CN106198963A - 一种用于捕获白细胞的免疫磁珠及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于捕获白细胞的免疫磁珠及其制备方法，所述免疫磁珠至少包括CD45免疫磁珠，还可以包括或不包括CD14免疫磁珠和CD15免疫磁珠中的一种或两种，其中，CD45免疫磁珠、CD14免疫磁珠和CD15免疫磁珠为CD45抗体、CD14抗体和CD15抗体分别与磁性微球偶联得到的免疫磁珠；所述CD45免疫磁珠、CD14免疫磁珠和CD15免疫磁珠的结构式为：A‑NH‑N＝CH‑B，其中A表示磁性微球，B表示抗体，或者A表示抗体，B表示磁性微球。将本发明的免疫磁珠用于捕获白细胞，不仅特异性、敏感性好，而且磁响应迅速、富集时间短，捕获效率高。并且制备方法简单，具有很强的实用性。

Description

一种用于捕获白细胞的免疫磁珠及其制备方法
技术领域
本发明涉及免疫磁珠的制备领域，具体地说是一种用于捕获白细胞的免疫磁珠及其制备方法。
背景技术
血液本身是一个由血浆和血细胞组成的复杂环境，其中血细胞包括红细胞、白细胞和血小板细胞。人体内白细胞总数和种类的百分比是相对稳定的，正常人每毫升血液里白细胞有(3.5～9.5)×106个，主要有：嗜中性粒细胞50～70％，嗜酸性粒细胞1～4％，嗜碱性粒细胞0～1％，淋巴细胞20～40％，单核细胞为l～7％。CD45抗原是一类分子量较大的跨膜蛋白，广泛存在于包括淋巴细胞、粒细胞和单核细胞在内的白细胞表面，可以作为白细胞主要的免疫生物标识物。并且，CD15抗原存在于粒细胞表面，CD14抗原存在于单核细胞表面，也可以作为白细胞的免疫生物标识物之一。
免疫磁珠分选法(Immunomagnetic separation，IMS)是近年来兴起的一种用于细胞分选的方法，它是在磁珠表面包被具免疫反应性的抗体进行抗原-抗体反应，在细胞表面形成“抗原-抗体-磁珠”免疫复合物。这些结合了磁珠的细胞一旦置于强大的磁场下，就会定向移动，使免疫复合物与其他未被结合的细胞分群。当具超顺磁性的磁珠脱离磁场后，磁性立即消失，从而达到阳性或阴性选择特定细胞的目的。
将免疫磁珠分选法应用于细胞的分选是本领域近年来兴起的技术。但是利用免疫磁珠分选法从血液复杂的环境中分选出特定细胞，需要免疫磁珠具有特异性的免疫生物标志物，而且稳定性、分散性好，不能团聚。同时，免疫磁珠的粒径不能过大，过大会压迫细胞；免疫磁珠的粒径也不能过小，粒径过小磁响应性也小，容易无法达到细胞分选的效果。然而，由于该复杂性，从血液中正向分选出需要的细胞进行培养和分析，现有的生物标志物往往难以达到敏感性的要求。例如循环肿瘤细胞(CTC)，在外周血中的浓度非常低，通常在约109个血细胞中仅有数个CTC，大约每105～107个单核细胞中才有几个循环肿瘤细胞。为了能够提高稀有细胞的捕获率，现有技术中在采用正向分选捕获CTC等稀有细胞之前，往往先经过反向分选，去除血液中的不相关细胞，然后再进行正向分选稀有细胞。例如在血液中捕获和富集CTC细胞的方法是利用CD45免疫磁珠结合表达CD45抗原的白细胞，进行磁分离去除白细胞，此法可将去除大部分表达CD45的淋巴细胞，并将全部类型的CTCs富集分选出来。但是剩余的白细胞包括粒细胞(CD15抗原)和单核细胞(CD14抗原)还存在，剩余的细胞中仅能获得0.01％～1％的CTCs。
发明内容
本发明的主要目的是针对现有技术存在的不足提供一种用于捕获白细胞的免疫磁珠及其制备方法，本发明的用于捕获白细胞的免疫磁珠粒径小，磁响应性好，用于白细胞捕获，捕获效率高，富集时间短，可以去除血液中大量的白细胞，同时制备过程简单，成本低。
