CN108387563A - 基于纳米棒的荧光增强结构、荧光检测系统及自动进样检测芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于纳米棒的荧光增强结构、荧光检测系统和自动进样的检测芯片,其中荧光增强结构包括衬底、纳米棒和纳米棒上修饰的抗体或单链DNA,其中纳米棒结构为在衬底上采用倾斜角沉积制备得到。利用本发明进行生物标记物的高灵敏度,快速,微流体自动进样检测,设备操作简单,低成本。
Description
技术领域
本发明属于检测分析领域,涉及一种荧光增强结构、荧光检测系统及自动进样检测芯片。
背景技术
生物标志物提供人体机能的指标以及疾病的预测、诊断和预后信息。检测生物样本(血液、唾液或者尿液等)中生物标记物(biomaker)浓度,对于疾病的早期诊断以及个性化治疗具有重要的意义。
现有检测方法有酶联免疫吸附测定(ELISA),荧光免疫测定(fluorescentimmunoassay)、比色分析(colorimetric analysis)等。
酶联免疫吸附测定(ELISA)
酶联免疫吸附测定技术使用酶标记抗体与吸附在载体上的某种生物标记物抗原发生特异性结合。在滴加底物溶液后,底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型,发生颜色反应。通过有无颜色和颜色深浅判定该生物标记物浓度。由于采用颜色判断,所以此方法灵敏度很低且容易产生误差。
荧光免疫测定(Fluorescent Immunoassay)
荧光免疫测定技术使用荧光素标记的抗体检测某种生物标记物抗原。在抗体抗原特异性结合后通过显微镜进行荧光检测。通过荧光强度判定该生物标记物浓度。此方法虽然理论上能够实现单分子的检测,但由于受到激光散射噪声等影响,实际检测灵敏度收到一定限制。该方法成本较高,需要大型仪器和专业人员,应用范围较窄。
比色分析(Colorimetric Analysis)
比色分析法是利用生物标记物构建比色免疫传感器,实现对抗原的检测。加入ABS缓冲液和四甲基联苯胺TMB溶液,通过紫外分光光度计检测TMB的紫外吸收来定量生物标记物的浓度。此方法需要复杂的器材与步骤,并且检测缓慢,灵敏度较低。
这些现有检测方法有如下几点缺陷:(1)需要医院大型仪器和专业人员,操作复杂;(2)检测时间较长;(3)检测灵敏度低。尤其是很多疾病早期其生物标志物浓度含量极低,检测的灵敏度是主要的制约因素。因此,提供一种高灵敏度、快速、低成本且操作简单的生物标记物检测系统及制备方法有着重要的科学意义和应用价值。
发明内容
本发明针对传统荧光免疫测定中检测灵敏度低,检测过程复杂的缺点,提出一种基于纳米结构荧光增强效应的生物检测系统,用于蛋白质、DNA等生物分子的高灵敏度检测,并提供纳米结构的简单制造方法。本发明通过纳米结构与微流体芯片的结合,解决了荧光免疫测定中操作步骤复杂、检测灵敏度低、背景噪声大等缺点,实现生物标志物的超灵敏检测,从而实现疾病的早期诊断。
本发明采用以下技术方案:
本发明提供一种基于纳米棒的荧光增强结构,包括衬底、纳米棒和纳米棒上修饰的抗体或单链DNA,其中纳米棒结构为在衬底上采用倾斜角沉积制备得到。其中,所述纳米棒的成分可以为金、银、氧化硅等。衬底为玻璃、硅片等材料。
作为本发明的一种实施方式,纳米棒上修饰有一层自组装薄膜,在自组装薄膜上吸附一层Protein A或者Protein G分子;通过自组装薄膜上吸附的proteinA/G分子在纳米结构表面修饰针对需检测的生物标志物的单克隆抗体,单克隆抗体捕获生物样品中的待测分子,并继续与该分子的多克隆抗体结合,最后与荧光标记的二抗结合,通过检测荧光强度确定待测生物标志物的浓度。
进一步,所述自组装薄膜的成分可为二硫代二琥珀酰亚胺或二硫代二丙酸酯。
本发明的另一种实施方式,纳米棒表面修饰与待测DNA互补的DNA单链,DNA单链末端添加巯基官能团与纳米棒表面形成共价键相连。
进一步,纳米棒不同区域修饰不同的抗体或单链DNA,实现不同生物分子的并行检测。
本发明还提供一种基于纳米棒的荧光免疫测定系统,设有上述的基于纳米棒的荧光增强结构。
本发明另外提供一种基于微流体的自动进样检测芯片,包括进样区域,反应区域以及毛细管泵区域;毛细管泵提供进样所需的动力和反应延时,反应区域设有上述的基于纳米棒的荧光增强结构,进样区域加入的生物样品在毛细管泵作用下流过反应区域,在一定时间内被纳米结构上相应的探针捕获,并通过检测反应后荧光强度检测待测生物标记物浓度。
进一步,微流体芯片的沟道尺寸为100nm-1000μm。
