CN206387808U - 检测样品中crp的芯片和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本实用新型提出了一种检测样品中CRP的芯片和试剂盒，具体地，提出了一种高灵敏、快速检测样品中C‑反应蛋白(CRP)的芯片以及包含该芯片的试剂盒，该芯片包括：基底；负载层，所述负载层形成在所述基底的表面，并且所述负载层是由等离子体纳米金颗粒形成的；捕获层，所述捕获层形成在所述负载层的外表面，所述捕获层携带有第一CRP捕获抗体，所述第一CRP捕获抗体特异性针对所述CRP。利用本实用新型的芯片，能够灵敏、快速地检测样品中的CRP。利用本实用新型的芯片，对样品中预定抗原CRP的检测灵敏度可低至0.2mg/L，检测范围为0.2～160mg/L，对样品的用量要求可低至1μL，而检测时间相比于现有技术大幅缩短，检测用时可控制在15min以内，并且可实现对CRP的高通量检测。

Description

检测样品中CRP的芯片和试剂盒

技术领域

本实用新型涉及生物检测领域，具体的，本实用新型涉及检测样品中CRP的芯片和试剂盒。

背景技术

C反应蛋白(CRP)于1930年被蒂利特和弗朗西斯最早从肺炎球菌肺炎感染病人身上发现。这种蛋白分子量为118kDa，其天然结构由五个非共价键合和的相同亚基构成。目前，CRP的已被公认为感染或炎症的早期指标，同时也被认为是许多疾病的通用生物标记物。由于这些疾病开始发生时，体内的CRP浓度非常低，10nM或甚至pM水平，这就要求所使用的分析方法必须具有高度灵敏度、选择性，而且还需具备速度快，使用最小的样品消耗等特点。

因此，在满足这些要求下，灵敏地分析生物体液中CRP的水平对于诊断和监测化疗/ 个性化医疗干预的进展至关重要。

实用新型内容

本实用新型是基于发明人对以下问题和事实的发现而提出的：

当前，临床检测CRP的主要有免疫层析、免疫比浊、酶联免疫和化学发光检测。免疫层析技术发展成熟、检测快速、无需专业技术人员参与，但是其检测灵敏度较低，通常只能用于定性或半定量检测，其主要应用在对灵敏度和特异性要求不是很高的快速体外诊断检测项目中。免疫比浊法操作简单，检测速度快、定量效果佳、专业技能要求低，但是其灵敏度不高，严重限制了其应用广度。酶联免疫吸附检测成本低，技术成熟，但其检测时间长，检测灵敏度不高，在西方发达国家基本已被淘汰。化学发光属于一种自发光的检测技术，灵敏度高，目前化学发光免疫检测在我国三甲医院已经广泛使用，然而其通常需要昂贵复杂的大型设备，且每次只能检测一项指标，是单通量的检测方法，其在检测单个样品中多项指标时需耗费多倍的时间、样品和费用。蛋白芯片是近十几年来伴随着基因芯片迅速发展起来的一项新技术。它通过微电子技术及表面化学技术把各种蛋白质高密度、有序地排列在固相支持物表面，然后通过探针蛋白特异性地捕获样品中的靶蛋白，并运用相应检测系统对靶蛋白进行定性、定量分析，是一种新的高通量分析技术。蛋白芯片技术具有样品耗费少、高通量的优点，是一种理想的多目标检测方式。然而，传统的蛋白芯片检测灵敏度低，限制了它在医疗诊断中的应用。

而表面等离子体光子学是将表面等离子体技术应用到光子学领域而发展出来的一门新的学科。经科学家特殊设计的等离子体纳米颗粒可以在外界光的作用下发生共振，从而可作为一个有效的光学纳米天线捕获更多的光信号，这种特殊的物理现象可被应用于荧光增强。

本实用新型利用等离子体基底制备等离子体荧光增强CRP检测芯片，并将其应用到临床血液检测中。发明人意外地发现，所制备的等离子体荧光增强CRP芯片可以实现采集指尖血全血或血清的检测，血液样本体积只需1uL。可以同时实现超敏CRP和常规CRP的全程检测，检测范围0.2-160mg/L,其检测时间≤15min，同时所得到的结果与现有常用的临床CRP检测方法(免疫比浊法)具有良好的相关性。