在本发明的一方面，本发明是通过如下技术方案实现的：一种用于捕获白细胞的免疫磁珠，所述用于捕获白细胞的免疫磁珠至少包括CD45免疫磁珠，还可以包括或不包括CD14免疫磁珠和CD15免疫磁珠中的一种或两种，其中，CD45免疫磁珠、CD14免疫磁珠和CD15免疫磁珠为CD45抗体、CD14抗体和CD15抗体分别与磁性微球偶联得到的免疫磁珠；所述CD45免疫磁珠、CD14免疫磁珠和CD15免疫磁珠的结构式为：A-NH-N＝CH-B，其中A表示磁性微球，B表示抗体，或者A表示抗体，B表示磁性微球。
可以选择的加入CD14免疫磁珠和CD15免疫磁珠，用于捕获和富集剩余未捕获完全的粒细胞和单核细胞。
优选的，所述磁性微球为核壳结构的无机或有机高分子包裹的磁性微球。比如二氧化硅包裹的磁性四氧化三铁、或者葡聚糖包裹的磁性四氧化三铁等。最优选的，所述磁性微球部分为二氧化硅包裹的磁性四氧化三铁。
优选的，所述用于捕获白细胞的免疫磁珠的粒径为200～300nm。
在本发明的第二方面，提供了一种制备上述用于捕获白细胞的免疫磁珠的方法，其步骤包括：
s1.磁性纳米簇的制备；
s2.氨基修饰的磁性微球的制备；
s3.肼基修饰的A部分的制备；
s4.醛基修饰的B部分的制备；
s5.免疫磁珠的制备：将步骤s3所述肼基修饰的A部分与步骤s4所述醛基修饰的B部分混合，在4～25℃下进行偶联反应2～24小时，得到所述免疫磁珠。
在本发明的一种实施方式中，对氨基修饰的磁性微球进行醛基修饰，并且对抗体进行肼基修饰。或者对氨基修饰的磁性微球进行肼基修饰，并且对抗体进行醛基修饰，均可以实现上述结构的免疫磁珠。
进一步的，所述步骤s3中的肼基修饰的A部分是通过：将氨基修饰的磁性微球或抗体用摩尔当量为10～50倍的SANH进行肼基修饰后得到的。最优选的，SANH的摩尔当量为氨基修饰的磁性微球或抗体的25倍。所述SANH为对-丙腙基吡啶甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(CAS：362522-50-7)，在室温条件下可以温和的将氨基转换为肼基。所述SANH一般溶解在DMF溶液中进行反应，浓度可以根据磁性微球或抗体的浓度进行调整，不影响反应结果。该反应过程可以在15～25℃室温条件下进行，反应时间根据本领域技术人员常规的检测技术判断，本发明一般采用对磁性微球的修饰反应时间16～24h，对抗体的修饰反应时间2～4h。
进一步的，所述步骤s4中的醛基修饰的B部分是通过：将氨基修饰的磁性微球或抗体用摩尔当量为5～20倍的SFB进行醛基修饰后得到的。最优选的，SFB的摩尔当量为氨基修饰的磁性微球或抗体的10倍。所述SFB为4-甲酰苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯(CAS：60444-78-2)，在室温条件下可以温和的将氨基转换为醛基。所述SFB一般溶解在DMF溶液中进行反应，浓度可以根据磁性微球或抗体的浓度进行调整，不影响反应结果。该反应过程可以在15～25℃室温条件下进行，反应时间根据本领域技术人员常规的检测技术判断，本发明一般采用对磁性微球的修饰反应时间16～24h，对抗体的修饰反应时间2～4h。
所述步骤s1中的磁性纳米簇是通过水热法、溶剂热法或共沉淀法制备得到，也可以采用市售商品。制备磁性纳米簇的方法为本领域技术人员所熟知的技术，得到的产品只需要满足具有良好的磁性，并且可以与无机或有机高分子形成核壳结构即可。
作为优选的，所述步骤s1中的磁性纳米簇是通过如下方法制备得到：
1)在空气中，向二价铁盐的水溶液中加入氨水，然后搅拌使溶液变成黑色，得到黑色Fe3O4颗粒；
2)向步骤1)中加入油酸，混合均匀后转移至密闭的反应釜中，在60～130℃下加热反应3～5小时，即可得到所述磁性纳米簇。
