CN106279421B - 一种cd133、cd24、cd44多重抗体免疫磁珠及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种CD133、CD24、CD44多重抗体免疫磁珠,所述多重抗体免疫磁珠由CD133免疫磁珠、CD24免疫磁珠和CD44免疫磁珠组成,其中CD133免疫磁珠、CD24免疫磁珠和CD44免疫磁珠分别为CD133抗体、CD24抗体和CD44抗体和磁性微球偶联得到的免疫磁珠。将本发明的多重抗体免疫磁珠用于捕获癌症干细胞,不仅特异性、敏感性好,而且磁响应迅速、富集时间短,捕获效率高。而且免疫磁珠的性质稳定,同时粒径小,磁响应性好,分散性好。并且制备方法简单,具有很强的实用性。
Description
技术领域
本发明涉及免疫磁珠的制备领域,具体地说是一种CD133、CD24、CD44多重抗体免疫磁珠及其制备方法。
背景技术
癌症干细胞(CSC)又称癌干细胞、癌症干细胞,是指具有干细胞的自我复制及多细胞分化性质的肿瘤细胞,可以作为肿瘤细胞侵袭力判断的标志。通常这类的细胞被认为有形成肿瘤,发展成癌症的潜力,特别是随着癌症转移出去后,产生新型癌症的来源。癌症干细胞自我更新的特性是造成肿瘤复发、转移及预后不良的主要原因。癌症干细胞内部复杂的机制能够解释癌症耐药性以及很多典型的肿瘤的行为。癌症发生的细胞假说就是指有一小部分亚群的肿瘤细胞有干细胞的特质,有能力产生新的肿瘤。癌症干细胞不仅能诱导原发肿瘤的形成,还是引起肿瘤化疗和放射治疗后复发的关键诱因。癌干细胞存在于癌细胞中,由于存在数量极少,因此很难被发现和捕获。
针对不同来源的肿瘤,癌症干细胞表面的生物标志物不尽相同。其中,CD133、CD24和CD44都是癌症干细胞的细胞表面标识物。它们的表达不仅在癌症细胞系中被发现,而且在宫颈癌、前列腺癌、头颈癌、肝脏肿瘤、脑癌、乳腺癌、肺癌等癌症患者的组织中均有发现。
免疫磁珠分选法(Immunomagnetic separation,IMS)是近年来兴起的一种用于细胞分选的方法,它是在磁珠表面包被具免疫反应性的抗体进行抗原-抗体反应,在细胞表面形成“抗原-抗体-磁珠”免疫复合物。这些结合了磁珠的细胞一旦置于强大的磁场下,就会定向移动,使免疫复合物与其他未被结合的细胞分群。当具超顺磁性的磁珠脱离磁场后,磁性立即消失,从而达到阳性或阴性选择特定细胞的目的。
将免疫磁珠分选法应用于肿瘤细胞的分选是本领域近年来兴起的技术。但是利用免疫磁珠分选法从血液复杂的环境中分选出肿瘤细胞,需要免疫磁珠具有特异性的生物标志物,而且稳定性、分散性好,不能团聚。并且多标志物抗体的联合应用可有效提高检测敏感性和特异性(Journal of the National Cancer Institute,2009,101(1):61-66)。同时,免疫磁珠的粒径不能过大,过大会压迫肿瘤细胞;免疫磁珠的粒径也不能过小,粒径过小磁响应性也小,容易无法达到肿瘤细胞分选的效果。
发明内容
本发明的主要目的是针对现有技术存在的不足提供一种CD133、CD24、CD44多重抗体免疫磁珠,磁珠粒径小,磁响应性好,用本发明的免疫磁珠进行癌症干肿瘤细胞捕获,不仅捕获效率高,灵敏性高,富集时间短,而且捕获的癌症干细胞准确有效,同时多重免疫磁珠的制备过程简单,成本低。
