CN104498600A - 一种基于磁珠与核酸水解分离发光标记物的核酸检测方法 - Google Patents

一种基于磁珠与核酸水解分离发光标记物的核酸检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104498600A
CN104498600A CN201410755917.2A CN201410755917A CN104498600A CN 104498600 A CN104498600 A CN 104498600A CN 201410755917 A CN201410755917 A CN 201410755917A CN 104498600 A CN104498600 A CN 104498600A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
magnetic bead
luminous
luminous marker
detection method
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201410755917.2A
Other languages
English (en)
Inventor
何农跃
杨淏文
李智洋
苏恩本
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Southeast University
Original Assignee
Southeast University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Southeast University filed Critical Southeast University
Priority to CN201410755917.2A priority Critical patent/CN104498600A/zh
Publication of CN104498600A publication Critical patent/CN104498600A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6823—Release of bound markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于磁珠与核酸水解分离发光标记物的核酸检测方法，设计用于检测靶核酸片段的功能化探针；将功能化探针修饰于功能化磁珠表面；通过杂交，将靶核酸片段及其发光标记物捕获至磁珠表面；磁分离，清洗，即得到已获取发光标记物的磁珠；加入核酸水解试剂，通过核酸水解将发光标记物从磁珠表面分离下来，即得到不含磁珠的发光标记物溶液；对该溶液进行发光检测，即可获取靶核酸信息。本发明完全克服了磁珠对发光信号的遮蔽效应导致的发光信号损失，能够检测出最少0.1pM核酸片段，检测灵敏度高。

Description

一种基于磁珠与核酸水解分离发光标记物的核酸检测方法
技术领域
本发明涉及生化检测和分子诊断领域，尤其涉及一种基于磁珠与核酸水解分离发光标记物的核酸检测方法。本发明可应用于涉及超灵敏核酸分子检测的领域。
背景技术
近年来，由于恶性公共卫生事件频发，如1996年日本发生的大肠杆菌(E.coli)O157:H7食物中毒的暴发流行，引起数人死亡，超过万人感染，造成巨大的社会恐慌；2003年SARS病毒在我国的肆虐；2005年猪链球菌的危害；近来禽流感病毒及2009年全世界范围内流行的甲型H1N1流感病毒等，都对人们的健康和生命造成了严重的威胁。另外，致病微生物污染也是影响我国食品卫生和安全的最主要因素，微生物性食物中毒导致的中毒人数最多，在2003年和2004年全国报告的重大食物中毒事故中，微生物性重大食物中毒起数和人数均有增加，分别占当年总起数和总人数的26％、43.8％和34％、58.1％。食品在加工、运输、贮藏、销售等过程中极易受到致病微生物污染。有害致病微生物不仅影响人们的健康，危及人们的生命，而且引起全社会的恐慌，影响正常的社会运行。为了能快速准确地鉴定病原体，力求将病原体对人的危害降到最低，科学家们使用了很多种鉴定方法。传统的微生物特征信息检测方法有病原体的培养、生化分析、毒素测定、血清学(抗原或抗体)检测等，但这些检测方法不仅不适合快速侦检，而且难以检测和鉴定病原体中所含的多种信息，如致病基因、毒力基因、抗性基因等。虽然近年来也发展了PCR技术及核酸探针杂交技术，但不能对微生物特征信息进行快速检测、更不具备高通量筛查的能力。
