CN111366563B - 数字化等离子免疫吸附试剂盒及其制造和测试方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种数字化等离子免疫吸附试剂盒及其制造和测试方法。该数字化等离子免疫吸附试剂盒包括：盒体、布置盒体内的纳米等离子体传感器芯片以及试剂；其中，纳米等离子体传感器芯片表面形成有纳米杯阵列，而且纳米杯阵列中的每个纳米杯包括纳米柱、以及依次形成在纳米柱表面的钛层和金层。

Description

数字化等离子免疫吸附试剂盒及其制造和测试方法
技术领域
本发明涉及一种用于超高灵敏度蛋白亲和力测定和动态互作结合成像的数字化等离子免疫吸附试剂盒。
背景技术
表面等离子体共振(SPR)生物传感器因其产生的倏逝场对局部折射率(RI)的变化具有很高的灵敏度，现已成为研究生物分子相互作用动力学的重要工具。表面等离子体共振(SPR)成像的提出将SPR技术与成像系统紧密结合在一起，成为具有无标记、高通量、原位和实时检测分子相互作用等特性的技术。可应用于测量大分子结合过程中的特异性、亲和力和动力学参数，如蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、受体药物和细胞/病毒-蛋白质结合。在疾病的早期诊断、药物筛选和食品质量控制中得到越来越广泛的应用。
数字PCR(聚合酶链式反应)的概念自1999年首次提出以来，便引发人们的持续关注，相比于实时定量PCR(qPCR)，dPCR能提供更敏感、更具重复性的临床方法。数字PCR(dPCR)是一种应用日益广泛的技术，在核酸的检测和定量方面具有许多优点。近年来，随着微流控和乳液化学的发展，工艺更加简化和自动化使得dPCR变得更加实用，越来越多地应用于临床检测中，包括肿瘤学和传染病以及胎儿基因筛查和预测移植排斥反应。
但是，现有的检测设备存在操作复杂或者设备昂贵的问题，不利于检测手段的普及。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中存在上述缺陷，提供一种用于超高灵敏度蛋白亲和力测定和动态互作结合成像的数字化等离子免疫吸附试剂盒，其避免了使用昂贵的光谱检测仪器，仅使用普通的白光光源和拍照设备实现亮场成像，没有复杂冗长的信号放大步骤。
根据本发明，提供了一种数字化等离子免疫吸附试剂盒，包括：盒体、布置盒体内的纳米等离子体传感器芯片以及试剂；其中，纳米等离子体传感器芯片表面形成有纳米杯阵列，而且纳米杯阵列中的每个纳米杯包括纳米柱、以及依次形成在纳米柱表面的钛层和金层。
优选地，试剂包括：蔗糖、己基硅烷、乙醇、11-巯基癸酸、1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、牛血清白蛋白、乙醇胺、纯化的CRP和磷酸盐缓冲液、单克隆抗CRP捕获和检测抗体。
根据本发明，还提供了一种制造上述数字化等离子免疫吸附试剂盒的方法，包括通过下述方法制造纳米等离子体传感器芯片：通过激光干涉光刻在氧化硅片上制成的锥形纳米柱阵列来制造原始模具；在复制原始模具之前，将原始模具硅烷化以获得疏水性；然后，将光学粘合剂涂覆在清洁的原始模具上，并将PET薄板放置在模具的顶部，经过紫外线照射后将表面具有纳米孔阵列的PET薄片从模具上剥离；此后，使用电子束蒸发机在具有纳米孔阵列的PET表面上沉积钛层和金层，以制成纳米等离子体传感器芯片。