在本发明的一方面,本发明是通过如下技术方案实现的:一种CD133、CD24、CD44多重抗体免疫磁珠,所述多重抗体免疫磁珠由CD133免疫磁珠、CD24免疫磁珠和CD44免疫磁珠组成,其中CD133免疫磁珠、CD24免疫磁珠和CD44免疫磁珠分别为CD133抗体、CD24抗体和CD44抗体和磁性微球偶联得到的免疫磁珠。
进一步的,所述CD133免疫磁珠、CD24免疫磁珠和CD44免疫磁珠的结构式为:A-NH-N=CH-B,其中A表示磁性微球,B表示CD133、CD24、CD44抗体,或者A表示CD133、CD24、CD44抗体,B表示磁性微球。
优选的,所述磁性微球为核壳结构的无机或有机高分子包裹的磁性微球。比如二氧化硅包裹的磁性四氧化三铁、或者葡聚糖包裹的磁性四氧化三铁等。最优选的,所述磁性微球为二氧化硅包裹的磁性四氧化三铁。
在本发明的第二方面,提供了一种制备上述CD133、CD24、CD44多重抗体免疫磁珠的方法,其步骤包括:
s1.磁性纳米簇的制备;
s2.氨基修饰的磁性微球的制备;
s3.肼基修饰的A部分的制备;
s4.醛基修饰的B部分的制备;
s5.免疫磁珠的制备:将步骤s3所述肼基修饰的A部分与步骤s4所述醛基修饰的B部分混合,在4~25℃下进行偶联反应2~24小时,得到CD133免疫磁珠、CD24免疫磁珠和CD44免疫磁珠。
在本发明的一种实施方式中,对氨基修饰的磁性微球进行醛基修饰,并且对CD133抗体、CD24抗体和CD44抗体分别进行肼基修饰。或者对氨基修饰的磁性微球进行肼基修饰,并且对CD133抗体、CD24抗体和CD44抗体分别进行醛基修饰,均可以实现上述结构的免疫磁珠。
进一步的,所述步骤s3中的肼基修饰的A部分是通过:将氨基修饰的磁性微球或抗体用摩尔当量为10~50倍的SANH进行肼基修饰后得到的。所述SANH为对-丙腙基吡啶甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(CAS:362522-50-7),在室温条件下可以温和的将氨基转换为肼基。所述SANH一般溶解在DMF(N,N-二甲基甲酰胺)溶液中进行反应,浓度可以根据磁性微球部分或抗体部分的浓度进行调整,不影响反应结果。该反应过程可以在15~25℃室温条件下进行,反应时间根据本领域技术人员常规的检测技术判断,本发明一般采用对磁珠部分的修饰反应时间16~24h,对抗体部分的修饰反应时间2~4h。
进一步的,所述步骤s4中的醛基修饰的B部分是通过:将氨基修饰的磁性微球或抗体用摩尔当量为5~20倍的SFB进行醛基修饰后得到的。所述SFB为4-甲酰苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯(CAS:60444-78-2),在室温条件下可以温和的将氨基转换为醛基。所述SFB一般溶解在DMF溶液中进行反应,浓度可以根据磁性微球部分或抗体的浓度进行调整,不影响反应结果。该反应过程可以在15~25℃室温条件下进行,反应时间根据本领域技术人员常规的检测技术判断,本发明一般采用对磁珠部分的修饰反应时间16~24h,对抗体部分的修饰反应时间2~4h。
所述步骤s1中的磁性纳米簇是通过水热法、溶剂热法或共沉淀法制备得到,也可以采用市售商品。制备磁性纳米簇的方法为本领域技术人员所熟知的技术,得到的产品只需要满足具有良好的磁性,并且可以与无机或有机高分子形成核壳结构即可。
作为优选的,所述步骤s1中的磁性纳米簇是通过如下方法制备得到:
1)在空气中,向二价铁盐的水溶液中加入氨水,然后搅拌使溶液变成黑色,得到黑色Fe3O4颗粒;
2)向步骤1)中加入油酸,混合均匀后转移至密闭的反应釜中,在60~130℃下加热反应3~5小时,即可得到所述磁性纳米簇。
