KR101691067B1 - 무표지 금속 3차원 나노 밀집체 동기화 표면증강 라만산란법을 이용한 단백질 검출방법 - Google Patents

무표지 금속 3차원 나노 밀집체 동기화 표면증강 라만산란법을 이용한 단백질 검출방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101691067B1
KR101691067B1 KR1020150102896A KR20150102896A KR101691067B1 KR 101691067 B1 KR101691067 B1 KR 101691067B1 KR 1020150102896 A KR1020150102896 A KR 1020150102896A KR 20150102896 A KR20150102896 A KR 20150102896A KR 101691067 B1 KR101691067 B1 KR 101691067B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
protein
substrate
reactive protein
solution
raman scattering
Prior art date
Application number
KR1020150102896A
Other languages
English (en)
Inventor
김현민
김은주
최은숙
Original Assignee
재단법인대구경북과학기술원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 재단법인대구경북과학기술원 filed Critical 재단법인대구경북과학기술원
Priority to KR1020150102896A priority Critical patent/KR101691067B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101691067B1 publication Critical patent/KR101691067B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/65—Raman scattering
    • G01N21/658—Raman scattering enhancement Raman, e.g. surface plasmons
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y15/00—Nanotechnology for interacting, sensing or actuating, e.g. quantum dots as markers in protein assays or molecular motors
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y20/00—Nanooptics, e.g. quantum optics or photonic crystals

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

본 발명은 무표지 3차원 금속 나노 밀집체 동기화 표면증강 라만산란법을 이용한 단백질 검출방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 단백질의 검출방법은 어떠한 표지도 연관되지 않고 표면처리된 3차원의 금속 나노입자 밀집체를 이용하여 단백질의 선택적 반응을 유도하고 이를 표면증강 라만산란법을 통해 0.01 ng/mL의 매우 낮은 농도 단위로 측정하여 검출할 수 있는 효과가 있다.