根据本发明，还提供了一种采用上述数字化等离子免疫吸附试剂盒的测试方法，包括：清洗纳米等离子体传感器芯片表面，然后在去离子水中采集透射光谱和图片，并记录采集区域；加入11-巯基癸酸溶液到处于乙醇中的芯纳米等离子体传感器片的表面，进行孵育以去除11-巯基癸酸溶液后，采用乙醇和去离子水清洗芯片；然后在去离子水中采集记录区域的透射光谱和图片；将芯片在EDC和NHS的1:1混合物中孵育预定时间，然后立即与单克隆抗CRP捕获抗体在PBS中在预定温度下孵育；随后清洗芯片表面，然后在去离子水中采集记录区域的透射光谱和图片；先后在BSA封闭溶液和乙醇胺溶液中各孵育芯片预定时间；用去离子水冲洗芯片，然后在去离子水中采集记录区域的透射光谱和图片；在PBS中将芯片在不同浓度的CRP中孵育；用PBS和去离子水冲洗后在去离子水中采集记录区域的透射光谱和图片；最后，在PBS中加入单克隆抗CRP检测抗体至芯片表面，采集记录区域随时间变化的动态图片；用PBS和去离子水冲洗芯片，在去离子水中采集记录区域的透射光谱和图片。
根据本发明，还提供了一种采用上述数字化等离子免疫吸附试剂盒的CRP蛋白浓度三明治夹心测试方法，包括：首先芯片表面在11-巯基癸酸溶液中形成SAM(self-assembled monolayers)，用EDC和NHS活化羧基，将CRP捕获抗体结合至芯片表面；用BSA与乙醇胺溶液封闭非特异性位点并覆盖剩余NHS；接着将CRP蛋白溶液加入到芯片表面，使得溶液中游离的CRP蛋白将被芯片表面固定的CRP抗体捕获而留在芯片表面；使溶液中的CRP浓度低于预定浓度，其中平均每个纳米孔包含一个至多个CRP蛋白分子；CRP蛋白随机分散至芯片表面的各处并被捕获，使得CRP蛋白在芯片表面分布的不均匀性；最后，将预定量的CRP检测抗体添加到芯片表面与被捕获的CRP蛋白进行结合，使得CRP检测抗体在芯片表面的结合改变所在区域环境的RI使得等离子体共振峰的红移，从而芯片表面区域将分为两个部分，含有CRP蛋白的区域在与CRP检测抗体结合后改变了原来的SPR信号，而不含有CRP蛋白的区域不能与CRP检测抗体结合保持原有的SPR信号。
优选地，引入泊松分布算式：
Figure GDA0003402664790000031
其中λ是与CRP蛋白浓度c关联的参数，有λ＝k1*c，k1为系数；概率P表示SPR信号发生变化的纳米孔区域与检测的纳米孔区域的比值；纳米孔区域的比值近似用像素点数目的变化来表示，将SPR信号发生变化的像素点数目的变化率表示为p，即
Figure GDA0003402664790000032
Ncp表示变化的像素点数目，Ntot表示总的像素点数目；加一个矫正系数k2来建立SPR信号发生变化的区域与像素点数目的变化之间的对应关系，则有对应关系公式：
p＝k2(1-|k1×c)；
两边取对数得到浓度公式：
c＝k1×In(1-k2×p)。
优选地，将像素点数目变化率p随CRP浓度的函数关系，用所述对应关系公式进行拟合，取CRP的浓度低于50ng/ml时的拟合结果以确定系数k1、k2的值，从而将浓度公式进一步表示为c(CRP)＝0.10804×In(1-4.90938×p)，以计算CRP蛋白浓度。
优选地，所述测试方法用于炎症标志物CRP蛋白的检测。
优选地，其中采用卤素灯进行照明，而且通过聚光镜和放大的物镜在CCD相机上曝光透射模式的图像。
本发明首次将数字化PCR概念引入到SPR成像技术中，结合经典的泊松统计算法，实现了数字化SPR图像技术对CRP蛋白浓度的定量检测。同时，通过采集蛋白结合过程的动态SPR图像，测定了CRP和抗CRP抗体结合动力学。不同于以往计算SPR图像模拟信号均值的方法，数字信号图像通过直接计数变化的敏感像素点来进行检测，通过自动化图像处理的方式实现SPR图像从初始图像到模拟信号图像再到数字信号图像的转变，达到10倍灵敏度的提升。使用此方法对缓冲液中人类C反应蛋白(CRP，100kDa)浓度进行了定量检测，这是一种广泛用于急性炎症疾病临床诊断和治疗的生物标记物。在此证明了检测极限(LOD)低至1ng/ml。这一结果至少比血浆CRP水平低3个数量级。本发明的研究为表面等离子体共振(SPR)成像检测蛋白浓度提供了新的思路和方法。同时避免了使用昂贵的光谱检测仪器，仅使用普通的白光光源和拍照设备实现亮场成像，没有复杂冗长的信号放大步骤，有望开发一种便携式生物传感器用于疾病的早期检测。
