CN108300657A - 一种核酸磁珠芯片及其制备方法 - Google Patents

一种核酸磁珠芯片及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因芯片技术领域，公开了一种核酸磁珠芯片，所述核酸磁珠芯片包括核酸磁珠和连在所述核酸磁珠上的核酸，所述核酸磁珠从内至外包括：磁性纳米Fe3O4颗粒核心、聚乙二醇层、正硅酸乙酯层、氨基层、氯基层、核酸层。本发明还公开了一种制备本发明的核酸磁珠芯片的方法以及利用所述核酸磁珠芯片进行检测的方法。

Description

一种核酸磁珠芯片及其制备方法
技术领域
本发明涉及基因芯片技术领域，特别涉及一种核酸磁珠芯片及其制备方法。
背景技术
生物磁珠是指具有细小粒径的超顺磁微球。磁珠具有超强的顺磁性，在磁场中能够迅速聚集，离开磁场后又能够有助于磁分离地均匀分散；磁珠具有合适的且差别较小的粒径，保证了足够强的磁响应性又不会沉降；磁珠具有丰富的表面活性基团，以便可以和生化物质偶联，并在外磁场的作用下实现与被待测样品的分离。
磁珠法DNA提取具有传统DNA提取方法无法比拟的优势，磁珠法纯化DNA主要是利用利息交换吸附材料吸附核酸，从而将核酸和蛋白质等其细胞中其他物质分离。核酸提取作为生物医学领域的基础，磁珠法DNA提取以其高效性、稳定性，对推动基因检测、个性化医疗的迅猛发展具有重要的意义。
磁珠法核酸纯化技术采用了纳米级磁珠微珠，这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团，能同核酸发生吸附反应。硅磁就是指磁珠微珠表面包裹一层硅材料来吸附核酸；离心磁珠是指磁珠微珠表面包裹了一层可发生离心交换的材料，从而达到吸附核酸目的。
由于目前市场上的生物磁珠并没有连接核酸探针且其表面基团也不能稳定连接核酸探针，限制了其使用价值。因此，本领域中需要一种技术，用于在磁珠上稳定连接核酸制成核酸磁珠并利用所述核酸磁珠制作芯片。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明人针对使用磁珠富集目标核酸的需求，提出了一种新的表面修饰磁珠并且能够稳定的将核酸探针通过化学共价键的方式稳定连接到磁珠表面，用于富集目标核酸序列，称为核酸磁珠芯片。
因此，在第一方面，本发明提供了一种核酸磁珠芯片，所述核酸磁珠芯片包括核酸磁珠和连在所述核酸磁珠上的核酸，所述核酸磁珠从内至外包括：磁性纳米Fe3O4颗粒核心、聚乙二醇层、正硅酸乙酯层、氨基层、氯基层。
在第二方面，本发明提供了一种本发明第一方面的核酸磁珠芯片的制备方法，所述方法包括步骤：
1)聚乙二醇修饰：将聚乙二醇修饰于磁性基底材料纳米Fe3O4颗粒表面，形成聚乙二醇包覆的磁性纳米Fe3O4颗粒；
2)正硅酸乙酯修饰：将正硅酸乙酯修饰于所述聚乙二醇包覆的磁性纳米Fe3O4颗粒表面，得到正硅酸乙酯包覆的磁性纳米Fe3O4颗粒；
3)氨基修饰：将APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)修饰于正硅酸乙酯包覆的磁性纳米Fe3O4颗粒表面，得到氨基修饰的磁性纳米Fe3O4颗粒；
4)氯基修饰：通过SN2亲核取代反应将三聚氰氯修饰于氨基修饰的磁性纳米Fe3O4颗粒表面，得到氯基修饰的活性功能化磁珠；
5)连接探针：将核酸探针与上述纳米磁珠在60℃-70℃，优选65℃，条件下进行反应，制备成核酸磁珠芯片。
在一个实施方案中，所述方法在步骤1)前还包括步骤p1)纳米Fe3O4的制备：利用化学共沉淀法制备磁性基底材料纳米Fe3O4颗粒。
在一个具体实施方案中，在步骤p1)中磁性基底材料纳米Fe3O4的制备如下：在氮气保护下将FeCl3/6H2O、FeCl2/4H2O、HCl混合，快速加入氨水并进行机械搅拌反应，在外加磁场的作用下静置分层，去离子水多次清洗，直至上层清液呈透明状；将上述纳米Fe3O4分散于水中，加入四甲基氢氧化铵(TAMH)溶液，搅拌并震荡后，过滤去除大颗粒，得到灰褐色磁性纳米颗粒溶液。