Description

무표지 금속 3차원 나노 밀집체 동기화 표면증강 라만산란법을 이용한 단백질 검출방법{Detection method of protein using surface enhanced raman scattering with Label free 3-dimensional metal nanoparticle aggregates}
본 발명은 무표지 금속 3차원 나노 밀집체 동기화 표면증강 라만산란법을 이용한 단백질 검출방법에 관한 것이다.
라만 분광법(Raman spectroscopy)은 주어진 시스템(system)에서의 진동(vibrational), 회전(rotational) 및 다른 저-주파 모드(low-frequency modes)를 감지하는 능력이 있으므로, 분석용 과학(analytical science)을 위한 비-파괴적이고(non-destructive) 무-표지(label-free)한 방식(modality)이다. 하지만, 라만 분광법은 낮은 산란 단면적(low scattering cross-section)으로 인하여 적용이 제한된다. 상기 제한을 극복하기 위하여 몇몇의 기술적인 접근이 이루어졌으며, 표면증강 라만산란법(Surface Enhanced Raman Scattering, SERS)이 유효한 접근이었다.
SERS 효과는 전자기장(electromagnetic field) 효과에 의한 낮은 라만 신호(low Raman signal)를 보상하기 위하여 자유 전자가 풍부한 금속 표면(예를 들면, Au, Ag 및 Cu)의 인근에 타겟 분자(또는 단일 분자)를 위치시킴으로써 얻어진다. SERS는 종종 나노 물질의 크기, 모양 및 기하학(geometry)에 높은 의존도(highly dependent)를 갖는 장 강화(field enhancements)를 극대화하기 위하여 나노 규모의 금속 구조체(nanoscale metallic structures)의 디자인에 사용된다.
특히, SERS는 벌집-모양(honeycomb-shaped) 금속성의 섬 배열(metallic island arrays)에 사용될 수 있음이 입증된 바 있으며, 여기서 주기적인 섬(periodic islands)은 여기 광자(excitation photons)의 임의로 위치된 조명(illumination)으로 인하여 균일하게 분산되는 라만 산란을 나타냈다.
한편, 금속 구조체 사이의 틈(핫스팟, hotspots)은 의도되는 라만 산란 단면적(Raman scattering cross-sections)을 얻기 위한 매우 국부적인(highly localized) 플라즈몬을 유도하는데 중요한 것으로 알려져 있다. 따라서, 안정한 라만-강화 기판/칩(substrates/chips)을 얻기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 군집형(Clustered) 나노구조체는 안정하고 강하게 집단의 전자기 증강(collective electromagnetic enhancements)을 위한 가장 유망한 물질이다. 상기 나노구조체의 밀집(aggregation)은 임의적으로 발생하거나, 설계를 통해 유도할 수 있다.
임의적으로 발생한 구조체와 관련하여 프랙털 나노군집체(fractal nanoclusters)의 형성을 유도하는 라만 여기 레이저 빔의 초점 용량(focal volume) 내에서 국부적인 표면 플라즈몬을 극대화하기 위한 연구가 진행되었으며, 여기서 여기된 국부 쌍극자(dipoles)는 라만의 무분별한 장(field) 강화 및 비선형의 광학 산란을 돕는다. 하지만, 수많은 핫스팟의 낮은 제어능력과 임의로 형성되는 프랙털과 관련하여 제한되는 신호 재현성으로 인하여 실질적인 적용을 어렵게 한다. 따라서, 금속성의 섬(metallic islands) 또는 나노입자 배열을 디자인하기 위하여 가공된 SERS 기판이 광범위하게 발달되었다. 하지만, 상기 가공된 기판의 고유한 높은 가격과 시간 소비로 인하여 비특허문헌 1에서는 가격이 저렴하고 용이하게 SERS 기판을 준비할 수 있도록, 건조된 나노입자-분석 방울 끝에서 형성되는 커피 고리-유사한 구조(coffee ring-like structures)를 사용하는 내용이 개시되어 있다.
한편, C-반응 단백질(C-Reactive Protein, CRP)은 인체 내의 혈액 속에서 흔히 발견되는 단백질로 그 양이 섭취하는 음식, 흡연 및 정신적 육체적 건강상태와 밀접하게 연관되어 있다. 건강한 성인의 경우 1 μg/mL 보다 작은 양이 검출되지만, 염증이 있는 경우 그 양이 쉽게 100배 이상 증가하는 것으로 알려져 있어 임상적으로 급성 염증, 당뇨 및 혈관계 질환을 예측하는 데 중요한 표지물질 중의 하나로 간주되고 있다.
C-반응 단백질은 125kDa 정도의 질량을 갖는 5각형 형태의 단백질 복합체로써 각각의 질량이 25kDa인 하부구조체 5개가 비공유 결합으로 연결되어 있으며, 세포 괴사를 촉진하기 위하여 죽어가는 세포 표면에서 발현되는 포스포코올린(Phosphocholine, PC)으로 불리는 화학 구조체와 매우 잘 반응을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 포스포코올린은 C-반응 단백질을 선택적으로 검출하는 데 흔하게 사용된다.
현재, C-반응 단백질은 효소결합 면역 분석법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA), 표면 플라즈몬 공명법(Surface Plasmon Resonance, SPR) 또는 자성 나노입자(Magnetic nanoparticles)를 이용한 방법으로 측정되어 왔으며, 최근에는 상술한 표면증강 라만산란법(Surface Enhanced Raman Scattering, SERS)이 새로이 도입되어 ELISA에서 흔히 사용되는 반응에 의해 생성된 형광표지를 SERS 방법으로 모니터링 하는 방법이 각광을 받고 있고, 그 측정 범위도 0.3 ng/mL에 이르는 것으로 보고되고 있다. 하지만, 상기 방법은 ELISA에 비해 뚜렷한 비교우위를 점하기 힘든 문제가 있다. 근적외선 파장의 레이저를 이용해 혈액에서 C-반응 단백질을 직접적으로 검출하는 방법도 소개되고 있으나, 측정범위가 30 μg/mL 정도로 약한 문제가 있다.
이에, 순수하게 C-반응 단백질뿐만 아니라, 다양한 종류의 단백질을 어떠한 표지도 연관되지 않고 선택적으로 정량적 분석이 가능하고 측정범위가 우수한 검출방법에 대한 개발이 요구되는 실정이다.
이에, 본 발명자들은 상기 요구를 충족하는 단백질의 검출방법을 연구하던 중, 본 발명에 따른 단백질의 검출방법은 어떠한 표지도 연관되지 않고 표면처리된 3차원의 금속 나노입자 밀집체를 이용하여 단백질의 선택적 반응을 유도하고 이를 표면증강 라만산란법을 통해 0.01 ng/mL의 매우 낮은 농도 단위로 측정하여 검출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
W. Wang, Y. Yin, Z. Tana and J. Liu, Coffee-Ring Effect-Based Simultaneous SERS Substrate Fabrication and Analyte Enrichment for Trace Analysis, Nanoscale, 2014, 6, 9588-9593.
본 발명의 목적은 어떠한 표지도 연관되지 않고 표면처리된 3차원의 금속 나노입자 밀집체를 이용하여 단백질의 선택적 반응을 유도하고 이를 표면증강 라만산란법을 통해 0.01 ng/mL의 매우 낮은 농도 단위로 측정하여 검출할 수 있는 단백질 검출방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 일면의 표면이 아민기(-NH2)로 개질된 기판을 준비하는 단계(단계 1);
상기 단계 1에서 준비한 기판을 금속 나노입자 콜로이드 용액에 담지하여, 상기 일면의 표면에 3차원의 금속 나노입자 밀집체(aggregates)를 형성하는 단계(단계 2);
상기 단계 2에서 형성된 3차원의 금속 나노입자 밀집체 표면에, 검출하고자 하는 단백질에 대하여 결합 특이적인 리간드(Ligand)를 고정화하는 단계(단계 3);
상기 단계 3에서 고정화된 리간드에 상기 단백질을 검출하고자 하는 시료를 처리하는 단계(단계 4); 및
표면증강 라만산란법(Surface Enhanced Raman Scattering, SERS)을 통해 2800 내지 3000 cm-1 파장영역의 라만 신호(Raman signals) 강도를 측정하여 상기 단백질을 검출하는 단계(단계 5);를 포함하는 무표지 금속 나노 밀집체 동기화 표면증강 라만산란법을 통한 단백질의 검출방법을 제공한다.
본 발명에 따른 단백질의 검출방법은 어떠한 표지도 연관되지 않고 표면처리된 3차원의 금속 나노입자 밀집체를 이용하여 단백질의 선택적 반응을 유도하고 이를 표면증강 라만산란법을 통해 0.01 ng/mL의 매우 낮은 농도 단위로 측정하여 검출할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 농도-유발적인(concentration-induced) Ag 나노입자 밀집체(Ag nanoparticle aggregates, AgNAs)에 포스포코올린(Phosphocholine, PC)을 기능화하고, C-반응 단백질을 함유하는 용액 방출을 제어하기 위한 모세관 틈을 형성하는 것 단계를 나타내는 이미지이다.
도 2는 <제조예 3>의 단계 3에서 20 ppm 농도의 은 나노입자 콜로이드 용액을 사용하여 기판을 고팅한 후, 광학현미경을 통해 관찰한 광학 이미지이다.
도 3은 <제조예 3>의 단계 3에서 100 ppm 농도의 은 나노입자 콜로이드 용액을 사용하여 기판을 고팅한 후, 광학현미경을 통해 관찰한 광학 이미지이다.
도 4(A)는 은나노 밀집체가 형성되어 있는 분석 칩에 있어서, 서로 다른 세 부분(1-3)을 대상으로 표면증강 라만산란법 스펙트라(SERS spectra)를 관찰한 결과를 나타내는 이미지이다. 상기 세 부분(1-3)은 모두 포스포코올린(Phosphocholine, PC)으로 고정화되어 있다.
도 4(B)는 <제조예 3>에서 제조한 분석 칩의 공간에 0.1 M의 트리스 완충용액을 떨어뜨리거나(대조군), C-반응 단백질 용액(농도 : 100 fM 내지 100 nM)을 떨어뜨려 은나노 밀집체로 모세관 현상을 통해 스며들게 한 후, 라만 현미경을 사용하여 표면증강 라만산란법 스펙트라(SERS spectra)를 관찰한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 4(C)는 상기 1 부분에서 관찰되는 C-반응 단백질의 농도 증가에 따라 비례하여 증가하는 라만 강도(Raman intensity)를 더욱 명확히 이해하기 위하여, 스펙트라의 C-H 신축 진동(stretching vibration) 영역(도 4(C)의 회색 음영으로 표시)을 확대한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 4(D)는 도 4(C)의 최대 피크(maximum peak)를 C-반응 단백질 농도에 따른 그래프로 나타낸 이미지이다.