附图说明
结合附图，并通过参考下面的详细描述，将会更容易地对本发明有更完整的理解并且更容易地理解其伴随的优点和特征，其中：
图1示意性地示出了根据本发明优选实施例的用于超高灵敏度蛋白亲和力测定和动态互作结合成像的数字化等离子免疫吸附试剂盒的示意图。
图2a示意性地示出了根据本发明优选实施例的用于超高灵敏度蛋白亲和力测定和动态互作结合成像的数字化等离子免疫吸附试剂盒的数字化图像蛋白检测原理图。
图2b示意性地示出了稀释后的CRP蛋白随机分散到芯片表面各处并与固定在芯片表面的捕获抗体结合，从而附着在芯片表面；此时芯片表面将分为含有CRP蛋白的区域和不含有CRP蛋白的区域。
图2c示意性地示出了过量的检测抗体滴加到芯片表面并与捕获的CRP蛋白结合进行信号放大，检测抗体的附着引起较大的等离子体共振峰的红移。
图2d示意性地示出了利用图像处理手段对含有CRP蛋白的区域和不含有CRP蛋白的区域进行像素点统计计数。
图2e示意性地示出了结合经典数字PCR泊松分布算法推导出数字SPR算法。
图2f示意性地示出了用推导公式对1-50ngCRP蛋白进行指数拟合，确定相关系数。
图3示意性地示出了根据本发明优选实施例的用于超高灵敏度蛋白亲和力测定和动态互作结合成像的数字化等离子免疫吸附试剂盒测试方法的SPR图像处理分析流程。
图4a、图4b和图4c分别示出了1ug/ml、100ng/ml和10ng/ml CRP蛋白动态图像检测中，模拟信号均值和数字信号计数值各自随时间的变化；图4d示出了条形图显示不同浓度CRP样品在与检测抗体反应后，模拟信号均值和数字信号计数值的变化(LOD＝1ng/ml)；图4e示出了在对数刻度上绘制模拟信号均值和数字信号计数值随CRP浓度变化的曲线，数字信号计数值(拟合系数＝0.985)的斜率为模拟信号均值(拟合系数＝0.977)的斜率的10倍；图4f示出了不同浓度CRP蛋白的动态图像检测，数字信号计数值随时间的变化曲线图。
需要说明的是，附图用于说明本发明，而非限制本发明。注意，表示结构的附图可能并非按比例绘制。并且，附图中，相同或者类似的元件标有相同或者类似的标号。
具体实施方式
本文提出了一种基于纳米孔生物传感器的数字等离子免疫吸附测定法。该方法对低浓度蛋白检测有着高敏感性。与数字PCR检测类似，数字化SPR图像分析方法结合泊松分布算法可用于对低浓度蛋白的定量检测。本发明证明，使用此方法能有效获取表面等离子体共振(SPR)图像中的蛋白结合信息，相比于计算模拟信号图像均值的方法，数字化信号计数法可以达到10倍灵敏度以上的提升。同时，本发明的技术避免了复杂的光谱检测，本发明将该方法应用于炎症标志物CRP蛋白的检测中，LOD为1ng/ml。通过对CRP蛋白与抗CRP抗体互作过程中的超灵敏动态成像，本发明测定了蛋白质结合动力学。本发明的研究为表面等离子体共振(SPR)成像检测蛋白浓度提供了新的思路和方法。同时避免了使用昂贵的光谱检测仪器，仅使用普通的白光光源和拍照设备实现亮场成像，没有复杂冗长的信号放大步骤，有望开发一种便携式生物传感器用于疾病的早期检测。
为了使本发明的内容更加清楚和易懂，下面结合具体实施例和附图对本发明的内容进行详细描述。
<试剂盒的组成>
图1示意性地示出了根据本发明优选实施例的用于超高灵敏度蛋白亲和力测定和动态互作结合成像的数字化等离子免疫吸附试剂盒的示意图。
如图1所示，根据本发明优选实施例的用于超高灵敏度蛋白亲和力测定和动态互作结合成像的数字化等离子免疫吸附试剂盒包括：盒体11、布置盒体内的纳米等离子体传感器芯片12以及试剂13；其中，纳米等离子体传感器芯片12表面形成有纳米杯阵列，而且纳米杯阵列中的每个纳米杯包括纳米柱、以及依次形成在纳米柱表面的钛层和金层。