恶性肿瘤是严重危害人类健康的疾病之一。世界卫生组织和国际抗癌联盟的相关资料显示，如果不能有效控制恶性肿瘤的发病率，预计癌症发病例在2020年将达到1600万，近1000万人死亡。我国每年新增癌症患者约160万人，其中因癌症死亡人数约130万人。导致癌症患者死亡主要是因为无法及早发现从而贻误治疗时机以及肿瘤治愈率低，而早期发现与有效治疗是预防和治疗癌症的关键手段。几十年来，研究者们发现，生物标志物可以用来进行肿瘤早期诊断，使得癌症的治愈率、生存率大大提高。近年来，随着微小RNA(microRNA,miRNA)的发现和进一步研究，使其有可能作为新的生物标志物。已证实，miRNA在外周血中的表达具有肿瘤相关性、组织特异性以及表达稳定性，外周血miRNA很可能是一种理想的肿瘤标志物，为癌症的早期诊断开辟了新途径。目前，外周血miRNA的检测手段主要有miRNA芯片技术与实时荧光定量PCR技术。但二维的芯片技术使得核酸杂交效率低下，使得其检测灵敏度相对偏低。而荧光定量PCR检测miRNA需要设计复杂的茎环探针，以及进行扩增反应，使得其检测成较高，亦无法实现自动化。
随着纳米技术的迅速发展，纳米材料逐渐被应用到生命科学领域，纳米磁珠(magnetic beads,MBs)因具有分离速度快、效率高、可重复使用、操作简单、易功能化、易实现自动化以及不影响分离物质的活性等特殊的物理化学性质和生物相容性，目前已应用于细胞分离、免疫测定、蛋白质和酶的固定以及核酸检测等方面。
近年来，发光标记类检测方法，如荧光标记、酶标化学发光等已广泛应用于生物分子检测来放大检测信号以提高检测灵敏度。操作安全，方法简便、快速，具有巨大的潜力，正成为生物分析研究与发展的最重要领域。因此，结合核酸探针杂交技术，通过标记能够产生发光信号的分子而获取靶核酸信息，可实现病靶核酸的快速检测与高通量筛查。
目前，已报道各种基于固相杂交与发光标记的核酸检测方法。其基本思路为：在固相载体表面修饰核酸探针，通过捕获标记有发光信号分子的待测特异核酸片段，再检测发光信号，经分析后，即可快速确认靶核酸的特性。
但随着研究深入发现，影响基于磁珠与发光标记核酸检测方法灵敏度的一个重要因素为：发光信号会由于磁珠的遮蔽作用而大大减弱——灵敏度降低最高可达90％。但现有技术仅有荧光检测法采用高温使双链核酸变性解链的方法分离荧光标记物，因为荧光标记物如荧光素(Cy3,Cy5)等可耐受高温。但化学发光检测法等的发光标记物无法通过高温的方式达到此目的，因为化学发光标记物等无法耐受高温，当高温时会失活而无法继续进行发光检测。因此，研制出一种通用的基于磁珠与分离发光标记物的核酸检测方法，能够极大地提高荧光、尤其是化学发光的检测灵敏度，这对于疾病分子诊断、食品微生物监测等具有重大意义。
发明内容
技术问题：本发明所要解决的主要技术问题是克服现有的基于磁珠与发光标记物的核酸检测方法存在的检测灵敏度受限问题，其原因是磁珠对光信号产生遮蔽效应，极大地减弱了发光信号强度。因此，提出一种基于磁珠与核酸水解分离发光标记物的核酸检测方法。
技术方案：本发明的一种基于磁珠与核酸水解分离发光标记物的核酸检测方法包括以下步骤：
1)设计用于检测靶核酸片段的功能化探针；
2)将功能化探针修饰于功能化磁珠表面；
3)通过杂交，将靶核酸片段及其发光标记物捕获至磁珠表面；
4)磁分离，清洗，即得到已获取发光标记物的磁珠；
5)加入核酸水解试剂，通过核酸水解将发光标记物从磁珠表面分离下来，即得到不含磁珠的发光标记物溶液；
6)对该溶液进行发光检测，即可获取靶核酸信息。
其中：
步骤1)所述靶核酸片段为非扩增或经扩增后的核酸片段。所述功能化探针为：能够与功能化磁珠以共价键、非共价键或物理吸附方式结合，并与靶核酸片段序列互补的寡核苷酸。
步骤2)所述功能化磁珠为：适合连接功能化探针，包括但不限于在磁珠表面以共价键、非共价键或物理吸附方式结合功能化探针。
步骤3)所述发光标记物为适用于分子检测的能够产生发光信号的分子，包括荧光标记物。
所述发光标记物为荧光素Cy3、Cy5，或发光标记物为碱性磷酸酶及其化学发光底物、辣根过氧化物酶及其化学发光底物。
所述发光标记物，其标记靶核酸的方式包括通过靶核酸扩增进行标记，以及通过报告探针与靶核酸片段杂交进行标记。
步骤5)所述核酸水解试剂为能够水解核酸的化学或生物试剂，包括核酸水解酶如DNA酶、RNA酶、核酸内切酶或核酸外切酶。
步骤6)所述发光检测为：基于分子标记的发光检测体系，包括荧光、化学发光或其他波长的光。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下特点：
将对应靶核酸片段的发光标记物从磁珠表面分离，进行发光检测，完全避免了磁珠遮蔽效应，提高了发光信号强度。因此，本发明技术极大地提高了检测灵敏度。
附图说明
以下结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
图1为一种基于磁珠与核酸水解分离发光标记物的核酸检测方法流程示意图。
图2为HBV核酸PCR扩增产物电泳图。
图3为HBV核酸的化学发光检测动力曲线。
具体实施方式