进一步的,所述步骤s2中的氨基修饰的磁性微球部分为核壳结构的二氧化硅包裹的磁性微球,效果更加优于直接在磁性纳米簇粒子表面进行氨基修饰得到的磁性微球,可以采用市售商品或者按照本领域技术人员所知的常规方法制备,均不影响本发明的结果。可以使纳米簇聚集在二氧化硅内部,形成核壳结构,增大粒径,并且增加磁性和稳定性即可。优选的,本发明采用如下方法制备氨基修饰的二氧化硅包裹的磁性微球:向含有磁性纳米簇的溶液中加入氨水、硅烷化试剂和氨基硅烷偶联剂,反应1~3天后得到氨基修饰的磁性微球部分;所述磁性纳米簇、氨水、硅烷化试剂、氨基硅烷偶联剂加入的质量比为:1:(12.5~40):(2~8):(0.5~3)。其中氨水的质量百分浓度为25~28%。其中,硅烷化试剂可以为正硅酸四乙酯(CAS:562-90-3),氨基硅烷偶联剂可以为(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(CAS:919-30-2)。本领域技术人员在选择其他的硅烷化试剂与氨基硅烷偶联剂时,可以对反应原料的比例进行调整,均不超出本发明的保护范围。
优选的,所述步骤s5中,磁性微球和抗体的质量比为1:(0.01~1)。抗体与磁性微球的质量比越高越有利于磁性微球表面偶联抗体,但是考虑到抗体的成本因素,本发明采用磁性微球和抗体的质量比为1:(0.01~0.2)。
在本发明的第三方面,提供了一种用于捕获癌症干细胞的试剂盒,所述试剂盒中含有上述多重免疫磁珠,其中,多重免疫磁珠为CD133免疫磁珠、CD24免疫磁珠和CD44免疫磁珠按照混合得到。由于不同的肿瘤干细胞表达的表面抗原量不同,因此CD133免疫磁珠、CD24免疫磁珠和CD44免疫磁珠混合的比例可以根据肿瘤的类型不同进行选择,本发明采用1:1:1。
所述癌症可以为宫颈癌、前列腺癌、头颈癌、肝脏肿瘤、脑癌、乳腺癌或肺癌。
本发明的有益效果为:
(1)将本发明的多重免疫磁珠用于捕获癌症干细胞,可以捕获癌细胞中极少量的癌症干细胞,用于进一步的培养和分析,指导靶向性用药,其捕获的特异性、灵敏性好,而且磁响应迅速、富集时间短,捕获效率高。可以用于外泌体、体液或活检组织的肿瘤细胞捕获与分析。
(2)本发明的免疫磁珠,其磁性微球部分和抗体部分通过腙键结构相连,得到的免疫磁珠在弱碱性条件下(血液中)性质稳定,同时粒径小,磁响应性好、分散性好。
(3)本发明的制备方法简单,反应条件温和,氨基、醛基和肼基修饰的过程均可以在室温下进行,不容易造成抗体的变质、降解等,同时避免了使用还原剂,使抗体可以在低温下与细胞孵育,保持抗体和细胞的活性。
(4)本发明原料简单易得,成本低,工艺步骤简单,抗体包被量大,具有很强的实用性。
具体实施方式
以下通过具体实施例来进一步说明本发明:下列实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规方法和条件,或按照商品说明书选择。
实施例1多重抗体免疫磁珠的制备
(1)磁性纳米簇的制备:
a.在空气中,将7g FeCl2·4H2O加入到50mL去离子水中,得到浓度为0.14g/mL的FeCl2水溶液。向50mL FeCl2水溶液中加入氨水30mL,搅拌45min后,颜色逐渐变为浅绿色,再变深绿色,最后变为黑色;
b.向步骤a中加入1.1g油酸,混合均匀后将混合液置于密闭的反应釜中,在110℃下加热反应4小时,然后用去离子水和乙醇交替洗涤各一次,磁分离后分散在正己烷中,即可得到黑色的磁性纳米簇Fe3O4。