基于此，在本实用新型的第一方面，本实用新型提出了一种检测样品中CRP的芯片。根据本实用新型的实施例，所述芯片包括：基底；负载层，所述负载层形成在所述基底的表面，并且所述负载层是由等离子体纳米金属颗粒形成的；捕获层，所述捕获层形成在所述负载层的上表面，所述捕获层携带有第一CRP捕获抗体，所述第一CRP捕获抗体特异性针对所述CRP。利用根据本实用新型实施例的芯片，能够高灵敏、快速检测样品中的CRP。根据本实用新型的实施例，所述样品可以全血样品或血清样品。利用根据本实用新型实施例的芯片，对样品中CRP的检测灵敏度可低至0.2mg/L，检测范围为0.2～160mg/L，对样品的用量要求可低至1μL，而检测时间相比于现有技术大幅缩短，检测用时可控制在15min 以内，并且可实现对CRP的高通量检测。

根据本实用新型的实施例，所述检测样品中CRP的芯片还可以进一步包括如下附件技术特征至少之一：

根据本实用新型的实施例，所述负载层为等离子体纳米金层或等离子体纳米银层。

根据本实用新型的实施例，所述负载层包括多个非连续的金岛。根据本实用新型的实施例，所述金岛由等离子体纳米金颗粒形成，金岛可以在外界光的作用下发生共振，可作为一个有效的光学纳米天线捕获更多的光信号，从而对荧光信号起到增强作用。

根据本实用新型的实施例，所述多个金岛在所述基底的外表面平均分布，并且所述金岛的岛面积为100～100000nm²。

根据本实用新型的实施例，所述金岛的岛面积为15000～60000nm²。

根据本实用新型的实施例，所述负载层的厚度为10～500nm。

根据本实用新型的实施例，所述负载层的厚度为10～200nm。

根据本实用新型的实施例，所述负载层的厚度为10～70nm。根据本实用新型的实施例，所述多个非连续的金岛中相邻两个金岛的距离为1～100nm纳米之间。

根据本实用新型的实施例，所述多个非连续的金岛中相邻两个金岛的距离为5～50nm。多个金岛中相邻两个金岛的距离在5～50nm之间，进而可有效提高金颗粒间的局部电场，进而有效增强荧光分子的激发。

根据本实用新型的实施例，所述基底是由玻璃、硅片或塑料形成的。

根据本实用新型的实施例，所述基底是由玻璃形成的。发明人发现，玻璃基底具有光学透明的特性，有利于荧光检测，且玻璃基底表面容易进行化学修饰，方便操作。

根据本实用新型的实施例，所述捕获层包括多个捕获印斑。根据本实用新型的实施例，当采用本实用新型的芯片检测样品中的CRP时，捕获层以捕获印斑的形式设置，捕获印斑捕获CRP抗原后，再与携带近红外荧光染料标记的检测抗体(第二CRP抗体)反应形成免疫三明治结构，此时，检测抗体上的近红外荧光信号可在等离子荧光增强作用下放大约100倍，从而极大地增加对CRP检测的灵敏度。

根据本实用新型的实施例，所述多个捕获印斑呈圆形，并且所述圆形的直径为10微米～1厘米。

根据本实用新型的实施例，所述圆形的直径为300微米～500微米。

根据本实用新型的实施例，所述捕获层进一步携带有鸡IgY抗体，并且所述鸡IgY抗体、所述第一CRP捕获抗体分别设置在不同的捕获印斑上。在本申请的实施例中，设置有第一CRP捕获抗体的捕获印斑被称为CRP检测印斑，设置有鸡IgY抗体的捕获印斑被称为参考印斑。根据本实用新型的实施例，在检测血液样品中的CRP实验中，可通过羊抗鸡 IgY抗体与鸡IgY抗体的特异性结合，进而获得可作为参考印斑上的荧光值，从而通过检测标准CRP样品，获得CRP检测印斑点上的荧光值与参考印斑上的荧光值的比值，以标准CRP样品的浓度为横坐标，比值为纵坐标，绘制“CRP浓度-比值”的标准曲线。在检测待测样品中CRP浓度时，可依据获得的CRP检测印斑点上的荧光值与参考印斑上的荧光值的比值，对应“CRP浓度-比值”的标准曲线，精确获得待测样品中CRP的浓度。利用根据本实用新型实施例的芯片检测样品中的CRP，可减少干扰，提高定量检测准确性。

根据本实用新型的实施例，所述捕获印斑是利用微量点样仪采用0.5～2微摩尔/升的浓度的抗体溶液进行打印形成的。根据本实用新型的实施例，采用的微量点样仪能够将第一 CRP捕获抗体精确地与负载层进行结合固定，进而能够精确控制第一CRP捕获抗体的点样量、点样斑点的大小，进而对CRP的检测更加准确。根据实用新型的实施例，所述第一CRP捕获抗体与负载层的连接方式为物理吸附。

