CN109239046B - 一种c反应蛋白检测试剂及sers检测方法 - Google Patents

一种c反应蛋白检测试剂及sers检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109239046B
CN109239046B CN201810958570.XA CN201810958570A CN109239046B CN 109239046 B CN109239046 B CN 109239046B CN 201810958570 A CN201810958570 A CN 201810958570A CN 109239046 B CN109239046 B CN 109239046B
Authority
CN
China
Prior art keywords
crp
aptamer
solution
agmnps
modified
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810958570.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN109239046A (zh
Inventor
周海波
江正瑾
胡紫微
袁凯松
简敬一
包芷君
梁晓辰
杨兴婕
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jinan University
Original Assignee
Jinan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jinan University filed Critical Jinan University
Priority to CN201810958570.XA priority Critical patent/CN109239046B/zh
Publication of CN109239046A publication Critical patent/CN109239046A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109239046B publication Critical patent/CN109239046B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/65—Raman scattering
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/65—Raman scattering
    • G01N2021/653—Coherent methods [CARS]
    • G01N2021/656—Raman microprobe

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于生物分析化学领域，公开了一种C反应蛋白检测试剂及SERS检测方法。所述检测试剂由巯基化CRP适配体修饰的Au‑NNPs探针和氨基化CRP适配体修饰的AgMNPs磁性捕获基底构成。当CRP存在时，Au‑NNPs探针和AgMNPs磁性捕获基底会通过适配体的特异性识别作用结合在一起形成三明治夹心结构，随着CRP浓度的改变，磁分离后将得到的CRP样品的拉曼光谱特征峰的强度值代入“拉曼强度与CRP浓度的线性曲线”，计算可得CRP的浓度。此方法具有信号稳定，超灵敏性，高选择性等优点，所得检测试剂及方法在临床分析诊断中具有重要应用价值。