(2)氨基修饰的磁性微球的制备:向10mg磁性纳米簇Fe3O4 1的溶液中加入125mg氨水、30mg正硅酸四乙酯和30mg(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷,反应1天后进行磁分离,并且用乙醇和水交替洗涤各两次,并用0.1M的pH 7~8的磷酸缓冲液分散后得到浓度为5mmol/L的氨基修饰的磁性微球1。
(3)肼基修饰的CD24抗体的制备:将5μL SANH的DMF溶液(浓度为5mmol/L)加入到100μL CD24抗体溶液(浓度为10μmol/L)中,在室温反应2h后,用超滤柱纯化得到肼基修饰的CD24抗体(简写为CD24-SANH)1。
检测CD24-SANH的浓度:通过BCA法计算修饰后的CD24-SANH的浓度为1.08mg/mL。
检测肼基修饰率:用定量的2-甲酰苯磺酰钠盐溶液检测肼基修饰率。取纯化后的CD24-SANH加入到的2-甲酰苯磺酰钠盐溶液中,涡旋混匀后于37℃反应1h,Nanodrop检测348nm处的吸光值为0.22。通过348nm处的吸光值和CD24-SANH的浓度计算出CD24-SANH的肼基修饰率为2.9。
(4)醛基修饰的磁性微球的制备:将5μL的氨基修饰的磁性微球1加入到SFB的DMF溶液(浓度为5mmol/L)50μL中,在室温反应20h后,进行磁分离纯化,得到醛基修饰的磁性微球1。
(5)将1mg步骤(4)中的醛基修饰的磁性微球与0.01mg步骤(3)中的肼基修饰的CD24抗体混合,在25℃下PBS缓冲液中混合4小时后,进行磁分离得到CD24免疫磁珠。
按照上述步骤(1)~(5)制备得到CD133免疫磁珠和CD44免疫磁珠。将CD133免疫磁珠、CD24免疫磁珠和CD44免疫磁珠按照质量比1:1:1混合得到多重抗体免疫磁珠。
实施例2多重抗体免疫磁珠的敏感性检测
取人结肠癌HCT116细胞(表面表达CD133/CD44抗原)、人非小细胞肺癌A549细胞(表面表达CD44/CD24抗原)和人乳腺腺癌细胞SK-BR-3细胞(表面表达CD24抗原)(均购自中国科学院细胞库),每组肿瘤细胞分别按照1:103、1:104、1:105、1:106的比例加入到PBMCs(5×106)中。将单独的抗体免疫磁珠以及多重抗体免疫磁珠分别加入到上述各混合细胞悬液中,在4℃下孵育30分钟。在2分钟内进行磁分选并用PBS洗涤2-3次,得到用免疫磁珠捕获并回收的肿瘤细胞。统计回收的肿瘤细胞占加入的肿瘤细胞总数的比例,计算免疫磁珠的捕获率,结果如表1所示:
表1不同免疫磁珠的捕获率
表1的结果表明,在不同的细胞系中,用单独的抗体磁珠捕获肿瘤细胞,捕获率明显下调,但是用多重抗体免疫磁珠捕获肿瘤细胞,在各种细胞系中的捕获效率相近,并且明显高于单独的抗体磁珠捕获效率。同时,随着肿瘤细胞添加比例的增加,捕获肿瘤细胞的数量呈线性。
实施例3模拟血液中CSC细胞的捕获
采集健康志愿者血样,将HCT116细胞与健康人的外周血混合,配成混合细胞悬液,调节HCT116细胞的浓度为1、10、20、50、500、1000个/mL,然后将多重抗体免疫磁珠依次加入到上述各混合细胞悬液中,在4℃下孵育30分钟。在1分钟内进行磁分选并用PBS洗涤2-3次,得到用免疫磁珠捕获并回收的HCT116细胞。统计回收的HCT116细胞占捕获前细胞总数的比例,计算免疫磁珠捕获血液样品中HCT116细胞的捕获效率,与实施例2中结果相近。