本发明公布了一种利用磁珠易于磁分离的特性结合杂交以及核酸水解分离发光标记物的策略，对不含磁珠的发光标记物溶液进行发光检测，获取靶核酸信息的方法。在本发明的一个较佳的实例中，以Fe3O4SiO2磁珠作为载体，在其表面修饰功能化探针，以生物素标记靶核酸片段，通过核酸杂交将带生物素标记的靶核酸片段捕获至磁珠表面，通过与亲和素标记酶孵育使磁珠获取对应靶核酸片段的酶分子，然后利用DNA酶水解核酸片段将对应靶核酸片段的酶分子从磁珠表面分离下来，最后进行化学发光检测，获取靶核酸信息。
其步骤如下：
1.在磁珠表面进行功能化修饰：(1)磁珠氨基化修饰：将1mL Fe3O4SiO2磁珠(30mg/mL)磁分离，加入6mL乙醇/水混合液并超声分散，然后取12μL氨丙基三乙氧基硅烷(aminopropyltriethoxysilane,APTES)加入上述混合液中，室温振荡搅拌7h。利用外加磁场将APTES修饰的磁性颗粒分离出来，用乙醇和二甲基甲酰胺(N,N-dimethyl formamide,DMF)分别清洗数次，以5mg/mL分散在DMF中，备用；(2)磁珠羧基化修饰：取1mL氨基化磁珠(5mg/mL)，逐滴加入等体积DMF溶解的丁二酸酐溶液(succinic anhydride,SA,1mM)，37℃摇床振荡12h。去离子水清洗数次，以10mg/mL分散在去离子水中。
2.设计用于检测靶核酸片段的特异性引物及功能化探针，探针以3’端氨基修饰。探针修饰磁珠：将羧基化磁珠(10mg/mL)用等体积2-N-吗啉代乙磺酸水合物溶液(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid hydrate,MES,25mM,pH 6)清洗数次，磁分离弃上清，加入MES溶液稀释的探针(2μM)到洗过的羧基化磁珠中，混匀后室温旋转孵育30min，立刻加入冷的用MES溶液溶解的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide,EDC,10mg/mL)至磁珠混合液中混匀，4℃下旋转孵育2h以上。磁分离弃上清，加入Tris溶液(50mM,含0.1％Tween-20,pH 7.4)溶液孵育15min中和未反应羧基，再用Tris溶液清洗数次，最后分散在磷酸盐缓冲溶液(PB,0.1M,pH 7.4)中，即得到连有特异探针的功能化磁珠。
3.对靶核酸片段进行PCR扩增：反应体系为10×Buffer 2μL、Mg2+1.2μL、dNTP Mix 1μL、上下游引物各1μL、DNA模板1μL、Taq酶0.5μL、加入去离子水补足体积至20μL；反应条件为95℃5min、95℃30s、60℃30s 72℃30s，35个循环。
4.核酸杂交：取30μL探针修饰磁珠(10mg/mL)于PCR管，磁分离弃上清，加入杂交液10μL、靶核酸片段PCR产物1μL，加去离子水补足体积至20μL；杂交反应条件为95℃5min、60℃10min；然后磁分离，对磁珠清洗数次，即得到已获取靶核酸片段的磁珠。
5.发光标记物标记靶核酸片段：(1)通过PCR扩增进行标记：在步骤3中所述dNTP Mix中加入biotin-11-dUTP，其他同步骤3，然后进行步骤4；(2)通过核酸杂交标记：设计与靶核酸片段序列互补的报告探针，该报告探针末端修饰有发光标记物；步骤4完成后，进行第二次核酸杂交：将步骤4的杂交产物磁分离，弃上清，加入杂交液10μL、报告探针溶液1μL，加入去离子水补足体积至20μL；杂交反应条件为95℃5min、60℃10min；然后磁分离，对磁珠清洗数次，即得到已获取发光标记的磁珠。
6.加入适量核酸水解试剂至已获取捕获靶核酸片段及其发光标记物的磁珠悬液中孵育10min，用移液器获取上清液，即得到不含磁珠的发光标记物溶液。
7.对发光标记溶液进行发光检测，获取靶核酸信息。
以下结合实例对本发明作进一步描述：
实施例1以乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV)DNA为对象进行检测
1.在磁珠表面进行功能化修饰：(1)磁珠氨基化修饰：将1mL Fe3O4SiO2磁珠(30mg/mL)磁分离，加入6mL乙醇/水混合液并超声分散，然后取12μL氨丙基三乙氧基硅烷(aminopropyltriethoxysilane,APTES)加入上述混合液中，室温振荡搅拌7h。利用外加磁场将APTES修饰的磁性颗粒分离出来，用乙醇和二甲基甲酰胺(N,N-dimethyl formamide,DMF)分别清洗数次，以5mg/mL分散在DMF中，备用；(2)磁珠羧基化修饰：取1mL氨基化磁珠(5mg/mL)，逐滴加入等体积DMF溶解的丁二酸酐溶液(succinic anhydride,SA,1mM)，37℃摇床振荡12h。去离子水清洗数次，以10mg/mL分散在去离子水中。
2.设计一对能够特异扩增HBV X基因序列的引物和与该序列互补配对的功能化探针，探针3’端以氨基修饰。引物序列如下：5’-CCTCTACCGTCCCCTTCTTCA-3’、5’-ACGTGCAGAGGTGAAGCGAAG-3’；探针序列如下：5‘-CACTTCGCTTCACCTCTGCACGTA-(T)15-NH2-3’。