在优选示例中，试剂13包括：蔗糖、己基硅烷、乙醇、11-巯基癸酸(MUA)、1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、牛血清白蛋白(BSA)、乙醇胺、纯化的CRP和磷酸盐缓冲液(PBS)缓冲液、单克隆抗CRP捕获和检测抗体。
<纳米等离子体传感器芯片的制造示例>
在优选实施例中，可以使用复制成型工艺来制备纳米等离子体传感器芯片。通过激光干涉光刻在氧化硅片上制成的锥形纳米柱阵列来制造原始模具。在复制原始模具之前，将原始模具硅烷化以获得疏水性。然后，将光学粘合剂(例如，Norland光学粘合剂，NOA-61)均匀且无气泡地涂覆在清洁的原始模具上，然后将PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)薄板放置在模具的顶部。经过例如90秒钟的紫外线(例如，105mW/cm2)照射后，将表面具有纳米孔阵列的PET薄片小心地从模具上剥离。最后，使用电子束蒸发机在具有纳米孔阵列的PET表面上沉积9nm钛和110nm金，以制成纳米等离子体传感器芯片。所得的纳米杯阵列具有350nm的周期，180nm的直径和500nm的高度。
<测试方法优选实施例>
首先采用例如70％乙醇溶液和去离子水清洗纳米等离子体传感器芯片表面，然后在去离子水中采集透射光谱和图片，并记录采集区域。加入1mM的11-巯基癸酸溶液(在乙醇中)到芯纳米等离子体传感器片表面，在室温下孵育例如24小时，去除11-巯基癸酸溶液后，用70％乙醇和去离子水清洗芯片(例如清洗两次)。然后在去离子水中采集记录区域的透射光谱和图片。在室温下将芯片在EDC(例如400mM)和NHS(例如100mM)的1:1混合物中孵育30分钟，然后立即与50μg/ml单克隆抗CRP捕获抗体(在PBS中)在4℃下孵育12h。采用PBS和去离子水清洗芯片表面，然后在去离子水中采集记录区域的透射光谱和图片。先后在60μg/mlBSA封闭溶液和10％乙醇胺溶液中各孵育芯片30分钟。用去离子水冲洗芯片两次，然后在去离子水中采集记录区域的透射光谱和图片。将芯片在不同浓度的CRP(在PBS中)中孵育2小时。用PBS和去离子水冲洗后在去离子水中采集记录区域的透射光谱和图片。最后，加入50μg/ml单克隆抗CRP检测抗体(在PBS中)至芯片表面，采集记录区域随时间变化的动态图片。2小时后用PBS和去离子水冲洗芯片，在去离子水中采集记录区域的透射光谱和图片。
注意，本领域技术人员可以理解的是，上述流程中的具体溶液浓度含量、具体时间数据可以适当调整，上述具体数值仅仅是优选的数值示例。
<示例：数字化SPR信号检测CRP蛋白含量>
图2a示意性地示出了根据本发明优选实施例的用于超高灵敏度蛋白亲和力测定和动态互作结合成像的数字化等离子免疫吸附试剂盒的图像蛋白检测原理图。其中，五角形状的图标表示CRP，“Y”表示CRP捕获抗体。
具体地说，例如，如图2a所示，本发明的实验可以在荧光倒置显微镜上进行的，用普通的100W卤素灯进行照明，透射模式的图像在2448×1920像素的真彩色CCD相机上曝光25ms后记录下来(图2a)。使用0.3NA的聚光镜和0.3NA，10倍放大的物镜，可以捕获覆盖844.6×662.4um2区域的图像。由此可以计算出每个像素所覆盖的芯片表面区域的大小约为345×345nm2，这近似于纳米孔阵列的周期350nm。