从实施例2-3的捕获结果来看,多重抗体免疫磁珠在单纯环境中(实施例2)的捕获效率能够精确到1:106,多重抗体免疫磁珠在复杂环境中(实施例3)也可以检测到1个/mL的HCT116细胞,可以满足目前液体活检的要求。
对上述孵育后的磁珠用无钙镁的PBS缓冲液重悬,将洗脱得到的磁珠-细胞用PicoPure RNA Isolation Kit试剂盒(Thermo Cat No:KIT0214)提取纯化总RNA,采用了PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(TAKARA,Cat No:RR047A),按说明书要求去除基因组DNA以及进行cDNA链合成。接下来涉及相应Taqman引物,进行qPCR检测,以GAPDH为内标比较qPCR检测结果,在相同条件下,与HCT116细胞的qPCR检测结果一致。说明用本发明的免疫磁珠捕获循环肿瘤细胞不会损伤细胞,可以用于后续细胞分析。并且说明,用本发明的免疫磁珠捕获到的细胞几乎没有PBMCs细胞,PBMCs细胞则基本不与免疫磁珠结合。
实施例4癌症病人的CSC细胞捕获
取10个不同的原发灶结直肠癌症病人的外周血血液3mL,对血液中的CSC细胞进行捕获。要求受试者血常规白细胞值位于2×106~1.2×107个/mL之间,全血样本未出现溶血或血块凝结。将实施例1中的多重抗体免疫磁珠加入到上述经过红细胞裂解后的血液中,在4℃下孵育30分钟,然后在1分钟内进行磁分选并用PBS洗涤2-3次,在其中三个癌症病人血液中捕获和富集到了癌症干细胞。将得到的癌症干细胞从免疫磁珠上洗脱后用无钙镁的PBS洗三遍,用100μl的DMEM培养基悬浮,静脉注射进CD1-Foxn1nu免疫缺陷鼠中,对照组静脉注射100ul的DMEM,结果发现本发明的癌症干细胞注射的老鼠体内都长了肿瘤,而对照组都没有。将肿瘤取出并做成石蜡切片,用多重抗体染色(CD133、CD24、CD44),显微镜观察发现每张片子都有荧光,用多重抗体染色(CD133、CD24、CD44),显微镜观察发现每张片子都有荧光,说明肿瘤细胞的表面至少含有CD133/CD24/CD44抗原中的一个,肿瘤是由于静脉注射癌症干细胞转移产生的,表面至少有CD133、CD24、CD44中一个的肿瘤细胞具有癌症干细胞的特征。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案,并非对本发明作任何形式上的限制,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明实施例原理以及权利要求的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也视为本发明实施例的保护范围。
Claims (7)
1.一种CD133、CD24、CD44多重抗体免疫磁珠,其特征在于:所述多重抗体免疫磁珠由CD133免疫磁珠、CD24免疫磁珠和CD44免疫磁珠组成,其中CD133免疫磁珠、CD24免疫磁珠和CD44免疫磁珠分别为CD133抗体、CD24抗体和CD44抗体和磁性微球偶联得到的免疫磁珠;
所述CD133免疫磁珠、CD24免疫磁珠和CD44免疫磁珠的结构式为:A-NH-N=CH-B,其中A表示磁性微球,B表示CD133、CD24或CD44抗体,或者A表示CD133、CD24或CD44抗体,B表示磁性微球;
所述免疫磁珠通过如下步骤制备获得:
s1.磁性纳米簇的制备;
s2.氨基修饰的磁性微球的制备;