进一步的，所述步骤s2中的氨基修饰的磁性微球为核壳结构的二氧化硅包裹的磁性微球，效果更加优于直接在磁性纳米簇粒子表面进行氨基修饰得到的磁性微球，可以采用市售商品或者按照本领域技术人员所知的常规方法制备，均不影响本发明的结果。可以使纳米簇聚集在二氧化硅内部，形成核壳结构，增大粒径，并且增加磁性和稳定性即可。优选的，本发明采用如下方法制备氨基修饰的二氧化硅包裹的磁性微球：向含有磁性纳米簇的溶液中加入氨水、硅烷化试剂和氨基硅烷偶联剂，反应1～3天后得到氨基修饰的磁性微球部分；所述磁性纳米簇、氨水、硅烷化试剂、氨基硅烷偶联剂加入的质量比为：1:(12.5～40):(2～8):(0.5～3)。其中氨水的质量百分浓度为25～28％。其中，硅烷化试剂可以为正硅酸四乙酯(CAS：562-90-3)，氨基硅烷偶联剂可以为(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(CAS：919-30-2)。本领域技术人员在选择其他的硅烷化试剂与氨基硅烷偶联剂时，可以对反应原料的比例进行调整，均不超出本发明的保护范围。
优选的，所述步骤s5中，磁性微球和抗体的质量比为1：(0.01～1)。抗体与磁性微球的质量比越高越有利于磁性微球表面偶联抗体，但是考虑到抗体的成本因素，本发明采用磁性微球和抗体的质量比为1：(0.01～0.2)。
在本发明的第三方面，提供了一种用于捕获白细胞的试剂盒，所述试剂盒中含有上述的用于捕获白细胞的免疫磁珠，所述用于捕获白细胞的免疫磁珠为CD45免疫磁珠、CD14免疫磁珠和CD15免疫磁珠混合得到。由于不同的白细胞中淋巴细胞、粒细胞和单核细胞中含量不相同，因此CD45免疫磁珠、CD14免疫磁珠、CD15免疫磁珠混合的比例可以根据淋巴细胞、粒细胞和单核细胞中含量不同进行选择，本发明采用5:1:5。
本发明的有益效果为：
(1)将本发明的免疫磁珠用于捕获白细胞，不仅特异性、敏感性好，而且磁响应迅速、富集时间短，捕获效率高，可以用来捕获血液中绝大多数的白细胞，有利于富集CTC等稀有细胞，并且避免了捕获的白细胞损伤，白细胞可以用于进一步的分析。
(2)本发明的免疫磁珠，其磁性微球部分和抗体部分通过腙键结构相连，得到的免疫磁珠在弱碱性条件下(血液中)性质稳定，同时粒径小，磁响应性好，分散性好。
(3)本发明的制备方法简单，反应条件温和，氨基、醛基和肼基修饰的过程均可以在室温下进行，不容易造成抗体的变质、降解等，同时避免了使用还原剂，使抗体可以在低温下与细胞孵育，保持抗体和细胞的生物活性。
(4)本发明原料简单易得，成本低，工艺步骤简单，具有很强的实用性。
附图说明
图1为本发明CD45免疫磁珠1的光学显微镜下形貌图；
图2为本发明CD45免疫磁珠1的荧光显微镜下形貌图；
图3为本发明CD45免疫磁珠1捕获白细胞的结果图；
图4为市售CD45免疫磁珠捕获白细胞的结果图；
图5为本发明CD45免疫磁珠1捕获KB细胞的结果图；
图6为市售CD45免疫磁珠和本发明CD45免疫磁珠吸附前后的细胞分布图；
图7为CD45免疫磁珠、CD14免疫磁珠、CD15免疫磁珠吸附前后的细胞分布图。
具体实施方式
以下通过具体实施例来进一步说明本发明：下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明对比用市售CD45免疫磁珠为购自thermofisher公司的CD45免疫磁珠，货号为11153D。
实施例1用于去除白细胞的免疫磁珠的制备
(1)磁性纳米簇的制备：
a.在空气中，将7g FeCl2·4H2O加入到50mL去离子水中，得到浓度为0.14g/mL的FeCl2水溶液。向50mL FeCl2水溶液中加入氨水30mL，搅拌20min后，颜色逐渐变为浅绿色，再变深绿色，最后变为黑色；
b.向步骤a中加入1.1g油酸，混合均匀后将混合液置于密闭的反应釜中，在110℃下加热反应4小时，然后用去离子水和乙醇交替洗涤各一次，磁分离后分散在正己烷中，即可得到黑色的磁性纳米簇Fe3O4 1。