Description

一种C反应蛋白检测试剂及SERS检测方法
技术领域
本发明属于生物分析化学领域，具体涉及一种C反应蛋白检测试剂及SERS检测方法。
背景技术
疾病生物标志物一般是可供客观测定和评价的一个普通生理或病理或治疗过程中的某种特征性的生化指标，通过对它的测定可以获知机体当前所处的生物学过程中的进程。检查一种疾病特异性的生物标志物，对于疾病的鉴定、早期诊断及预防、治疗过程中的监控可起到帮助作用。
C反应蛋白(CRP)是一种五聚体蛋白，分子量大约为115KD。CRP由肝细胞所合成，具有激活补体和促进粒细胞及巨噬细胞的吞噬作用。
传统观点认为CRP是一种非特异的炎症标志物，但近十年的研究揭示了CRP直接参与了炎症与动脉粥样硬化等心血管疾病，并且是心血管疾病最强有力的预示因子与危险因子。它是一种通用的炎症生物标志物，可用于诊断癌症，心血管疾病和癌症中的炎症反应。正常健康受试者的基础CRP水平低于10mg/L(～87nM)。然而，已发现血清CRP水平高于3mg/L(～26nM)时与心血管事件的延长风险相关。1-3mg/L的水平与心血管事件的中等风险相关，而低于1mg/L(～8.7nM)的水平表示低风险。因此，CRP的检测对炎症等疾病的早期诊断具有一定的参考意义。
目前报道的检测CRP的方法有电化学发光法，荧光法，化学发光法，表面等离子体共振等，但是存在着检测时间长，灵敏度不够高等缺点。
SERS具有高灵敏、高选择性和检测速度快等优点，在生物分析化学领域具有广泛的应用。因此，开发一种基于SERS的CRP检测试剂及检测方法具有重要的意义。
发明内容
为实现对C反应蛋白的超灵敏检测，本发明的首要目的在于提供一种C反应蛋白检测试剂。
本发明的另一目的在于提供一种采用上述检测试剂对C反应蛋白进行SERS检测的方法。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种C反应蛋白检测试剂，由巯基化CRP适配体修饰的具有纳米间隙的核壳型纳米金(Au-NNPs)探针和氨基化CRP适配体修饰的银包裹的Fe3O4(AgMNPs)磁性捕获基底构成。
优选地，所述巯基化CRP适配体的DNA序列为：5'-CGAAGGGGATTCGAGGGGTGATTGCGTGCTCCATTTGGTGTTTTTTTTTTTT-(CH2)6-SH-3'；所述氨基化CRP适配体的DNA序列为：5'-CGAAGGGGATTCGAGGGGTGATTGCGTGCTCCATTTGGTGTTTTTTTTTTTT-(CH2)6-NH2-3'。
优选地，所述巯基化CRP适配体修饰的Au-NNPs探针通过如下方法制备得到：
(1)将巯基修饰的单链DNA与金纳米粒子(AuNPs)混合，经冷冻、解冻，得到DNA修饰的纳米金(DNA-AuNPs)；修饰DNA的目的是为了形成纳米间隙；
(2)将4-ATP(对氨基苯硫酚)与DNA-AuNPs在搅拌条件下混合孵育，产物经离心分离后分散于超纯水中，得到4-ATP修饰的金纳米粒子(4-ATP-DNA-AuNPs)溶液；
(3)将4-ATP-DNA-AuNPs溶液与PBS溶液和NaCl溶液混合，然后加入PVP、NH2OH·HCl和HAuCl4溶液混合反应，产物经离心、洗涤后分散于超纯水中，得到具有纳米间隙的核壳型纳米金探针(Au-NNPs)溶液；
(4)将Au-NNPs溶液与巯基化CRP适配体混合孵育，产物经离心、洗涤后分散于PBS溶液中，得到巯基化CRP适配体修饰的具有纳米间隙的核壳型纳米金(Au-NNPs)探针。
优选地，步骤(1)中所述巯基修饰的单链DNA序列为：5'-CACGCGTTTCTCAAA-(PEG)9-T10-(CH2)3-SH-3'。
优选地，步骤(1)中所述金纳米粒子通过如下方法制备：将HAuCl4溶液加入到超纯水中，搅拌下加热回流，然后加入柠檬酸钠溶液反应，得到金纳米粒子(AuNPs)。
优选地，步骤(1)中所述冷冻、解冻是指在-25℃温度下冷冻2h，然后在室温下解冻。
优选地，所述氨基化CRP适配体修饰的AgMNPs磁性捕获基底通过如下方法制备得到：
(1)将金纳米粒子(AuNPs)自组装在Fe3O4磁性纳米粒子表面，得到AuNPs-Fe3O4磁性纳米粒子，然后加入到含AgNO3和PVP的水溶液中，超声混匀后加入甲醛、氨水超声反应，产物经磁分离、洗涤，得到银包裹的Fe3O4磁性纳米粒子(AgMNPs)；