在一个具体实施方案中，在步骤1)中将所述磁性基底材料磁性纳米颗粒溶液与异丙醇混合超声；边搅拌边加入聚乙二醇(PEG)，搅拌后加入水，搅拌后在步骤2)中加入正硅酸乙酯，再搅拌，在磁场的作用下用乙醇和水洗涤。
在一个具体实施方案中，在步骤4)中在三聚氢氯的四氢呋喃溶液中进行。
在一个具体实施方案中，在步骤5)中将氨基修饰的DNA探针与上述制备完成的磁珠进行反应，制备成核酸磁珠芯片。
在第三方面，本发明提供了一种利用本发明第一方面的核酸磁珠芯片进行检测的方法：
1)对待测样本进行核酸样本文库构建；
2)核酸磁珠芯片准备：向核酸磁珠芯片中加入水进行解链，磁性分离回收单链的核酸磁珠芯片备用；
3)杂交反应：将步骤2)中解链后的核酸磁珠芯片与步骤1)中构建好的核酸样本文库进行杂交富集反应；
4)回收目标产物：杂交富集反应后的磁珠芯片经过磁性分离洗涤，然后向其中加入水进行解链，回收目标产物水溶液；
5)qPCR检测：通过qPCR检测回收目标DNA浓度。
在一个具体实施方案中，在步骤2)中在95℃条件下进行解链。
在一个具体实施方案中，在步骤3)中在42℃条件下进行杂交富集反应。
在一个具体实施方案中，在步骤4)中在95℃下进行解链。
在一个具体实施方案中，在步骤4)中还包括回收所述核酸磁珠芯片。
在第四方面，本发明提供了一种包括本发明第一方面的核酸磁珠芯片的试剂盒，所述试剂盒包括一份核酸磁珠芯片样品和多个核酸磁珠芯片补充样，所述补充样的量优选是所述一份核酸磁珠芯片样品的8％-12％，优选10％。
本发明将核酸探针连接在磁性基底材料上制备出核酸磁珠芯片，有利于把捕获目标DNA的核酸探针与目标DNA进行分离纯化，本发明的磁珠芯片可多次重复使用。
附图说明
通过以下附图对本发明进行说明：
图1.根据本发明一个具体实施方案的核酸磁珠示意图。
图2.纳米Fe3O4制备的化学式(A)和核酸磁珠制备的结构式示意图(B)。
图3.正硅酸乙酯修饰的纳米Fe3O4的扫描电镜及EDS表面元素测定图谱。
图4.活性基团氯修饰的纳米Fe3O4的扫描电镜及EDS表面元素测定图谱。
图5.核酸磁珠芯片的扫描电镜及EDS表面元素测试图谱。
图6.杂交富集反应流程图。
图7.qPCR检测曲线图。
具体实施方式
在本发明中，通过三聚氰氯与氨基探针连接，不需要添加任何试剂，且三聚氢氯与氨基反应后生成三聚氰胺为弱碱性，弱碱性对三聚氢氯与氨基的反应本身有一定的促进作用，所以通过三聚氢氯与氨基的反应可以高效的将氨基探针连接到磁珠上。另外，探针连接到磁珠上后制备成磁珠芯片，利用此磁珠芯片去富集目标核酸，利用三聚氢氯和氨基探针生成三聚氰胺能够稳定存在，三聚氰胺在300-400℃才会断裂。
在本发明中，与本发明的纳米磁珠的核酸探针可以是双链探针或单链探针，优选是单链探针。最适合的探针长度为500-800nt。
在本发明中，所述试剂盒包括一份核酸磁珠芯片样品和多个核酸磁珠芯片补充样，所述补充样的量优选是所述一份核酸磁珠芯片样品的8％-12％，优选10％。所述一份核酸磁珠芯片样品是进行一次实验的所需量，这个量可以由本领域普通技术人员根据实际应用场景进行确定，作为产品销售的核酸磁珠芯片可以根据市场需求制备多个一份核酸样品的量，形成一系列产品进行销售。这样通过每次实验回收核酸磁珠芯片，下次实验加入核酸磁珠芯片补充样可以进行新的一次实验，大大节约实验成本。
在本发明中，为了达到更好的效果，使用如下方法制备纳米Fe3O4：在氮气保护下将FeCl3/6H2O、FeCl2/4H2O、HCl混合，快速加入氨水并进行机械搅拌反应，在外加磁场的作用下静置分层，去离子水多次清洗，直至上层清液呈透明状；将上述纳米Fe3O4分散于水中，加入四甲基氢氧化铵(TAMH)溶液，搅拌并震荡后，过滤去除大颗粒，得到灰褐色磁性纳米颗粒溶液。通过上述方法制备的纳米Fe3O4适合制备核酸磁珠芯片，磁性保持好，并且后续与聚乙二醇层、正硅酸乙酯层、氨基层、氯基层结合好，适合进行核酸磁珠芯片的回收再利用，多次反复使用，效果无衰减。
