CN106366195B - 一种pd-l1抗体免疫磁珠及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种PD‑L1抗体免疫磁珠及其制备方法，包括磁性微球部分和抗体部分，所述免疫磁珠的结构式为：A‑NH‑N＝CH‑B，其中A表示磁性微球，B表示PD‑L1抗体，或者A表示PD‑L1抗体，B表示磁性微球。将本发明的免疫磁珠用于捕获肿瘤细胞，不仅特异性、敏感性好，而且磁响应迅速、富集时间短，捕获效率高。而且免疫磁珠的性质稳定，同时粒径小，磁响应性好，分散性好。并且制备方法简单，具有很强的实用性。

Description

一种PD-L1抗体免疫磁珠及其制备方法
技术领域
本发明涉及免疫磁珠的制备领域，具体地说是一种PD-L1抗体免疫磁珠及其制备方法。
背景技术
PD-1是55KD的跨膜蛋白，与CD28、ICOS和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)相关抗原4(CTLA-4)同属免疫球蛋白超家族成员。与CD28、CTLA-4的局限性表达(主要在T细胞)不同，PD-1可表达于活化的T细胞、B细胞和骨髓细胞，以及CD4-CD8-胸腺细胞。PD-L1(B7-H1)是PD-1的配体，PD-L1mRNA在非淋巴组织(如胎盘、心、肺和骨骼肌)中含量丰富，但除巨噬样细胞和胎盘滋养层外，PD-L1蛋白在正常组织中几乎检测不到。在APC、T细胞和内皮细胞上经诱导可表达PD-L1，而且多种人类的肿瘤中富含PD-L1。近几年发现，多种肿瘤细胞表面高表达PD-L1，通过与肿瘤浸润淋巴细胞表面的PD-1分子结合，抑制淋巴细胞的功能，是导致肿瘤发生免疫逃逸的重要原因之一。
在例如卵巢癌、肾脏癌、结肠直肠癌、胰脏癌、肝癌和黑色素瘤的大量生物样品中，在不考虑后续治疗情况下，已经证实PD-L1的表达与不良预后和总存活期短有关。并且已经证实阻断PD-L1与PD-1结合的抗PD-L1单克隆抗体具有针对许多肿瘤类型的抗肿瘤活性，其中早期人临床数据表明具有表达PD-L1的肿瘤的患者更可能对抗PD-1治疗起反应。
免疫磁珠分选法(Immunomagnetic separation，IMS)是近年来兴起的一种用于细胞分选的方法，它是在磁珠表面包被具免疫反应性的抗体进行抗原-抗体反应，在细胞表面形成“抗原-抗体-磁珠”免疫复合物。这些结合了磁珠的细胞一旦置于强大的磁场下，就会定向移动，使免疫复合物与其他未被结合的细胞分群。当具超顺磁性的磁珠脱离磁场后，磁性立即消失，从而达到阳性或阴性选择特定细胞的目的。
将免疫磁珠分选法应用于肿瘤细胞的分选是本领域近年来兴起的技术。但是利用免疫磁珠分选法从血液复杂的环境中分选出肿瘤细胞，需要免疫磁珠具有特异性的生物标志物，而且稳定性、分散性好，不能团聚。同时，免疫磁珠的粒径不能过大，过大会压迫肿瘤细胞；免疫磁珠的粒径也不能过小，粒径过小磁响应性也小，容易无法达到肿瘤细胞分选的效果。
发明内容
本发明的主要目的是针对现有技术存在的不足提供一种PD-L1抗体免疫磁珠及其制备方法，本发明的PD-L1抗体免疫磁珠粒径小，磁响应性好，用于进行肿瘤细胞捕获，不仅捕获效率高，富集时间短，捕获得到的肿瘤细胞可以进行进一步的分析，而且免疫磁珠的制备过程简单，成本低。
在本发明的一方面，本发明是通过如下技术方案实现的：一种PD-L1抗体免疫磁珠，包括磁性微球部分和抗体部分，所述免疫磁珠的结构式为：A-NH-N＝CH-B，其中A表示磁性微球，B表示PD-L1抗体，或者A表示PD-L1抗体，B表示磁性微球。
优选的，所述磁性微球为核壳结构的无机或有机高分子包裹的磁性微球。比如二氧化硅包裹的磁性四氧化三铁、或者葡聚糖包裹的磁性四氧化三铁等。最优选的，所述磁性微球部分为二氧化硅包裹的磁性四氧化三铁。
优选的，所述PD-L1抗体免疫磁珠的粒径为200～300nm。