(2)氨基修饰的磁性微球的制备：向10mg磁性纳米簇Fe3O4 1的溶液中加入125mg氨水、30mg正硅酸四乙酯和30mg(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷，反应1天后进行磁分离，并且用乙醇和水交替洗涤各两次，并用0.1M的pH 7～8的磷酸缓冲液分散后得到浓度为5mmol/L的氨基修饰的磁性微球1。
(3)肼基修饰的CD45抗体的制备：将5μL SANH的DMF溶液(浓度为5mmol/L)加入到100μL CD45抗体溶液(浓度为10μmol/L)中，在室温反应2h后，用超滤柱纯化得到肼基修饰的CD45抗体(简写为CD45-SANH)1。
检测CD45-SANH的浓度：通过BCA法计算修饰后的CD45-SANH的浓度为1.80mg/mL。
检测肼基修饰率：用定量的2-甲酰苯磺酰钠盐溶液检测肼基修饰率。取纯化后的CD45-SANH加入到的2-甲酰苯磺酰钠盐溶液中，涡旋混匀后于37℃反应1h，Nanodrop检测348nm处的吸光值为0.16。通过348nm处的吸光值和CD45-SANH的浓度计算出CD45-SANH的肼基修饰率为6.2。
(4)醛基修饰的磁性微球的制备：将5μL的氨基修饰的磁性微球1加入到SFB的DMF溶液(浓度为5mmol/L)50μL中，在室温反应20h后，进行磁分离纯化，得到醛基修饰的磁性微球1。
(5)免疫磁珠的制备：将1mg步骤(4)中的醛基修饰的磁性微球与0.01mg步骤(3)中的肼基修饰的CD45抗体混合，在25℃下pH值为6.0的PBS缓冲液中混合2小时后，进行磁分离得到CD45抗体偶联磁性微球的CD45免疫磁珠。计算得到每毫克CD45免疫磁珠1上，包被抗体率为85％(消耗的抗体量与加入的抗体总量的比例)。
对上述CD45免疫磁珠1进行显微镜检测，得到的光学显微镜下形貌图如图1所示，荧光显微镜下形貌图如图2所示。通过图1和图2可以看出，本发明的CD45免疫磁珠1上，免疫磁珠上都偶联有标记荧光的CD45，偶联效率高。
按照上述步骤(1)～(5)制备得到CD14免疫磁珠和CD15免疫磁珠。将CD14免疫磁珠、CD15免疫磁珠和CD45免疫磁珠按照质量比1:5:5混合得到用于捕获白细胞的免疫磁珠。
实施例2用于捕获白细胞的免疫磁珠的特异性检测
采集健康志愿者血样，通过人淋巴细胞分离液进行外周血单核细胞(PBMCs)提取，将PBMCs制成四组浓度为1×106/mL的细胞悬液，在两组中分别加入0.5mg和5mg实施例1中的CD45免疫磁珠后，在4℃下孵育30分钟，在1分钟内进行磁分选并洗涤。对另外两组中分别加入0.5mg和5mg市售的CD45免疫磁珠，按照同样的方法孵育。
收集人口腔表皮样癌细胞KB细胞(来源中国科学院细胞库购买)，同样制成浓度为1×106/mL的细胞悬液，加入5mg实施例1中的用于捕获白细胞的免疫磁珠后，在4℃下孵育30分钟，作为阴性对照。
对孵育后的磁珠进行重悬，然后进行显微镜检测。本发明CD45免疫磁珠结果如图3所示，孵育30分钟后，PBMCs细胞表面聚集有很多用于捕获白细胞的免疫磁珠，吹打不散，当免疫磁珠加入量为过饱和5mg时，捕获率达到99.7％，当免疫磁珠加入量为0.5mg时，捕获率为96％。市售的CD45免疫磁珠结果如图4所示，市售的CD45免疫磁珠尺寸较大，快接近白细胞大小，当免疫磁珠加入量为过饱和5mg时，捕获率仅有98.9％，当免疫磁珠加入量为0.5mg时，捕获率为86％。而KB细胞则基本不与本发明用于捕获白细胞的免疫磁珠结合，呈分散状，如图5所示。
实施例3用于捕获不同类型白细胞的免疫磁珠的特异性检测
采集健康志愿者血样，通过人淋巴细胞分离液进行外周血单核细胞(PBMCs，含淋巴细胞和单核细胞)提取，将PBMCs制成浓度为1×106/mL的细胞悬液，分别加入实施例1中的CD45、CD15、CD14免疫磁珠后，在4℃下孵育30分钟，在1分钟内进行磁分选并洗涤。
