CN106841164B - 基于sers位移和强度相结合的糖蛋白检测芯片的应用 - Google Patents

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Abstract

一种基于SERS位移和强度相结合的异质体分辨糖蛋白检测芯片，属于SERS检测技术领域。本发明首次应用抗体纳米金及具有拉曼活性和良好生物相容性的银组装膜作为基底，设计了一个可以读出异质体％的基于表面增强拉曼的三明治结构的蛋白芯片，这种蛋白芯片目前最具潜力的应用是肝癌的早期诊断。在肝癌早期诊断中，这种蛋白芯片对甲胎蛋白(AFP)的高分辨可以大大提高诊断的准确性。而且检测读出异质体％的定量方式首次采用了最新的定量方法(拉曼特征峰的位移)和旧的定量方法(内标和特征峰相对强度)相结合的方式。本发明芯片还可以应用于其他同源异质体蛋白的分辨与检测，可以有效排除由传统免疫方法带来的假阳性和假阴性，同时降低了芯片制作成本。

Description

基于SERS位移和强度相结合的糖蛋白检测芯片的应用
技术领域
本发明属于SERS检测技术领域，具体涉及一种基于SERS位移和强度相结合的异质体分辨糖蛋白检测芯片。
背景技术
许多疾病经常与糖蛋白的变异有关(如高尔基体糖蛋白73、血小板膜活化糖蛋白、血清酸性糖蛋白等)，使得检测糖蛋白变得至关重要。以肝癌标记物甲胎蛋白(AFP)为例，AFP是一种胚胎蛋白，也是一种糖蛋白，在胚胎1-2个月时主要由卵黄囊和肝脏合成，之后主要由肝脏合成。3月龄时血清AFP含量达到最高峰，约为3000ng/mL，随着分娩的临近，血清中AFP水平呈直线下降。出生后1-2年降至正常成人水平。在胚胎时期，AFP是血清中的正常成分，可能起着与血清白蛋白相似的作用。在成年人阶段因其合成通常受到抑制故血清中含量甚微，一般不超过20ng/mL，绝大多数低于5ng/mL。若成人血清 AFP含量升高，则往往是疾病的表现。常见于畸胎瘤及各种原因引起的急慢性肝炎、肝硬化、尤其是肝癌，偶见于其他肿瘤如胃肠道肿瘤、肺癌、结肠癌、胰腺癌、胆囊癌。
鉴于AFP与肝癌的密切关系，许多学者对AFP的应用进行了多方面的研究，其重点是AFP在肝癌的早期诊断、药物疗效观察、手术是否彻底、有无远处移、患者的预后判断以及基因治疗等方面的应用。AFP发现至今的三十多年里，其检测方法不断得到改进，特异性和灵敏度不断提高，对肝癌的诊断日趋精确。除了目前常用的酶联免疫分析法和放射免疫分析法外，检测血清AFP曾经使用过的方法有琼脂免疫扩散、免疫对流电泳、反向间接血凝、放射免疫火箭电泳自显影等方法，这些方法要么灵敏度低，要么方法复杂，现已淘汰。
研究工作已经证实肝部病变产生的AFP与正常的AFP在糖基链上存在不同，通过AFP与小豆凝集素的作用强弱，可以将AFP分成三类：AFP-L1、AFP- L2，AFP-L3。人们研究发现，AFP-L1主要存在于胚胎阶段的细胞当中，属于正常人的甲胎蛋白；AFP-L2来自于怀孕的母体分泌的甲胎蛋白；而AFP-L3是肝癌细胞特异性产生的蛋白，如果检测AFP总浓度，这个浓度既包含需要检测的 AFP-L3也包含了非特性异性的AFP-L1和AFP-L2的浓度，特异性的降低的同时，也使蛋白芯片产生了很严重的假阳性结果。在诊断学中，认为当异质体 AFP-L3占AFP总量超过10％时，可以诊断为早期肝癌，随后成为一种新的诊断指标AFP-L3％，即异质体％。因此发展一种可以读出AFP-L3％的异质体分辨的蛋白芯片具有十分重要的意义和应用前景。