(2)将11-巯基十一烷酸(MUA)和11-巯基-1-十一烷醇(MU)加入到AgMNPs的乙醇溶液中，室温孵育，产物经磁分离、洗涤，得到羧基化AgMNPs；
(3)将EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基丁二酰亚胺)加入到羧基化AgMNPs的乙醇溶液中，然后加入PBS缓冲液混合均匀，再加入氨基化CRP适配体的PBS溶液，室温孵育，产物经磁分离、洗涤，得到氨基化CRP适配体修饰的银包裹的Fe3O4(AgMNPs)磁性捕获基底。
优选地，所述Fe3O4磁性纳米粒子通过如下方法制备：将FeCl3·6H2O超声溶解于乙二醇中，然后加入聚乙二醇和无水乙酸钠搅拌至完全溶解，200℃条件下反应，产物经磁分离、洗涤、干燥，得到Fe3O4磁性纳米粒子。
一种采用上述检测试剂对C反应蛋白进行SERS检测的方法，包括如下步骤：
(1)将一系列已知浓度的CRP的PBS溶液与氨基化CRP适配体修饰的AgMNPs磁性捕获基底的PBS溶液混合，得到混合液，然后加入巯基化CRP适配体修饰的Au-NNPs探针进行反应，此时Au-NNPs探针、CRP和AgMNPs形成三明治夹心结构复合物，磁分离得到夹心结构复合物；
(2)利用拉曼仪器检测步骤(1)所得夹心结构复合物，得到CRP的拉曼图谱，以CRP浓度的对数值为横坐标，以对应的拉曼光谱强度为纵坐标，绘制定量分析的线性关系曲线；
(3)以步骤(1)和(2)的方法对待测CRP样品进行检测，所得拉曼光谱强度代入步骤(2)的线性关系曲线，计算即可得到样品中CRP的浓度。
优选地，所述拉曼仪器检测的激光波长为633nm，采集时间为2s。
优选地，所述拉曼光谱强度选取拉曼图谱中1140cm-1位置处的拉曼强度作为特征峰。
本发明的原理为：通过合成了具有良好稳定性和强拉曼增强效果的有纳米间隙的核壳型纳米金探针，同时，合成了银包裹的Fe3O4磁性纳米粒子作为捕获基底，在拉曼探针和磁性捕获基底上都修饰CRP的适配体，构建CRP检测体系，当CRP存在时，Au-NNPs探针和AgMNPs磁性捕获基底会通过适配体的特异性识别作用结合在一起形成三明治夹心结构，随着CRP浓度的改变，磁分离后将得到的CRP样品的拉曼光谱特征峰的强度值代入“拉曼强度与CRP浓度的线性曲线”，计算可得CRP的浓度。此方法具有信号稳定，超灵敏性，高选择性等优点，所得检测试剂及方法在临床分析诊断中具有重要应用价值。
本发明的检测试剂及检测方法具有如下优点及有益效果：
(1)本发明通过制备具有纳米间隙的核壳型纳米金(Au-NNPs)探针，将拉曼信号分子4-ATP封装在纳米间隙中，提高了拉曼信号的稳定性，同时具有很高的SERS增强效果。利用该探针的强拉曼增强效果，以及适配体的特异性识别作用，磁性捕获基底的分离富集作用以及所包裹的纳米银的进一步拉曼增强效果，构建一种CRP定量检测的超灵敏检测试剂及方法，同时为其他蛋白类疾病标志物的检测提供了一种检测策略的参考。
(2)本发明所制备的具有纳米间隙的核壳型纳米金(Au-NNPs)探针，纳米粒子内部具有很窄的纳米间隙，可把拉曼信号分子封装在里面，不容易脱落出来也不会受到实际样品的复杂基质的干扰，信号更加稳定。
(3)本发明所制备的银包裹的Fe3O4(AgMNPs)磁性捕获基底，具有良好的超顺磁性，可以满足对样品中CRP的分离富集需求；同时包裹的一层纳米银具有很好的拉曼增强效果，有利于在拉曼检测中进一步提高灵敏度。
(4)本发明的检测试剂及方法对C反应蛋白具有超高的灵敏度，可以实现浓度低至10fM的CRP检测，该试剂及方法具有进一步应用于其他血液中低浓度疾病标志物检测的潜力。
附图说明
图1为实施例中所得Au-NNPs的透射电镜图。
图2为实施例中所得Au-NNPs的拉曼光谱图。
图3为实施例中所得AgMNPs的透射电镜图。
图4为实施例中不同浓度CRP条件下，Au-NNPs探针、CRP和AgMNPs形成三明治夹心结构复合物的SERS谱图。
图5为实施例中以CRP浓度的对数值为横坐标，以对应的1140cm-1处的拉曼强度为纵坐标，绘制定量分析的线性关系曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例
本实施例的一种C反应蛋白检测试剂，由巯基化CRP适配体修饰的具有纳米间隙的核壳型纳米金(Au-NNPs)探针和氨基化CRP适配体修饰的银包裹的Fe3O4(AgMNPs)磁性捕获基底构成。