采集健康志愿者血样，通过红细胞裂解液提取总白细胞(含粒细胞、淋巴细胞和单核细胞，淋巴细胞占20～40％，粒细胞占50～70％，单核细占1～7％)，将PBMCs制成浓度为1×106/mL的细胞悬液，分别加入实施例1中的CD45、CD15、CD14免疫磁珠后，在4℃下孵育30分钟，在1分钟内进行磁分选并洗涤。
收集KB细胞，同样制成浓度为1×106/mL的细胞悬液，加入实施例1中的CD45免疫磁珠后，在4℃下孵育30分钟，作为阴性对照。
如图6所示，通过细胞计数器检测CD45免疫磁珠吸附细胞前后的分布图可以直观的看到，免疫磁珠去掉的是哪种尺寸的细胞。图6中a图为实施例2、3中的人淋巴细胞分离液提取PBMCs(含淋巴细胞和单核细胞)的分布图，可以看出主要为6～8微米的淋巴细胞峰以及含量较少的单核细胞。b图是裸磁珠(不偶联抗体)吸附后的分布图，可以看出b图与a图相同，说明裸磁珠不能够去除PBMCs细胞。c图和d图分别为市售CD45免疫磁珠和本发明实施例1的CD45免疫磁珠吸附PBMCs后的分布图，可以看出市售CD45免疫磁珠和本发明实施例1的CD45免疫磁珠都可以去掉6～8微米的淋巴细胞峰。图6中e图为KB细胞分布图，KB细胞尺寸分布在11～18微米。f图和g图分别为市售CD45免疫磁珠和本发明实施例1的CD45免疫磁珠吸附KB细胞后的分布图，从f图可以看出市售CD45免疫磁珠吸附KB细胞后，KB细胞的尺寸分布发生偏移，可能是由于市售CD45免疫磁珠尺寸大，对KB细胞产生一定非特异性吸附，对KB细胞造成一定损伤，有碎片存在导致KB细胞的尺寸向左偏移。而本发明的CD45免疫磁珠不对KB细胞造成影响。
如图7所示，通过细胞计数器可以直观的看到不同抗体(CD45、CD15、CD14)免疫磁珠吸附细胞前后的分布图，可以确定不同抗体免疫磁珠去掉的是哪种类型白细胞。a图是人淋巴细胞分离液提取PBMCs的分布图，b图是红细胞裂解液提取总白细胞的分布图，a图的细胞主要包括6～8微米的淋巴细胞以及少数单核细胞。b图的细胞主要包括9微米的粒细胞和6～8微米的淋巴细胞。c图和d图分别为用本发明CD45免疫磁珠分选a图的PBMCs和b图的总白细胞后的细胞分布图，可以看出本发明CD45免疫磁珠主要结合6～8微米的淋巴细胞，不结合9微米处的粒细胞。e图和f图分别为用本发明CD14免疫磁珠分选a图的PBMCs和b图的总白细胞后的细胞分布图，e图可以看出CD14免疫磁珠不结合6～8微米的淋巴细胞，可以去掉少部分单核细胞，f图可以看出CD14免疫磁珠也不结合9微米处的粒细胞。g图和h图分别是CD15免疫磁珠分选a图的PBMCs和b图的总白细胞后的细胞分布图，g图可以看出CD15免疫磁珠分离PBMCs前后峰谱和形状基本一致，不结合6～8微米的淋巴细胞峰和少部分单核细胞，f图可以看出CD15免疫磁珠不结合6～8微米的淋巴细胞峰，但是可以结合9微米处的粒细胞峰。因而可以得出结论，CD45免疫磁珠主要用于去除6～8微米的淋巴细胞，CD14免疫磁珠主要是去除白细胞中的单核细胞，CD15免疫磁珠主要是去除白细胞中的粒细胞。
实施例4癌症病人的CTC细胞捕获
取健康人和不同癌症病人的外周血血液，对血液中的CTC进行捕获。要求受试者血常规白细胞值位于2×106～1.2×107个/mL之间，全血样本未出现溶血或血块凝结。并且受试者相关信息完整，样本采集、保存方法规范，实验操作规范，具体步骤如下：取不同癌症病人血液3ml，先对血液进行红细胞裂解，然后加入本发明实施例1的CD45免疫磁珠、CD14免疫磁珠和CD15免疫磁珠，在4℃下孵育30分钟，然后在1分钟内进行磁分选，去除白细胞。对去除了白细胞的细胞悬液进行抗体染色、并在载玻片上固定、然后进行细胞核DAPI染色、封片后，用荧光显微镜鉴定。荧光显微镜显示白细胞去除效果好，剩余的白细胞量不足2.4×10-3个。