CN114544941A - 一种pdl1的适配体功能化sers探针的制备方法及其应用 - Google Patents

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刘超
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Abstract

本发明涉及生物传感及其材料制备技术领域，具体来说是一种PDL1的适配体功能化SERS探针的制备方法及其应用，包括用Au/TiO2/Fe3O4纳米球制备适配体修饰CD63探针、用Ag/4‑ATP/Au SERS标签制备适配体修饰PDL1探针，以及将该探针以“三明治夹心”的方法在SERS特异性检测PDL1中的应用。本申请通过同时使用SERS和ELISA测试探测外泌体PDL1，证明其测量PDL1在动物体内表达时间依赖性变化；且原始血清样本分析结果显示，SERS方法探测循环外泌体PDL1的诊断灵敏度可达98％，表明本申请的SERS方法具有卓越灵敏度和准确度。采用本发明适配体探针结合SERS夹心法量化血清中PDL1生物标志物，具有特异性强、灵敏度高、选择性好等优点，且操作简单、方便、快捷，在基于PDL1/PD1的免疫疗法的监测中具有良好的应用前景。

Description

一种PDL1的适配体功能化SERS探针的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物传感及其材料制备技术领域，具体来说是一种PDL1的适配体功能化SERS探针的制备方法及其应用。
背景技术
恶性细胞通过包括释放细胞因子，如肿瘤生长因子(TGF-β)或白细胞介素10(IL-10)，或者改变肿瘤相关巨噬细胞和细胞表面标志物的不同表达等多种途径绕过免疫系统观察，这会通过刺激有利于癌症转移的免疫抑制状态来破坏与恶性细胞的平衡。癌细胞会进一步吸收调节性T细胞(通常称为Treg)，这有助于下调肿瘤抗原表达，并促进细胞凋亡。这会导致免疫抑制检查点(即PDL1、CTLA-4、VISTA和B7-H4)激活，这些检查点与T细胞中的共抑制受体结合从而限制免疫反应系统。这些机制综合结果导致肿瘤微环境的形成，也是导致癌症相关疫苗缺乏有效诊断和治疗效率的一个重要原因。
程序性细胞死亡配体1(PDL1)及其首要的靶点PD-1是两个关键的免疫检查点，它们结合在一起以促进肿瘤生长和转移。事实上，多种证据表明，癌细胞会分泌小尺寸的囊泡(10-100nm)，通常称其为外泌体，它有更高的PDL1表达，可以与T细胞上的PD-1相互作用以终止其抗肿瘤反应。这些外泌体富含肿瘤外PDL1和其他细胞粘附生物标志物，如整联蛋白(CD63、CD81、CD82)，是导致抗PD-1/PDL1免疫治疗的机制之一。还有报道称，患者外周血中癌症分泌的外泌体中存在高水平的PDL1表达也与疾病分期相关，这表明外泌体可能是癌症的潜在来源。因此，外泌体PDL1分析已成为与开发有效和敏感的诊断工具相关的主要课题。以前，已经使用了广泛的分析工具，例如质谱法、流式细胞术和组织化学方法，但是这些方法操作繁琐、耗时费力。所以，还亟需其它测试方法，以对实际情况进行快速、现场和定量监测。目前，在临床水平对PDL1表达快速检测仍具有挑战性。
据调研，公告号为CN 109387499 B的中国专利公开了一种将石墨烯金属氧化物复合材料PDL1探针及其制备方法，其使用SERS作为替代工具，通过基于目标特异性适体-纳米粒子的探针的能力提供具有更高结合精度和目标识别的高灵敏度，用于PDL1的定量检测。但该方法在检测时，需要对细胞进行离心处理，而且也无法用于采血样品直接测量。本申请采用“三明治夹心”的方法，通过对SERS基底进行适配体修饰，开发了功能化探针以特异性地靶向血清中的循环外泌体的PDL1，检测时，利用外磁场作用实现在血液中直接测量，且利用标签信号实现了PDL1的定量检测，与传统抗体相比具有优越的特性，例如对靶标的亲和力强(检测特异性好)、稳定性好、体积小、易于合成、降低生产成本等。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于如何提供一种适配体修饰的磁性复合材料SERS基底，以“三明治夹心”方法将其用于表面增强拉曼光谱特异性定量检测血液中PDL1，具有测量简单、特异性强、灵敏度高、选择性好等优点。