所述巯基化CRP适配体修饰的Au-NNPs探针通过如下方法制备得到：
(1)Au纳米粒子的制备：制备过程中使用的所有玻璃器皿在王水(HCl/HNO3，3:1)中彻底浸泡清洗，用超纯水中冲洗，并在使用前烘箱干燥。将0.25mL 0.1M HAuCl4溶液加入100mL超纯水中并在剧烈磁力搅拌下加热回流。溶液沸腾后迅速加入1.5mL 1％(w/v)柠檬酸钠溶液。混合物继续反应30分钟。在反应过程中，溶液的颜色从无色变为黑色，最后变为酒红色。在继续搅拌下自然冷却至室温后，将制备好的Au纳米粒子(AuNPs)储存在铝箔包裹的棕色玻璃瓶中，保存于在4℃冰箱中的以供进一步使用。
(2)制备DNA修饰的AuNPs：将500μL 6.5μM巯基修饰的单链DNA(无需进一步处理直接使用)与1mL制备的AuNPs混合。将混合物置于-25℃的冰箱中冷冻2小时，然后在室温下解冻。解冻后，所得DNA修饰的纳米金(DNA-AuNPs)的颜色仍为红色。修饰DNA的目的是为了形成纳米间隙。所用巯基修饰的单链DNA序列为：5'-CACGCGTTTCTCAAA-(PEG)9-T10-(CH2)3-SH-3'。
(3)4-ATP的修饰：将100μL 0.1M的4-ATP与1mL DNA-AuNP在220rpm和25℃下孵育60小时。以12000rpm，20分钟将溶液离心除去游离的4-ATP分子，然后再分散于1.1mL的超纯水中，得到4-ATP-DNA-AuNPs溶液。
(4)Au-NNPs的制备：将体积为200μL的4-ATP-DNA-AuNPs溶液与100μLPBS溶液(0.1M，pH 7.4)、30μL 2.0M NaCl混合。随后，加入100μL 1％PVP溶液，26μL 10mM NH2OH·HCl溶液和26μL 5mM HAuCl4溶液，并使混合物在剧烈涡旋下反应1.5分钟。最后，以10000rpm离心15分钟，收集所得的Au-NNPs产物，并用超纯水洗涤两次以除去未反应的物质，然后再分散在200μL的超纯水中。
(5)基于Au-S键的形成，在Au-NNPs的表面修饰巯基化CRP适配体：将体积为200μL的所制备的Au-NNPs与6μL50μM巯基化CRP适配体在25℃温和摇动下孵育12小时。随后，将混合物在10000rpm下离心15分钟并用PBS溶液洗涤以除去过量的适配体。将获得的产物再分散在PBS溶液中，得到巯基化CRP适配体修饰的Au-NNPs探针，在4℃下储存以供进一步使用。所用巯基化CRP适配体的DNA序列为：5'-CGAAGGGGATTCGAGGGGTGATTGCGTGCTCCATTTGGTGTTTTTTTTTTTT-(CH2)6-SH-3'。
本实施例所得Au-NNPs的透射电镜图如图1所示。从图中可以看出探针的尺寸约为40nm，在该纳米粒子中有纳米间隙的存在。
本实施例所得Au-NNPs的拉曼光谱图如图2所示。拉曼信号来自封装在纳米间隙中的4-ATP分子，1140cm-1处的拉曼信号强度大并且稳定，可被选为特征峰用于后续检测。
所述氨基化CRP适配体修饰的AgMNPs磁性捕获基底通过如下方法制备得到：
(1)Fe3O4磁性纳米粒子的制备：将2.43g FeCl3·6H2O超声溶解于72mL乙二醇中，形成澄清的溶液后，加入1.8g聚乙二醇10000和3.906g无水乙酸钠。将上述混合物搅拌一天两夜以完全溶解；然后装入反应釜中，在200℃条件下反应8小时后取出；磁分离，将下层的磁性纳米粒子用超纯水和乙醇分别洗涤5次，放入40℃烘箱中干燥40min。
(2)银包裹的Fe3O4磁性纳米粒子(AgMNPs)的制备：银的包裹采用以小粒径的纳米金做种子来进行介导的方法。首先将4nm的AuNPs自装在Fe3O4磁性纳米粒子表面，得到AuNPs-Fe3O4磁性纳米粒子。然后将2mg AgNO3和300mg PVP溶解于200mL水中，加入10mg上一步制备的AuNPs-Fe3O4磁性纳米粒子，超声混匀。加入150μL甲醛、300μL氨水，在30℃下剧烈超声4.5min，得到银包裹的Fe3O4磁性纳米粒子(AgMNPs)，磁分离，用超纯水洗涤5次以除去过量的PVP。
(3)AgMNPs的羧基化：将0.2mg 11-巯基十一烷酸(MUA)和0.2mg 11-巯基-1-十一烷醇(MU)加入1mL 5mg/mL AgMNPs的乙醇溶液中。将混合物在室温下孵育过夜。随后，通过磁分离收集纳米颗粒并用乙醇洗涤五次以除去过量的MUA和MU，获得羧基化的AgMNPs。将所得产物分散在乙醇中，终浓度为5mg/mL。