在本发明的第二方面，提供了一种制备上述PD-L1抗体免疫磁珠的方法，其步骤包括：
s1.磁性纳米簇的制备；
s2.氨基修饰的磁性微球的制备；
s3.肼基修饰的A部分的制备；
s4.醛基修饰的B部分的制备；
s5.免疫磁珠的制备：将步骤s3所述肼基修饰的A部分与步骤s4所述醛基修饰的B部分混合，在4～25℃下进行偶联反应2～24小时，得到所述免疫磁珠。
在本发明的一种实施方式中，对氨基修饰的磁性微球进行醛基修饰，并且对PD-L1抗体进行肼基修饰。或者对氨基修饰的磁性微球进行肼基修饰，并且对PD-L1抗体进行醛基修饰，均可以实现上述结构的免疫磁珠。
进一步的，所述步骤s3中的肼基修饰的A部分是通过：将氨基修饰的磁性微球或PD-L1抗体用摩尔当量为10～50倍的SANH进行肼基修饰后得到的。最优选的，SANH的摩尔当量为氨基修饰的磁性微球或PD-L1抗体的25倍。所述SANH为对-丙腙基吡啶甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(CAS：362522-50-7)，在室温条件下可以温和的将氨基转换为肼基。所述SANH一般溶解在DMF溶液中进行反应，浓度可以根据磁性微球或PD-L1抗体的浓度进行调整，不影响反应结果。该反应过程可以在15～25℃室温条件下进行，反应时间根据本领域技术人员常规的检测技术判断，本发明一般采用对磁性微球的修饰反应时间16～24h，对PD-L1抗体的修饰反应时间2～4h。
进一步的，所述步骤s4中的醛基修饰的B部分是通过：将氨基修饰的磁性微球或PD-L1抗体用摩尔当量为5～20倍的SFB进行醛基修饰后得到的。最优选的，SFB的摩尔当量为氨基修饰的磁性微球或PD-L1抗体的10倍。所述SFB为4-甲酰苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯(CAS：60444-78-2)，在室温条件下可以温和的将氨基转换为醛基。所述SFB一般溶解在DMF溶液中进行反应，浓度可以根据磁性微球或PD-L1抗体的浓度进行调整，不影响反应结果。该反应过程可以在15～25℃室温条件下进行，反应时间根据本领域技术人员常规的检测技术判断，本发明一般采用对磁性微球的修饰反应时间16～24h，对PD-L1抗体的修饰反应时间2～4h。
所述步骤s1中的磁性纳米簇是通过水热法、溶剂热法或共沉淀法制备得到，也可以采用市售商品。制备磁性纳米簇的方法为本领域技术人员所熟知的技术，得到的产品只需要满足具有良好的磁性，并且可以与无机或有机高分子形成核壳结构即可。
作为优选的，所述步骤s1中的磁性纳米簇是通过如下方法制备得到：
1)在空气中，向二价铁盐的水溶液中加入氨水，然后搅拌使溶液变成黑色，得到黑色Fe3O4颗粒；
2)向步骤1)中加入油酸，混合均匀后转移至密闭的反应釜中，在60～130℃下加热反应3～5小时，即可得到所述磁性纳米簇。
进一步的，所述步骤s2中的氨基修饰的磁性微球为核壳结构的二氧化硅包裹的磁性微球，效果更加优于直接在磁性纳米簇粒子表面进行氨基修饰得到的磁性微球，可以采用市售商品或者按照本领域技术人员所知的常规方法制备，均不影响本发明的结果。可以使纳米簇聚集在二氧化硅内部，形成核壳结构，增大粒径，并且增加磁性和稳定性即可。优选的，本发明采用如下方法制备氨基修饰的二氧化硅包裹的磁性微球：向含有磁性纳米簇的溶液中加入氨水、硅烷化试剂和氨基硅烷偶联剂，反应1～3天后得到氨基修饰的磁性微球部分；所述磁性纳米簇、氨水、硅烷化试剂、氨基硅烷偶联剂加入量的质量比为：1:(12.5～40):(2～8):(0.5～3)。其中氨水的质量百分浓度为25～28％。其中，硅烷化试剂可以为正硅酸四乙酯(CAS：562-90-3)，氨基硅烷偶联剂可以为(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(CAS：919-30-2)。本领域技术人员在选择其他的硅烷化试剂与氨基硅烷偶联剂时，可以对反应原料的比例进行调整，均不超出本发明的保护范围。