本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：
本发明一方面公开了一种PDL1的适配体功能化SERS探针的制备方法，包括以下步骤：
S1、制备CD63探针
S1-1、磁性复合材料Au/TiO2/Fe3O4的制备
a.制备Fe3O4纳米球：在磁力搅拌下，将FeCl3·6H2O、柠檬酸三钠和NaAc(醋酸钠)完全溶解在乙二醇中，然后将上述混合物转移到高压釜中加热，对得到的黑色产物进行洗涤、密封干燥，得到Fe3O4纳米球；
b.修饰Fe3O4纳米球：将干燥的Fe3O4纳米球和氨水溶解在乙醇中，加热并搅拌上述混合物，同时将稀释在乙醇中的TBOT(钛酸四丁酯)滴加到混合物中，待混合物降至室温，继续搅拌20-28小时；
对搅拌产物进行洗涤、干燥，在超声水浴下将干燥产物溶解在乙醇中，然后添加APTMS(3-氨基丙基-三甲氧基硅烷)并再次超声处理；将上述混合溶液加热回流，并对回流产物进行洗涤，再分散在乙醇中得到修饰Fe3O4纳米球；
c.制备Au/TiO2/Fe3O4纳米球：调节修饰Fe3O4纳米球的pH至4.5-5.5，搅拌的同时将经过APTMS稳定的TiO2/Fe3O4纳米球添加到Au纳米颗粒中，并继续搅拌15-25分钟；使用外磁场分离，对获得的产物进行洗涤并溶解在水中，得到Au/TiO2/Fe3O4纳米球；
S1-2、适配体修饰CD63探针
将硫醇化的CD63适配体溶解在无核酸酶的水中，并在93-98℃的水浴中加热10-15分钟，随后立即浸入冰水浴中25-35分钟；再将TCEP(三(2-羧乙基)膦)溶解到上述CD63适配体溶液中，使CD63适配体脱盐；然后将混合物在室温下孵育1.5-2.5小时，并用无核酸酶的水洗涤；
将等体积的脱盐CD63适配体溶液与Au/TiO2/Fe3O4纳米球混合，并在3.5-4.5℃下孵育8-10小时；使用外部磁场分离，将收集产物用无核酸酶水洗涤，并与MCH(平均红细胞血红蛋白量)再次在3.5-4.5℃下孵育1.5-2.5小时，最后对孵育产物再次洗涤得到适配体修饰CD63探针，并在3.5-4.5℃温度下储存；
S2、制备PDL1探针
S2-1、Ag/4-ATP/Au SERS标签的制备
配制0.01-0.02mol/L的4-ATP水溶液，并在3.5-4.5℃下储存4-5小时；
将4-ATP添加到Au纳米颗粒中，并对混合物进行磁力搅拌，而后将混合溶液在3.5-4.5℃下孵育4-5小时并用去离子水洗涤；
然后将抗坏血酸添加到4-ATP功能化的Au纳米球中，逐滴添加AgNO3，当溶液颜色从红色变为浅橙色时，停止搅拌并用去离子水洗涤产物，得到Ag/4-ATP/Au SERS标签。
S2-2、适配体修饰的PDL1探针
将硫醇化的PDL1适配体溶液溶解在无核酸酶的水中，并在90-100℃的水浴中加热10-15分钟，随后立即浸入冰水浴中25-30分钟；再将TCEP(三(2-羧乙基)膦)溶解到上述PDL1适配体溶液中，使PDL1适配体脱盐；然后将混合物在室温下孵育1.5-2.5小时，并用无核酸酶的水洗涤；
将等体积的脱盐PDL1适配体溶液与Ag/4-ATP/Au SERS标签混合，并在3.5-4.5℃下孵育8-10小时；对孵育产物进行离心，并用无核酸酶水洗涤；然后将洗涤后的溶液与MCH(平均红细胞血红蛋白量)在3.5-4.5℃下混合1.5-2.5小时，同时进行离心；最后对孵育产物再次洗涤，得到适配体修饰PDL1探针，并在3.5-4.5℃温度下储存。
有益效果：本申请通过制备磁性复合材料Au/TiO2/Fe3O4对CD63适配体进行修饰，并制备CD63探针；通过制备Ag/4-ATP/Au SERS标签对PDL1适配体进行修饰，并制备PDL1探针，从而得到适配体修饰的磁性复合材料SERS基底；检测时，利用外磁场作用形成“三明治夹心”，利用标签信号实现PDL1的定量检测，实现在血液中直接测量，具有测量简单、特异性强、灵敏度高、选择性好等优点。
优选地，所述步骤S1-1的a中FeCl3·6H2O、柠檬酸三钠和NaAc的质量比为1：0.4-0.45：1.8-2.2；
优选地，所述步骤S1-1的a中混合物在高压釜中的加热温度为180-200℃，加热时间为8-10小时。
优选地，所述步骤S1-1的a中黑色产物采用去离子水和乙醇洗涤3次。
优选地，所述步骤S1-1的a中密封干燥时间为10-12小时。
优选地，所述步骤S1-1的b中Fe3O4纳米球和氨水的质量比为1：1-1.2；氨水的质量浓度为25-30w％。