도 5는 <제조예 3>에서 제조한 분석 칩 또는 포스포코올린(Phosphocholine, PC)을 표면에 고정화하지 않고 -OH기를 고정화한 분석 칩에 다양한 종류의 반응 단백질[C-반응 단백질(CRP), 혈청 전분질 P 요소(serum amyloid P component, SAP) 또는 포스파티딜콜린 전달단백질(phosphatidyl choline transfer protein, PCTP)]을 반응시키며 표면증강 라만산란법 스펙트라(SERS spectra)의 변화를 관찰한 이미지이다.
도 6(A)는 C-반응 단백질을 함유하지 않거나 다양한 농도로 함유하는 1% 혈청 용액과, <제조예 3>에서 제조한 분석 칩을 사용하여, C-반응 단백질의 농도 변화에 따라 표면증강 라만산란법 스펙트라(SERS spectra)를 통해 관찰되는 C-H 신축 진동(stretching vibration) 영역(약 2930 cm-1) 강도를 관찰한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 6(B)는 트리스 완충용액 또는 1% N-혈청에서 C-반응 단백질의 결합 상수를 결정하기 위하여 랭뮤어 등온선(langmuir isotherm)을 사용하여 계산된 보정 곡선(Calibration curve)이다.
도 6(C)는 트리스 완충용액 또는 1% N-혈청에서 C-반응 단백질의 농도에 따른 라만 피크 강도의 변화를 정규화하여 나타내는 이미지이며, 삽도는 면역 비색 분석(Immuno Colorimetric Assay, ICA)을 통해 1% N-혈청에서의 C-반응 단백질 결합능력을 나타내는 그래프이다.
도 7(A)는 은나노 밀집체의 두께에 따라 C-반응 단백질 검출과 관련한 라만 강도의 변화를 나타내는 이미지이고, 삽도는 C-반응 단백질 100 pM를 <제조예 3>에서 제조한 분석 칩에 가한 후 건조하고 표면의 형태를 관찰한 SEM(Scanning Electron Microscopy) 이미지이다.
도 7(B) 및 도 7(C)는 C-반응 단백질 100 pM를 <제조예 3>에서 제조한 분석 칩에 가한 후 건조하고 원자간력 현미경(Atomic Force Microscope, AFM)을 통해 은나노 밀집체의 다양한 부분의 두께를 광학 현미경 이미지를 통해 관찰한 사진이다.
도 7(D)는 C-반응 단백질 용액을 100 fM 내지 100 nM의 농도로 변화시키며 <제조예 3>에서 제조한 분석 칩에 가하는 경우, 은나노 밀집체의 상이한 두께에 따른 2930 cm-1에서의 표면증강 라만산란법 스펙트라 신호 강도를 나타내는 이미지이다.
이하, 본 발명의 상세히 설명한다.
본 발명은 일면의 표면이 아민기(-NH2)로 개질된 기판을 준비하는 단계(단계 1);
상기 단계 1에서 준비한 기판을 금속 나노입자 콜로이드 용액에 담지하여, 상기 일면의 표면에 3차원의 금속 나노입자 밀집체(aggregates)를 형성하는 단계(단계 2);
상기 단계 2에서 형성된 3차원의 금속 나노입자 밀집체 표면에, 검출하고자 하는 단백질에 대하여 결합 특이적인 리간드(Ligand)를 고정화하는 단계(단계 3);
상기 단계 3에서 고정화된 리간드에 상기 단백질을 검출하고자 하는 시료를 처리하는 단계(단계 4); 및
표면증강 라만산란법(Surface Enhanced Raman Scattering, SERS)을 통해 2800 내지 3000 cm-1 파장영역의 라만 신호(Raman signals) 강도를 측정하여 상기 단백질을 검출하는 단계(단계 5);를 포함하는 무표지 금속 나노 밀집체 동기화 표면증강 라만산란법을 통한 단백질의 검출방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 따른 단백질의 검출방법을 단계별로 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 단백질의 검출방법에 있어서, 상기 단계 1은 본 발명은 일면의 표면이 아민기(-NH2)로 개질된 기판을 준비하는 단계이다.
이때, 상기 기판은 유리, 실리카, 사파이어, ITO(Indium Tin Oxide) 유리 등 친수화후 아민기를 도입할 수 있는 옥사이드(Oxide) 계열의 정질 또는 비정질 투명구조체라면 모두 사용 가능하다.
본 발명에 따른 단백질의 검출방법에 있어서, 상기 단계 2는 상기 단계 1에서 준비한 기판을 금속 나노입자 콜로이드 용액에 담지하여, 상기 일면의 표면에 3차원의 금속 나노입자 밀집체(aggregates)를 형성하는 단계이다.
이때, 상기 금속은 금, 은, 알루미늄 등을 사용할 수 있다.
또한, 상기 금속 나노입자 콜로이드 용액은 탈이온수에 금속 나노입자를 분산시킨 용액을 사용할 수 있다.
나아가, 상기 기판을 금속 나노입자 콜로이드 용액에 담지하는 시간과 온도는 특별한 제한은 없으나 상온에서 12-36시간 동안 담지하는 것이 바람직하다.
상기 3차원의 금속 나노입자 밀집체는, 구형의 금속 나노입자가 50 ppm 이상의 농도로 분산되어 있는 콜로이드 용액에 친수화(hydrophilic) 처리된 기판을 담지할 경우 자발적으로 금속 나노입자가 기판 표면에 다중 층으로 적층되어 형성된다.
이때, 상기 금속 나노입자는 직경이 25 내지 60 nm, 바람직하게는 30 내지 50 nm, 더욱 바람직하게는 35 내지 45 nm인 것을 사용할 수 있다.
또한, 상기 층은 2 내지 10층인 것이 바람직하고, 4 내지 9층인 것이 더욱 바람직하고, 5 내지 8층인 것이 더욱더 바람직하고, 6 내지 7층인 것이 가장 바람직하다. 상기 바람직한 층의 범위를 벗어난 경우 라만 신호의 강도가 약화되어 단백질 검출 하한 농도가 증가하는 문제가 있다.
본 발명에 따른 단백질의 검출방법에 있어서, 상기 단계 3은 상기 단계 2에서 형성된 3차원의 금속 나노입자 밀집체 표면에, 검출하고자 하는 단백질에 대하여 결합 특이적인 리간드(Ligand)를 고정화하는 단계이다.
이때, 상기 단백질은 리간드 특이적 결합을 하는 단백질이라면 모두 사용 가능하지만, 가장 바람직하게는 C-반응 단백질(C-reactive protein)을 사용할 수 있다.
또한, 상기 리간드는 상기 단백질의 결합자리(Binding site)에 대응하는 리간드라면 모두 사용 가능하지만, 가장 바람직하게는 포스포코올린(Phosphocholine, PC)을 사용할 수 있다. 이때, 상기 리간드는 상기 단백질의 결합자리(Binding site)에 대응하도록 배향되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 단백질의 검출방법에 있어서, 상기 단계 4는 상기 단계 3에서 고정화된 리간드에 상기 단백질을 검출하고자 하는 시료를 처리하는 단계이다.
이때, 상기 시료는 검출하고자 하는 단백질을 포함하지 않거나 포함할 수 있고, 검출하고자 하는 단백질을 포함하는 경우 리간드-단백질 특이적 결합이 유도된다.
본 발명에 따른 단백질의 검출방법에 있어서, 상기 단계 5는 표면증강 라만산란법(Surface Enhanced Raman Scattering, SERS)을 통해 2800 내지 3000 cm-1 파장영역의 라만 신호(Raman signals) 강도를 측정하여 상기 단백질을 검출하는 단계이다.
이때, 상기 2800 내지 3000 cm-1 파장영역의 라만 신호(Raman signals)는, 검출하고자 하는 단백질에 존재하는 C-H의 신축 진동(stretching vibration)으로 인하여 발생하는 것을 특징으로 한다.
한편, 본 발명의 또 다른 하나의 실시형태로 하기 단계 1-7의 C-반응 단백질의 검출방법을 제공한다.
단계 1 : 상업적으로 이용 가능한 제1기판의 표면을 수산화(hydroxylate)하기 위하여 피라나 용액(piranha solution), 황산, 수산화나트륨 등의 시약에 상기 제1기판을 담지하거나, UV·오존 처리 또는 산소 플라즈마 처리를 수행한다. 이때, 상기 담지 시간은 특별한 제한은 없으나 20분 내지 1시간이 바람직하다.
상기 제1기판의 표면에 수산기(-OH)가 도입되면 탈이온수, 메틸 알코올, 에틸 알코올, 이소프로필 알코올 등의 용매로 세척한 후, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 함유하는 용액에 상기 제1기판을 담지하여 표면을 유기 실란(organosilane), 즉 아민기(-NH2)로 기능화한다.
[화학식 1]
Figure 112015070590652-pat00001
(상기 화학식 1에서,
R1, R2 및 R3는 독립적으로 수산기(-OH)와 반응하여 공유결합을 형성할 수 있는 작용기라면 특별한 제한 없이 사용 가능하고;
q는 1 내지 6의 정수이다.
더욱 바람직하게는,
R1, R2 및 R3는 독립적으로 메톡시이고;
q는 2 내지 4의 정수이다).
단계 2 : 금속 나노입자가 균일하게 분산되어 있는 콜로이드 용액에 상기 단계 1의 제1기판을 담지한다. 이때, 담지 시간과 온도는 특별한 제한은 없으나 상온에서 12-36시간 동안 담지하는 것이 바람직하다.
여기서, 상기 기판에 코팅되는 금속 나노입자는 콜로이드 용액의 금속 나노입자 농도에 의하여 형태가 결정되며, 일반적으로 은 나노입자의 농도를 50 ppm 이상 유지시키면 3차원의 금속 나노입자 밀집체가 자발적으로 생성된다.
단계 3 : 상기 단계 2의 제1기판을 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 함유하는 용액에 담지한다. 이때, 상기 단계 2에서 생성된 3차원의 금속 나노입자 밀집체와 하기 화학식 2로 표시되는 화합물의 티올기(-SH)가 결합하며, 화학식 2로 표시되는 화합물이 고정된다.
[화학식 2]
Figure 112015070590652-pat00002
(상기 화학식 1에서,
n은 8 내지 12의 정수이고; 및
m은 1 내지 5의 정수이다).
단계 4 : 상기 단계 3의 제1기판 표면을 포스포코올린(Phosphocholine, PC)으로 고정화하기 위하여, 1,3-쌍극성 고리화 첨가 반응을 통한 클릭 화학을 사용한다. 보다 구체적으로는, 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물을 함유하는 용액을 상기 단계 3의 제1기판에 떨어뜨려 반응시킨다. 이때, 상기 화학식 2로 표시되는 화합물의 아지드기(-N3)와, 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물의 아세틸렌기(-C≡CH)가 결합하며, 화학식 3으로 표시되는 화합물이 고정된다.
[화학식 3]
Figure 112015070590652-pat00003
(상기 화학식 2에서,
k는 2 내지 10의 정수이다).
이에, 하기 화학식 4로 표시되는 C-반응 단백질과 특이적 결합을 하는 포스포코올린(Phosphocholine, PC)이 기판의 표면에 들어나게 된다.
[화학식 4]
Figure 112015070590652-pat00004