优选的，所述步骤s5中，磁性微球和PD-L1抗体的质量比为1：(0.01～1)。PD-L1抗体与磁性微球的质量比越高越有利于磁性微球表面偶联PD-L1抗体，但是考虑到PD-L1抗体的成本因素，本发明采用磁性微球部分和PD-L1抗体部分的质量比为1：(0.01～0.2)。
在本发明的第三方面，提供了一种用于捕获肿瘤细胞的试剂盒，所述试剂盒中含有上述的PD-L1抗体免疫磁珠。所述肿瘤细胞为表面表达PD-L1配体的肿瘤细胞，例如非小细胞肺癌肿瘤细胞或黑色素瘤肿瘤细胞等。
本发明的有益效果为：
(1)将本发明的免疫磁珠用于捕获肿瘤细胞，不仅特异性、敏感性好，而且磁响应迅速、富集时间短，捕获效率高。避免了捕获的肿瘤细胞损伤，肿瘤细胞可以用于进一步的分析和培养。可以用于外泌体、体液或活检组织的肿瘤细胞捕获与分析。
(2)本发明的免疫磁珠，其磁性微球和PD-L1抗体通过腙键结构相连，得到的免疫磁珠在弱碱性条件下(血液中)性质稳定，同时粒径小、磁响应性好、分散性好、不易团聚。
(3)本发明的制备方法简单，反应条件温和，氨基、醛基和肼基修饰的过程均可以在室温下进行，不容易造成PD-L1抗体的变质、降解等，同时避免了使用还原剂，使抗体可以在低温下与细胞孵育，保持抗体和细胞的活性。
(4)本发明原料简单易得，成本低，工艺步骤简单，具有很强的实用性。
附图说明
图1为本发明PD-L1抗体免疫磁珠分选的肿瘤细胞免疫荧光图。
具体实施方式
以下通过具体实施例来进一步说明本发明：下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1PD-L1抗体免疫磁珠的制备
(1)磁性纳米簇的制备：
a.在空气中，将7g FeCl2·4H2O加入到50mL去离子水中，得到浓度为0.14g/mL的FeCl2水溶液。向50mL FeCl2水溶液中加入氨水30mL，搅拌20min后，颜色逐渐变为浅绿色，再变深绿色，最后变为黑色；
b.向步骤a中加入1.1g油酸，混合均匀后将混合液置于密闭的反应釜中，在110℃下加热反应4小时，然后用去离子水和乙醇交替洗涤各一次，磁分离后分散在正己烷中，即可得到黑色的磁性纳米簇Fe3O4 1。
(2)氨基修饰的磁性微球的制备：向10mg磁性纳米簇Fe3O4 1的溶液中加入125mg氨水、30mg正硅酸四乙酯和30mg(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷，反应1天后进行磁分离，并且用乙醇和水交替洗涤各两次，并用0.1M的pH 7～8的磷酸缓冲液分散后得到浓度为5mmol/L的氨基修饰的磁性微球1。
(3)肼基修饰的PD-L1抗体的制备：将5μL SANH的DMF溶液(浓度为5mmol/L)加入到100μL PD-L1抗体溶液(浓度为10μmol/L)中，在室温反应2h后，用超滤柱纯化得到肼基修饰的PD-L1抗体(简写为PD-L1-SANH)1。
检测PD-L1-SANH的浓度：通过BCA法计算修饰后的PD-L1-SANH的浓度为0.70mg/mL。
检测肼基修饰率：用定量的2-甲酰苯磺酰钠盐溶液检测肼基修饰率。取纯化后的PD-L1-SANH加入到的2-甲酰苯磺酰钠盐溶液中，涡旋混匀后于37℃反应1h，Nanodrop检测348nm处的吸光值为0.16。通过348nm处的吸光值和PD-L1-SANH的浓度计算出PD-L1-SANH的肼基修饰率为3.2。
(4)醛基修饰的磁性微球的制备：将5μL的氨基修饰的磁性微球1加入到SFB的DMF溶液(浓度为5mmol/L)50μL中，在室温反应20h后，进行磁分离纯化，得到醛基修饰的磁性微球1。