优选地，所述步骤S1-1的b中搅拌温度为40-50℃、速度为500-700rpm、时间为10-20分钟。
优选地，所述步骤S1-1的b中TBOT与乙醇的体积比为1：10-15。
优选地，所述步骤S1-1的b中搅拌产物采用去离子水和乙醇洗涤3次，干燥时间为10-15小时。
优选地，所述步骤S1-1的b中超声水浴时间为10-20分钟，APTMS与乙醇的体积比为1：150-250。
优选地，所述步骤S1-1的b中回流温度为80-90℃、时间为3-5小时。
优选地，所述步骤S1-1的c中使用HCl调节pH。
优选地，所述步骤S1-1的c中TiO2/Fe3O4纳米球与Au纳米颗粒的体积比为1：80-120。
优选地，所述步骤S1-2中CD63适配体溶解在无核酸酶的水中后的溶液浓度为10- 4mol/L。
优选地，所述步骤S1-2中TCEP的浓度为300-500μmol/L；TCEP与CD63适配体溶液的体积比为1：8-12。
优选地，所述步骤S1-2中MCH的浓度为10-7mol/L。
优选地，所述步骤S2-1中4-ATP与Au纳米颗粒的体积比为1:800-1000。
优选地，所述步骤S2-1中磁力搅拌是时间为3-7分钟。
优选地，所述步骤S2-1中抗坏血酸的浓度为0.08-0.12mol/L，抗坏血酸与4-ATP功能化的Au纳米球的体积比为1:3-8。
优选地，所述步骤S2-1中滴加AgNO3的浓度为0.8-1.2mmol/L，AgNO3与4-ATP功能化的Au纳米球的体积体积比为1:1-8。
优选地，所述步骤S2-2中PDL1适配体溶解在无核酸酶的水中后的溶液浓度为10- 4mol/L。
优选地，所述步骤S2-2中TCEP的浓度为300-500μmol/L；TCEP与PDL1适配体溶液的体积比为1：10。
优选地，所述步骤S2-2中MCH的浓度为10-7mol/L。
优选地，所述步骤S2-2中孵育产物的离心速度为1200-1700rpm，离心时间为3-7分钟。
本发明另一方面公开了一种PDL1的适配体功能化SERS探针的应用，包括以下步骤：
S1、将等体积的外泌体和CD63探针混合，并将混合物在室温下孵育，使CD63适配体和外泌体CD63蛋白之间发生免疫反应，然后进行外泌体的SERS分析；
S2、向上述混合液中引入与CD63探针等体积的PDL1探针，并将混合物在室温下孵育，使用外部磁场进行分离，得到“CD63探针-SERS-PDL1探针”三明治组合物；
S3、将上述组合物用水冲洗，应用激光产生4-ATP报告分子的强拉曼信号，以此实现靶向CD63探针结合的外泌体上PDL1含量的定量测量。
优选地，所述步骤S1、S2中的孵育时间均为35-45分钟。
优选地，所述步骤S3中4-ATP在1080cm-1处的信号峰用于校准PDL1并进行量化。
进一步方案，一种PDL1的适配体功能化SERS探针用于检测小鼠MC38(结肠癌细胞)刺激小鼠中的PDL1表达。
本发明的优点在于：
1、本发明通过同时使用SERS和ELISA测试探测外泌体PDL1，证明这种三明治-SERS方法的可靠性。另外，应用此方法，可以对原始血清样本进行直接测量与分析，结果显示，SERS方法探测循环外泌体PDL1的诊断灵敏度可达98％，表明本申请的SERS方法具有卓越灵敏度。
2、本发明的适配体经修饰后具有特异性，采用本发明适配体探针结合SERS夹心法量化血清中PDL1生物标志物时，只对血液中外泌体PDL1具有选择性检测，具有特异性强、灵敏度高、选择性好等优点。
3、本发明检测时利用外磁场作用实现在血液中直接测量，无需对细胞进行离心处理，简单方便，在基于PDL1/PD1的免疫疗法的监测中具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本申请实施例1的实验示意图。
图2为本申请实施例1中Au/TiO2/Fe3O4复合材料的TEM表征图。
图3为本申请实施例1中Ag/4-ATP/Au SERS标签的TEM表征图。
图4为本申请实施例4的实验示意图。
图5为本申请实施例4的实验过程示意及结果。
图6为本申请实施例5的实验过程示意及结果。
图7为本申请实施例5中原始血清样品中外泌体PDL1的定量化。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
实施例1