在本实用新型的第二方面，本实用新型提出了一种检测样品中CRP的芯片。根据本实用新型的实施例，所述芯片包括：玻璃基底；负载层，所述负载层形成在所述玻璃基底的外表面的至少一部分，并且所述负载层由多个金岛构成，所述多个金岛在所述玻璃基底的外表面间隔设置，并且所述金岛是由等离子体纳米金颗粒形成的，所述多个金岛在所述玻璃基底的外表面平均分布，所述多个金岛中相邻两个的间距为5～50nm，所述金岛的厚度为10～70nm；捕获层，所述捕获层形成在所述多个金岛的至少一个上，并且所述捕获层携带第一CRP捕获抗体，所述捕获层是由多个间隔设置的捕获印斑构成的，并且一个捕获印斑至少在一个所述金岛的上表面，所述捕获印斑呈圆形，所述圆形的直径为300微米～500微米，任选地，所述第一CRP捕获抗体特异性针对所述CRP。任选地，所述捕获层进一步携带鸡IgY抗体，并且所述鸡IgY抗体、所述第一CRP捕获抗体分别设置在不同的捕获印斑上，任选地，所述捕获印斑是利用GeSim Nano-Plotter TM 2.1点样仪采用0.5～2微摩尔/升的浓度的抗体溶液进行打印形成的。利用根据本实用新型实施例的芯片，能够快速、高灵敏度地检测样品中的CRP。根据本实用新型的实施例，所述样品可以是全血样品或血清样品。利用根据本实用新型实施例的芯片，对样品中预定抗原CRP的检测灵敏度可低至 0.2mg/L，检测范围为0.2～160mg/L，对样品的用量要求可低至1uL，而检测时间相比于现有技术大幅缩短，检测用时可控制在15min以内，并且可实现对CRP的高通量检测。

在本实用新型的第三方面，本实用新型提出了一种检测检测样品中CRP的试剂盒。根据本实用新型的实施例，所述试剂盒包括前面所述的检测样品中CRP的芯片以及任选的第二抗体容器，所述第二抗体容器中设置有第二CRP检测抗体，所述第二CRP检测抗体特异性针对所述CRP，并且所述第二CRP检测抗体具有近红外荧光染料标记。利用根据本实用新型实施例的试剂盒，对样品中预定抗原CRP的检测灵敏度可低至0.2mg/L，检测范围为 0.2～160mg/L，对样品的用量要求可低至1μL，而检测时间相比于现有技术大幅缩短，检测用时可控制在15min以内，并且可实现对CRP的高通量检测。

根据本实用新型的实施例，所述检测样品中CRP的试剂盒还可以进一步包括如下附件技术特征至少之一：

根据本实用新型的实施例，所述近红外荧光染料标记为IR800。发明人发现，相比于cy5 等其它染料，IRDye800标记的第二CRP检测抗体在前面所述的检测样品中CRP的芯片上可获得高达2个数量级的荧光增强效果。进而利用本实用新型实施例的试剂盒检测样品中预定抗原CRP，检测灵敏度会进一步显著提高。

附图说明

图1是根据本实用新型实施例的芯片的纵相剖面图；

图2是根据本实用新型实施例的芯片的负载层的结构示意图；

图3是根据本实用新型实施例的芯片的捕获层的结构示意图；

图4是根据本实用新型实施例的芯片的结构示意图；

图5是根据本实用新型实施例的等离子体芯片结构的扫描隧道电子显微镜照片；

图6是根据本实用新型实施例的芯片的检测示意图；

图7是根据本实用新型实施例的检测区分布示意图；

图8是根据本实用新型实施例的标准曲线；

图9是根据本实用新型实施例的利用本实用新型的芯片检测稀释800倍后的45例血清样本中的CRP浓度的结果与临床结果的相关性分析；以及

图10是根据本实用新型实施例的利用本实用新型的芯片检测稀释800倍后的45例全血样本中的CRP浓度结果与临床结果的相关性分析。

具体实施方式

下面详细描述本实用新型的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本实用新型，而不能理解为对本实用新型的限制。

检测样品中CRP的芯片

在本实用新型的第一方面，本实用新型提出了一种检测样品中CRP的芯片。根据的本实用新型的实施例，参考图(纵相剖面)1，所述芯片包括：基底100；负载层200，所述负载层200形成在所述基底100的表面，并且所述负载层是由等离子体纳米金属颗粒形成的；捕获层300，所述捕获层300形成在所述负载层的上表面，所述捕获层300携带有第一CRP捕获抗体，所述第一CRP捕获抗体特异性针对所述CRP。