表面增强拉曼散射(SERS)是一种超灵敏的表面分析技术，借助分子在 SERS活性基底的吸附可将分子本身的拉曼信号显著增强。在一些特殊体系中， SERS的增强因子可以达到1014-1015，使单分子检测成为可能。经历了30年的发展，近年来SERS已被广泛应用在表面吸附、电化学和催化反应、生物医学检测等诸多领域。由于水对信号无影响，使得拉曼光谱受到生物科学工作者的青睐。与其他超灵敏检测技术相比，拉曼光谱有其自身的优点：1)极高的检测灵敏度：可以实现单分子检测，对拉曼信号较弱的蛋白质检测提供了一种非常好的方法。2)极高的选择性：表面选择定则和共振增强的选择性使得SERS可以在极其复杂的体系中只增强目标分子或集团。3)微区与原位检测：光学检测，样品尺寸可以小到微米级。4)无损检测：采用的是可见光，对材料和人体都是非破坏性的。
众所周知，蛋白芯片是通过靶分子和捕捉分子相互作用来监测蛋白分子之间的相互作用，将拉曼技术与蛋白芯片相结合，不但可以增加拉曼检测的灵敏度，同时也将蛋白芯片的灵敏度大大提高。将SERS蛋白芯片赋予其他新的功能和指标也是发明的创新点。
发明内容
针对上面的问题，我们首次应用抗体纳米金及具有拉曼活性和良好生物相容性的银组装膜作为基底，设计了一个可以读出异质体％的基于表面增强拉曼的三明治结构的蛋白芯片，这种蛋白芯片目前最具潜力的应用是肝癌的早期诊断。而且还可以应用于其他同源异质体蛋白的分辨与检测，这种蛋白芯片可以有效排除由传统免疫方法带来的假阳性和假阴性，同时降低了芯片制作成本。
本发明的目的是提供一种新的蛋白芯片，它能够读出异质体％，实现目标蛋白总量和异质体蛋白的分别检测。在肝癌早期诊断中，这种蛋白芯片对甲胎蛋白(AFP)的高分辨可以大大提高诊断的准确性。而且检测读出异质体％的定量方式首次采用了最新的定量方法(拉曼特征峰的位移)和旧的定量方法 (内标和特征峰相对强度)相结合的方式。
本发明所述的蛋白芯片检测方法包括：蛋白芯片及抗体纳米金的制备；目标糖蛋白总量AFP和异质体糖蛋白AFP-L3检测两部分，通过目标蛋白总量和其中异质体蛋白浓度相除可以得到异质体％。
本发明所述的方法包括两个部分：
1.蛋白芯片和抗体纳米金溶液的制备
1.1蛋白芯片的制备：
1.1.1羟基化：将硅片放入质量分数95～98％的浓硫酸水溶液和质量分数 25～30％的过氧化氢水溶液混合溶液中，两种溶液的体积比7：3，直至溶液不再有气泡出现为止，将硅片取出并用水清洗，然后浸泡在水溶液中；
1.1.2将上一步羟基化得到的硅片浸泡在质量百分数为1～3％的聚二烯基丙二甲基氯化铵(PDDA)水溶液30～40分钟，取出后用水清洗，氮气吹干；
1.1.3将上一步修饰了PDDA分子的硅片放入Meisel&Lee法制备的银溶胶 (银离子粒径60nm)中浸泡4～6个小时，取出后用水冲洗，氮气吹干，得到表面组装银的SERS纳米芯片；
1.1.4纳米芯片对巯基苯甲酸-AFP抗体的修饰
表面组装银的SERS纳米芯片的修饰包括两部分：首先是对巯基苯甲酸- AFP抗体的修饰，然后是牛血清蛋白的封闭，目的是得到生物相容性良好的蛋白芯片，而且具有特异性结合甲胎蛋白的能力。
首先，将上一步制备好的表面组装银的SERS纳米芯片在10-3～10-4M的对巯基苯甲酸(4-MBA)乙醇溶液中浸泡4～6个小时，将纳米芯片取出后用酒精冲洗，氮气吹干；然后为了加快反应，活化羧基，将氮气吹干的纳米芯片再浸泡在0.5～2mg/mL的(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)(EDC)和 N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)等浓度的混合水溶液中12～15小时，活化羧基；最后将活化羧基的SERS纳米芯片取出后用水冲洗，氮气吹干，再浸泡在 30ng/mL的AFP(对AFP-L1、AFP-L2，AFP-L3均有免疫响应)抗体的磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)中反应12～15小时，将SERS纳米芯片取出后用磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)冲洗，氮气吹干。