如图1所示，本申请实施例公开一种PDL1的适配体功能化SERS探针的制备方法，包括以下步骤：
S1、制备CD63探针
S1-1、磁性复合材料Au/TiO2/Fe3O4的制备
a.制备Fe3O4纳米球：在磁力搅拌下，将1.0g FeCl3·6H2O、0.43g柠檬酸三钠和2gNaAc(醋酸钠)完全溶解在33.3mL的乙二醇中，然后将上述混合物转移到衬有聚四氟乙烯的高压釜中，在200℃下加热10小时，对得到的黑色产物用去离子水和乙醇洗涤3次，在密封玻璃瓶中干燥12h，得到Fe3O4纳米球。
b.修饰Fe3O4纳米球：将0.075g干燥的Fe3O4纳米球和0.3mL质量浓度为28％的氨水溶解在90％的乙醇中，将上述混合物加热至45℃，并以600rpm连续机械搅拌15分钟；同时，在连续机械搅拌下，将用10mL乙醇稀释的0.75mL TBOT(钛酸四丁酯)滴加到混合物中，待混合物降至室温，在室温下保持机械搅拌24小时。
对搅拌产物用去离子水和乙醇洗涤3次，在空气中干燥12小时，再在超声水浴下将干燥产物溶解在50mL的乙醇中15分钟；然后添加0.25mL APTMS(3-氨基丙基-三甲氧基硅烷)，并将混合物再次超声处理15分钟；将上述混合溶液在85℃下回流4小时，并对回流产物进行洗涤，再分散在50mL乙醇中，得到修饰Fe3O4纳米球。
c.制备Au/TiO2/Fe3O4纳米球：使用0.01mol/L的HCl调节修饰Fe3O4纳米球的pH至5.0，在机械搅拌下，将0.5mL经过APTMS稳定的TiO2/Fe3O4纳米球添加到50mL的Au纳米颗粒中，并继续搅拌20分钟；使用外磁场分离，对获得的产物洗涤3次，并进行TEM表征分析，表征结果如图2所示，可以看出，制备产物为Au/TiO2/Fe3O4纳米球。将制备的Au/TiO2/Fe3O4纳米球溶解在0.5mL水中，储存备用。
S1-2、适配体修饰CD63探针
将硫醇化的CD63适配体溶解在无核酸酶的水中，得到浓度为10-4mol/L的溶液；并将上述溶液在95℃的水浴中加热13分钟，随后立即浸入冰水浴中30分钟；再按照体积比为1：10的比例，将400μmol/L的TCEP(三(2-羧乙基)膦)溶解到上述CD63适配体溶液中，使CD63适配体脱盐；然后将混合物在室温下孵育2小时，并用无核酸酶的水洗涤。
将等体积的脱盐CD63适配体溶液与Au/TiO2/Fe3O4纳米球混合，并在4℃下孵育10小时；使用外部磁场分离，将收集产物用无核酸酶水洗涤，并与10μL浓度为10-7mol/L的MCH(平均红细胞血红蛋白量)再次在4℃下孵育2小时，最后对孵育产物再次洗涤，得到适配体修饰CD63探针，并在4℃温度下储存.
S2、制备PDL1探针
S2-1、Ag/4-ATP/Au SERS标签的制备
配制0.01mol/L的4-ATP水溶液，并在4℃下储存4-5小时。
将2.5μL的4-ATP添加到2mL的Au纳米颗粒中，并对混合物进行磁力搅拌5分钟；而后将混合溶液在4℃下孵育5小时并用去离子水洗涤。
然后将0.4mL浓度为0.1mol/L的抗坏血酸添加到4-ATP功能化的Au纳米球中，逐滴添加2.4mL浓度为1mol/L的AgNO3，当溶液颜色从红色变为浅橙色时，停止搅拌并用去离子水洗涤产物。对洗涤产物进行TEM表征分析，表征结果如图3所示，可以看出，制备产物为Ag/4-ATP/Au SERS标签。
S2-2、适配体修饰的PDL1探针
将硫醇化的PDL1适配体溶液溶解在无核酸酶的水中，得到浓度为10-4mol/L的溶液；将上述溶液在95℃的水浴中加热13分钟，随后立即浸入冰水浴中30分钟；再按照体积比为1：10的比例，将400μmol/L的TCEP(三(2-羧乙基)膦)溶解到上述PDL1适配体溶液中，使PDL1适配体脱盐；然后将混合物在室温下孵育2小时，并用无核酸酶的水洗涤；
将等体积的脱盐PDL1适配体溶液与Ag/4-ATP/Au SERS标签混合，并在4℃下孵育10小时；以1500rpm的转速对孵育产物离心5分钟，并用无核酸酶水洗涤；然后将洗涤后的溶液与与10μL浓度为10-7mol/L的MCH(平均红细胞血红蛋白量)在4℃下混合2小时，同时进行离心使分子充分结合；最后对孵育产物再次洗涤，得到适配体修饰PDL1探针，并在4℃温度下储存。
实施例2
如图1所示，本申请实施例公开一种PDL1的适配体功能化SERS探针的制备方法，包括以下步骤：
S1、制备CD63探针
S1-1、磁性复合材料Au/TiO2/Fe3O4的制备