实施例1‐‐核酸磁珠芯片制备
本发明提供了一种核酸磁珠芯片，图1示例性示出的核酸磁珠的示意图，其从内至外包括：磁性纳米Fe3O4颗粒核心、聚乙二醇层、正硅酸乙酯层、氨基层、氯基层。通过如下步骤制备本发明的核酸磁珠芯片的一个示例性体实施方案，图2示出了纳米Fe3O4制备的化学式(A)和核酸磁珠制备的结构式示意图(B)：
1)纳米Fe3O4的制备：在氮气保护下将FeCl3/6H2O 0.886g、FeCl2/4H2O 0.341g、4ml2mol/L HCl混合于250ml三口烧瓶中，快速加入40ml 1mol/L的氨水，机械搅拌反应30min，在外加磁场的作用下静置分层，去离子水多次清洗，直至上层清液呈透明状；
2)将上述纳米Fe3O4分散于10ml水中，加入1.5ml 25％四甲基氢氧化铵(TAMH)溶液，搅拌10min后加水定溶至40ml，超生震荡15min，用砂芯漏斗过滤去除大颗粒，得到灰褐色磁性纳米颗粒溶液；
3)取上述磁性纳米颗粒溶液，与100ml异丙醇混合超声30min；边搅拌边加入3g聚乙二醇(PEG)4000，搅拌10min后加入9ml水，再搅拌10min后加入0.5ml正硅酸乙酯，搅拌12h；磁场的作用下用乙醇和水各洗3次，图3示出了正硅酸乙酯修饰的纳米Fe3O4的扫描电镜及EDS表面元素测定图谱；
4)将上述所得磁珠分散于9.5ml无水乙醇中，加入0.5ml水，搅拌下加入1ml 3-氨丙基三乙氧基硅烷，70℃下继续搅拌反应12h，用乙醇和水各清洗3次即得氨基硅烷化的磁性纳米颗粒，110℃真空干燥；
5)将上述氨基修饰的磁性纳米Fe3O4加入到200ml、0.05mol/L的三聚氢氯的四氢呋喃溶液中，冰浴4℃条件下反应1h，磁性分离，四氢呋喃清洗，丙酮清洗，真空干燥并保存，图4示出了活性基团氯修饰的纳米Fe3O4的扫描电镜及EDS表面元素测定图谱；
6)将1012个氨基修饰的DNA探针与上述制备完成的磁珠在65℃条件下进行反应，制备成核酸磁珠芯片，图5示出了核酸磁珠芯片的扫描电镜及EDS表面元素测试图谱。
通过测试不同长度的DNA探针，发现对于本发明的核酸磁珠，最适合的DNA探针长度是500-800nt。这种长度的探针的优势在于：杂交捕获目标DNA的容错性较高，能够将所有的目标区域DNA都富集到。
实施例2‐‐核酸磁珠芯片测试
通过以下试验对上述实施例中制备的核酸磁珠芯片进行测试：
1)样本文库构建：利用KAPA试剂盒(罗氏)进行核酸样本文库构建；
2)核酸磁珠芯片准备：将0.01g的核酸磁珠芯片置于2ml离心管中，向其中加入1ml水在95℃条件下进行解链，磁性分离回收单链的核酸磁珠芯片备用；
3)杂交反应：将上述解链后的核酸磁珠芯片与构建好的样本文库在42℃条件下进行杂交富集反应，杂交富集反应体系为1ml，包括核酸样本文库、终浓度5*SSC、0.5ml甲酰胺(V/V)、终浓度0.2％SDS、终浓度1mM乙二胺四乙酸钠(EDTA)和终浓度10％硫酸葡聚糖(M/V)；
4)回收目标产物：杂交富集反应后的磁珠芯片经过磁性分离洗涤，然后向其中每次加入400ul水进行95℃高温解链，回收目标产物水溶液5次；
5)qPCR检测：利用qPCR试剂盒(罗氏)对5次回收的目标产物进行浓度测定，测试结果如下(参见图7，图中示出了利用DNA杂交技术富集目标DNA，并回收目标DNA，通过qPCR检测回收目标DNA浓度)：
qPCR检测cq值及浓度
第N次 1 2 3 4 5
Cq值 10.97 12.38 14.11 13.68 12.28
浓度(ng/ul) 0.00175 0.0007 0.00023 0.00031 0.00075
实施例3‐‐核酸磁珠芯片回收再利用
通过以下试验对上述实施例2中使用的核酸磁珠芯片进行回收再利用：