本发明采用三明治夹心法来检测CRP蛋白的浓度。简单来说首先芯片表面在11-巯基癸酸溶液中形成自组装单层膜，简称SAM(self-assembled monolayers)，在用EDC和NHS活化羧基后，将CRP捕获抗体结合至芯片表面。用BSA与乙醇胺溶液封闭非特异性位点并覆盖剩余NHS。接着将稀释后的CRP蛋白溶液加入到芯片表面，溶液中游离的CRP蛋白将被芯片表面固定的CRP抗体捕获而留在芯片表面(图2b)。当溶液中的CRP浓度较低时，平均每个纳米孔包含一个至多个CRP蛋白分子。CRP蛋白随机分散至芯片表面的各处并被捕获，使得CRP蛋白在芯片表面分布的不均匀性(图3)。最后，过量的CRP检测抗体添加到芯片表面与被捕获的CRP蛋白进行结合(图4c)。CRP检测抗体在芯片表面的结合改变所在区域环境的RI使得等离子体共振峰的红移，从而芯片表面区域将分为两个部分，含有CRP蛋白的区域在与CRP检测抗体结合后改变了原来的SPR信号，而不含有CRP蛋白的区域不能与CRP检测抗体结合保持原有的SPR信号(图4c)。
数字PCR(dPCR)是一种对核酸分子绝对定量及扩增的新技术，由于每个纳米孔中可能结合了两个或两个以上的CRP蛋白分子，结合数字PCR的概念，本发明引入泊松分布算式(图2e)来检测低浓度CRP蛋白含量。
Figure GDA0003402664790000081
这里，λ和CRP蛋白浓度c有关，有λ＝k1*c。当k＝0(不含有CRP蛋白分子)时，上式可化简为：
Figure GDA0003402664790000084
此处概率P可看作SPR信号发生变化的纳米孔区域与检测的纳米孔区域的比值。纳米孔区域的比值可近似用像素点数目的变化来表示，本发明将SPR信号发生变化的像素点数目的变化率表示为p，即
Figure GDA0003402664790000082
Ncp表示变化的像素点数目，Ntot表示总的像素点数目。同时由于衍射极限的存在，SPR信号发生变化的区域与像素点数目的变化之间不是一一对应的，需要添加一个矫正系数k2来建立对应关系，则有：
Figure GDA0003402664790000083
将其表示为p与c的函数得到：
p＝k2(1-|k1×c) (2)
两边取对数可进一步可变性为通用公式：
c＝k1×In(1-k2×p) (3)
像素点数目变化率p随CRP浓度的函数关系如图2f所示。用公式(2)进行拟合，本发明发现当CRP的浓度低于50ng/ml时，拟合结果较好，为0.983。由此可以确定系数k1、k2的值，因而公式(3)可表示为c(CRP)＝0.10804×In(1-4.90938×p)。
<仿真设置示例>
示例使用市售的三维有限差分时域(3D-FDTD)方法来研究纳米杯芯片的远场透射光谱的相关变化。示例在厚度为1000nm的基板上构建了一个纳米杯。纳米杯阵列的周期为350nm，纳米杯的顶部直径，底部直径和深度分别为180nm，160nm和500nm。依次在杯子的上方放置一个9nm的Ti层和一个110nm的Au层(Johnson和Christy的光学参数)。光源放置在纳米杯结构上方，并沿法线入射方向传播到基板。模拟总面积为350nm x 350nm x 2000nm。沿x和y方向应用周期性边界条件，并沿z轴应用完美匹配的层以消除边界的任何干扰。
<光学设置示例>
使用在透射模式下操作的Olympus IX73立式荧光显微镜进行显微镜测量。使用100W的卤素灯作为光源，光路包括一块毛玻璃、NA为0.3的聚光镜和10倍放大倍数，NA为0.3的物镜。RGB真彩色图片由cellSens软件控制的基于电荷耦合器件的(CCD)相机采集，曝光时间设定为25ms，数字增益为1。利用光谱仪(iHR320HORIBA)来获取透射光谱。来自样品的透射光谱用光源光谱进行归一化以获得最终的透射数据。光谱数据的采集由定制的LabVIEW程序控制。
<图像处理示例>
获取的所有RGB图像先用ImageJ软件进行预处理，使用软件内置的RegisterVirtual Stack功能对图片进行刚性配准，将配准后的图片剪裁为1000×1000像素大小的图片作为初始图像。