进一步,所述自动进样检测芯片设有微流道阵列。
进一步,所述自动进样检测芯片采用智能手机实现检测结果的读取和分析。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
本发明采用倾斜角沉积的方法制备纳米棒,然后在纳米棒上修饰的抗体或单链DNA,该方法无需复杂的电子束光刻、纳米压印等就能在衬底上制备可控纳米结构,简单易行,降低生产成本,适合大规模集成生产。
采用本发明的荧光增强结构进行荧光检测分析具有以下优点:
(1)高灵敏度:该发明通过采用纳米棒的局部表面等离子共振作用(LSPR)使得检测荧光强度大大增强,显著提升了检测生物标记物浓度的灵敏度从而实现疾病的早期诊断和检测。
(2)高特异性:通过蛋白的免疫测定和DNA的杂化反应,特异性好,检测结果可行度高;
进一步,在芯片表面不同区域修饰不同的抗体以及DNA分子,可实现不同生物分子的并行检测,具有高并行性。
本发明的自动进样检测芯片,该发明通过制备毛细管泵结构提供动力与反应所需延时,实现微流体芯片自动进样,检测操作简单便捷;通过倾斜角沉积制备基于纳米棒荧光增强的生物标记物检测系统,实现只需加入样品就可检测荧光强度进而得出生物标记物浓度,从而实现疾病检测,快速高效。
该发明通过微流体结构实现生物标记物浓度检测,由于沟道尺寸小(100nm-1000μm),消耗样品少,反应速度快,成本低。
进一步,采用微流道阵列实现并行化检测多种疾病。
本发明可以结合智能手机实现检测结果的读取分析。将微流体芯片插入手机特制的手机外壳,通过光学系统辅助手机的拍照功能实现检测结果读取和分析,设备操作简单,低成本。
附图说明
图1是实施例1基于倾斜角沉积(Oblique angle deposition)制备银纳米棒的示意图;
图2是实施例1中A的局部放大图;
图3是实施例1中制备得到的基于纳米棒的荧光增强结构的示意图;
图4是实施例2中纳米结构荧光增强系数的曲线;
图5是试验3纳米结构芯片与玻璃芯片对于肌钙蛋白I检测的荧光曲线;
图6是实施例4中基于微流体的自动进样检测芯片俯视示意图;
图7是图6中沿B-B方向的剖视示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明进行详述。
实施例1
倾斜角沉积制备纳米棒
如图1所示,原材料源1放置在坩埚中,制备装置3下方枪灯丝发射电子束,蒸发坩埚中原材料源(金、银、氧化硅等)。原材料源1形成原材料蒸汽2,制备装置玻璃片衬底4法线方向与蒸汽方向成θ角(蒸镀角)。最终在衬底4上形成纳米棒5。
蒸汽首先在衬底表面成核,由于有限的表面原子扩散和阴影效应,这些表面的成核中心会继续生长为纳米结构。可以通过控制蒸镀角θ、沉积时衬底的旋转速度、沉积厚度、沉积速率、功率等控制纳米结构的形貌参数,并通过优化达到最大的荧光增强效果。本实施例中,金属纳米棒蒸镀工艺过程中,基座倾斜角度为10°~86°,旋转速度为0-1rpm,待加工基座温度为25℃~100℃,金属蒸发速率0.03nm~1nm/s,蒸发材料采用金、银等金属。本实施例采用的原料为银。图2显示了形成的银纳米棒。
对本实施例中得到的纳米结构进行扫描电子显微镜测试,得到图3。图3为倾斜角沉积得到的金/银纳米结构的扫描电子显微镜照片。其中图3(a)生长的金银纳米棒侧视图,图3(b)生长的金银纳米棒俯视图。生长的金银纳米棒厚度为250nm。先在玻璃片衬底上沉积QCM=1.5μm的银纳米棒,再沉积QCM=10nm的金用来包裹银纳米棒,形成如图3所示层次结构。从图3中可以得出金属纳米棒平均直径为50nm~150nm,厚度为200nm~300nm,间距为100nm~200nm。
实施例2
对于实施例1中得到的金纳米棒进行荧光增强实验,得出纳米结构的荧光增强系数曲线。
将同样浓度与体积的荧光溶液覆盖试验一得到的金纳米棒表面以及玻璃片表面,利用荧光显微镜分别分析荧光强度,其比值为荧光增强系数。
具体的,配置浓度梯度1pM~100μM荧光素溶液。将金纳米棒放入相同容积反应室中,其反应室由PDMS bonding玻璃片衬底并在其上加盖玻片制备。将同等体积不同浓度梯度荧光素溶液加入反应室中,通过显微镜照相机拍摄荧光图像并分析,得到图4不同浓度(1pM~100μM)荧光素金包裹银纳米棒上荧光增强系数示意图。从图4中可以看出,纳米结构能将荧光强度平均提高100倍以上。
实施例3
金属纳米棒表面修饰cTnI抗体检测心血管疾病。
肌钙蛋白I(cTnI)在心血管早期诊断中有着重要意义,本实施例利用纳米结构对于肌钙蛋白I进行高灵敏度检测。