3.探针修饰磁珠：将羧基化磁珠(10mg/mL)用等体积2-N-吗啉代乙磺酸水合物溶液(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid hydrate,MES,25mM,pH 6)清洗数次，磁分离弃上清，加入MES溶液稀释的探针(2μM)到洗过的羧基化磁珠中，混匀后室温旋转孵育30min，立刻加入冷的用MES溶液溶解的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide,EDC,10mg/mL)至磁珠混合液中混匀，4℃下旋转孵育2h以上。磁分离弃上清，加入Tris溶液(50mM,含0.1％Tween-20,pH 7.4)溶液孵育15min中和未反应羧基，再用Tris溶液清洗数次，最后分散在磷酸盐缓冲溶液(PB,0.1M,pH7.4)中，即得到连有特异探针的功能化磁珠。
4.对靶核酸片段进行PCR扩增：反应体系为10×Buffer 2μL、Mg2+1.2μL、dNTP Mix(dATP:dCTP:dGTP:dTTP:biotin-11-dUTP＝25:25:25:23:2)1μL、上下游引物各1μL、DNA模板1μL、Taq酶0.5μL、加去离子水补足体积至20μL；反应条件为95℃5min、95℃30s、60℃30s 72℃30s，35个循环。图2为HBV核酸PCR扩增产物电泳图，靶核酸片段条带单一，证明扩增成功。
5.核酸杂交：取30μL探针修饰磁珠(10mg/mL)于PCR管，磁分离，弃上清，加入杂交液10μL、PCR产物1μL，加去离子水补足体积至20μL；杂交反应条件为95℃5min、60℃20min；然后磁分离，对磁珠清洗数次，即得到已获取带发光标记的靶核酸片段的磁珠。
6.化学发光检测：磁珠液磁分离后吸去上清，加入封闭液混匀后室温放置30min，期间不断混匀。磁分离吸去上清，加入封闭液稀释碱性磷酸酶标记链霉亲和素(alkaline phosphatase labeled streptavidin,ALP-SA)，混匀后室温孵育30min。磁分离后清洗数次，然后加入DNA酶2μL孵育10min，用移液器转移上清液，将上清液与磁珠分开，然后在上清液与磁珠中分别加入0.25mM化学发光底物3-(2’-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3”-羟基)苯-1,2-二氧杂环丁烷磷酸(3-(2’-spiroadamantane)-4-methoxy-4-(3”-phosphoryloxy)phenyl-1,2-dioxetane,AMPPD)。充分混匀后测定化学发光强度值至其稳定，平行测定3次。以未加入DNA酶的发光检测结果作为对照。
化学发光检测结果如图3所示。测得的发光值说明去除磁珠遮蔽效应后，化学发光信号显著提升，相对于未超声对照组提高到7倍左右。能够检测出最少0.1pM核酸片段。重复三次实验，结果稳定。即加入DNA酶孵育的化学发光检测获取的HBV核酸信息灵敏度显著高于未加入DNA酶对照组的检测结果。
实施例2：以血清miR-21为对象进行检测
1.在磁珠表面进行功能化修饰：同实施例1中所述在磁珠表面进行功能化修饰的方法。
2.设计与miR-21序列互补配对的功能化捕获探针与报告探针，捕获探针3’端以氨基修饰，报告探针5’端以生物素修饰。探针序列如下：5’-CTGATAAGCTA-(T)15-NH2-3’、5’-Biotin-(T)15-TCAACATCAG-3’。
3.在磁珠表面修饰捕获探针：将羧基化磁珠(5mg/mL)用等体积2-N-吗啉代乙磺酸水合物溶液(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid hydrate,MES,25mM,pH 6)清洗数次，磁分离弃上清，加入MES溶液稀释的探针(1μM)到洗过的羧基化磁珠中，混匀后室温旋转孵育30min，立刻加入冷的用MES溶液溶解的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide,EDC,10mg/mL)至磁珠混合液中混匀，4℃下旋转孵育2h以上。磁分离弃上清，加入Tris溶液(50mM,含0.1％Tween-20,pH 7.4)溶液孵育15min中和未反应羧基，再用Tris溶液清洗数次，最后分散在磷酸盐缓冲溶液(PB,0.1M,pH 7.4)中，即得到连有捕获探针的功能化磁珠。
4.第一次核酸杂交：(1)取30μL捕获探针修饰磁珠(10mg/mL)于PCR管，磁分离，弃上清，加入杂交液10μL、PCR产物1μL，加去离子水补足体积至20μL；杂交反应条件为95℃5min、60℃20min；然后磁分离，对磁珠清洗数次，即得到已获取miR-21片段的磁珠。
5.第二次核酸杂交：磁分离，弃上清，加入杂交液10μL、报告探针溶液1μL，加入去离子水补足体积至20μL；杂交反应条件为95℃5min、60℃10min；然后磁分离，对磁珠清洗数次，即得到已获取带发光标记物的miR-21片段的磁珠。