a.制备Fe3O4纳米球：在磁力搅拌下，将1.0g FeCl3·6H2O、0.4g柠檬酸三钠和1.8gNaAc(醋酸钠)完全溶解在33.3mL的乙二醇中，然后将上述混合物转移到衬有聚四氟乙烯的高压釜中，在180℃下加热9小时，对得到的黑色产物用去离子水和乙醇洗涤3次，在密封玻璃瓶中干燥10h，得到Fe3O4纳米球。
b.修饰Fe3O4纳米球：将0.075g干燥的Fe3O4纳米球和0.3mL质量浓度30％的氨水溶解在90％的乙醇中，将上述混合物加热至40℃，并以700rpm连续机械搅拌20分钟；同时，在连续机械搅拌下，将用10mL乙醇稀释的0.65mL TBOT(钛酸四丁酯)滴加到混合物中，待混合物降至室温，在室温下保持机械搅拌28小时。
对搅拌产物用去离子水和乙醇洗涤3次，在空气中干燥15小时，再在超声水浴下将干燥产物溶解在50mL的乙醇中10分钟；然后添加0.33mL APTMS(3-氨基丙基-三甲氧基硅烷)，并将混合物再次超声处理10分钟；将上述混合溶液在80℃下回流5小时，并对回流产物进行洗涤，再分散在50mL乙醇中，得到修饰Fe3O4纳米球。
c.制备Au/TiO2/Fe3O4纳米球：使用0.01mol/L的HCl调节修饰Fe3O4纳米球的pH至4.5，在机械搅拌下，将0.63mL经过APTMS稳定的TiO2/Fe3O4纳米球添加到50mL的Au纳米颗粒中，并继续搅拌15分钟；使用外磁场分离，对获得的产物洗涤3次，并溶解在0.5mL水中，得到Au/TiO2/Fe3O4纳米球。
S1-2、适配体修饰CD63探针
将硫醇化的CD63适配体溶解在无核酸酶的水中，得到浓度为10-4mol/L的溶液；并将上述溶液在93℃的水浴中加热15分钟，随后立即浸入冰水浴中25分钟；再按照体积比为1：8的比例，将500μmol/L的TCEP(三(2-羧乙基)膦)溶解到上述CD63适配体溶液中，使CD63适配体脱盐；然后将混合物在室温下孵育1.5小时，并用无核酸酶的水洗涤。
将等体积的脱盐CD63适配体溶液与Au/TiO2/Fe3O4纳米球混合，并在3.5℃下孵育9小时；使用外部磁场分离，将收集产物用无核酸酶水洗涤，并与10μL浓度为10-7mol/L的MCH(平均红细胞血红蛋白量)再次在3.5℃下孵育1..5小时，最后对孵育产物再次洗涤，得到适配体修饰CD63探针，并在3.5℃温度下储存.
S2、制备PDL1探针
S2-1、Ag/4-ATP/Au SERS标签的制备
配制0.01mol/L的4-ATP水溶液，并在3.5℃下储存4.5小时。
将2.2μL的4-ATP添加到2mL的Au纳米颗粒中，并对混合物进行磁力搅拌3分钟；而后将混合溶液在3.5℃下孵育5小时并用去离子水洗涤。
然后将0.3mL浓度为0.08mol/L的抗坏血酸添加到4-ATP功能化的Au纳米球中，逐滴添加0.6mL浓度为1mol/L的AgNO3，当溶液颜色从红色变为浅橙色时，停止搅拌并用去离子水洗涤产物，得到Ag/4-ATP/Au SERS标签。
S2-2、适配体修饰的PDL1探针
将硫醇化的PDL1适配体溶液溶解在无核酸酶的水中，得到浓度为10-4mol/L的溶液；将上述溶液在93℃的水浴中加热15分钟，随后立即浸入冰水浴中25分钟；再按照体积比为1：8的比例，将500μmol/L的TCEP(三(2-羧乙基)膦)溶解到上述PDL1适配体溶液中，使PDL1适配体脱盐；然后将混合物在室温下孵育1.5小时，并用无核酸酶的水洗涤；
将等体积的脱盐PDL1适配体溶液与Ag/4-ATP/Au SERS标签混合，并在3.5℃下孵育9小时；以1200rpm的转速对孵育产物离心7分钟，并用无核酸酶水洗涤；然后将洗涤后的溶液与与10μL浓度为10-7mol/L的MCH(平均红细胞血红蛋白量)在3.5℃下混合1.5小时，同时进行离心使分子充分结合；最后对孵育产物再次洗涤，得到适配体修饰PDL1探针，并在3.5℃温度下储存。
实施例3
如图1所示，本申请实施例公开一种PDL1的适配体功能化SERS探针的制备方法，包括以下步骤：
S1、制备CD63探针
S1-1、磁性复合材料Au/TiO2/Fe3O4的制备
a.制备Fe3O4纳米球：在磁力搅拌下，将1.0g FeCl3·6H2O、0.45g柠檬酸三钠和2.2g NaAc(醋酸钠)完全溶解在33.3mL的乙二醇中，然后将上述混合物转移到衬有聚四氟乙烯的高压釜中，在190℃下加热8小时，对得到的黑色产物用去离子水和乙醇洗涤3次，在密封玻璃瓶中干燥11h，得到Fe3O4纳米球。