根据本实用新型的实施例，所述负载层为等离子体纳米金层或等离子体纳米银层。即负载层可由等离子体纳米金颗粒或银颗粒形成。当负载层为等离子体纳米金层时，根据本实用新型的具体实施例，参考图2，所述负载层200包括多个金岛210。根据本实用新型的实施例，所述金岛210由等离子体纳米金颗粒形成，金岛210可以在外界光的作用下发生共振，可作为一个有效的光学纳米天线捕获更多的光信号，从而对荧光信号起到增强作用。

根据本实用新型的再一具体实施例，所述多个金岛210在所述基底100的外表面平均分布，所述金岛的岛面积为100～100000nm²。

根据本实用新型的再一具体实施例，所述金岛的岛面积为15000～60000nm²。

根据本实用新型的再一具体实施例，金岛210所形成负载层200的厚度为10～500nm。

根据本实用新型的再一具体实施例，金岛210所形成负载层200的厚度10～200nm。

根据本实用新型的再一具体实施例，金岛210所形成负载层200的厚度为10～70nm。

根据本实用新型的再一具体实施例，多个金岛210中相邻两个金岛的距离在1～100纳米之间。

根据本实用新型的再一具体实施例，多个金岛210中相邻两个金岛的距离在5～50nm。进而可有效提高金颗粒间的局部电场，进而有效增强荧光分子的激发。

所述基底的材料不受特别限制，根据本实用新型的具体实施例，所述基底的材料可采用玻璃、硅片或塑料形制成的。根据本实用新型的具体实施例，优选采用玻璃。玻璃基底光学透明，有利于荧光检测、其表面容易进行化学修饰、成本低廉且加工工艺成熟，是工业上常用的广学检测基材。

根据本实用新型的具体实施例，所述基底100和负载层200形成的结构被称为等离子体芯片结构。其中等离子体芯片结构可通过液相种子生长法在玻璃基片上原位制备。根据本实用新型的实施例，所述液相种子生长法的操作步骤如下所述：1)将玻璃基底与氨水和氯金酸接触，以便获得第一等离子体芯片结构半成品；2)将所述第一等离子体芯片结构半成品与硼氢化钠接触，以便获得第二等离子体芯片结构半成品；以及3)将所述第二等离子体芯片结构半成品与氯金酸和羟胺接触，以便获得所述等离子体芯片结构，在步骤1)中，所述接触的时间为0.5min～3min,所述氨水的浓度为100mmol/L～1000mmol/L，所述氯金酸的浓度为0.1mmol/L～25mmol/L，在步骤2)中，所述接触的时间为0.5min～3min,所述硼氢化钠溶液的浓度为0.1mmol/L～10mmol/L，在步骤3)中，所述接触的时间为 11min～23min,所述氯金酸的浓度为0.1mmol/L～1mmol/L，所述氯金酸和所述羟胺的摩尔比为1：1。利用根据本实用新型实施例的上述操作获得的等离子体芯片结构，等离子体芯片结构表面的负载层(200)贵金属膜的形貌和厚度得到了精准的控制，获得的等离子体金属层具有非连续的金岛结构210，每个金岛的大小合适，金岛210之间的距离均匀分布于～10nm 左右，非常适用于近红外(650nm～1700nm)的荧光增强的生物分子检测。

根据本实用新型的实施例，参考图3，所述捕获300包括多个捕获印斑310。发明人发现，捕获层以捕获印斑310的形式设置，可有效实现CRP的高通量捕获和检测。根据本实用新型的具体实施例，所述捕获印斑310呈圆形，并且所述圆形的直径为300微米～500微米。

根据本实用新型的实施例，所述捕获层进一步携带鸡IgY抗体，并且所述鸡IgY抗体、所述第一CRP捕获抗体分别设置在不同的捕获印斑310上。根据本实用新型的实施例，在捕获血液样品中的CRP实验中，可通过羊抗鸡IgY抗体与鸡IgY抗体的特异性结合，进而获得可作为参考点的荧光值，从而通过CRP标准品的荧光值与参考点的荧光值的比值，获得“CRP浓度-比值”的标准曲线。

根据本实用新型的具体实施例，所述捕获印斑是利用微量点样仪采用0.5～2微摩尔/升的浓度的抗体溶液进行打印形成的。根据本实用新型的实施例，采用微量点样器，如GeSimNano-Plotter TM微量点样器，能够将第一CRP捕获抗体精确地与负载层200进行结合固定，进而能够精确控制第一CRP捕获抗体的点样量、点样斑点的大小，进而对CRP 的检测更加准确。所述第一CRP捕获抗体与负载层200的连接方式不受特别限制，根据实用新型的实施例，可采用物理吸附的方式进行连接。