(4)羧基化的AgMNPs与氨基化的CRP适配体的缩合：将100μL 10mMEDC和20μL 0.1M的NHS加入到100μL 5mg/mL羧基化AgMNPs中。然后，加入780μL PBS缓冲液(0.1M，pH 7.0)，并将所得混合物在220rpm和25℃下振荡15分钟以充分混合。加入体积为25μL氨基化CRP适配体(在PBS中10μM)，并将混合物孵育2小时。最后，通过磁分离收集产物并用超纯水洗涤三次以除去过量的适配体分子。得到氨基化CRP适配体修饰的AgMNPs。将所得产物分散在100μL PBS缓冲液(0.1M，pH 7.0)，4℃保存备用。即为氨基化CRP适配体修饰的AgMNPs磁性捕获基底。所用氨基化CRP适配体的DNA序列为：5'-CGAAGGGGATTCGAGGGGTGATTGCGTGCTCCATTTGGTGTTTTTTTTTTTT-(CH2)6-NH2-3'。
所得AgMNPs的透射电镜图如图3所示，可以看出此复合磁性材料的粒径约为400nm。在Fe3O4的表面，可清晰地看出自组装的小粒径AuNPs和包裹的银壳。
采用上述检测试剂对C反应蛋白进行SERS检测的方法，具体步骤如下：
(1)用PBS缓冲液(0.1M，pH 7.4)配制不同浓度的CRP溶液，然后取20μL氨基化CRP适配体修饰的AgMNPs磁性捕获基底，加入20μL不同浓度的CRP PBS溶液，涡旋混匀，置于28℃，172rpm摇床中反应1小时。磁分离，得到CRP-AgMNPs复合物。
(2)将巯基化CRP适配体修饰的Au-NNPs探针50μL加入得到的CRP-AgMNPs复合物中，在25℃反应1小时；此时Au-NNPs探针、CRP和AgMNPs形成三明治夹心结构复合物，磁分离得到夹心结构复合物。
(3)取上述反应得到的夹心结构复合物5μL滴于载玻片上，利用拉曼仪器“HORIBALabRAM HR”检测，得到待测CRP的拉曼图谱，结果如图4所示。拉曼信号来自标记在Au-NNPs探针间隙中的4-ATP分子，选择拉曼图谱中的1140cm-1位置处的拉曼强度作为特征峰。从图中可以看出，随着CRP浓度的升高，SERS信号逐渐增强。当CRP的浓度为10fM时，仍然可以观察到SERS信号，因此此方法对CRP的检测限可以达到10fM。以CRP浓度的对数值为横坐标，以对应的1140cm-1处的拉曼强度为纵坐标，绘制定量分析的线性关系曲线，结果如图5所示。根据此定量关系曲线，可实现对CRP浓度的定量测定。
(4)将20μL氨基化CRP适配体修饰的AgMNPs磁性捕获基底溶液与20μL待测CRP浓度的血清混合，在25℃反应1小时，磁分离，得到CRP-AgMNPs复合物。然后加入50μL巯基化CRP适配体修饰的Au-NNPs探针溶液，在25℃反应1小时，形成三明治夹心复合结构，进行磁分离；将磁分离得到的复合物进行拉曼光谱检测，得到拉曼光谱图，根据1140cm-1处的特征峰的强度值，代入线性关系曲线，计算即可得到血清中CRP的浓度。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 暨南大学
<120> 一种C反应蛋白检测试剂及SERS检测方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> modified_base
<222> (52)..(52)
<223> (CH2)6 -SH修饰
<400> 1
cgaaggggat tcgaggggtg attgcgtgct ccatttggtg tttttttttt tt 52
<210> 2
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> modified_base
<222> (52)..(52)
<223> (CH2)6 -NH2修饰
<400> 2
cgaaggggat tcgaggggtg attgcgtgct ccatttggtg tttttttttt tt 52
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> modified_base
<222> (15)..(15)
<223> (PEG)9-T10-(CH2)3 -SH修饰
<400> 3
cacgcgtttc tcaaa 15