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实施例原理以及权利要求的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明实施例的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于捕获白细胞的免疫磁珠，其特征在于：所述用于捕获白细胞的免疫磁珠至少包括CD45免疫磁珠，还可以包括或不包括CD14免疫磁珠和CD15免疫磁珠中的一种或两种，其中，CD45免疫磁珠、CD14免疫磁珠和CD15免疫磁珠为CD45抗体、CD14抗体和CD15抗体分别与磁性微球偶联得到的免疫磁珠；所述CD45免疫磁珠、CD14免疫磁珠和CD15免疫磁珠的结构式为：A-NH-N＝CH-B，其中A表示磁性微球，B表示抗体，或者A表示抗体，B表示磁性微球。
2.根据权利要求1所述用于捕获白细胞的免疫磁珠，其特征在于：所述磁性微球为核壳结构的无机或有机高分子包裹的磁性微球。
3.根据权利要求1所述用于捕获白细胞的免疫磁珠，其特征在于：所述用于捕获白细胞的免疫磁珠的粒径为200～300nm。
4.一种制备权利要求1-3中任一项所述用于捕获白细胞的免疫磁珠的方法，其步骤包括：
s1.磁性纳米簇的制备；
s2.氨基修饰的磁性微球的制备；
s3.肼基修饰的A部分的制备；
s4.醛基修饰的B部分的制备；
s5.免疫磁珠的制备：将步骤s3所述肼基修饰的A部分与步骤s4所述醛基修饰的B部分混合，在4～25℃下进行偶联反应2～24小时，得到所述免疫磁珠。
5.根据权利要求4所述用于捕获白细胞的免疫磁珠的制备方法，其特征在于：所述步骤s3中的肼基修饰的A部分是通过：将氨基修饰的磁性微球或抗体用摩尔当量为10～50倍的SANH进行肼基修饰后得到的。
6.根据权利要求4所述用于捕获白细胞的免疫磁珠的制备方法，其特征在于：所述步骤s4中的醛基修饰的B部分是通过：将氨基修饰的磁性微球或抗体用摩尔当量为5～20倍的SFB进行醛基修饰后得到的。
7.根据权利要求4所述用于捕获白细胞的免疫磁珠的制备方法，其特征在于：所述步骤s1中的磁性纳米簇是通过如下方法制备得到：
1)在空气中，向二价铁盐的水溶液中加入氨水，然后搅拌使溶液变成黑色，得到黑色Fe3O4颗粒；
2)向步骤1)中加入油酸，混合均匀后转移至密闭的反应釜中，在60～130℃下加热反应3～5小时，即可得到所述磁性纳米簇。
8.根据权利要求4所述用于捕获白细胞的免疫磁珠的制备方法，其特征在于：所述步骤s2中的氨基修饰的磁性微球部分为核壳结构的二氧化硅包裹的磁性微球，通过如下方法制备得到：向含有磁性纳米簇的溶液中加入氨水、硅烷化试剂和氨基硅烷偶联剂，反应1～3天后得到氨基修饰的磁性微球部分；所述磁性纳米簇、氨水、硅烷化试剂、氨基硅烷偶联剂加入的质量比为：1:(12.5～40):(2～8):(0.5～3)。
9.根据权利要求4所述用于捕获白细胞的免疫磁珠的制备方法，其特征在于：所述步骤s5中，磁性微球部分和抗体部分的质量比为1： (0.01～1)。
10.一种用于捕获白细胞的的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求1～3中任一项所述的用于捕获白细胞的免疫磁珠，所述用于捕获白细胞的免疫磁珠为CD45免疫磁珠、CD14免疫磁珠和CD15免疫磁珠混合得到。
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Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106841620A (zh) * 2017-03-21 2017-06-13 上海美吉医学检验有限公司 一种基于液体活检的结直肠癌检测的试剂盒