단계 5 : 상기 단계 1-4가 수행된 제1기판의 일면과, 제2기판의 일면을 접착제를 사용하여 마주보게 접착하여 분석 칩을 제조하되, 상기 제1기판의 좌·우 변에만 접착제를 도포하여 제1기판과 제2기판 사이 소정의 공간을 형성한다.
이때, 상기 공간은 0.5 내지 2 mm의 공간이 형성되도록 접촉시키는 것이 바람직하며, 1 mm의 공간이 형성되도록 접촉시키는 것이 가장 바람직하다. 상기 공간이 0.5 mm 미만일 경우, 추후 C-반응 단백질을 검출하기 위하여 분석시료를 상기 공간에 주입할 때 상기 공간에의 분석시료 도입이 용이하지 못한 문제가 있고, 상기 공간이 2 mm 초과일 경우, 추후 C-반응 단백질을 검출하기 위하여 분석시료를 상기 공간에 주입할 때 3차원의 금속 나노입자 밀집체로의 분석시료 흡수(모세관 현상)가 유도되지 못하는 문제가 있다.
또한, 상기 접착제는 에폭시계 접착제를 사용하는 것이 바람직하다.
단계 6 : 상기 단계 5의 분석 칩에 형성되어 있는 공간에 C-반응 단백질을 검출하기 위한 분석시료를 주입한다. 이때, 상기 분석시료는 모세관 현상에 의해 자발적으로 3차원의 금속 나노입자 밀집체로 스며든다. 여기서, 상기 분석시료에 C-반응 단백질이 존재하는 경우 리간드-단백질 특이적 결합을 통해 C-반응 단백질이 고정화된다.
단계 7 : 상기 단계 6의 분석 칩을 세척하여 리간드-단백질 특이적 결합이 유도되지 않은 불순물을 제거한 후, 표면증강 라만산란법(Surface Enhanced Raman Scattering, SERS)을 통해 2800 내지 3000 cm-1 파장영역의 라만 신호(Raman signals) 강도를 측정하여 C-반응 단백질을 검출할 수 있다.
본 발명에 따른 단백질 검출방법은 특이적 리간드-단백질 상호작용을 확인하는 무표지 표면증강 라만산란법(Surface Enhanced Raman Scattering, SERS)이다.
농도-유발적인(concentration-induced) Ag 나노입자 밀집체(Ag nanoparticle aggregates, AgNAs)를 사용하는 무반사(reflection-free) SERS 칩(chip)은 C-H 신축 진동(stretching vibration) 모드, 즉 2800 내지 3000 cm-1에서 PC-CRP 상호작용의 정성적인(qualitative) 검출을 가능하게 한다. 이때, 상기 모드의 분해성(resol-vability)은 지문 영역(1000 - 1600 cm-1) 및 저주파 영역(900 cm-1 이하)과 비교하여 우수하다.
특히, <제조예 3>에서 제조한 분석 칩을 사용한 표면증강 라만산란법(Surface Enh-anced Raman Scattering, SERS)을 통해 C-반응 단백질의 농도에 따른 검출능력을 평가하기 위하여 실험을 수행한 결과, C-반응 단백질 용액의 농도에 따라 C-H 신축 진동(stretching vibration) 영역에 해당하는 진동모드가 특정한 부위의 은나노 구조체(특히 1 부분)에서 민감하게 변화하는 것과 감도가 0.01 ng/mL로 매우 우수함을 확인하였다(실시예 1의 도 4 참조).
또한, C-반응 단백질과 포스포코올린의 결합 특이성을 평가하기 위하여 실험을 수행한 결과, C-반응 단백질은 오직 포스포코올린(Phospho-choline, PC)에 대하여 민감한 것을 알 수 있으며, 상기 포스포코올린 또한 다른 단백질(SAP 또는 PCTP)과는 반응하지 않는 것으로 나타났다(실시예 2의 도 5 참조).
나아가, 1% 혈청 용액 하에 C-반응 단백질이 특이적으로 검출되는지 확인하기 위하여 실험을 수행한 결과, 1% N-혈청 하에서 C-반응 단백질의 농도를 증가시키는 경우, 트리스 완충용액에서 C-반응 단백질의 농도를 증가시키는 경우와 유사하게 농도 의존적으로 라만 강도가 증가하는 것으로 나타났으며, 감도가 0.1 ng/mL로 우수함을 확인하였다(실시예 3의 도 6 참조).
또한, 본 발명에 따른 분석 칩에 형성되는 은나노 밀집체의 두께에 따라 C-반응 단백질에 대한 신호가 변화하는지 관찰하기 위하여 실험을 수행한 결과, 은나노 밀집체의 두께가 두꺼워질수록 2930 cm-1 부근에서의 신호 강도가 점점 강해지며, 특히 두께 200 nm 부근에서 신호가 가장 강한 것으로 나타났다. 아울러, 200 nm 두께(약, 5개의 층)의 은나노 밀집체 부근의 경우 C-반응 단백질이 밀집하여 흡수되 두꺼운 생물막(thick biological film)이 형성되어 있는 반면, 40 nm 두께(단일층)의 은나노 밀집체 부근의 경우 C-반응 단백질의 흡수가 거의 관찰되지 않으며 오직 은나노 입자들이 밀집되어 있는 것으로 나타났다. 이때, 표면증강 라만산란법 스펙트라의 신호는 은나노 밀집체의 두께가 두꺼워질수록 강해지며, 은나노 밀집체의 두께가 280 nm(약, 7개 층)로 가까워질수록 신호 강도의 증가 정도가 점차적으로 완만해 지는 것으로 나타났다(실험예 1의 도 7 참조).
이하, 본 발명의 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.
< 제조예 1> 2-(2-(2- 아지도에톡시 ) 에톡시 )에틸 11-티오운데카노에이트(2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethyl 11- thioundecanoate )의 제조
단계 1 : 11-( 트리틸티오 ) 언데카노익 엑시드의 제조
Figure 112015070590652-pat00005
11-마르캅토언데카노익 엑시드(Mercaptoundecanoic acid) 1.00 g(4.58 mmol), 트리틸 클로라이드(trityl chloride) 1.40 g(5.02 mmol) 및 포타슘 카보네이트(potassium carbonate) 0.95 g(6.87 mmol)를 아세토나이트릴 20 mL에 첨가하여 100로 가열하며 교반하였다. 7시간 동안 교반한 후, 아세토나이트릴을 감압 증류로 제거하고, 클로로포름에 용해시킨 후, 0.1N 하이드로클로라이드 수용액을 세 차례에 걸쳐 세척하였다. 클로로포름을 수집하여 마그네슘 설페이트를 첨가하여 건조시키고, 상기 건조된 클로로포름을 감압 필터하여 마그네슘 설페이트를 제거한 후, 감압 증류하여 클로로포름을 제거하고, 전개액(헥산:에틸 아세테이트=9:1)으로 로딩하여 트리틸 클로라이드를 제거한 후, 전개액(헥산:에틸 아세테이트=1:1)을 사용한 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하여 표제 화합물을 1.76 g 얻었다(수율 83%).
1H NMR(CDCl3 400MHz): δ(ppm) 7.42-7.17(m, (C6H5)3-C-S-CH2-, 15H), 2.35(t, -CH2-CH2-CH2-C(O)OH, J=7.6, 2H), 2.14(t, -C-S-CH2-CH2-, J=7.6, 2H),1.65(p, -CH2-CH2-CH2-C(O)OH, J=7.2, 2H), 1.41-1.12(m, -S-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-, 14H).
단계 2 : 2-(2-(2- 아지도에톡시 ) 에톡시 )에탄올의 제조
Figure 112015070590652-pat00006
트리에틸렌 글리콜 5.00 g(33.3 mmol) 및 트리에틸 아민 2.70 mL(19.40 mmol)을 클로로포름 50 mL에 첨가하고, 얼음조를 사용하여 0℃로 냉각시킨 후, 메탄설포닐 클로라이드 1.00 mL(12.90 mmol)를 천천히 첨가하였다. 이후, 얼음조를 제거하고, 상온에서 20분 동안 교반하였다. 용매를 감압 증류로 제거하고, 전개액(디클로로메탄:메탄올=95:5)을 사용하여 불순물들을 제거하여 2-(2-(2-하이드록시에톡시)에톡시)에틸 메탄설포네이트 2.55 g을 얻었다.
상기 2-(2-(2-하이드록시에톡시)에톡시)에틸 메탄설포네이트 2.55 g, 소듐 아자이드 1.10 g(16.90 mmol) 및 포타슘 아이오다이드 1.40 g(8.43 mmol)를 에탄올 50 mL에 첨가하고, 110℃로 가열하며 교반하였다. 14시간 동안 교반한 후, 용매를 감압 증류로 제거하고, 물에 용해시킨 후, 클로로포름으로 세 차례에 걸쳐 추출하였다. 상기 추출한 클로로포름을 수집하여 마그네슘 설페이트를 첨가하여 건조하고, 건조된 클로로포름을 감압 필터하여 마그네슘 설페이트를 제거한 후, 감압 증류하여 클로로포름을 제거하여 표제 화합물 0.91 g을 얻었다(수율 16%).
1H NMR(CDCl3 400MHz): δ(ppm) 3.75-3.59(m, -O-CH2-CH2-O-, 10H), 3.40(t, -O-CH2-CH2-N3, J=4.8, 2H).
단계 3 : 2-(2-(2- 아지도에톡시 ) 에톡시 )에틸 12-( 트리틸티오 ) 도데카노에이트 (2-(2-(2- azidoethoxy ) ethoxy )ethyl 12-( tritylthio ) dodecanoate )의 제조
Figure 112015070590652-pat00007
상기 단계 1에서 얻은 11-(트리틸티오)언데카노익 엑시드 1.76 g(3.81 mmol), 상기 단계 2에서 얻은 2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에탄올 0.73 g(4.17 mmol), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드 1.10 g(5.74 mmol) 및 N,N'-디메틸아미노 피리딘 0.70 g(5.73 mmol)을 클로로포름 20 mL에 첨가하고 상온에서 교반하였다. 17시간 교반한 후, 반응액을 클로로포름으로 희석하고, 0.1 N 하이드로클로라이드 수용액 및 브라인으로 세 차례에 걸쳐 세척하였다. 클로로포름을 수집하고, 마그네슘 설페이트를 첨가하여 건조시킨 후, 건조된 클로로포름을 감압 필터하여 마그네슘 설페이트를 제거하고, 감압 증류하여 클로로포름을 제거한 후, 전개액(헥산:에틸 아세테이트=3:1)을 사용한 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하여 표제 화합물 1.85 g을 얻었다(수율 79%).
1H NMR(CDCl3 400MHz): δ(ppm) 7.40-7.17(m, (C6H5)3-C-S-CH2-, 15H), 4.24(m, -CH2-C(O)O-CH2-CH2-, 2H), 3.71-3.64(m, -O-CH2-CH2-O-, 8H), 3.39(t, -O-CH2-CH2-N3 J=4.8, 2H), 2.33(t, -CH2-CH2-CH2-C(O)OH, J=7.6, 2H), 2.14(t, -C-S-CH2-CH2-, J=7.6, 2H), 1.64(m, -CH2-CH2-CH2-C(O)OH, 2H), 1.41-1.12(m, -S-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-, 14H).
단계 4 : 2-(2-(2- 아지도에톡시 ) 에톡시 )에틸 11-티오운데카노에이트(2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethyl 11- thioundecanoate )의 제조
Figure 112015070590652-pat00008
상기 단계 3에서 얻은 2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에틸 12-(트리틸티오)도데카노에이트 1.80 g(2.92 mmol), 트리에틸실란 0.56 mL(3.51 mmol) 및 트리플루오로아세트산 2.00 mL을 클로로포름 8 mL에 첨가하고 상온에서 교반하였다. 4시간 동안 교반한 후, 반응액을 클로로포름으로 희석시키고, 소듐 바이카보네이트 수용액을 세 차례에 걸쳐 세척하였다. 클로로포름을 수집하여 마그네슘 설페이트를 첨가하여 건조시키고, 건조된 클로로포름을 감압 필터하여 마그네슘 설페이트를 제거한 후, 감압 증류하여 클로로포름을 제거하고, 전개액(헥산:에틸 아세테이트=3:1)을 사용한 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하여 표제 화합물 0.47 g을 얻었다(수율 43%).