Claims (9)

1.一种C反应蛋白检测试剂，其特征在于：所述检测试剂由巯基化CRP适配体修饰的Au-NNPs探针和氨基化CRP适配体修饰的AgMNPs磁性捕获基底构成；
所述巯基化CRP适配体修饰的Au-NNPs探针通过如下方法制备得到：
(1)将巯基修饰的单链DNA与AuNPs混合，经冷冻、解冻，得到DNA-AuNPs；
(2)将4-ATP与DNA-AuNPs在搅拌条件下混合孵育，产物经离心分离后分散于超纯水中，得到4-ATP-DNA-AuNPs溶液；
(3)将4-ATP-DNA-AuNPs溶液与PBS溶液和NaCl溶液混合，然后加入PVP、NH2OH·HCl和HAuCl4溶液混合反应，产物经离心、洗涤后分散于超纯水中，得到Au-NNPs溶液；
(4)将Au-NNPs溶液与巯基化CRP适配体混合孵育，产物经离心、洗涤后分散于PBS溶液中，得到巯基化CRP适配体修饰的Au-NNPs探针。
2.根据权利要求1所述的一种C反应蛋白检测试剂，其特征在于：所述巯基化CRP适配体的DNA序列为：5'-CGAAGGGGATTCGAGGGGTGATTGCGTGCTCCATTTGGTGTTTTTTTTTTTT-(CH2)6-SH-3'；所述氨基化CRP适配体的DNA序列为：5'-CGAAGGGGATTCGAGGGGTGATTGCGTGCTCCATTTGGTGTTTTTTTTTTTT-(CH2)6-NH2-3'。
3.根据权利要求1所述的一种C反应蛋白检测试剂，其特征在于：步骤(1)中所述巯基修饰的单链DNA序列为：5'-CACGCGTTTCTCAAA-(PEG)9-T10-(CH2)3-SH-3'。
4.根据权利要求1所述的一种C反应蛋白检测试剂，其特征在于：步骤(1)中所述AuNPs通过如下方法制备：将HAuCl4溶液加入到超纯水中，搅拌下加热回流，然后加入柠檬酸钠溶液反应，得到AuNPs。
5.根据权利要求1所述的一种C反应蛋白检测试剂，其特征在于：步骤(1)中所述冷冻、解冻是指在-25℃温度下冷冻2h，然后在室温下解冻。
6.根据权利要求1所述的一种C反应蛋白检测试剂，其特征在于：所述氨基化CRP适配体修饰的AgMNPs磁性捕获基底通过如下方法制备得到：
(1)将AuNPs自组装在Fe3O4磁性纳米粒子表面，得到AuNPs-Fe3O4磁性纳米粒子，然后加入到含AgNO3和PVP的水溶液中，超声混匀后加入甲醛、氨水超声反应，产物经磁分离、洗涤，得到AgMNPs；
(2)将MUA和MU加入到AgMNPs的乙醇溶液中，室温孵育，产物经磁分离、洗涤，得到羧基化AgMNPs；
(3)将EDC和NHS加入到羧基化AgMNPs的乙醇溶液中，然后加入PBS缓冲液混合均匀，再加入氨基化CRP适配体的PBS溶液，室温孵育，产物经磁分离、洗涤，得到氨基化CRP适配体修饰的AgMNPs磁性捕获基底。
7.根据权利要求6所述的一种C反应蛋白检测试剂，其特征在于：所述Fe3O4磁性纳米粒子通过如下方法制备：将FeCl3·6H2O超声溶解于乙二醇中，然后加入聚乙二醇和无水乙酸钠搅拌至完全溶解，200℃条件下反应，产物经磁分离、洗涤、干燥，得到Fe3O4磁性纳米粒子。
8.一种采用权利要求1～7任一项所述的检测试剂对C反应蛋白进行SERS检测的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将一系列已知浓度的CRP的PBS溶液与氨基化CRP适配体修饰的AgMNPs磁性捕获基底的PBS溶液混合，得到混合液，然后加入巯基化CRP适配体修饰的Au-NNPs探针进行反应，此时Au-NNPs探针、CRP和AgMNPs形成三明治夹心结构复合物，磁分离得到夹心结构复合物；
(2)利用拉曼仪器检测步骤(1)所得夹心结构复合物，得到CRP的拉曼图谱，以CRP浓度的对数值为横坐标，以对应的拉曼光谱强度为纵坐标，绘制定量分析的线性关系曲线；
(3)以步骤(1)和(2)的方法对待测CRP样品进行检测，所得拉曼光谱强度代入步骤(2)的线性关系曲线，计算即可得到样品中CRP的浓度。
9.根据权利要求8所述的检测试剂对C反应蛋白进行SERS检测的方法，其特征在于：所述拉曼光谱强度选取拉曼图谱中1140cm-1位置处的拉曼强度作为特征峰。
CN201810958570.XA 2018-08-22 2018-08-22 一种c反应蛋白检测试剂及sers检测方法 Active CN109239046B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810958570.XA CN109239046B (zh) 2018-08-22 2018-08-22 一种c反应蛋白检测试剂及sers检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810958570.XA CN109239046B (zh) 2018-08-22 2018-08-22 一种c反应蛋白检测试剂及sers检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109239046A CN109239046A (zh) 2019-01-18
CN109239046B true CN109239046B (zh) 2021-06-11