1)回收核酸磁珠芯片：将回收目标产物后的磁珠芯片用去离子水进行磁性分离清洗3次备用；
2)杂交反应：将上述回收回来的核酸磁珠芯片与构建好的样本文库在42℃条件下进行杂交富集反应，杂交富集反应体系为1ml，包括核酸样本文库、终浓度5*SSC、0.5ml甲酰胺(V/V)、终浓度0.2％SDS、终浓度1mM乙二胺四乙酸钠(EDTA)和终浓度10％硫酸葡聚糖(M/V)；
3)回收目标产物：杂交富集反应后的磁珠芯片经过磁性分离洗涤，然后向其中每次加入400ul水进行95℃高温解链，回收目标产物水溶液5次；
4)qPCR检测：利用qPCR试剂盒(罗氏)对5次回收的目标产物进行浓度测定；
通过上述试验发现，本发明的核酸磁珠芯片的回收效率可达90％以上。因此，本发明的核酸磁珠芯片适合回收再利用，对于节约成本非常有意义。

Claims (10)

1.一种核酸磁珠芯片，所述核酸磁珠芯片包括核酸磁珠和连在所述核酸磁珠上的核酸，所述核酸磁珠从内至外包括：磁性纳米Fe3O4颗粒核心、聚乙二醇层、正硅酸乙酯层、氨基层、氯基层。
2.一种制备根据权利要求1所述的核酸磁珠芯片的方法，所述方法包括步骤：
1)聚乙二醇修饰：将聚乙二醇修饰于磁性基底材料纳米Fe3O4颗粒表面，形成聚乙二醇包覆的磁性纳米Fe3O4颗粒；
2)正硅酸乙酯修饰：将正硅酸乙酯修饰于所述聚乙二醇包覆的磁性纳米Fe3O4颗粒表面，得到二氧化硅包覆的磁性纳米Fe3O4颗粒；
3)氨基修饰：将3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰于正硅酸乙酯包覆的磁性纳米Fe3O4颗粒表面，得到氨基修饰的磁性纳米Fe3O4颗粒；
4)氯基修饰：通过SN2亲核取代反应将三聚氰氯修饰于APTES包覆的磁性纳米Fe3O4颗粒表面，得到氯基修饰的活性功能化磁珠；
5)连接探针：将核酸探针与上述纳米磁珠在60℃-70℃，优选65℃，条件下进行反应，制备成核酸磁珠芯片。
3.根据权利要求2所述的方法，步骤1)中的纳米Fe3O4的制备：利用化学共沉淀法制备磁性基底材料纳米Fe3O4颗粒。
4.根据权利要求3所述的方法，步骤1)中使用的磁性基底材料纳米Fe3O4的制备：在氮气保护下将FeCl3/6H2O、FeCl2/4H2O、HCl混合，快速加入氨水并进行机械搅拌反应，在外加磁场的作用下静置分层，去离子水多次清洗，直至上层清液呈透明状；将上述纳米Fe3O4分散于水中，加入四甲基氢氧化铵(TAMH)溶液，搅拌并震荡后，过滤去除大颗粒，得到灰褐色磁性纳米颗粒溶液。
5.根据权利要求2所述的方法，在步骤1)和2)中将所述磁性基底材料磁性纳米颗粒溶液与异丙醇混合超声；边搅拌边加入聚乙二醇(PEG)，搅拌后加入水，再搅拌后加入正硅酸乙酯，再搅拌，磁场的作用下用乙醇和水洗涤。
6.根据权利要求2所述的方法，在步骤4)中在三聚氢氯的四氢呋喃溶液中进行。
7.根据权利要求2所述的方法，在步骤5)中将氨基修饰的DNA探针与上述制备完成的磁珠进行反应，制备成核酸磁珠芯片。
8.一种利用根据权利要求1所述的核酸磁珠芯片进行检测的方法：
1)对待测样本进行核酸样本文库构建；
2)核酸磁珠芯片准备：向核酸磁珠芯片中加入水进行解链，磁性分离回收单链的核酸磁珠芯片备用；
3)杂交反应：将步骤2)中解链后的核酸磁珠芯片与步骤1)中构建好的核酸样本文库进行杂交富集反应；
4)回收目标产物：杂交富集反应后的磁珠芯片经过磁性分离洗涤，然后向其中加入水进行解链，回收目标产物水溶液；
5)qPCR检测：通过qPCR检测回收目标DNA浓度。
9.根据权利要求8所述的方法，在步骤4)中还包括回收所述核酸磁珠芯片。
10.一种包括根据权利要求1所述的核酸磁珠芯片的试剂盒，所述试剂盒包括一份核酸磁珠芯片样品和多个核酸磁珠芯片补充样，所述补充样的量优选是所述一份核酸磁珠芯片样品的8％-12％，优选10％。
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