CN106970221A (zh) * 2017-03-21 2017-07-21 上海美吉医学检验有限公司 一种基于液体活检的前列腺癌检测的试剂盒
CN106990080A (zh) * 2017-03-21 2017-07-28 上海美吉医学检验有限公司 一种基于液体活检的非小细胞肺癌检测的试剂盒
CN107435039A (zh) * 2017-06-13 2017-12-05 安徽安龙基因医学检验所有限公司 一种分选白细胞的免疫磁珠的制备方法及储存方法
CN109991410A (zh) * 2017-12-29 2019-07-09 上海白泽医学检验所有限公司 一种含抗cd45单抗的组合物及其使用方法
CN110726838A (zh) * 2019-09-29 2020-01-24 武汉纺织大学 一种基于免疫微球的循环肿瘤细胞明场负向鉴定方法
CN111808811A (zh) * 2020-07-20 2020-10-23 天康生物股份有限公司 复合磁性微粒、去除外周血或骨髓细胞中红细胞的方法及其应用
CN115326683A (zh) * 2022-08-12 2022-11-11 四川成电医联科技咨询有限公司 一种基于阻抗脉冲时延法的磁珠标定的白细胞子分群计数方法
CN115326684A (zh) * 2022-08-12 2022-11-11 四川成电医联科技咨询有限公司 一种基于阻抗法的磁珠标定的白细胞子分数群计数方法
CN116064368A (zh) * 2021-10-29 2023-05-05 京东方科技集团股份有限公司 用于捕获cd138阳性细胞的捕获剂及制备方法、捕获方法
JP7520824B2 (ja) 2019-05-08 2024-07-23 株式会社日立ハイテク 自動分析装置の前処理方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999045094A1 (en) * 1998-03-02 1999-09-10 Compucyte Corp. Selective cell analysis
CN101939645A (zh) * 2007-12-05 2011-01-05 齐翁米克斯股份有限公司 细胞测定套件和方法
CN103100358A (zh) * 2012-12-20 2013-05-15 华南理工大学 一种磁性纳米离子液体复合微粒及其制备方法和应用
CN103159854A (zh) * 2013-03-07 2013-06-19 浙江大学 抗体与微珠连接方法
CN105067808A (zh) * 2015-07-30 2015-11-18 南京医科大学 一种高纯度循环肿瘤细胞的富集方法及试剂盒
CN105301030A (zh) * 2015-10-26 2016-02-03 上海师范大学 一种单增李斯特菌检测试剂和检测方法
CN105675378A (zh) * 2014-11-18 2016-06-15 上海张江转化医学研发中心有限公司 一种简单的分离单个循环肿瘤细胞的方法和装置

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999045094A1 (en) * 1998-03-02 1999-09-10 Compucyte Corp. Selective cell analysis
CN101939645A (zh) * 2007-12-05 2011-01-05 齐翁米克斯股份有限公司 细胞测定套件和方法
CN103100358A (zh) * 2012-12-20 2013-05-15 华南理工大学 一种磁性纳米离子液体复合微粒及其制备方法和应用