根据本实用新型的实施例，所述样品可以采用全血样品或血清样品。利用根据本实用新型实施例的芯片，对样品中CRP的检测灵敏度可低至0.2-160mg/L，样品的用量可低至1 uL，而检测时间相比于现有技术大幅缩短，检测用时可控制在15min以内，并且可实现对 CRP的高通量检测。本实用新型的芯片，相对于传统的以玻璃或硝酸纤维素膜为基底芯片荧光检测，传统的芯片荧光检测在检测过程中需要耗费更多的孵育时间，用于保证样品中更多的CRP被芯片基底捕获，后续才可检测到。而本实用新型的芯片中的裸金等离子体结构具有荧光放大的作用，可极大地提高灵敏度，只需极其微量的CRP被捕获便可检测到。因此可很大程度地减少孵育时间(约5min)，最终使检测时间可缩短至15min，

在本实用新型的第二方面，本实用新型提出了一种检测样品中CRP的芯片。根据本实用新型的实施例，参考图4，所述芯片包括：玻璃基底100；负载层200，所述负载层200 形成在所述玻璃基底的外表面的至少一部分，并且所述负载层200由多个金岛210构成，所述多个金岛210在所述玻璃基底100的外表面间隔设置，并且所述金岛210是由等离子体纳米金颗粒形成的，所述多个金岛在所述玻璃基底的外表面平均分布，所述多个金岛210 中相邻两个的间距为5～50nm，所述金岛210的厚度为10～70nm；捕获层300，所述捕获层 300形成在所述多个金岛210的至少一个上，并且所述捕获层携带第一CRP捕获抗体，所述捕获层300是由多个间隔设置的捕获印斑310构成的，并且一个捕获印斑310至少在一个所述金岛210的上表面，所述捕获印斑310呈圆形，所述圆形的直径为300微米～500微米，任选地，所述第一CRP捕获抗体特异性针对所述CRP，任选地，所述捕获层300进一步携带鸡IgY抗体，并且所述鸡IgY抗体、所述第一CRP捕获抗体分别设置在不同的捕获印斑310上，任选地，所述捕获印斑310是利用GeSim Nano-Plotter TM 2.1点样仪采用0.5～2 微摩尔/升的浓度的抗体溶液进行打印形成的。利用根据本实用新型实施例的芯片，能够高灵敏度地检测样品中的CRP。根据本实用新型的实施例，所述样品可以全血样品或血清样品。利用根据本实用新型实施例的芯片，对样品中CRP的检测灵敏度可低至0.2-160mg/L，对样品的用量要求可低至1uL，而检测时间相比于现有技术大幅缩短，检测用时可控制在 15min以内，并且可实现对CRP的高通量检测。

根据本实用新型的具体实施例，在利用本实用新型的芯片检测血样中CRP时，需要加入具有荧光标记的第二CRP检测抗体，并且所述第二CRP检测抗体特异性针对CRP。进而第一捕获抗体和第二检测抗体均可特异性识别CRP，第二CRP检测抗体的荧光标记在第二CRP检测抗体与CRP特异性结合后，在相应激发光的作用下可发出荧光，荧光在本实用新型芯片的荧光增强作用下，荧光可被百倍放大，进而利用本实用新型的实施例的芯片检测CRP，可实现对CRP的高灵敏度、快速、高通量的检测。

根据本实用新型的再一具体施例，上述的荧光标记是IRDye800标记。发明人发现，相对于cy5等其它染料，IRDye800标记的第二CRP检测抗体在本实用新型的芯片上可获得高达2个数量级放大作用的荧光增强效果。

根据本实用新型的再一具体实施例，在利用本实用新型的芯片检测血样的实验中，需要进一步加入具有荧光标记的羊抗鸡IgY抗体。羊抗鸡IgY抗体可特异性结合鸡IgY抗体。根据本实用新型的具体实施例，通过羊抗鸡IgY抗体与抗体鸡IgY抗体的特异性结合，获得的荧光值可作为参考点的荧光值，进而通过CRP标准品的荧光值与参考点的荧光值的比值，获得“CRP浓度-比值”的标准曲线。利用根据本实用新型实施例的芯片检测样品中的CRP抗原，能够进一步精确确定样品中抗原CRP的浓度，最大可能地减少不同装置、不同操作人员、不同操作环境下造成的检测误差。利用根据本实用新型实施例的芯片检测样品中的CRP的浓度，获得的检测结果的准确度、可信度、稳定性进一步提高。