1H NMR(CDCl3 400MHz): δ(ppm) 4.24(m, -CH2-C(O)O-CH2-CH2-, 2H), 3.71-3.64(m, -O-CH2-CH2-O-, 8H), 3.40(t, -O-CH2-CH2-N3 J=4.8, 2H), 2.54(q, -C-S-CH2-CH2-, J=7.6, 2H), 2.34(t, CH2-CH2-CH2-C(O)OH, J=7.6, 2H), 1.63(m, -CH2-CH2-CH2-C(O)OH, -S-CH2-CH2-CH2-, 2H), 1.38-1.27(m, -CH2-CH2-CH2-CH2-, 12H).
< 제조예 2> 6- 프로파질헥실 포스포릴콜린(6- propargylhexyl phosphoryl choline)의 제조
단계 1 : 6-( 프로프 -2- 이닐옥시 ) 헥산 -1-올의 제조
Figure 112015070590652-pat00009
DMF (20 mL)에 용해된 1,6-헥산디올 (3 g, 25.4 mmol) 용액을, 얼음조 내에서 DMF (20 mL)에 용해된 수소화 나트륨 (1.52 g, 38.1 mmol)의 현탁액에 방울 단위로 첨가한 후, 30분 동안 교반하였다. DMF (20 mL)에 용해된 프로파질 브로마이드 (5.7 g, 38.1 mmol)를 첨가하고, 상온에서 20시간 동안 교반하였다. 감압 하에 용매를 제거하고, 조 생성물을 디에틸 에테르(diethyl ether)에 용해시켰다. 물로 세척한 후, 무수 마그네슘 설페이트로 건조하고, 실리카겔을 사용한 컬럼 크로마토그래피(Rf = 0.5, 헥산:EtOAc=1:1)를 통해 정제하여 표제 화합물 1.80 g을 얻었다(수율 45.4%).
IR: 3373, 3292, 2933, 2858, 1093; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.13(s, 2H, HCCCH2O), 3.59(t, 2H, CH2OH), 3.52(t, 2H, CH2OCH2), 3.03(s, 1H, CH2OH), 2.48(s, 1H, HCCCH2O), 1.58(m, 4H, OCH2CH2CH2CH2CH2), 1.38(m, 4H, OCH2CH2CH2CH2); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 79.8, 74.3, 70.0, 62.3, 57.9, 32.5, 29.3, 25.8, 25.5; Exact mass calcd for C9H16O2: 156.12, found: 179 [M+Na]+.
단계 2 : 2-((6-( 프로프 -2-엔-1- 일옥시 ) 헥실 ) 옥시 )-1,3,2- 디옥사포스포레인 -2-옥 사이드 의 제조
Figure 112015070590652-pat00010
상기 단계 1에서 제조한 화합물 (600 mg, 3.84 mmol), 2-클로로-1,3,2-디옥사포스포란 2-옥사이드 (1.09 g, 7.68 mmol) 및 트리에틸아민 (777 mg, 7.68 mmol)을 30 mL의 DCM에 용해시키고, 이를 상온에서 72시간 동안 암실에서 교반하였다. 용매를 감압 하에 제거하고, 조 생성물을 실리카겔을 사용한 컬럼 크로마토그래피(Rf = 0.3, 헥산:EtOAc=1:4)를 통해 정제하여 표제 화합물 700 mg을 얻었다(수율 69.5%).
단계 3 : 6- 프로파질헥실 포스포릴콜린의 제조
Figure 112015070590652-pat00011
상기 단계 2에서 제조한 화합물 (700 mg, 2.66 mmol) 및 트리메틸아민 (1.57 g, 26.6 mmol)을 8 mL의 아세토나이트릴(acetonitrile)에 용해시키고, 60℃에서 20시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에 제거하고, 조 생성물을 실리카겔을 사용한 컬럼 크로마토그래피(Rf = 0.2, 클로로포름:메탄올 2:1 및 클로로포름:메탄올:물 50:50:4)를 통해 정제하였다. 용매를 감압 하 제거하고, 잔여물을 무수 클로로포름에 용해시킨 후, 필터하여 표제 화합물 411 mg을 얻었다(수율 48.1%).
IR: 3350, 3296, 2936, 2860, 1086, 1059; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 4.28(m, 2H, POCH2CH2N+), 4.15(d, 2H, HCCCH2O), 3.90(q, 2H, CH2CH2CH2OP), 3.69(m, 2H, POCH2CH2N+), 3.54(t, 2H, HCCCH2OCH2), 3.27(s, 9H, N+(CH3)3), 2.85(t, 1H, HCCCH2O), 1.64(m, 4H, OCH2CH2CH2CH2CH2), 1.44(m, 4H, OCH2CH2CH2CH2); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 79.7, 74.8, 69.6, 65.5, 59.0, 57.4, 53.5, 30.4, 29.2, 25.6, 25.3; Exact mass calcd for C14H28NO5P: 321.17, found: 322 [M+H]+.
< 제조예 3> 단백질 검출을 위한 분석 칩의 제조
분석 칩의 제작은 기본적으로 농도가 조절된 C-반응 단백질 용액이 모세관 현상을 이용해서 은 밀집 구조체에 쉽게 접근할 수 있도록 설계하였다. 구체적인 제조과정은 하기와 같으며, 간략도를 도 1에 나타내었다.
도 1은 농도-유발적인(concentration-induced) Ag 나노입자 밀집체(Ag nanoparticle aggregates, AgNAs)에 포스포코올린(Phosphocholine, PC)을 기능화하고, C-반응 단백질을 함유하는 용액 방출을 제어하기 위한 모세관 틈을 형성하는 것 단계를 나타내는 이미지이다.
단계 1 : 상업적으로 이용 가능한 얇은 커버 글라스(thin cover slips) 기판 22 mm × 22 mm를 물과 알코올로 세척하고, 건조하였다. 이후, 상기 기판의 표면을 수산화(hydroxylate)하기 위하여 피라나 용액(H2SO4:H2O2 = 7:3(v/v))에 30분 동안 담지하고, 물로 세척한 후, 2% 3-아미노프로필트리메톡시실란(3-Aminopropyltri-methoxysilane, APTMS) 톨루엔 용액에 하루 동안 담지하여 표면을 유기 실란(organosilane), 즉 아민기로 기능화하였다.
단계 2 : 40 nm의 평균 직경을 갖는 콜로이드 은 나노입자(730807, Sigma-Aldrich, Co., Ltd.)를 원심분리하고, 은 나노입자 콜로이드 용액 초기 부피의 십분의 일(one tenth)이 되도록 물에 재-현탁(re-suspended) 하여 10 내지 100 ppm 농도의 저장액(stock solution)을 제조하였다.
단계 3 : 상기 단계 1에서 제조한 아민기로 기능화된 기판을, 상기 단계 2에서 제조한 저장액에 상온에서 24시간 동안 담지하였다. 여기서, 상기 기판에 코팅되는 은 나노입자는 상기 은 나노입자 콜로이드 용액의 농도에 의하여 형태가 결정된다. 이와 관련한 결과는 균일하게 분포된 단층 필름, 즉 은나노 입자 밀집체가 생성되지 않는 경우(20 ppm 농도의 은 나노입자를 갖는 저장액에 기판을 담지한 경우)를 광학 현미경(라만 현미경에 통합되어 있는 올리푸스사의 BX53 정립현미경을 사용)으로 촬영한 도 2와, 은나노 입자 밀집체가 생성된 경우(100 ppm 농도의 은 나노입자를 갖는 저장액에 기판을 담지한 경우)를 광학현미경으로 촬영한 도 3으로부터 확인할 수 있다. 이때, 은 나노입자 용액의 농도가 50 ppm 이상을 유지하면 은나노 밀집체가 자발적으로 생성됨을 확인하였다.
단계 4 : 상기 단계 3의 기판을 <제조예 1>에서 준비한 2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에틸 11-티오운데카노에이트[아지도(azido)-티올(thiol)]의 에탄올성 용액(2 mL)에 상온에서 12시간 동안 담지하였다. 12시간 후, 상기 기판을 에탄올로 세 차례에 걸쳐 세척한 후, 상온에서 건조하였다. 여기서, 상기 티올(thiol) 그룹은 은나노 입자로의 고정에 사용된다.
이후, 기판 표면을 포스포코올린(Phosphocholine, PC)으로 고정화하기 위하여, 1,3-쌍극성 고리화 첨가 반응을 통한 클릭 화학을 사용하였다. 보다 구체적으로는, 황산 구리(II) 5 수화물 0.5 mM, 아스코르브산나트륨 1 mM 및 상기 <제조예 2>에서 준비한 6-프로파질헥실 포스포릴콜린(6-propargylhexyl-phosphorylcholine) 1 mM를 함유하는 트리스 완충용액(0.1 M Tris, pH 8.0) 10 μL를 기판에 방울 단위로 떨어뜨려 반응시켰다. 이후, 탈이온수로 세 차례에 걸쳐 세척하였다. 여기서, 사용한 황산 구리(II):아스코르브산나트륨:6-프로파질헥실 포스포릴콜린의 몰 비는 0.5:1:1이며, 2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에틸 11-티오운데카노에이트의 아지도(azido) 그룹이 6-프로파질헥실 포스포릴콜린과 반응하여 포스포코올린(Phosphocholine, PC)이 표면에 들어나게 된다.
단계 5 : 상기 단계 4의 기판을 뒤집은 후, 현미경용 글라스에 에폭시 수지를 사용하여 약 1 mm 정도의 공간이 형성되도록 접촉시킨 뒤, 2시간 동안 건조하여 분석 칩을 제조하였다. 여기서, 상기 공간에 C-반응 단백질 용액을 떨어뜨리면 모세관 현상에 의해 자발적으로 은나노 밀집체로 스며들게 되며, 상기 용액은 질소 가스 건(gas gun)을 사용하여 쉽게 제거할 수 있다.
< 실시예 1> C-반응 단백질의 농도에 따른 검출능력 평가
<제조예 3>에서 제조한 분석 칩을 사용한 표면증강 라만산란법(Surface Enh-anced Raman Scattering, SERS)을 통해 C-반응 단백질의 농도에 따른 검출능력을 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
먼저, <제조예 3>에서 제조한 분석 칩에 C-반응 단백질 용액(Sigma-Aldrich, 농도 : 100 fM 내지 100 nM)을 분석 칩의 공간에 떨어뜨려 은나노 밀집체로 모세관 현상을 통해 스며들게 하였다. 이후, 라만 현미경(Nicolet Raman spectrometer (Almeca XR))을 사용하여 표면증강 라만산란법 스펙트라(SERS spectra)를 관찰하였다. C-반응 단백질 용액을 떨어뜨리기 전 표면증강 라만산란법 스펙트라를 통해 분석 칩을 관찰한 결과를 도 4(A)에 나타내었으며, C-반응 단백질 용액을 떨어뜨린 후 관찰되는 표면증강 라만산란법 스펙트라를 통해 분석 칩을 관찰한 결과를 도 4(B-D)에 나타내었다.
도 4(A)는 은나노 밀집체가 형성되어 있는 분석 칩에 있어서, 서로 다른 세 부분(1-3)을 대상으로 표면증강 라만산란법 스펙트라(SERS spectra)를 관찰한 결과를 나타내는 이미지이다. 상기 세 부분(1-3)은 모두 포스포코올린(Phosphocholine, PC)으로 고정화되어 있다.
도 4(A)에 나타난 바와 같이, 은나노 밀집체가 형성된 1 부분에서 라만 강도가 가장 강하게 나타났다. 반면, 은나노 밀집체가 형성되지 않고 오직 PC만 고정화되어 있는 3 부분에서는 라만 강도가 관찰되지 않는 것으로 나타났다.