(5)免疫磁珠的制备：将1mg步骤(4)中的醛基修饰的磁性微球与0.01mg步骤(3)中的肼基修饰的PD-L1抗体混合，在25℃下pH值为6.0的PBS缓冲液中混合2小时后，进行磁分离得到PD-L1抗体偶联磁性微球的PD-L1抗体免疫磁珠。计算得到每毫克PD-L1抗体免疫磁珠1上，包被抗体率为85％(消耗的抗体量与加入的抗体总量的比例)。
实施例2PD-L1抗体免疫磁珠的敏感性检测
采集健康志愿者血样，通过人淋巴细胞分离液进行PBMCs提取，然后将人非小细胞肺癌细胞H1299(来源中国科学院细胞库购买)悬液按比例加入到PBMCs中，使PBMCs与H1299的比例分别为103:1、104:1、105:1、106:1。然后将实施例1的免疫磁珠依次加入到上述各混合细胞悬液中，在4℃下孵育30分钟。在1分钟内进行磁分选并用PBS洗涤2-3次，得到用免疫磁珠捕获并回收的H1299细胞。并且磁分选在1分钟内完成，说明免疫磁珠的磁响应性好。
重复各浓度下的实验，结果表明，所有浓度下都可以检测到H1299细胞，说明PD-L1抗体免疫磁珠的敏感性好。
实施例3模拟血液中肿瘤细胞的捕获
采集健康志愿者血样，将H1299细胞与健康人的外周血混合，配成混合细胞悬液，调节H1299细胞的浓度为1、10、20、50、500、1000个/mL，然后将免疫磁珠依次加入到上述各混合细胞悬液中，在4℃下孵育30分钟。在1分钟内进行磁分选并用PBS洗涤2-3次，得到用免疫磁珠捕获并回收的H1299细胞。统计回收的H1299细胞，在H1299细胞的浓度为1个/mL时仍然可以捕获到H1299细胞。
从实施例2-3的捕获结果来看，免疫磁珠在单纯环境中(实施例2)的捕获效率能够精确到1：106，免疫磁珠在复杂环境中(实施例3)也可以检测到1个/mL的H1299细胞，敏感性可以满足目前液体活检的要求。
对上述孵育后的磁珠用无钙镁的PBS缓冲液重悬，将洗脱得到的磁珠-细胞用PicoPure RNA Isolation Kit试剂盒(Thermo Cat No：KIT0214)提取纯化总RNA，采用了PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TAKARA,Cat No：RR047A)，按说明书要求去除基因组DNA以及进行cDNA链合成。接下来涉及相应Taqman引物，进行qPCR检测，以GAPDH为内标比较qPCR检测结果，在相同条件下，与H1299细胞的qPCR检测结果一致。说明用本发明的免疫磁珠捕获肿瘤细胞不会损伤细胞，可以用于后续细胞分析。并且说明，用本发明的免疫磁珠捕获到的细胞基本没有PBMCs细胞，PBMCs细胞则基本不与PD-L1抗体免疫磁珠结合。
实施例4癌症病人的非小细胞肺癌肿瘤细胞捕获
取健康人和不同非小细胞肺癌癌症病人的外周血血液，对血液中的肿瘤细胞进行捕获。要求受试者血常规白细胞值位于2×106～1.2×107个/mL之间，全血样本未出现溶血或血块凝结。并且受试者相关信息完整，样本采集、保存方法规范，实验操作规范，具体步骤如下：取不同癌症病人血液3ml，加入PD-L1抗体免疫磁珠依次加入到上述各混合细胞悬液中，在4℃下孵育30分钟，然后在1分钟内进行磁分选并用PBS洗涤2-3次，将孵育回收的肿瘤细胞进行抗体染色、并在载玻片上固定、然后进行细胞核DAPI染色、封片后，用荧光显微镜鉴定，结果如图1所示，细胞膜表面显示有荧光，在荧光显微镜下为绿光荧光，说明捕获到的细胞表面呈PD-L1阳性，说明为肿瘤细胞。而正常人的血液中没有捕获到肿瘤细胞。
如果先对血液进行红细胞裂解，并且用CD45抗体免疫磁珠去除血液中的白细胞后再用PD-L1抗体免疫磁珠进行肿瘤细胞的捕获，捕获效率更高。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实施例原理以及权利要求的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明实施例的保护范围。