CN103159854A (zh) * 2013-03-07 2013-06-19 浙江大学 抗体与微珠连接方法
CN105675378A (zh) * 2014-11-18 2016-06-15 上海张江转化医学研发中心有限公司 一种简单的分离单个循环肿瘤细胞的方法和装置
CN105067808A (zh) * 2015-07-30 2015-11-18 南京医科大学 一种高纯度循环肿瘤细胞的富集方法及试剂盒
CN105301030A (zh) * 2015-10-26 2016-02-03 上海师范大学 一种单增李斯特菌检测试剂和检测方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DANIELLE RUSSELL等: "SureLINKTM Conjugation Chemistry: Phosphatase Conjugates and Their Use in Immunodetection", 《KPL APPLICATION NOTE》 *
王娟: "Fe3O4纳米材料的制备、改性及应用", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技I辑》 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106841620A (zh) * 2017-03-21 2017-06-13 上海美吉医学检验有限公司 一种基于液体活检的结直肠癌检测的试剂盒
CN106970221A (zh) * 2017-03-21 2017-07-21 上海美吉医学检验有限公司 一种基于液体活检的前列腺癌检测的试剂盒
CN106990080A (zh) * 2017-03-21 2017-07-28 上海美吉医学检验有限公司 一种基于液体活检的非小细胞肺癌检测的试剂盒
CN106970221B (zh) * 2017-03-21 2019-01-04 上海美吉医学检验有限公司 一种基于液体活检的前列腺癌检测的试剂盒
CN106841620B (zh) * 2017-03-21 2019-01-04 上海美吉逾华生物医药科技有限公司 一种基于液体活检的结直肠癌检测的试剂盒
CN107435039A (zh) * 2017-06-13 2017-12-05 安徽安龙基因医学检验所有限公司 一种分选白细胞的免疫磁珠的制备方法及储存方法
CN109991410A (zh) * 2017-12-29 2019-07-09 上海白泽医学检验所有限公司 一种含抗cd45单抗的组合物及其使用方法
JP7520824B2 (ja) 2019-05-08 2024-07-23 株式会社日立ハイテク 自動分析装置の前処理方法
CN110726838A (zh) * 2019-09-29 2020-01-24 武汉纺织大学 一种基于免疫微球的循环肿瘤细胞明场负向鉴定方法
CN111808811A (zh) * 2020-07-20 2020-10-23 天康生物股份有限公司 复合磁性微粒、去除外周血或骨髓细胞中红细胞的方法及其应用
CN116064368A (zh) * 2021-10-29 2023-05-05 京东方科技集团股份有限公司 用于捕获cd138阳性细胞的捕获剂及制备方法、捕获方法
CN115326683A (zh) * 2022-08-12 2022-11-11 四川成电医联科技咨询有限公司 一种基于阻抗脉冲时延法的磁珠标定的白细胞子分群计数方法
CN115326684A (zh) * 2022-08-12 2022-11-11 四川成电医联科技咨询有限公司 一种基于阻抗法的磁珠标定的白细胞子分数群计数方法

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