b.修饰Fe3O4纳米球：将0.075g干燥的Fe3O4纳米球和0.3mL质量浓度为25％的氨水溶解在90％的乙醇中，将上述混合物加热至50℃，并以500rpm连续机械搅拌10分钟；同时，在连续机械搅拌下，将用10mL乙醇稀释的1mL TBOT(钛酸四丁酯)滴加到混合物中，待混合物降至室温，在室温下保持机械搅拌20小时。
对搅拌产物用去离子水和乙醇洗涤3次，在空气中干燥10小时，再在超声水浴下将干燥产物溶解在50mL的乙醇中20分钟；然后添加0.2mL APTMS(3-氨基丙基-三甲氧基硅烷)，并将混合物再次超声处理20分钟；将上述混合溶液在90℃下回流3小时，并对回流产物进行洗涤，再分散在50mL乙醇中，得到修饰Fe3O4纳米球。
c.制备Au/TiO2/Fe3O4纳米球：使用0.01mol/L的HCl调节修饰Fe3O4纳米球的pH至5.5，在机械搅拌下，将0.25mL经过APTMS稳定的TiO2/Fe3O4纳米球添加到50mL的Au纳米颗粒中，并继续搅拌25分钟；使用外磁场分离，对获得的产物洗涤3次，并溶解在0.5mL水中，得到Au/TiO2/Fe3O4纳米球。
S1-2、适配体修饰CD63探针
将硫醇化的CD63适配体溶解在无核酸酶的水中，得到浓度为10-4mol/L的溶液；并将上述溶液在98℃的水浴中加热10分钟，随后立即浸入冰水浴中35分钟；再按照体积比为1：12的比例，将300μmol/L的TCEP(三(2-羧乙基)膦)溶解到上述CD63适配体溶液中，使CD63适配体脱盐；然后将混合物在室温下孵育2.5小时，并用无核酸酶的水洗涤。
将等体积的脱盐CD63适配体溶液与Au/TiO2/Fe3O4纳米球混合，并在4.5℃下孵育8小时；使用外部磁场分离，将收集产物用无核酸酶水洗涤，并与10μL浓度为10-7mol/L的MCH(平均红细胞血红蛋白量)再次在4.5℃下孵育2.5小时，最后对孵育产物再次洗涤，得到适配体修饰CD63探针，并在4.5℃温度下储存.
S2、制备PDL1探针
S2-1、Ag/4-ATP/Au SERS标签的制备
配制0.02mol/L的4-ATP水溶液，并在4.5℃下储存4小时。
将1μL的4-ATP添加到2mL的Au纳米颗粒中，并对混合物进行磁力搅拌7分钟；而后将混合溶液在4.5℃下孵育5小时并用去离子水洗涤。
然后将0.33mL浓度为0.12mol/L的抗坏血酸添加到4-ATP功能化的Au纳米球中，逐滴添加0.3mL浓度为1mol/L的AgNO3，当溶液颜色从红色变为浅橙色时，停止搅拌并用去离子水洗涤产物，得到Ag/4-ATP/Au SERS标签。
S2-2、适配体修饰的PDL1探针
将硫醇化的PDL1适配体溶液溶解在无核酸酶的水中，得到浓度为10-4mol/L的溶液；将上述溶液在98℃的水浴中加热10分钟，随后立即浸入冰水浴中35分钟；再按照体积比为1：12的比例，将300μmol/L的TCEP(三(2-羧乙基)膦)溶解到上述PDL1适配体溶液中，使PDL1适配体脱盐；然后将混合物在室温下孵育2.5小时，并用无核酸酶的水洗涤；
将等体积的脱盐PDL1适配体溶液与Ag/4-ATP/Au SERS标签混合，并在4.5℃下孵育8小时；以1700rpm的转速对孵育产物离心7分钟，并用无核酸酶水洗涤；然后将洗涤后的溶液与与10μL浓度为10-7mol/L的MCH(平均红细胞血红蛋白量)在4.5℃下混合2.5小时，同时进行离心使分子充分结合；最后对孵育产物再次洗涤，得到适配体修饰PDL1探针，并在4.5℃温度下储存。
实施例4
如图4所示，本申请实施例公开一种PDL1的适配体功能化SERS探针的应用，包括以下步骤：
S1、将等体积的外泌体和CD63探针混合，并将混合物在室温下孵育40分钟，使CD63适配体和外泌体CD63蛋白之间发生免疫反应，然后进行外泌体的SERS分析。
S2、向上述混合液中引入与CD63探针等体积的PDL1探针，并将混合物在室温下孵育40分钟，使用外部磁场进行分离，得到“CD63探针-SERS-PDL1探针”三明治组合物。
S3、将上述组合物用水冲洗，应用激光产生4-ATP报告分子的强拉曼信号，以此实现靶向CD63探针结合的外泌体上PDL1含量的定量测量，测定结果见图5。其中，4-ATP在1080cm-1处的信号峰用于校准PDL1并进行量化。
实施例5