后续的图像处理与分析均在MATLAB软件中进行。模拟信号图像是通过计算初始图像每个像素点处R通道强度值与三通道强度值和的比值得到的，通过这个简单的转换，在一定程度上消除了由光源和样品波动引起的图像总体强度的变化。因此获得了更加可靠的具有等离子体特征的信号。平均模拟信号值是通过计算模拟信号图像整体均值的变化率得到的：
Vmas＝(Mean2-Mean1)/(Mean1)
Mean1、Mean2分别为加入检测抗体前后获取的模拟信号图像的整体均值。
数字信号图像是将模拟信号图像通过设定阈值进行二元化后获得的。设定一个合适的阈值，将大于阈值的像素点的值设为1，小于阈值的像素点的值设为0，图像被分割为像素值为1的区域和值为0的区域。数字信号计数值是通过计算数字信号图像中像素值为1的像素点数目的变化率得到的：
Vdsc＝(Count2-Count1)/Count1
Count1、Count2分别为加入检测抗体前后获取的数字信号图像中像素值为1的像素点的个数。
内置的MATLAB颜色图(Autumn)用于模拟信号图像和数字信号图像的可视化。
<SPR图像光学性质与处理>
为了研究芯片在溶液中的光学特性，本发明准备了0％-40％的蔗糖溶液，分别对应RI值1.33-1.4。本发明采集了同一块芯片在不同浓度蔗糖溶液下的透射光谱和显微图片(具体配置见具体示例)。随着RI的增加，由于纳米孔等离子体的红移特性，透射光谱红移。利用三维时域有限差分(FDTD)软件模拟了不同环境RI下的传感器芯片的透射光谱，具体的模拟细节可以在支持信息中找到。通过模拟仿真的结果，与实验结果吻合，证实了纳米孔等离子体的这一特性。
常规的基于谱峰位移的检测方法需要依赖昂贵的精密仪器，本发明能够用拍摄的显微图片替代光谱仪进行检测。在没有内部参考的情况下，光源以及样品的波动容易引起透射光强度的变化，造成检测结果的不准确。为此本发明通过在每个像素点处归一化RGB三通道的强度值，构建了SPR共振峰移与显微图片颜色的变化之间的紧密的联系，得到了一种稳定可靠的信号图像(具体配置见具体示例)。归一化后，RGB三通道各自的强度值的平均值随RI的变化，结果表明归一化后的强度值与RI之间具有很好的线性关系。随着环境RI的增大，R通道归一化强度值的上升，G通道归一化强度值的下降。由于透射光中，蓝光的成分极少，因此B通道的归一化强度值很小，约为1％，可忽略不计。R通道和G通道的归一化强度值都可用来检测RI的变化。在本示例中本发明选取归一化强度值较大的R通道来表征SPR信号，构建了模拟信号图像用以进行检测。平均模拟信号值是通过计算模拟信号图像整体均值的变化率得到的，计算方法见具体示例。
例如，采集的显微图片在经过imageJ进行预处理(详见具体示例)后成为1000×1000像素大小的初始图片，初始图片包含了345×345um2的芯片表面区域。图像预处理是必要的，它提高了检测的精确度和后续图像处理的运算速度。
初始图片在导入到matlab软件后，本发明使用上述方法计算每个像素点处R/RGB的值来作为每个像素点处的SPR信号值，经过转换后的得到能准确反应SPR信号的模拟信号图像。初始图片和模拟信号图片在CRP检测中的变化微弱，肉眼难以看出区别。本发明使用二元化的方法进一步处理模拟信号图片，将其转换为数字信号图片)。本发明选择合适的阈值，将高于阈值的像素点的值设置为1，将低于阈值的像素点的值设置为0。阈值的选取是动态的，考虑到实验中使用的芯片之间的差异性，对于不同的芯片下拍摄的图片，应采取相同的方法而不是相同的阈值。为保证提取信号的稳定，本发明使用加入检测抗体前拍摄的模拟信号图片的中值作为阈值，加入检测抗体后拍摄的图片使用相同的阈值，在检测抗体与CRP蛋白结合后，环境RI的值发生变化，等离子体共振峰红移。导致图像中一些像素点R/RGB的值增大，原本低于阈值的像素点越过阈值成为值为1的像素点，值为1的像素点数目因而增多，CRP的浓度越大，芯片表面含有CRP的区域越大，则跃迁的像素点数目将越多，从而构建了CRP蛋白浓度变化与像素点数目变化之间的关系。