6.化学发光检测：同实施例1所述化学发光检测的方法。
化学发光检测结果表明，miR-21检测的有益效果同实施例1，故不赘述。

Claims (9)

1.一种基于磁珠与核酸水解分离发光标记物的核酸检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
1)设计用于检测靶核酸片段的功能化探针；
2)将功能化探针修饰于功能化磁珠表面；
3)通过杂交，将靶核酸片段及其发光标记物捕获至磁珠表面；
4)磁分离，清洗，即得到已获取发光标记物的磁珠；
5)加入核酸水解试剂，通过核酸水解将发光标记物从磁珠表面分离下来，即得到不含磁珠的发光标记物溶液；
6)对该溶液进行发光检测，即可获取靶核酸信息。
2.根据权利要求1所述的一种基于磁珠与核酸水解分离发光标记物的核酸检测方法，其特征在于，步骤1)所述靶核酸片段为非扩增或经扩增后的核酸片段。
3.根据权利要求1所述的一种基于磁珠与核酸水解分离发光标记物的核酸检测方法，其特征在于，步骤1)所述功能化探针为：能够与功能化磁珠以共价键、非共价键或物理吸附方式结合，并与靶核酸片段序列互补的寡核苷酸。
4.根据权利要求1所述的一种基于磁珠与核酸水解分离发光标记物的核酸检测方法，其特征在于，步骤2)所述功能化磁珠为：适合连接功能化探针，包括但不限于在磁珠表面以共价键、非共价键或物理吸附方式结合功能化探针。
5.根据权利要求1所述的一种基于磁珠与核酸水解分离发光标记物的核酸检测方法，其特征在于，步骤3)所述发光标记物为适用于分子检测的能够产生发光信号的分子，包括荧光标记物。
6.根据权利要求1所述的一种基于磁珠与核酸水解分离发光标记物的核酸检测方法，其特征在于所述发光标记物为荧光素Cy3、Cy5，或发光标记物为碱性磷酸酶及其化学发光底物、辣根过氧化物酶及其化学发光底物。
7.根据权利要求1所述的一种基于磁珠与核酸水解分离发光标记物的核酸检测方法，其特征在于所述发光标记物，其标记靶核酸的方式包括通过靶核酸扩增进行标记，以及通过报告探针与靶核酸片段杂交进行标记。
8.根据权利要求1所述的一种基于磁珠与核酸水解分离发光标记物的核酸检测方法，其特征在于，其中步骤5)所述核酸水解试剂为能够水解核酸的化学或生物试剂，包括核酸水解酶如DNA酶、RNA酶、核酸内切酶或核酸外切酶。
9.根据权利要求1所述的一种基于磁珠与核酸水解分离发光标记物的核酸检测方法，其特征在于，步骤6)所述发光检测为：基于分子标记的发光检测体系，包括荧光、化学发光或其他波长的光。
CN201410755917.2A 2014-12-10 2014-12-10 一种基于磁珠与核酸水解分离发光标记物的核酸检测方法 Pending CN104498600A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410755917.2A CN104498600A (zh) 2014-12-10 2014-12-10 一种基于磁珠与核酸水解分离发光标记物的核酸检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410755917.2A CN104498600A (zh) 2014-12-10 2014-12-10 一种基于磁珠与核酸水解分离发光标记物的核酸检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104498600A true CN104498600A (zh) 2015-04-08

Family

ID=52940050

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410755917.2A Pending CN104498600A (zh) 2014-12-10 2014-12-10 一种基于磁珠与核酸水解分离发光标记物的核酸检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104498600A (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105039498A (zh) * 2015-06-12 2015-11-11 青岛科技大学 一种基于光二极管诱导化学发光测定Ago2蛋白的RNA核酸内切酶活性的方法
CN105132533A (zh) * 2015-07-24 2015-12-09 清华大学深圳研究生院 一种靶分子浓度的检测方法
CN107058584A (zh) * 2017-06-07 2017-08-18 浙江殷欣生物技术有限公司 一种核酸杂交化学发光检测方法
CN107515295A (zh) * 2017-10-17 2017-12-26 环境保护部华南环境科学研究所 一种检测环境中真菌毒素的方法