s3.肼基修饰的A部分的制备;
s4.醛基修饰的B部分的制备;
s5.免疫磁珠的制备:将步骤s3所述肼基修饰的A部分与步骤s4所述醛基修饰的B部分混合,在4~25℃下进行偶联反应2~24小时,得到CD133免疫磁珠、CD24免疫磁珠或CD44免疫磁珠;
所述步骤s1中的磁性纳米簇是通过如下方法制备得到:
a.在空气中,将7g FeCl2·4H2O加入到50mL去离子水中,得到浓度为0.14g/mL的FeCl2水溶液;向50mL FeCl2水溶液中加入氨水30mL,搅拌45min后,颜色逐渐变为浅绿色,再变深绿色,最后变为黑色;
b.向步骤a中加入1.1g油酸,混合均匀后将混合液置于密闭的反应釜中,在110℃下加热反应4小时,然后用去离子水和乙醇交替洗涤各一次,磁分离后分散在正己烷中,即可得到黑色的磁性纳米簇Fe3O4。
2.根据权利要求1所述的CD133、CD24、CD44多重抗体免疫磁珠,其特征在于:所述磁性微球为核壳结构的无机或有机高分子包裹的磁性微球。
3.一种制备权利要求1或2所述CD133、CD24、CD44多重抗体免疫磁珠的方法,其步骤包括:
s1.磁性纳米簇的制备;
s2.氨基修饰的磁性微球的制备;
s3.肼基修饰的A部分的制备;
s4.醛基修饰的B部分的制备;
s5.免疫磁珠的制备:将步骤s3所述肼基修饰的A部分与步骤s4所述醛基修饰的B部分混合,在4~25℃下进行偶联反应2~24小时,得到CD133免疫磁珠、CD24免疫磁珠或CD44免疫磁珠;
所述步骤s1中的磁性纳米簇是通过如下方法制备得到:
a.在空气中,将7g FeCl2·4H2O加入到50mL去离子水中,得到浓度为0.14g/mL的FeCl2水溶液;向50mL FeCl2水溶液中加入氨水30mL,搅拌45min后,颜色逐渐变为浅绿色,再变深绿色,最后变为黑色;
b.向步骤a中加入1.1g油酸,混合均匀后将混合液置于密闭的反应釜中,在110℃下加热反应4小时,然后用去离子水和乙醇交替洗涤各一次,磁分离后分散在正己烷中,即可得到黑色的磁性纳米簇Fe3O4。
4.根据权利要求3所述CD133、CD24、CD44多重抗体免疫磁珠的制备方法,其特征在于:所述步骤s3中的肼基修饰的A部分是通过:将氨基修饰的磁性微球或抗体用摩尔当量为10~50倍的SANH进行肼基修饰后得到的。
5.根据权利要求3所述CD133、CD24、CD44多重抗体免疫磁珠的制备方法,其特征在于:所述步骤s4中的醛基修饰的B部分是通过:将氨基修饰的磁性微球或抗体用摩尔当量为5~20倍的SFB进行醛基修饰后得到的。
6.根据权利要求3所述CD133、CD24、CD44多重抗体免疫磁珠的制备方法,其特征在于:所述步骤s2中的氨基修饰的磁性微球部分为核壳结构的二氧化硅包裹的磁性微球,通过如下方法制备得到:向含有磁性纳米簇的溶液中加入氨水、硅烷化试剂和氨基硅烷偶联剂,反应1~3天后得到氨基修饰的磁性微球部分;所述磁性纳米簇、氨水、硅烷化试剂、氨基硅烷偶联剂加入的质量比为:1:(12.5~40):(2~8):(0.5~3)。
7.一种用于捕获癌症干细胞的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒中含有权利要求1所述的多重抗体免疫磁珠,其中,多重抗体免疫磁珠为CD133免疫磁珠、CD24免疫磁珠和CD44免疫磁珠混合得到。
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