Claims (8)

1.一种PD-L1抗体免疫磁珠，包括磁性微球部分和抗体部分，其特征在于：所述免疫磁珠的结构式为：A-NH-N＝CH-B，其中A表示磁性微球，B表示PD-L1抗体，或者A表示PD-L1抗体，B表示磁性微球；
所述PD-L1抗体免疫磁珠通过如下步骤制备获得：
s1.磁性纳米簇的制备；
s2.氨基修饰的磁性微球的制备；
s3.肼基修饰的A部分的制备；
s4.醛基修饰的B部分的制备；
s5.免疫磁珠的制备：将步骤s3所述肼基修饰的A部分与步骤s4所述醛基修饰的B部分混合，在4～25℃下进行偶联反应2～24小时，得到所述免疫磁珠；
所述步骤s1中的磁性纳米簇是通过如下方法制备得到：
a.在空气中，将7g FeCl2·4H2O加入到50mL去离子水中，得到浓度为0.14g/mL的FeCl2水溶液；向50mL FeCl2水溶液中加入氨水30mL，搅拌45min后，颜色逐渐变为浅绿色，再变深绿色，最后变为黑色；
b.向步骤a中加入1.1g油酸，混合均匀后将混合液置于密闭的反应釜中，在110℃下加热反应4小时，然后用去离子水和乙醇交替洗涤各一次，磁分离后分散在正己烷中，即可得到黑色的磁性纳米簇Fe3O4。
2.根据权利要求1所述的PD-L1抗体免疫磁珠，其特征在于：所述磁性微球部分为核壳结构的无机或有机高分子包裹的磁性微球。
3.根据权利要求2所述的PD-L1抗体免疫磁珠，其特征在于：所述PD-L1抗体免疫磁珠的粒径为200～300nm。
4.一种制备权利要求1-3中任一项所述PD-L1抗体免疫磁珠的方法，其步骤包括：
s1.磁性纳米簇的制备；
s2.氨基修饰的磁性微球的制备；
s3.肼基修饰的A部分的制备；
s4.醛基修饰的B部分的制备；
s5.免疫磁珠的制备：将步骤s3所述肼基修饰的A部分与步骤s4所述醛基修饰的B部分混合，在4～25℃下进行偶联反应2～24小时，得到所述免疫磁珠；
所述步骤s1中的磁性纳米簇是通过如下方法制备得到：
a.在空气中，将7g FeCl2·4H2O加入到50mL去离子水中，得到浓度为0.14g/mL的FeCl2水溶液；向50mL FeCl2水溶液中加入氨水30mL，搅拌45min后，颜色逐渐变为浅绿色，再变深绿色，最后变为黑色；
b.向步骤a中加入1.1g油酸，混合均匀后将混合液置于密闭的反应釜中，在110℃下加热反应4小时，然后用去离子水和乙醇交替洗涤各一次，磁分离后分散在正己烷中，即可得到黑色的磁性纳米簇Fe3O4。
5.根据权利要求4所述PD-L1抗体免疫磁珠的制备方法，其特征在于：所述步骤s3中的肼基修饰的A部分是通过：将氨基修饰的磁性微球或PD-L1抗体用摩尔当量为10～50倍的SANH进行肼基修饰后得到的。
6.根据权利要求4所述PD-L1抗体免疫磁珠的制备方法，其特征在于：所述步骤s4中的醛基修饰的B部分是通过：将氨基修饰的磁性微球或PD-L1抗体用摩尔当量为5～20倍的SFB进行醛基修饰后得到的。
7.根据权利要求4所述PD-L1抗体免疫磁珠的制备方法，其特征在于：所述步骤s2中的氨基修饰的磁性微球部分为核壳结构的二氧化硅包裹的磁性微球，通过如下方法制备得到：向含有磁性纳米簇的溶液中加入氨水、硅烷化试剂和氨基硅烷偶联剂，反应1～3天后得到氨基修饰的磁性微球部分；所述磁性纳米簇、氨水、硅烷化试剂、氨基硅烷偶联剂加入的质量比为：1:(12.5～40):(2～8):(0.5～3)。
8.一种用于捕获肿瘤细胞的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求1所述的PD-L1抗体免疫磁珠。
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