CN107974487A (zh) * 2017-11-23 2018-05-01 南京鼓楼医院 一种基于多糖修饰磁珠与分离化学发光中心的核酸增敏检测方法
CN108300657A (zh) * 2018-02-07 2018-07-20 北京量化健康科技有限公司 一种核酸磁珠芯片及其制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1091831A (zh) * 1992-12-09 1994-09-07 株式会社日立制作所 检测核酸的方法
CN1808101A (zh) * 2004-12-15 2006-07-26 中国科学院上海应用物理研究所 Dna的荧光检测方法及其试剂盒
CN1926247A (zh) * 2004-03-01 2007-03-07 生物概念股份有限公司 检测strp例如脆性x染色体综合征
CN102358910A (zh) * 2011-11-03 2012-02-22 东南大学 基于磁分离与引物延伸的化学发光检测拷贝数多态性的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1091831A (zh) * 1992-12-09 1994-09-07 株式会社日立制作所 检测核酸的方法
CN1926247A (zh) * 2004-03-01 2007-03-07 生物概念股份有限公司 检测strp例如脆性x染色体综合征
CN1808101A (zh) * 2004-12-15 2006-07-26 中国科学院上海应用物理研究所 Dna的荧光检测方法及其试剂盒
CN102358910A (zh) * 2011-11-03 2012-02-22 东南大学 基于磁分离与引物延伸的化学发光检测拷贝数多态性的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHIYANG LI ET AL: "Polymerase Chain Reaction Coupling with Magnetic Nanoparticles-Based Biotin-Avidin System for Amplification of Chemiluminescent Detection Signals of Nucleic Acid", 《JOURNAL OF NANOSCIENCE AND NANOTECHNOLOGY》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105039498A (zh) * 2015-06-12 2015-11-11 青岛科技大学 一种基于光二极管诱导化学发光测定Ago2蛋白的RNA核酸内切酶活性的方法
CN105039498B (zh) * 2015-06-12 2018-11-23 青岛科技大学 一种基于光二极管诱导化学发光测定Ago2蛋白的RNA核酸内切酶活性的方法
CN105132533A (zh) * 2015-07-24 2015-12-09 清华大学深圳研究生院 一种靶分子浓度的检测方法
WO2017016281A1 (zh) * 2015-07-24 2017-02-02 清华大学深圳研究生院 一种靶分子浓度的检测方法
CN107058584A (zh) * 2017-06-07 2017-08-18 浙江殷欣生物技术有限公司 一种核酸杂交化学发光检测方法
CN107515295A (zh) * 2017-10-17 2017-12-26 环境保护部华南环境科学研究所 一种检测环境中真菌毒素的方法
CN107974487A (zh) * 2017-11-23 2018-05-01 南京鼓楼医院 一种基于多糖修饰磁珠与分离化学发光中心的核酸增敏检测方法
CN108300657A (zh) * 2018-02-07 2018-07-20 北京量化健康科技有限公司 一种核酸磁珠芯片及其制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Jalandra et al. Strategies and perspectives to develop SARS-CoV-2 detection methods and diagnostics
Yin et al. CRISPR-Cas based virus detection: Recent advances and perspectives
CN104498600A (zh) 一种基于磁珠与核酸水解分离发光标记物的核酸检测方法
Zhao et al. Colorimetric biosensors for point-of-care virus detections
Zhou et al. CRISPR/Cas12a based fluorescence-enhanced lateral flow biosensor for detection of Staphylococcus aureus