도 4(B)는 <제조예 3>에서 제조한 분석 칩의 공간에 0.1 M의 트리스 완충용액을 떨어뜨리거나(대조군), C-반응 단백질 용액(농도 : 100 fM 내지 100 nM)을 떨어뜨려 은나노 밀집체로 모세관 현상을 통해 스며들게 한 후, 라만 현미경을 사용하여 표면증강 라만산란법 스펙트라(SERS spectra)를 관찰한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 4(B)에 나타난 바와 같이, 3 부분에서는 식별 가능한 정도의 어떠한 변화도 관찰되지 않았다. 하지만, 1 부분에서는 C-반응 단백질의 농도를 증가시킬수록 라만 강도(Raman intensity)가 현저히 증가하는 것으로 나타났다.
도 4(C)는 상기 1 부분에서 관찰되는 C-반응 단백질의 농도 증가에 따라 비례하여 증가하는 라만 강도(Raman intensity)를 더욱 명확히 이해하기 위하여, 스펙트라의 C-H 신축 진동(stretching vibration) 영역(도 4(C)의 회색 음영으로 표시)을 확대한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 4(C)에 나타난 바와 같이, 1 부분에서는 C-반응 단백질의 농도를 증가시킬수록 라만 강도(Raman intensity)가 현저히 증가하는 것으로 나타났다. 하지만, 지문 영역(1000 - 1600 cm-1)에서는 어떠한 변화도 관찰되지 않았다.
한편, 도 4(D)는 도 4(C)의 최대 피크(maximum peak)를 C-반응 단백질 농도에 따른 그래프로 나타낸 이미지이다.
도 4(D)에 나타난 바와 같이, 1 부분에서는 C-반응 단백질의 농도를 증가시킬수록 라만 강도(Raman intensity)가 현저히 증가하는 것으로 나타났다.
이로부터, C-반응 단백질 용액의 농도에 따라 C-H 신축 진동(stretching vibration) 영역에 해당하는 진동모드가 특정한 부위의 은나노 구조체(특히 1 부분)에서 민감하게 변화하는 것과 감도가 0.01 ng/mL로 매우 우수함을 알 수 있다.
< 실시예 2> C-반응 단백질과 포스포코올린의 결합 특이성 평가
C-반응 단백질과 포스포코올린의 결합 특이성을 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
<제조예 3>에서 제조한 분석 칩 또는 포스포코올린(Phosphocholine, PC)을 표면에 고정화하지 않고 -OH기를 고정화한 분석 칩에 다양한 종류의 반응 단백질[C-반응 단백질(CRP), 혈청 전분질 P 요소(serum amyloid P component, SAP) 또는 포스파티딜콜린 전달단백질(phosphatidyl choline transfer protein, PCTP)]을 반응시키며 표면증강 라만산란법 스펙트라(SERS spectra)의 변화를 관찰하였다.
이때, <제조예 3>의 분석 칩은 표면이 포스포코올린(Phosphocholine, PC)으로 고정화되어 있으며, 포스포코올린(Phosphocholine, PC)을 표면에 고정화하지 않고 -OH기를 고정화한 분석 칩은 표면이 -OH기로 고정화되어 있다.
또한, 혈청 전분질 P 요소(serum amyloid P component, SAP)는 펜트라신(pentra-xin) 군에 포함되는 단백질이며, 각각의 질량이 25kDa인 하부구조체 5개로 구성되며 단백질 시퀀스(sequence)에 있어 C-반응 단백질과 약 51% 유사하므로, 프롤린(proline) 말단 기와 선택적으로 반응하지만 포스포코올린(Phosphocholine, PC)과는 반응하지 않는다.
나아가, 포스파티딜콜린 전달단백질(phosphatidyl choline transfer protein, PCTP)은 C-반응 단백질에 상응하는 단백질 스퀀스는 아니지만, 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine)의 포스포코올린(Phosphocholine, PC) 헤드 그룹과 결합한다.
상기 표면증강 라만산란법 스펙트라(SERS spectra)의 변화를 관찰한 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5는 <제조예 3>에서 제조한 분석 칩 또는 포스포코올린(Phosphocholine, PC)을 표면에 고정화하지 않고 -OH기를 고정화한 분석 칩에 다양한 종류의 반응 단백질[C-반응 단백질(CRP), 혈청 전분질 P 요소(serum amyloid P component, SAP) 또는 포스파티딜콜린 전달단백질(phosphatidyl choline transfer protein, PCTP)]을 반응시키며 표면증강 라만산란법 스펙트라(SERS spectra)의 변화를 관찰한 이미지이다.
보다 구체적으로는, 도 5의 빨간색의 원 및 곡선은 <제조예 3>의 분석 칩과 C-반응 단백질을 사용한 경우 2930 cm-1 부근의 라만 강도를 나타낸 것이고; 검은색의 원 및 곡선은 <제조예 3>의 분석 칩과 혈청 전분질 P 요소(serum amyloid P component, SAP)를 사용한 경우 2930 cm-1 부근의 라만 강도를 나타낸 것이고; 회색의 원 및 곡선은 포스포코올린(Phosphocholine, PC)을 표면에 고정화하지 않고 -OH기를 고정화한 분석 칩과 C-반응 단백질을 사용한 경우 2930 cm-1 부근의 라만 강도를 나타낸 것이고; 및 초록색의 원 및 곡선은 <제조예 3>의 분석 칩과 포스파티딜콜린 전달단백질(phosphatidyl choline transfer protein, PCTP)를 사용한 경우 2930 cm-1 부근의 라만 강도를 나타낸 것이다. 도 5의 삽도는 면역 비색 분석(Immuno Colorimetric Assay, ICA)을 통해 450 nm 부근에서 측정된 광학 밀도를 나타낸다.
도 5에 나타난 바와 같이, C-반응 단백질은 오직 포스포코올린(Phospho-choline, PC)에 대하여 민감한 것을 알 수 있으며, 상기 포스포코올린 또한 다른 단백질(SAP 또는 PCTP)과는 반응하지 않는 것으로 나타났다.
< 실시예 3> 혈청 내에 존재하는 C-반응 단백질 검출능력 평가
상기 <실험예 2>에서 확인한 C-반응 단백질과 포스포코올린의 결합 특이성이 임상에 적용되기 위해서는 혈청(serum) 내 존재하는 많은 종류의 단백질의 존재 하에서도 특이성이 유지되어야 한다. 이에, 1% 혈청 용액 하에 C-반응 단백질이 특이적으로 검출되는지 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
C-반응 단백질을 함유하지 않거나 다양한 농도로 함유하는 1% 혈청 용액과, <제조예 3>에서 제조한 분석 칩을 사용하여, C-반응 단백질의 농도 변화에 따라 표면증강 라만산란법 스펙트라(SERS spectra)를 통해 관찰되는 강도(cps) 변화를 측정하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6(A)는 C-반응 단백질을 함유하지 않거나 다양한 농도로 함유하는 1% 혈청 용액과, <제조예 3>에서 제조한 분석 칩을 사용하여, C-반응 단백질의 농도 변화에 따라 표면증강 라만산란법 스펙트라(SERS spectra)를 통해 관찰되는 C-H 신축 진동(stretching vibration) 영역(약 2930 cm-1) 강도를 관찰한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 6(B)는 트리스 완충용액 또는 1% N-혈청에서 C-반응 단백질의 결합 상수를 결정하기 위하여 랭뮤어 등온선(langmuir isotherm)을 사용하여 계산된 보정 곡선(Calibration curve)이다.
도 6(C)는 트리스 완충용액 또는 1% N-혈청에서 C-반응 단백질의 농도에 따른 라만 피크 강도의 변화를 정규화하여 나타내는 이미지이며, 삽도는 면역 비색 분석(Immuno Colorimetric Assay, ICA)을 통해 1% N-혈청에서의 C-반응 단백질 결합능력을 나타내는 그래프이다.
도 6(A-C)에 나타난 바와 같이, 1% N-혈청 하에서 C-반응 단백질의 농도를 증가시키는 경우, 트리스 완충용액에서 C-반응 단백질의 농도를 증가시키는 경우와 유사하게 농도 의존적으로 라만 강도가 증가하는 것으로 나타났으며, 감도가 0.1 ng/mL로 우수함을 알 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 검출방법은 임상(혈청)에 적용하여 우수한 감도로 C-반응 단백질을 검출할 수 있음을 확인할 수 있다.
< 실험예 1> 은나노 밀집체의 두께에 따른 C-반응 단백질 검출능력 평가
본 발명에 따른 분석 칩에 형성되는 은나노 밀집체의 두께에 따라 C-반응 단백질에 대한 신호가 변화하는지 관찰하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
<제조예 3>에서 제조한 분석 칩에 C-반응 단백질 100 pM를 가한 후 건조하고, 원자간력 현미경(Atomic Force Microscope, AFM, Park systems, NX-10)을 통해 은나노 밀집체의 다양한 부분의 두께를 측정한 후, 상기 두께에 따른 신호 강도를 표면증강 라만산란법 스펙트라를 통해 확인하였다. 또한, C-반응 단백질 용액을 100 fM 내지 100 nM의 농도로 변화시키며 <제조예 3>에서 제조한 분석 칩에 가하는 경우, 은나노 밀집체의 상이한 두께에 따른 2930 cm-1에서의 표면증강 라만산란법 스펙트라 신호 강도를 측정하였다. 그 결과를 도 7(A-D)에 나타내었다.
도 7(A)는 은나노 밀집체의 두께에 따라 C-반응 단백질 검출과 관련한 라만 강도의 변화를 나타내는 이미지이고, 삽도는 C-반응 단백질 100 pM를 <제조예 3>에서 제조한 분석 칩에 가한 후 건조하고 표면의 형태를 관찰한 SEM(Scanning Electron Microscopy) 이미지이다.
도 7(B) 및 도 7(C)는 C-반응 단백질 100 pM를 <제조예 3>에서 제조한 분석 칩에 가한 후 건조하고 원자간력 현미경(Atomic Force Microscope, AFM)을 통해 은나노 밀집체의 다양한 부분의 두께를 광학 현미경 이미지를 통해 관찰한 사진이다.
도 7(D)는 C-반응 단백질 용액을 100 fM 내지 100 nM의 농도로 변화시키며 <제조예 3>에서 제조한 분석 칩에 가하는 경우, 은나노 밀집체의 상이한 두께에 따른 2930 cm-1에서의 표면증강 라만산란법 스펙트라 신호 강도를 나타내는 이미지이다.
도 7(A-C)에 나타난 바와 같이, 은나노 밀집체의 두께가 두꺼워질수록 2930 cm-1 부근에서의 신호 강도가 점점 강해지며, 특히 두께 200 nm 부근에서 신호가 가장 강한 것으로 나타났다. 또한, 도 7(A)의 삽도로부터 200 nm 두께(약, 5개의 층)의 은나노 밀집체 부근의 경우 C-반응 단백질이 밀집하여 흡수되 두꺼운 생물막(thick biological film)이 형성되어 있는 반면, 40 nm 두께(단일층)의 은나노 밀집체 부근의 경우 C-반응 단백질의 흡수가 거의 관찰되지 않으며 오직 은나노 입자들이 밀집되어 있는 것으로 나타났다.
또한, 도 7(D)에 나타난 바와 같이, 표면증강 라만산란법 스펙트라의 신호는 은나노 밀집체의 두께가 두꺼워질수록 강해지며, 은나노 밀집체의 두께가 280 nm(약, 7개 층)로 가까워질수록 신호 강도의 증가 정도가 점차적으로 완만해 지는 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명에 따른 C-반응 단백질의 검출방법은 어떠한 표지도 연관되지 않고 표면처리된 은나노 밀집체를 이용하여 C-반응 단백질의 선택적 반응을 유도하고 이를 표면증강 라만산란법을 통해 0.01 ng/mL의 매우 낮은 농도 단위로 측정할 수 있는 효과가 있다.