具体操作步骤如下:首先在金属纳米结构表面固定一层自组装薄膜(DSP/DSU/PEG等),在自组装薄膜上覆盖一层Protein A/G分子(可选),再加入BSA溶液block。通过Protein A/G分子在纳米结构表面固定肌钙蛋白I的单克隆抗体,加入含有不同浓度肌钙蛋白I的生物样品,并继续与该分子的多克隆抗体结合,最后荧光标记的二抗结合多克隆抗体实现定量分析,通过检测荧光强度确定肌钙蛋白I的浓度。图5是不同浓度肌钙蛋白I在纳米结构芯片上检测的荧光强度曲线与玻璃上检测的荧光强度曲线的对比,从中可以发现纳米结构有着更强的荧光强度和检测灵敏度。
实施例4
利用软光刻技术制备的PDMS微流体芯片,沟道的特征尺寸为100nm-1000μm。芯片分为进样区域,反应区域以及毛细管泵区域。毛细管泵提供进样所需的动力和反应延时。实施例1中获得的纳米结构,将其集成于微流体芯片的反应区域,生物样品在毛细管泵作用下流过反应区域,并通过检测反应后荧光强度检测待测生物标记物浓度。
将生物样品置于芯片的进样区域,通过毛细管泵将样品吸入反应区域并控制反应时间,最后通过检测反应区域的荧光强度得出相应的生物标志物浓度并实现疾病检测。
图6为基于微流体的自动进样检测芯片示意图。图7是图6中沿B-B方向的剖视示意图。结合图6和图7可知,所述自动进样检测芯片设有底板17和上盖16,其中上盖16采用PDMS材料,底板17为玻璃板。自动进样检测芯片沿液体流向分为进样口11、毛细管12、反应室13、流阻14和毛细管泵15。表面修饰有生物分子的纳米棒5设置在反应室内,进样口11和反应室13之间设有毛细管12。毛细管泵15提供进样所需的动力和反应延时。
实施例5:
制作一个手机外壳,手机外壳上集成一套光学系统,包括荧光光源、组合透镜、滤光片、电池等。使用时,将微流体芯片插入手机外壳中并固定,通过外壳上集成的光学系统对芯片反应区域的荧光拍照,并利用手机对荧光强度进行分析从而得到检测结果。
实施例6
利用倾斜角沉积工艺在衬底上集成金/银纳米结构。
在DNA单链末端添加巯基官能团(-SH),能够与金/银的纳米结构形成化学键从而固定在表面。加入样品后荧光标记的待测DNA序列与表面修饰的DNA互补杂化,通过检测荧光强度即可检测样品中DNA序列以及变异情况,实现基因检测。
Claims (10)
1.一种基于纳米棒的荧光增强结构,其特征在于,所述荧光增强结构包括衬底、纳米棒和纳米棒上修饰的抗体或单链DNA,其中纳米棒结构为在衬底上采用倾斜角沉积制备得到。
2.根据权利要求1所述的基于纳米棒的荧光增强结构,其特征在于,纳米棒上修饰有一层自组装薄膜,在自组装薄膜上吸附一层Protein A或者Protein G分子;通过自组装薄膜上吸附的protein A/G分子在纳米结构表面修饰针对需检测的生物标志物的单克隆抗体,单克隆抗体捕获生物样品中的待测分子,并继续与该分子的多克隆抗体结合,最后与荧光标记的二抗结合,通过检测荧光强度确定待测生物标志物的浓度。
3.根据权利要求2所述的基于纳米棒的荧光增强结构,其特征在于,所述自组装薄膜的成分二硫代二琥珀酰亚胺或二硫代二丙酸酯。
4.根据权利要求1所述的基于纳米棒的荧光增强结构,其特征在于,纳米棒表面修饰与待测DNA互补的DNA单链,DNA单链末端添加巯基官能团与纳米棒表面形成共价键相连。
5.根据权利要求1所述的基于纳米棒的荧光增强结构,其特征在于,纳米棒不同区域修饰不同的抗体或单链DNA。
6.一种基于纳米棒的荧光免疫测定系统,其特征在于,所述荧光免疫测定系统设有如权利要求1-5任意一项所述的基于纳米棒的荧光增强结构。
7.一种基于微流体的自动进样检测芯片,其特征在于,所述自动进样检测芯片包括进样区域,反应区域以及毛细管泵区域;毛细管泵提供进样所需的动力和反应延时,反应区域设有如权利要求1-5任意一项所述的基于纳米棒的荧光增强结构,进样区域加入的生物样品在毛细管泵作用下流过反应区域被纳米结构上相应的探针捕获,并通过检测反应后荧光强度检测待测生物标记物浓度。
8.根据权利要求7所述的基于微流体的自动进样检测芯片,其特征在于,微流体芯片的沟道尺寸为100nm-1000μm。
9.根据权利要求7所述的基于微流体的自动进样检测芯片,其特征在于,所述自动进样检测芯片设有微流道阵列。
10.根据权利要求7所述的基于微流体的自动进样检测芯片,其特征在于,所述自动进样检测芯片采用智能手机实现检测结果的读取和分析。
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