为了方便理解，根据本实用新型的一个实施例，下面对利用本实用新型的高灵敏、快速检测样品中CRP的芯片检测样品中CRP的浓度的方法进行描述：

血清或全血样品通过两次稀释(第一次：1uL稀释至39uLPBS(10％BSA)中，第二次：10uL第一次稀释液加入190uL PBS(10％BSA)中)稀释至800倍。分别取100微升稀释液加入至每个孔中，摇动5min。本实用新型的芯片用PBST洗涤三次，随后用IRDye800标记的抗体(10nM第二CRP抗体和1nM羊抗IgY)在黑暗中5min摇动染色。后用PBST洗涤三次。等离子体芯片最后用纯水清洗、在扫描之前的空气压缩机干燥。获取荧光比值(CRP 检测点的荧光值与参考点荧光值之比)之后，根据“CRP浓度-比值”的标准曲线求出样品中CRP的浓度。

检测样品中CRP的试剂盒

另一方面，本实用新型提出了一种检测检测样品中CRP的试剂盒。根据本实用新型的实施例，该试剂盒包括前面所述的检测样品中CRP的芯片以及任选的第二抗体容器，所述第二抗体容器中设置有第二CRP检测抗体，所述第二CRP检测抗体特异性针对所述CRP，并且所述第二CRP检测抗体具有近红外荧光染料标记。其中，近红外荧光染料标记的类型不受特别限制，根据本实用新型的具体实施例，所采用的近红外荧光染料标记可为IR800，相比于采用cy5等其它染料，IRDye800标记的第二CRP检测抗体在前面所述的检测样品中CRP的芯片上可获得高达2个数量级的荧光增强效果。进而利用本实用新型实施例的试剂盒检测样品中预定抗原CRP，检测灵敏度会进一步显著提高。利用根据本实用新型实施例的试剂盒，对样品中预定抗原CRP的检测灵敏度可低至0.2mg/L，检测范围为0.2～160mg/L，对样品的用量要求可低至1μL，而检测时间相比于现有技术大幅缩短，检测用时可控制在15min以内，并且可实现对CRP的高通量检测。

下面详细描述本实用新型的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本实用新型，而不能理解为对本实用新型的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

在本实施例中，发明人详细介绍了本实用新型芯片相关实验材料的获得、IRDye800 标记的检测抗体的获得以及血清样本的制备过程。

实验材料：氯金酸、硼氢化钠、盐酸羟胺和二甲亚砜(DMSO)购自Sigma-Aldrich 公司购买。氢氧化铵购买自Fisher化学。脱盐柱购自GE Healthcare。FAST框架滑动架和滑动快速孵化室从Sigma-Aldrich公司购买。检测抗体CRP抗体1、捕获抗体CRP 抗体2、CRP校准品均购自菲鹏生物科技有限公司。800CW NHS酯是由LI- COR公司购买。胎牛血清购自浙江天杭生物技术公司。

IRDye800标记的检测抗体的获得：捕获抗体通过1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺/N-羟基共价偶联IRDye800，然后用柱分离未标记的IRDye800。 800CWNHS酯用DMSO稀释并保存在-20℃，使用前避光。捕获抗体和IRDye800以 1:1的摩尔比混合4度下摇动，在黑暗中1.5小时。NAP-5柱用于除去未结合的染料。起初，10毫升的PBS加入到柱中，当柱子中溶液自由低落完全后，将PBS加入至先前的标记混合物中，使其总体积达到500微升并加入至柱子中，滴落后，再加入另外500 微升PBS。最后，收集IRDye800标记的检测抗体，将其储存在-20℃，使用前避光。

人血清：这项研究调查方案得到了深圳罗湖医院的机构伦理委员会的批准。自项目启动时已取得患者知情同意。实验中检测所用到的所有样品均在深圳罗湖医院收集。 3毫升的血液被吸引到一个EDTA管，并分成等份用于血液检查。对于血清试验，3 毫升的血液加入至血清管中，并在3000转每分钟离心15分钟。上清液在离心管收集。血清样本在使用前储存在-20℃条件下。全血样本在采集后24h内检测。

本申请所述的“等离子体芯片结构”(包括基底100和负载层200)在10.0千伏加速电压、FEG源下通过日立S-4800扫描电子显微镜(SEM)观察，得到如图5所示的扫描隧道电子显微镜照片。