Claims (11)

  1. 일면의 표면이 아민기(-NH2)로 개질된 기판을 준비하는 단계(단계 1);
    상기 단계 1에서 준비한 기판을 금속 나노입자 콜로이드 용액에 담지하여, 상기 일면의 표면에 3차원의 금속 나노입자 밀집체(aggregates)를 형성하는 단계(단계 2);
    상기 단계 2에서 형성된 3차원의 금속 나노입자 밀집체 표면에, 검출하고자 하는 단백질에 대하여 결합 특이적인 리간드(Ligand)를 고정화하는 단계(단계 3);
    상기 단계 3에서 고정화된 리간드에 상기 단백질을 검출하고자 하는 시료를 처리하는 단계(단계 4); 및
    표면증강 라만산란법(Surface Enhanced Raman Scattering, SERS)을 통해 2800 내지 3000 cm-1 파장영역의 라만 신호(Raman signals) 강도를 측정하여 상기 단백질을 검출하는 단계(단계 5);를 포함하는 무표지 금속 나노 밀집체 동기화 표면증강 라만산란법을 통한 단백질의 검출방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 기판은 유리, 실리카, 사파이어 및 ITO(Indium Tin Oxide) 유리로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 검출방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 금속은 금, 은 및 알루미늄으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 검출방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 금속 나노입자 콜로이드 용액은 탈이온수에 금속 나노입자를 분산시킨 용액인 것을 특징으로 하는 검출방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 3차원의 금속 나노입자 밀집체는 금속 나노입자가 2 내지 10층으로 적층된 것을 특징으로 하는 검출방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 금속 나노입자는 25 내지 60 nm 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 검출방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 단계 4를 수행한 후, 상기 단계 5를 수행하기 이전에 기판을 세척하는 단계를 더 포함할 수 있는 것을 특징으로 하는 검출방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 세척은 탈이온수, 메틸 알코올, 에틸 알코올 및 이소프로필 알코올로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세척용매를 기판에 처리하여 수행하는 것을 특징으로 하는 검출방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 단백질은 C-반응 단백질(C-reactive protein)인 것을 특징으로 하는 검출방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 리간드는 포스포코올린(Phosphocholine, PC)인 것을 특징으로 하는 검출방법.
  11. 제1항에 있어서,
    2800 내지 3000 cm-1 파장영역의 라만 신호(Raman signals)는, 단백질에 존재하는 C-H의 신축 진동(stretching vibration)으로 인하여 발생하는 것을 특징으로 하는 검출방법.
KR1020150102896A 2015-07-21 2015-07-21 무표지 금속 3차원 나노 밀집체 동기화 표면증강 라만산란법을 이용한 단백질 검출방법 KR101691067B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150102896A KR101691067B1 (ko) 2015-07-21 2015-07-21 무표지 금속 3차원 나노 밀집체 동기화 표면증강 라만산란법을 이용한 단백질 검출방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150102896A KR101691067B1 (ko) 2015-07-21 2015-07-21 무표지 금속 3차원 나노 밀집체 동기화 표면증강 라만산란법을 이용한 단백질 검출방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR101691067B1 true KR101691067B1 (ko) 2016-12-30