本申请实施例公开一种PDL1的适配体功能化SERS探针在检测小鼠MC38(结肠癌细胞)刺激小鼠中的PDL1表达的应用，向3组6周的小鼠体内注射MC38，分别在4、8、12天提取小鼠血液；同时，监测小鼠的肿瘤生长情况，并以记录数字图像以进行比较，结果表明所有小鼠第4天下腹部都出现了小肿块，这是肿瘤生长的最早迹象。
从提取的小鼠血液样品中分离外泌体，并将每个样品分为等体积的两组，两组样品分别用传统酶联免疫吸附测定(ELISA)和SERS分析。SERS分析时采用实施例4的检测方法，在样品中的随机位置应用拉曼激光，总共记录6个光谱，ELISA为一式三份，同时使用SERS和ELISA检测外泌体PDL1。结果如图6所示，表明MC38处理的小鼠模型中PDL1表达时间依赖性变化。
对原始血清样品中外泌体PDL1进行定量化分析，结果如图7所示。SERS方法探测循环外泌体PDL1的诊断灵敏度可达98％，表明本申请的SERS方法具有卓越灵敏度。
使用原理及优点：本发明采用SERS结合适配体修饰的方法测量外泌体中PDL1，具有很好的靶向特异性；采用本发明适配体探针结合SERS夹心法量化血清中PDL1生物标志物时，只对血液中外泌体PDL1具有选择性检测，具有特异性强、敏度高、选择性好等优点；本方法还以ELISA测试进行验证，对原始血清样本分析结果显示，SERS方法探测循环外泌体PDL1的诊断灵敏度可达98％，表明本申请的SERS方法具有卓越灵敏度和准确性；另外，在测量中利用磁场可以快速提取被检测样品，操作快速简便。因此，本发明专利在基于PDL1/PD1的免疫疗法的监测中具有良好的应用前景。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种PDL1的适配体功能化SERS探针的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、制备CD63探针
S1-1、磁性复合材料Au/TiO2/Fe3O4的制备
a.制备Fe3O4纳米球：在磁力搅拌下，将FeCl3·6H2O、柠檬酸三钠和NaAc(醋酸钠)完全溶解在乙二醇中，然后将上述混合物转移到高压釜中加热，对得到的黑色产物进行洗涤、密封干燥，得到Fe3O4纳米球；
b.修饰Fe3O4纳米球：将干燥的Fe3O4纳米球和氨水溶解在乙醇中，加热并搅拌上述混合物，同时将稀释在乙醇中的TBOT(钛酸四丁酯)滴加到混合物中，待混合物降至室温，继续搅拌20-28小时；
对搅拌产物进行洗涤、干燥，在超声水浴下将干燥产物溶解在乙醇中，然后添加APTMS(3-氨基丙基-三甲氧基硅烷)并再次超声处理；将上述混合溶液加热回流，并对回流产物进行洗涤，再分散在乙醇中得到修饰Fe3O4纳米球；
c.制备Au/TiO2/Fe3O4纳米球：调节修饰Fe3O4纳米球的pH至4.5-5.5，搅拌的同时将经过APTMS稳定的TiO2/Fe3O4纳米球添加到Au纳米颗粒中，并继续搅拌15-25分钟；使用外磁场分离，对获得的产物进行洗涤并溶解在水中，得到Au/TiO2/Fe3O4纳米球；
S1-2、适配体修饰CD63探针
将硫醇化的CD63适配体溶解在无核酸酶的水中，并在93-98℃的水浴中加热10-15分钟，随后立即浸入冰水浴中25-35分钟；再将TCEP(三(2-羧乙基)膦)溶解到上述CD63适配体溶液中，使CD63适配体脱盐；然后将混合物在室温下孵育1.5-2.5小时，并用无核酸酶的水洗涤；
将等体积的脱盐CD63适配体溶液与Au/TiO2/Fe3O4纳米球混合，并在3.5-4.5℃下孵育8-10小时；使用外部磁场分离，将收集产物用无核酸酶水洗涤，并与MCH(平均红细胞血红蛋白量)再次在3.5-4.5℃下孵育1.5-2.5小时，最后对孵育产物再次洗涤得到适配体修饰CD63探针，并在3.5-4.5℃温度下储存；
S2、制备PDL1探针
S2-1、Ag/4-ATP/Au SERS标签的制备
配制0.01-0.02mol/L的4-ATP水溶液，并在3.5-4.5℃下储存4-5小时；
将4-ATP添加到Au纳米颗粒中，并对混合物进行磁力搅拌，而后将混合溶液在3.5-4.5℃下孵育4-5小时并用去离子水洗涤；
然后将抗坏血酸添加到4-ATP功能化的Au纳米球中，逐滴添加AgNO3，当溶液颜色从红色变为浅橙色时，停止搅拌并用去离子水洗涤产物，得到Ag/4-ATP/Au SERS标签。
S2-2、适配体修饰的PDL1探针
