物的核酸检测方法 |
CN108300776A (zh) * | 2017-01-13 | 2018-07-20 | 金赟懿 | 脆性x综合征快速筛查试剂盒 |
US10459666B2 (en) | 2017-03-03 | 2019-10-29 | Commvault Systems, Inc. | Using storage managers in respective data storage management systems for license distribution, compliance, and updates |
CA3087624A1 (en) * | 2018-01-05 | 2019-07-11 | Quotient Suisse Sa | Self-assembling diagnostic array platform |
GB201803019D0 (en) * | 2018-02-26 | 2018-04-11 | Univ Newcastle | Methods for detecting target polynucleotides |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2159279T3 (es) * | 1991-01-04 | 2001-10-01 | Univ Washington | Secuencias de dna relacionadas con el sindrome del cromosoma x fragil aislado. |
US6180337B1 (en) * | 1991-05-24 | 2001-01-30 | Baylor College Of Medicine | Diagnosis of the fragile X syndrome |
US6200747B1 (en) * | 1992-01-28 | 2001-03-13 | North Shore University Hospital Research Corp. | Method and kits for detection of fragile X specific, GC-rich DNA sequences |
WO1994003638A1 (en) * | 1992-07-30 | 1994-02-17 | Applied Biosystems, Inc. | Method of detecting aneuploidy by amplified short tandem repeats |
JP2807612B2 (ja) * | 1993-03-12 | 1998-10-08 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | 新規キシラナーゼ、その製造法、該キシラナーゼによるパルプ処理方法及びキシロオリゴ糖の製造法 |
US6120992A (en) * | 1993-11-04 | 2000-09-19 | Valigene Corporation | Use of immobilized mismatch binding protein for detection of mutations and polymorphisms, and allele identification in a diseased human |
US5753439A (en) * | 1995-05-19 | 1998-05-19 | Trustees Of Boston University | Nucleic acid detection methods |
US5888740A (en) * | 1997-09-19 | 1999-03-30 | Genaco Biomedical Products, Inc. | Detection of aneuploidy and gene deletion by PCR-based gene- dose co-amplification of chromosome specific sequences with synthetic sequences with synthetic internal controls |
US6143504A (en) * | 1998-10-27 | 2000-11-07 | Arch Development Corporation | Methods and compositions for the diagnosis of fragile X syndrome |
US6268147B1 (en) * | 1998-11-02 | 2001-07-31 | Kenneth Loren Beattie | Nucleic acid analysis using sequence-targeted tandem hybridization |
US6225061B1 (en) * | 1999-03-10 | 2001-05-01 | Sequenom, Inc. | Systems and methods for performing reactions in an unsealed environment |
US6638719B1 (en) * | 1999-07-14 | 2003-10-28 | Affymetrix, Inc. | Genotyping biallelic markers |
US20040265883A1 (en) * | 2003-06-27 | 2004-12-30 | Biocept, Inc. | mRNA expression analysis |
-
2004
- 2004-03-01 US US10/791,209 patent/US20050191636A1/en not_active Abandoned
-
2005
- 2005-02-28 WO PCT/US2005/007049 patent/WO2005085476A1/en active Application Filing
- 2005-02-28 EP EP05724566A patent/EP1723261A1/en not_active Withdrawn
- 2005-02-28 CN CNA2005800064661A patent/CN1926247A/zh active Pending
- 2005-02-28 JP JP2007502004A patent/JP2007525998A/ja not_active Withdrawn
- 2005-02-28 KR KR1020067020635A patent/KR20070011354A/ko not_active Application Discontinuation
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007535928A (ja) * | 2004-05-05 | 2007-12-13 | バイオセプト インコーポレイテッド | 染色体異常の検出 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1723261A1 (en) | 2006-11-22 |
US20050191636A1 (en) | 2005-09-01 |
CN1926247A (zh) | 2007-03-07 |
WO2005085476A1 (en) | 2005-09-15 |
KR20070011354A (ko) | 2007-01-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2007525998A (ja) | 脆弱x症候群などのstrpの検出 | |
US7468249B2 (en) | Detection of chromosomal disorders | |
AU2008217678B2 (en) | Method and test kit for determining the amounts of target sequences and nucleotide variations therein | |
EP0733126B1 (en) | Immobilized mismatch binding protein for detection or purification of mutations or polymorphisms | |
US20060199183A1 (en) | Probe biochips and methods for use thereof | |
EP1241266A1 (en) | Method of detecting nucleotide polymorphism | |
AU8162498A (en) | Methods for the detection of multiple single nucleotide polymorphisms in a single reaction | |
JP5663491B2 (ja) | 標的核酸の検出方法 | |
US20080003609A1 (en) | Method of detecting bladder urothelial carcinoma | |
US20100086918A1 (en) | Methods for High Sensitivity Detection of Genetic Polymorphisms | |
JP2008507955A (ja) | チトクロムp450−2c19をコードする遺伝子における突然変異を検出する方法 | |
US20040038258A1 (en) | Methods for detecting DNA polymorphisms | |
JP2024035109A (ja) | 核酸の正確な並行検出及び定量のための方法 | |
JP5017947B2 (ja) | 複数の塩基多型の同定方法 | |
KR101075392B1 (ko) | Fga 유전자로부터 유래된 단일염기다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 마이크로어레이 및 진단키트, 이를 이용한 검출 방법 | |
JP2010246400A (ja) | 多型の識別方法 | |
WO2008118843A2 (en) | Arrays, systems, and methods of using genetics predictors of polycystic diseases | |
JP2007295855A (ja) | 核酸修飾解析のためのサンプル核酸の製造方法と、当該サンプル核酸を用いた核酸修飾を検出する方法 | |
WO2002090564A1 (en) | Methods for gene expression profiling | |
KR20100084760A (ko) | PLCG1 및 RasGRP3 유전자로부터 유래된 단일염기다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는마이크로어레이 및 진단키트, 및 이를 이용한 분석방법 | |
JP2005027519A (ja) | ヒトチトクロームp4502a6遺伝子多型の簡易検出方法および検出用試薬 | |
JP2003135069A (ja) | 塩基多型の同定方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080214 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20080214 |
|
A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20081203 |