Family

ID=57737307

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020150102896A KR101691067B1 (ko) 2015-07-21 2015-07-21 무표지 금속 3차원 나노 밀집체 동기화 표면증강 라만산란법을 이용한 단백질 검출방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101691067B1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109239046A (zh) * 2018-08-22 2019-01-18 暨南大学 一种c反应蛋白检测试剂及sers检测方法
WO2020197305A1 (ko) * 2019-03-27 2020-10-01 주식회사 엑소퍼트 표면-증강 라만 산란 기반의 표적 물질 검출용 기판의 제조방법, 이에 따른 표적 물질 검출용 기판 및 이를 이용한 표적 물질 검출 방법

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20120046603A (ko) * 2010-11-02 2012-05-10 서울대학교산학협력단 암시야 현미경 기술과 ｚ－ｄｅｐｔｈ 의존 공초점 표면증강 라만 산란을 이용한 단세포내 단백질 코팅된 금속 나노파티클의 탐지방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20120046603A (ko) * 2010-11-02 2012-05-10 서울대학교산학협력단 암시야 현미경 기술과 ｚ－ｄｅｐｔｈ 의존 공초점 표면증강 라만 산란을 이용한 단세포내 단백질 코팅된 금속 나노파티클의 탐지방법

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
‘Anti tags: SERS-Encoded Nanoparticle Assemblies that Enable Single-Spot Multiplex Protein Detection’, N. Guarrotxena 등, Adv. Mater. 2014년, 26권, 1941~1946쪽 (2013.12.16.)* *
‘Detection of proteins on Silica-Silver Core-Shell substrates by surface-enhanced Raman spectroscopy’, L. Chen 등, Journal of Colloid and Interface Science, 360권, (2011), 482~487쪽 (2011.04.27.)* *
'Multiple detection of proteins by SERS-based immunoassay with core shell magnetic gold nanoparticles', Vibrational Spectroscopy, 72, 2014, 44~49 *
W. Wang, Y. Yin, Z. Tana and J. Liu, Coffee-Ring Effect-Based Simultaneous SERS Substrate Fabrication and Analyte Enrichment for Trace Analysis, Nanoscale, 2014, 6, 9588-9593.

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109239046A (zh) * 2018-08-22 2019-01-18 暨南大学 一种c反应蛋白检测试剂及sers检测方法
CN109239046B (zh) * 2018-08-22 2021-06-11 暨南大学 一种c反应蛋白检测试剂及sers检测方法
WO2020197305A1 (ko) * 2019-03-27 2020-10-01 주식회사 엑소퍼트 표면-증강 라만 산란 기반의 표적 물질 검출용 기판의 제조방법, 이에 따른 표적 물질 검출용 기판 및 이를 이용한 표적 물질 검출 방법
KR20200115840A (ko) * 2019-03-27 2020-10-08 주식회사 엑소퍼트 표면-증강 라만 산란 기반의 표적 물질 검출용 기판의 제조방법, 이에 따른 표적 물질 검출용 기판 및 이를 이용한 표적 물질 검출 방법
KR102225542B1 (ko) 2019-03-27 2021-03-11 주식회사 엑소퍼트 표면-증강 라만 산란 기반의 표적 물질 검출용 기판의 제조방법, 이에 따른 표적 물질 검출용 기판 및 이를 이용한 표적 물질 검출 방법

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ranjan et al. Rapid biosensing tools for cancer biomarkers
Citartan et al. Label-free methods of reporting biomolecular interactions by optical biosensors
KR101140029B1 (ko) 항원고정화 면역형광 슬라이드의 제조방법 및 그에 의해 제조되는 면역형광 슬라이드
Liang et al. Plasma enhanced label-free immunoassay for alpha-fetoprotein based on a U-bend fiber-optic LSPR biosensor
Zhao et al. A MoS 2 nanoflower and gold nanoparticle-modified surface plasmon resonance biosensor for a sensitivity-improved immunoassay
JP4939182B2 (ja) 検知素子、該検知素子を用いた標的物質検知装置及び標的物質を検知する方法
JP6196159B2 (ja) 金属錯体量子結晶及びそれを用いる生化学物質の表面増強ラマン散乱（ｓｅｒｓ）分析法
US9557266B2 (en) Surface plasmon resonance sensor
EP3105589B1 (en) Biosensor for conformation and secondary structure analysis
EP3646012A1 (en) Sers-active opto-fluidic photonic crystal fiber probe as biopsy needle and optofluidic sensor
Zhang et al. Enhanced wavelength modulation SPR biosensor based on gold nanorods for immunoglobulin detection
Hu et al. SERS-based immunoassay using core–shell nanotags and magnetic separation for rapid and sensitive detection of cTnI
KR101093203B1 (ko) Ｌｓｐｒ 광학특성 기반 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩 및 그 용도
KR101691067B1 (ko) 무표지 금속 3차원 나노 밀집체 동기화 표면증강 라만산란법을 이용한 단백질 검출방법
CN108387563A (zh) 基于纳米棒的荧光增强结构、荧光检测系统及自动进样检测芯片
JP5110254B2 (ja) 蛍光測定法と、蛍光測定のための測定用チップ及びその製造方法
EP1674857B1 (en) Method for measuring a surface plasmon resonance and noble metal compound used for the same
CN111077298A (zh) 一种免疫荧光共定位成像平台的制备方法及应用
Riahi-Zanjani et al. Molecular modeling and experimental study of a new peptide-based microextraction fiber for preconcentrating morphine in urine samples
KR101422700B1 (ko) C-반응성 단백질 검출용 합성항체
Tabatabaei et al. Recent advances of plasmon-enhanced spectroscopy at bio-Interfaces
KR20100127531A (ko) 표면 플라즈몬 공명 장치를 이용한 중금속 이온 검출용 금속 단백질　기반 바이오센서
KR101195253B1 (ko) 항원고정화 면역형광 슬라이드의 제조방법 및 그에 의해 제조되는 면역형광 슬라이드
Yang et al. A displacement assay for the sensing of carbohydrate using zinc oxide biotracers
KR101758345B1 (ko) 국소표면 플라즈몬 공명을 이용한 표적물질 검출용 바이오센서 및 이의 제조방법

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190924

Year of fee payment: 4