本申请的所述的检测样品中CRP的芯片的检测示意图如图6所示。

实施例2 获得CRP检测标准曲线

CRP检测标准曲线制作：采用夹层结构来检测CRP。通过点样仪GeSim Nano-Plotter TM 2.1固定捕获抗体至等离子体芯片结构上。捕获抗体用PBS稀释到1 μM，并加入到384孔板中。通过运行设计的打印方案，捕获抗体按照4nL每个点、每个点重复4次打印，最终获得～400微米的圆形斑点。该芯片在4℃下放置过夜。取朗道的标准品(CRP标准品)(浓度分别为0、2.5、10、20、80和160mg/L)通过两次稀释(第一次：1uL稀释至39uLPBS(10％BSA)中，第二次：10uL第一次稀释液加入 190uL PBS(10％BSA)中)稀释至800倍。分别取100微升稀释液加入至每个孔中，摇动5min。芯片用PBST洗涤三次，随后IRDye800标记的抗体(10nM第二CRP抗体和1nM羊抗IgY)在黑暗中5min摇动染色。后用PBST洗涤三次。等离子体芯片最后用纯水清洗、在扫描之前的低速离心甩干表面的液体。检测区分布示意图如图7所示 (其中，各检测区域分布有两行特异检测区，每行分布有4个平行的点，第一行固定有鸡IgY，用于定量参考；第二行固定有第一捕获CRP抗体，用于检测CRP。第二行四个点荧光强度的平均值除以第一行四个点荧光强度的平均值被称为荧光比值，此值用于CRP的定量检测。)根据不同标准样品的浓度与其荧光比值(同一检测孔中CRP 检测点的荧光值与参考点荧光值之比)绘制标准曲线。所得标准曲线如图8所示(其中，每个浓度检测5次，横坐标表示样品在稀释800倍前的CRP浓度，纵坐标是根据图7中计算所得的荧光比值)。

荧光测量和分析：用MidaScan(NIRMIDAS Biotech)扫描器扫描芯片，选择800纳米通道、激光强度设置为7.0、分辨率设置为20微米。扫描后获得16位灰度图像。 MidaScan配套的图像软件用于分析该图像。选择栅阵列分析模式测量每个点的强度。点阵的形貌由程序自动识别。每个点的强度通过所选区域总信号强度除以面积获得。图像上平行的4个点的平均强度被定义为测试的强度。血清中特异性标记物的浓度与所获图像上的荧光强度比值之间存在正相关关系。读取荧光强度后便可间接地获得浓度值。

LOD和LOQ计算：LOD和LOQ均是根据校准曲线进行计算获得。等离子体芯片的校正曲线的线性拟合方程均通过OriginPro拟合计算获得。LOD定义为平均空白值加上S.D.的3倍，LOQ定义为平均空白值加上S.D的10倍。

实施例3 CRP检测芯片的应用

CRP检测芯片的检测：采用夹层结构来检测CRP。通过点样仪GeSim Nano-PlotterTM 2.1固定捕获抗体至等离子体芯片结构上。第一捕获抗体用PBS稀释到1μM，并加入到384孔板中。通过运行设计的打印方案，第一捕获抗体按照4nL每个点、每个点重复4次打印，最终获得～400微米的圆形斑点。该芯片在4℃下放置过夜。血清或全血样品通过两次稀释(第一次：1uL稀释至39uLPBS(10％BSA)中，第二次：10uL第一次稀释液加入190uL PBS(10％BSA)中)稀释至800倍。分别取100微升稀释液加入至每个孔中，摇动5min。芯片用PBST洗涤三次，随后IRDye800标记的抗体(10nM CRP 抗体2和1nM羊抗IgY)在黑暗中5min摇动染色。后用PBST洗涤三次。等离子体芯片最后用纯水清洗、在扫描之前的空气压缩机干燥。获取荧光比值(同一检测孔中CRP 检测点的荧光值与参考点荧光值之比)之后，根据实施例2中绘制的标准曲线反求出浓度。

进而，发明人比较了利用本实用新型的芯片检测获得的血清或全血中的CRP浓度与临床检测结果进行相关性分析，结果如图9和图10所示。其中图9显示了利用本实用新型的芯片检测稀释800倍后的45例血清样本中的CRP浓度的结果与临床结果的相关性分析，图10显示了利用本实用新型的芯片检测稀释800倍后的45例全血样本的结果与临床结果的相关性分析，其中，全血CRP浓度是根据全血样本中实际检测到的CRP浓度经血红细胞压积较正获得。图9和图10显示，利用本实用新型的芯片检测获得的血清或全血中的CRP浓度与临床检测结果具有很好的相关性。

在本实用新型的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”、“轴向”、“径向”、“周向”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本实用新型和简化描述，而不是指示或暗示所指的芯片或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本实用新型的限制。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本实用新型的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本实用新型的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本实用新型的限制，本领域的普通技术人员在本实用新型的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (20)