<方法对比及动力学定量>
本发明将由初始图像转换后的模拟信号图像与数字信号图像同时用于CRP蛋白浓度的检测中。图4d显示了用模拟信号和数字信号两种方法检测CRP蛋白浓度结果。用模拟信号图像的方法进行检测，其LOD为10ng/ml。用数字信号图像的方法进行检测，其LOD为1ng/ml，检测极限提升了10倍。这可能是由于数字化的方法去除了一些背景信号的干扰。图4e显示了平均模拟信号值(Vmas)和数字信号计数值(Vdsc)随CRP浓度(从1ng/ml到500ng/ml)的变化在对数刻度上的曲线，结果符合线性关系。可以看到平均模拟信号值(Vmas)随CRP浓度的变化曲线，拟合系数(R2)为0.977，斜率为0.28。数字信号计数值(Vdsc)随CRP浓度的变化曲线，拟合系数(R2)为0.985，斜率为2.93。相比于模拟信号图像的变化率，数字信号图像的变化率和灵敏度提升了10倍以上。
图4a，图4b，图4c显示出了加入CRP检测抗体后平均模拟信号值(Vmas)和数字信号计数值(Vdsc)随时间的变化曲线。可以看到在检测相同浓度CRP蛋白时，数字信号的变化率要远远大于模拟信号的变化率。且在反应的前30min，1ug/mlCRP(图4a)的反应速率要显著快于100ng/ml CRP(图4b)，和10ng/ml CRP(图4c)的反应速率。SPR系统可以提供分子间相互作用速率并用来测定动力学常数已经被研究过。
Figure GDA0003402664790000121
本发明将获取的动态数字信号图像应用于CRP蛋白结合动力学分析。动力学常数值通过(图4f)确定，拟合函数为y＝a(1-ebx)。从图中可以看到25μg/ml和50μg/ml CRP拟合曲线几乎重叠，这说明在加入50μg/m CRP时达到饱和。CRP蛋白和检测抗体(DA)之间的生物分子相互作用方程可表达为：
这里
Figure GDA0003402664790000122
的值可以通过检测50ug/ml CRP下芯片达到饱和时的数字信号计数值来确定。通过计算拟合系数较好(R2＞0.94)，且远离饱和值(＜90％
Figure GDA0003402664790000123
)的0.5ug/ml与1ug/ml CRP的拟合曲线，得到ka与kd计算值分别3.994×106(±0.36×106)和2.15×102(±0.21×102)。解离平衡常数KD由算式KD＝kd/ka得出，计算值为5.38×(±0.31×)M。KD的计算值接近用纳米粒子放大SPR成像传感器测的结果。
本发明首次将数字化PCR概念引入到SPR成像技术中，结合经典的泊松统计算法，实现了数字化SPR图像技术对CRP蛋白浓度的定量检测。同时，通过采集蛋白结合过程的动态SPR图像，测定了CRP和抗CRP抗体结合动力学。不同于以往计算SPR图像模拟信号均值的方法，数字信号图像通过直接计数变化的敏感像素点来进行检测，通过自动化图像处理的方式实现SPR图像从初始图像到模拟信号图像再到数字信号图像的转变，达到10倍灵敏度的提升。使用此方法对缓冲液中人类C反应蛋白(CRP，100kDa)浓度进行了定量检测，这是一种广泛用于急性炎症疾病临床诊断和治疗的生物标记物。在此证明了检测极限(LOD)低至1ng/ml。这一结果至少比血浆CRP水平低3个数量级。本发明的研究为表面等离子体共振(SPR)成像检测蛋白浓度提供了新的思路和方法。同时避免了使用昂贵的光谱检测仪器，仅使用普通的白光光源和拍照设备实现亮场成像，没有复杂冗长的信号放大步骤，有望开发一种便携式生物传感器用于疾病的早期检测。
需要说明的是，除非特别指出，否则说明书中的术语“第一”、“第二”、“第三”等描述仅仅用于区分说明书中的各个组件、元素、步骤等，而不是用于表示各个组件、元素、步骤之间的逻辑关系或者顺序关系等。