将硫醇化的PDL1适配体溶液溶解在无核酸酶的水中，并在90-100℃的水浴中加热10-15分钟，随后立即浸入冰水浴中25-30分钟；再将TCEP(三(2-羧乙基)膦)溶解到上述PDL1适配体溶液中，使PDL1适配体脱盐；然后将混合物在室温下孵育1.5-2.5小时，并用无核酸酶的水洗涤；
将等体积的脱盐PDL1适配体溶液与Ag/4-ATP/Au SERS标签混合，并在3.5-4.5℃下孵育8-10小时；对孵育产物进行离心，并用无核酸酶水洗涤；然后将洗涤后的溶液与MCH(平均红细胞血红蛋白量)在3.5-4.5℃下混合1.5-2.5小时，同时进行离心；最后对孵育产物再次洗涤，得到适配体修饰PDL1探针，并在3.5-4.5℃温度下储存。
2.根据权利要求1所述的一种PDL1的适配体功能化SERS探针的制备方法，其特征在于：所述步骤S1-1的a中FeCl3·6H2O、柠檬酸三钠和NaAc的质量比为1：0.4-0.45：1.8-2.2；
混合物在高压釜中的加热温度为180-200℃，加热时间为8-10小时；
黑色产物采用去离子水和乙醇洗涤3次；
密封干燥时间为10-12小时。
3.根据权利要求1所述的一种PDL1的适配体功能化SERS探针的制备方法，其特征在于：所述步骤S1-1的b中Fe3O4纳米球和氨水的质量比为1：1-1.2；氨水的质量浓度为25-30w％；
搅拌温度为40-50℃、速度为500-700rpm、时间为10-20分钟；
TBOT与乙醇的体积比为1：10-15；
搅拌产物采用去离子水和乙醇洗涤3次，干燥时间为10-15小时；
超声水浴时间为10-20分钟，APTMS与乙醇的体积比为1：150-250；
回流温度为80-90℃、时间为3-5小时。
4.根据权利要求1所述的一种PDL1的适配体功能化SERS探针的制备方法，其特征在于：所述步骤S1-1的c中使用HCl调节pH；
TiO2/Fe3O4纳米球与Au纳米颗粒的体积比为1：80-120。
5.根据权利要求1所述的一种PDL1的适配体功能化SERS探针的制备方法，其特征在于：所述步骤S1-2中CD63适配体溶解在无核酸酶的水中后的溶液浓度为10-4mol/L；
TCEP的浓度为300-500μmol/L；TCEP与CD63适配体溶液的体积比为1：8-12；
MCH的浓度为10-7mol/L。
6.根据权利要求1所述的一种PDL1的适配体功能化SERS探针的制备方法，其特征在于：所述步骤S2-1中4-ATP与Au纳米颗粒的体积比为1:800-1000；
磁力搅拌是时间为3-7分钟；
抗坏血酸的浓度为0.08-0.12mol/L，抗坏血酸与4-ATP功能化的Au纳米球的体积比为1:3-8；
滴加AgNO3的浓度为0.8-1.2mmol/L，AgNO3与4-ATP功能化的Au纳米球的体积体积比为1:1-8。
7.根据权利要求1所述的一种PDL1的适配体功能化SERS探针的制备方法，其特征在于：所述步骤S2-2中PDL1适配体溶解在无核酸酶的水中后的溶液浓度为10-4mol/L；
TCEP的浓度为300-500μmol/L；TCEP与PDL1适配体溶液的体积比为1：10；
MCH的浓度为10-7mol/L；
孵育产物的离心速度为1200-1700rpm，离心时间为3-7分钟。
8.一种PDL1的适配体功能化SERS探针的应用，其特征在于：包括以下步骤：
S1、将等体积的外泌体和CD63探针混合，并将混合物在室温下孵育，使CD63适配体和外泌体CD63蛋白之间发生免疫反应，然后进行外泌体的SERS分析；
S2、向上述混合液中引入与CD63探针等体积的PDL1探针，并将混合物在室温下孵育，使用外部磁场进行分离，得到“CD63探针-SERS-PDL1探针”三明治组合物；
S3、将上述组合物用水冲洗，应用激光产生4-ATP报告分子的强拉曼信号，以此实现靶向CD63探针结合的外泌体上PDL1含量的定量测量。
9.根据权利要求8所述的一种PDL1的适配体功能化SERS探针的应用，其特征在于：所述步骤S1、S2中的孵育时间均为35-45分钟；所述步骤S3中4-ATP在1080cm-1处的信号峰用于校准PDL1并进行量化。
10.根据权利要求8所述的一种PDL1的适配体功能化SERS探针的应用，其特征在于：用于检测小鼠MC38(结肠癌细胞)刺激小鼠中的PDL1表达。
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