1.一种检测样品中CRP的芯片，其特征在于，包括：

基底；

负载层，所述负载层形成在所述基底的表面，并且所述负载层是由等离子体纳米金属颗粒形成的；

捕获层，所述捕获层形成在所述负载层的上表面，所述捕获层携带有第一CRP捕获抗体，所述第一CRP捕获抗体特异性针对所述CRP。

2.根据权利要求1所述的检测样品中CRP的芯片，其特征在于，所述负载层为等离子体纳米金层或等离子体纳米银层。

3.根据权利要求2所述的检测样品中CRP的芯片，其特征在于，所述负载层包括多个非连续的金岛。

4.根据权利要求3所述的检测样品中CRP的芯片，其特征在于，所述多个非连续的金岛在所述基底的外表面平均分布，并且所述金岛的岛面积为100～100000nm²。

5.根据权利要求4所述的检测样品中CRP的芯片，其特征在于，所述金岛的岛面积为15000～60000nm²。

6.根据权利要求1所述的检测样品中CRP的芯片，其特征在于，所述负载层的厚度为10～500nm。

7.根据权利要求6所述的检测样品中CRP的芯片，其特征在于，所述负载层的厚度为10～200nm。

8.据权利要求6所述的检测样品中CRP的芯片，其特征在于，所述负载层的厚度为10～70nm。

9.根据权利要求3所述的检测样品中CRP的芯片，其特征在于，所述多个非连续的金岛中相邻两个金岛的距离为1～100nm纳米之间。

10.据权利要求9所述的检测样品中CRP的芯片，其特征在于，所述多个非连续的金岛中相邻两个金岛的距离为5～50nm。

11.根据权利要求1所述的检测样品中CRP的芯片，其特征在于，所述基底是由玻璃、硅片或塑料形成的。

12.根据权利要求11所述的检测样品中CRP的芯片，其特征在于，所述基底是由玻璃形成的。

13.根据权利要求1所述的检测样品中CRP的芯片，其特征在于，所述捕获层包括多个捕获印斑。

14.根据权利要求13所述的检测样品中CRP的芯片，其特征在于，所述多个捕获印斑呈圆形，并且所述圆形的直径为10微米～1厘米。

15.根据权利要求14所述的检测样品中CRP的芯片，其特征在于，所述圆形的直径为300微米～500微米。

16.根据权利要求13所述的检测样品中CRP的芯片，其特征在于，所述捕获层进一步携带鸡IgY抗体，并且所述鸡IgY抗体、所述第一CRP捕获抗体分别设置在不同的捕获印斑上。

17.根据权利要求13所述的检测样品中CRP的芯片，其特征在于，所述捕获印斑是利用微量点样仪采用0.5～2微摩尔/升的浓度的抗体溶液进行打印形成的。

18.一种检测样品中CRP的芯片，其特征在于，包括：

玻璃基底；

负载层，所述负载层形成在所述玻璃基底的外表面的至少一部分，并且所述负载层由多个金岛构成，所述多个金岛在所述玻璃基底的外表面间隔设置，并且所述金岛是由等离子体纳米金颗粒形成的，所述多个金岛在所述玻璃基底的外表面平均分布，所述多个金岛中相邻两个的间距为5～50nm，所述金岛的厚度为10～70nm；

捕获层，所述捕获层形成在所述多个金岛的至少一个上，并且所述捕获层携带第一CRP捕获抗体，所述捕获层是由多个间隔设置的捕获印斑构成的，并且一个捕获印斑至少在一个所述金岛的上表面，所述捕获印斑呈圆形，所述圆形的直径为300微米～500微米，

任选地，所述第一CRP捕获抗体特异性针对所述CRP，

任选地，所述捕获层进一步携带鸡IgY抗体，并且所述鸡IgY抗体、所述第一CRP捕获抗体分别设置在不同的捕获印斑上，

任选地，进一步包括第二CRP检测抗体，所述第二CRP检测抗体特异性针对所述CRP，所述第二CRP检测抗体具有近红外荧光染料标记，

任选地，所述捕获印斑是利用微量点样仪，采用0.5～2微摩尔/升的浓度的抗体溶液进行打印形成的。

19.一种检测样品中CRP的试剂盒，其特征在于，包括：

权利要求1～18任一项所述的检测样品中CRP的芯片；以及

任选的第二抗体容器，所述第二抗体容器中设置有第二CRP检测抗体，所述第二CRP检测抗体特异性针对所述CRP，并且所述第二CRP检测抗体具有近红外荧光染料标记。

20.根据权利要求19所述的试剂盒，其特征在于，所述近红外荧光染料标记为IR800。