可以理解的是，虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然而上述实施例并非用以限定本发明。对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (5)

1.一种数字化等离子免疫吸附试剂盒的CRP蛋白浓度三明治夹心测试方法，其特征在于包括：
首先芯片表面在11-巯基癸酸溶液中形成自组装单层膜(self-assembledmonolayers)，用EDC和NHS活化羧基，将CRP捕获抗体结合至芯片表面；用BSA与乙醇胺溶液封闭非特异性位点并覆盖剩余NHS；接着将CRP蛋白溶液加入到芯片表面，使得溶液中游离的CRP蛋白将被芯片表面固定的CRP抗体捕获而留在芯片表面；使溶液中的CRP浓度低于预定浓度，其中平均每个纳米孔包含一个至多个CRP蛋白分子；CRP蛋白随机分散至芯片表面的各处并被捕获，使得CRP蛋白在芯片表面分布的不均匀性；最后，将预定量的CRP检测抗体添加到芯片表面与被捕获的CRP蛋白进行结合，使得CRP检测抗体在芯片表面的结合改变所在区域环境的RI使得等离子体共振峰的红移，从而芯片表面区域将分为两个部分，含有CRP蛋白的区域在与CRP检测抗体结合后改变了原来的SPR信号，而不含有CRP蛋白的区域不能与CRP检测抗体结合保持原有的SPR信号；
所述数字化等离子免疫吸附试剂盒，包括：盒体、布置盒体内的纳米等离子体传感器芯片以及试剂；其中，纳米等离子体传感器芯片表面形成有纳米杯阵列，而且纳米杯阵列中的每个纳米杯包括纳米柱、以及依次形成在纳米柱表面的钛层和金层；
所述纳米等离子体传感器芯片的制备方法为：通过激光干涉光刻在氧化硅片上制成的锥形纳米柱阵列来制造原始模具；在复制原始模具之前，将原始模具硅烷化以获得疏水性；然后，将光学粘合剂涂覆在清洁的原始模具上，并将PET薄板放置在模具的顶部，经过紫外线照射后将表面具有纳米孔阵列的PET薄片从模具上剥离；此后，使用电子束蒸发机在具有纳米孔阵列的PET表面上沉积钛层和金层，以制成纳米等离子体传感器芯片。
2.根据权利要求1所述的测试方法，其特征在于包括：
引入泊松分布算式：
Figure FDA0003402664780000011
其中λ是与CRP蛋白浓度c关联的参数，有λ＝k1*c，k1为系数；概率P表示SPR信号发生变化的纳米孔区域与检测的纳米孔区域的比值；纳米孔区域的比值近似用像素点数目的变化来表示，将SPR信号发生变化的像素点数目的变化率表示为p，即
Figure FDA0003402664780000021
Ncp表示变化的像素点数目，Ntot表示总的像素点数目；加一个矫正系数k2来建立SPR信号发生变化的区域与像素点数目的变化之间的对应关系，则有对应关系公式：P(X＝0)＝1-k2×p，将其表示为p与c的函数得到：
p＝k2(1-1k1×c)；
两边取对数得到浓度公式：
c＝k1×In(1-k2×p)。
3.根据权利要求2所述的测试方法，其特征在于还包括：将像素点数目变化率p随CRP浓度的函数关系，用所述对应关系公式进行拟合，取CRP的浓度低于50ng/ml时的拟合结果以确定系数k1、k2的值，从而将浓度公式进一步表示为c(CRP)＝0.10804×In(1-4.90938×p)，以计算CRP蛋白浓度。
4.根据权利要求1或2所述的测试方法，其特征在于，所述测试方法用于炎症标志物CRP蛋白的检测。
5.根据权利要求1或2所述的测试方法，其特征在于，其中采用卤素灯进行照明，而且通过聚光镜和放大的物镜在CCD相机上曝光透射模式的图像。
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