1.1.5牛血清蛋白封闭
为防止非特异性结合，将上一步得到的SERS纳米芯片浸泡在0.1mg/mL的牛血清蛋白的磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)中1～3小时，将SERS纳米芯片取出后用磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)冲洗，氮气吹干，得到本发明所述的蛋白芯片；
1.2抗体纳米金溶液的制备
通过传统的Meisel&Lee法制备20nm的金溶胶，将1mL金溶胶 8000～15000转/分钟离心5～10分钟后去掉上层清液，然后和100μL、1mg/mL的 5,5'-二硫代双(琥珀酰亚胺基-2-硝基苯甲酸)的乙腈溶液混合，反应3～6小时后，加入20μL饱和的AFP-L3抗体的磷酸缓冲溶液，反应12～16小时，再加入 100μL、0.1mg/mL的牛血清蛋白的磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)封闭，离心去掉上层清液后用磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)重新分散至500μL并保存于4℃冰箱中，得到抗体纳米金溶液。
2.AFP总浓度和异质体蛋白浓度的检测
2.1 AFP总浓度的检测
分别取100μL不同浓度的AFP(如实施例1中所述的浓度值为0、1、10、 100、1000ng/mL，还可以是其它的浓度数值，选取的浓度数值越多，得到的曲线越精确)水溶液于500μL离心管中，将步骤1.1.5制备好的多个蛋白芯片分别放入其中，反应12～16小时；取出蛋白芯片后用水冲净，氮气吹干后，放入样品台，分别进行拉曼检测。经过数据比对发现对巯基苯甲酸的拉曼特征峰在 1075cm-1处的位移和不同甲胎蛋白浓度的对数呈现的线性关系：加入AFP(0、 1、10、100、1000ng/mL)后对巯基苯甲酸1075cm-1对应的拉曼位移分别为 0、0.55、1.36、1.99、3.03。利用步骤1.1.5制备的蛋白芯片通过拉曼检测的数据，绘制甲胎蛋白浓度的对数与该浓度对应的对巯基苯甲酸的特征峰在 1075cm-1处位移的散点图，拟合得到标准曲线如图1所示，曲线方程为y＝ 0.79601x+0.52596，其中x代表AFP总浓度的对数，y代表对巯基苯甲酸在 1075cm-1处拉曼特征峰的位移。
同样地，取100μL未知浓度的AFP水溶液于500μL离心管中，取步骤 1.1.5制备好的蛋白芯片放入其中，反应12～16小时；取出的蛋白芯片用水冲净，氮气吹干，放入样品台，进行拉曼检测。随后该谱图中1075cm-1处的位移值带入标准曲线1的线性方程中，即可得到未知AFP的浓度。最后将检测完成 AFP总浓度的蛋白芯片保存在装有400μL的磷酸缓冲溶液的离心管中，以备下一步异质体蛋白浓度的检测。
2.2异质体蛋白浓度的检测