Family

ID=65068188

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810958570.XA Active CN109239046B (zh) 2018-08-22 2018-08-22 一种c反应蛋白检测试剂及sers检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109239046B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109946273A (zh) * 2019-03-13 2019-06-28 长春理工大学 一种用于检测c-反应蛋白的荧光探针及其制备方法
CN110632302B (zh) * 2019-10-30 2023-07-18 中国农业科学院农产品加工研究所 一种同时检测待测样品中大肠杆菌和沙门氏菌的含量的方法
CN113155788B (zh) * 2021-01-15 2023-03-21 西安交通大学 基于核酸适配体和量子点淬灭效应的c反应蛋白检测试剂及方法
CN115399756A (zh) * 2022-09-14 2022-11-29 华东理工大学 一种用于原位检测炎症环境的多参数sers活性微针

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010158238A (ja) * 2008-12-09 2010-07-22 Tokyo Univ Of Agriculture & Technology Ｃ反応性タンパク質結合性アプタマー及びその用途
KR20100107648A (ko) * 2009-03-26 2010-10-06 한양대학교 산학협력단 표면증강 라만 산란 복합 프로브 및 이를 이용하여 표적 물질을 검출하는 방법
CN102321616A (zh) * 2011-09-15 2012-01-18 湖南大学 利用微流控芯片筛选蛋白质的核酸适体的方法
WO2012019104A1 (en) * 2010-08-05 2012-02-09 Abbott Point Of Care Inc. Immunoassay method and device with magnetically susceptible bead capture
CN103411948A (zh) * 2013-06-24 2013-11-27 吉林大学 基于探针标记免疫金-磁性复合材料检测甲胎蛋白的sers方法
KR101691067B1 (ko) * 2015-07-21 2016-12-30 재단법인대구경북과학기술원 무표지 금속 3차원 나노 밀집체 동기화 표면증강 라만산란법을 이용한 단백질 검출방법
CN106596927A (zh) * 2016-12-26 2017-04-26 中国科学院长春光学精密机械与物理研究所 一种光纤生物探针及其制备方法与全血检测方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040023293A1 (en) * 1999-09-27 2004-02-05 Kreimer David I. Biochips for characterizing biological processes
KR20120107497A (ko) * 2009-12-17 2012-10-02 아박시스, 인크. 샘플 내 분석물을 검출하기 위한 신규 분석 및 그것과 관련된 키트 및 조성물
TWI497076B (zh) * 2010-06-25 2015-08-21 Univ Nat Cheng Kung 適合體及ｃ－反應蛋白檢測方法
WO2016085911A1 (en) * 2014-11-26 2016-06-02 Washington University Bioplasmonic detection of biomarkers in body fluids using peptide recognition elements