Zhang et al. A strategy combining 3D-DNA Walker and CRISPR-Cas12a trans-cleavage activity applied to MXene based electrochemiluminescent sensor for SARS-CoV-2 RdRp gene detection
CN111778357B (zh) 基于CRISPR/Cas12a的呼吸道合胞病毒核酸快速检测试剂盒及其检测方法
Xie et al. Advancing sensing technology with CRISPR: From the detection of nucleic acids to a broad range of analytes–a review
CN102703601B (zh) 多功能磁性荧光微球及其制备方法和应用
JP2015506666A (ja) 核酸プローブ及びビーズサブセットを用いて呼吸器病原体を検出する組成物及び方法
Zhang et al. CRISPR/Cas Systems‐Inspired Nano/Biosensors for Detecting Infectious Viruses and Pathogenic Bacteria
Fernandes et al. Recent advances in point of care testing for COVID-19 detection
Ke et al. Enhanced chemiluminescence imaging sensor for ultrasensitive detection of nucleic acids based on HCR-CRISPR/Cas12a
KR20060073457A (ko) 핵산 프라이머 세트, 핵산 프로브 세트 및 그들을 이용한호흡기 질환 바이러스의 검출방법
Xu et al. Novel rolling circle amplification biosensors for food-borne microorganism detection
CN102358910A (zh) 基于磁分离与引物延伸的化学发光检测拷贝数多态性的方法
Moulick et al. Advanced nanotechnologies in avian influenza: current status and future trends–a review
CN104278079A (zh) 用核酸层析技术检测核酸的试纸条和方法
CN101215600B (zh) 核酸目的序列的检测探针及检测方法
CA3153071A1 (en) Systems, methods, and compositions for the rapid early-detection of host rna biomarkers of infection and early identification of covid-19 coronavirus infection in humans
Tang et al. Single-nucleotide polymorphism genotyping of exoS in pseudomonas aeruginosa using dual-color fluorescence hybridization and magnetic separation
Liu et al. CRISPR-Cas12a coupled with universal gold nanoparticle strand-displacement probe for rapid and sensitive visual SARS-CoV-2 detection
Su et al. Sensitive detection of hepatitis C virus using a catalytic hairpin assembly coupled with a lateral flow immunoassay test strip
CN104531851A (zh) 一种基于磁珠与多糖水解分离发光标记物的核酸检测方法
Zhou et al. Sensitive fluorescence biosensor for SARS-CoV-2 nucleocapsid protein detection in cold-chain food products based on DNA circuit and g-CNQDs@ Zn-MOF

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20150408

RJ01 Rejection of invention patent application after publication