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010158238A (ja) * 2008-12-09 2010-07-22 Tokyo Univ Of Agriculture & Technology Ｃ反応性タンパク質結合性アプタマー及びその用途
KR20100107648A (ko) * 2009-03-26 2010-10-06 한양대학교 산학협력단 표면증강 라만 산란 복합 프로브 및 이를 이용하여 표적 물질을 검출하는 방법
WO2012019104A1 (en) * 2010-08-05 2012-02-09 Abbott Point Of Care Inc. Immunoassay method and device with magnetically susceptible bead capture
CN102321616A (zh) * 2011-09-15 2012-01-18 湖南大学 利用微流控芯片筛选蛋白质的核酸适体的方法
CN103411948A (zh) * 2013-06-24 2013-11-27 吉林大学 基于探针标记免疫金-磁性复合材料检测甲胎蛋白的sers方法
KR101691067B1 (ko) * 2015-07-21 2016-12-30 재단법인대구경북과학기술원 무표지 금속 3차원 나노 밀집체 동기화 표면증강 라만산란법을 이용한 단백질 검출방법
CN106596927A (zh) * 2016-12-26 2017-04-26 中国科学院长春光学精密机械与物理研究所 一种光纤生物探针及其制备方法与全血检测方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Detection of C-reactive protein using nanoparticle- enhanced surface plasmon resonance using an aptamer-antibody sandwich assay;Bin Wu 等;《CHEMICAL COMMUNICATIONS》;20160127;第52卷(第17期);参见摘要，第3568页左栏第1段，第3569页右栏第1段 *
SERS aptasensor detection of Salmonella typhimurium using a magnetic gold nanoparticle and gold nanoparticle based sandwich structure;Xiaoyuan Ma 等;《Analytical Methods》;20161021(第8期);参见摘要，第8100-8101页"Experimental"，第8103页"Analytical performance""Real sample application"，图6 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN109239046A (zh) 2019-01-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109239046B (zh) 一种c反应蛋白检测试剂及sers检测方法
Zhao et al. Gold nanostructures encoded by non-fluorescent small molecules in polyA-mediated nanogaps as universal SERS nanotags for recognizing various bioactive molecules
CN110412291B (zh) 一种构建sers光谱探针检测乳腺癌标志物egfr磷酸化酪氨酸的方法
Liang et al. The surface-plasmon-resonance effect of nanogold/silver and its analytical applications
CN109991207B (zh) 一种用于检测酪氨酸酶的三明治结构的sers传感器及其制备和检测方法
Er et al. Metal nanoparticles/MoS2 surface-enhanced Raman scattering-based sandwich immunoassay for α-fetoprotein detection
Liu et al. Highly sensitive protein detection using enzyme-labeled gold nanoparticle probes
CN113155807B (zh) 一种基于表面增强拉曼光谱技术的microRNA超灵敏检测方法
Lv et al. The label-free immunosensor based on rhodium@ palladium nanodendrites/sulfo group functionalized multi-walled carbon nanotubes for the sensitive analysis of carcino embryonic antigen
Song et al. Combination assay of lung cancer associated serum markers using surface-enhanced Raman spectroscopy
CN110376379A (zh) 一种分子印迹结合静默区内标sers技术高精度检测cea的方法
Tai et al. Gold nanoparticles based optical biosensors for cancer biomarker proteins: a review of the current practices
Haroon et al. Surface-enhanced Raman scattering (SERS) spectroscopy for prostate cancer diagnosis: A review
Putnin et al. Dually functional polyethylenimine-coated gold nanoparticles: a versatile material for electrode modification and highly sensitive simultaneous determination of four tumor markers
JP2023130343A (ja) 溶液ベースのプラズモン特異的結合パートナーアッセイにおけるシグナル増幅
Zhao et al. Ultrasensitive dual-enhanced sandwich strategy for simultaneous detection of Escherichia coli and Staphylococcus aureus based on optimized aptamers-functionalized magnetic capture probes and graphene oxide-Au nanostars SERS tags
Puente et al. Silver-chitosan and gold-chitosan substrates for surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS): Effect of nanoparticle morphology on SERS performance
Zhang et al. Spontaneous implantation of gold nanoparticles on graphene oxide for salivary SERS sensing
Lu et al. Detection of squamous cell carcinoma antigen in cervical cancer by surface-enhanced Raman scattering-based immunoassay
Wang et al. Detection of IL-8 in human serum using surface-enhanced Raman scattering coupled with highly-branched gold nanoparticles and gold nanocages
CN112986211A (zh) 一种可靶向触发和自校准的适配体sers传感器高精度检测人体血液中肿瘤标志物的方法
CN110186902A (zh) 一种检测汞离子的表面增强拉曼传感器
Hu et al. Aptamer-functionalized silver nanoparticles for scanometric detection of platelet-derived growth factor-BB
Lin et al. A novel Apt-SERS platform for the determination of cardiac troponin I based on coral-like silver-modified magnetic substrate and BCA method
CN114544941A (zh) 一种pdl1的适配体功能化sers探针的制备方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Zhou Haibo

Inventor after: Jiang Zhengjin

Inventor after: Hu Ziwei

Inventor after: Yuan Kaisong

Inventor after: Jian Jingyi

Inventor after: Bao Zhijun

Inventor after: Liang Xiaochen

Inventor after: Yang Xingjie

Inventor after: Zhou Xia

Inventor before: Zhou Haibo

Inventor before: Jiang Zhengjin

Inventor before: Hu Ziwei

Inventor before: Yuan Kaisong

Inventor before: Jian Jingyi

Inventor before: Bao Zhijun

Inventor before: Liang Xiaochen

Inventor before: Yang Xingjie

CB03 Change of inventor or designer information