分别取100μL不同浓度的AFP-L3(如实施例1中所述的浓度值为8、50、 100、400、1000ng/mL，还可以是其它的浓度数值，选取的浓度数值越多，得到的曲线越精确)水溶液于500μL离心管中，将步骤1.1.5制备好的多个蛋白芯片分别放入其中，反应12～16小时；取出蛋白芯片后用水冲净，氮气吹干后，重新放入装有400μL磷酸缓冲液的离心管中，分别加入100μL抗体纳米金溶液，继续反应12～16小时。随后将蛋白芯片取出用水冲洗，氮气吹干，放入样品台，分别进行拉曼检测。在这个体系中，因为对巯基苯甲酸在1075cm-1处的峰强度与体系无关，而且强度稳定不变，我们将它作为内标峰。5,5'-二硫代双 (琥珀酰亚胺基-2-硝基苯甲酸)在1340cm-1处的特征峰强度与AFP-L3的浓度成正相关，AFP-L3的浓度越大，峰强越大：加入AFP-L3(8、50、100、400、 1000ng/mL)得到的拉曼谱图中特征峰与内标峰的强度比分别为0.08、0.14、 0.2、0.55、1.2。因此，绘制5,5'-二硫代双(琥珀酰亚胺基-2-硝基苯甲酸)在 1340cm-1处的特征峰强度与对巯基苯甲酸在1075cm-1处的特征峰峰强度的比值与AFP-L3浓度的散点图，然后进行拟合，得到的标准曲线如图2所示。线性方程为y＝0.07501+0.00119x，其中x代表AFP-L3的浓度，y代表两个特征峰强度的比值。
继续步骤2.1的操作，进行异质体蛋白浓度的检测。向检测完未知AFP浓度的蛋白芯片的离心管中加入100μL步骤1.2制备的抗体纳米金溶液，反应 12～16小时，反应后取出用水冲洗，氮气吹干，再次进行拉曼检测，将得到的 1340cm-1处与1075cm-1的峰强度比值带入到标准曲线2的线性方程中，得到未知浓度的AFP-L3浓度。
通过步骤2.1、2.2得到的AFP与AFP-L3的浓度进行计算，c(AFP-L3)/c (AFP)＝AFP-L3％，得出AFP-L3％。在肝癌早期诊断中，AFP-L3％大于10％可以诊断为肝癌。
上述方法中，采用三明治纳米材料作为基底进行SERS测试，SERS光谱结果结合扫描电子显微镜(SEM)(如图3所示)，拉曼信号和电镜图像吻合，在蛋白芯片的表面附着上述方法制备的抗体纳米金纳米粒子。
本发明中，我们采用了两种传统纳米材料作为基底，对探针分子对巯基苯甲酸和5,5'-二硫代双(琥珀酰亚胺基-2-硝基苯甲酸)进行了表面增强拉曼(SERS) 检测，改善了SERS基底的检测的稳定性。通过新型基底的使用，解决了通过 SERS方法无法得到AFP-L3％的难题，同时得到了更多分子与基底相互作用、分子量的信息。同时也为发展SERS作为医学诊断工具奠定基础。
本发明中使用的仪器是共聚焦拉曼光谱仪(Horiba LabRam ARAMIS)，激发源波长为632.8nm功率为10W，扫描时间为10s。
附图说明
图1：蛋白芯片特征峰位移随AFP浓度变化图以及标准曲线，该图表明该蛋白芯片可以在1～1000ng/mL区间内有良好的线性变化，可以用于定量检测 AFP，最低检测限为0.1ng/mL。图中A为不同AFP浓度对应的拉曼谱图，B为各浓度拉曼谱图波数在1075cm-1附近的放大图，C为根据AFP浓度对数和其对应的拉曼位移绘制的标准曲线。
图2：抗体纳米金溶液特征峰相对强度变化随AFP-L3浓度变化图以及标准曲线，表明该方法在8～1000ng/mL区间内有良好的线性响应，可以完成异质体糖蛋白的定量检测，最低检测限为0.5ng/mL。图中A为不同AFP-L3浓度对应的拉曼谱图，B为根据AFP-L3浓度变化和其对应的特征峰与内标峰比值绘制的标准曲线，C为各浓度拉曼谱图波数在1340cm-1附近的放大图。
图3：反应后基底材料的扫描电镜图，图中A为无AFP-L3加入抗体纳米金溶液的扫描电镜图，图中B为有AFP-L3加入抗体纳米金溶液的扫描电镜图，可以发现图B由于免疫反应使得抗体纳米金作用在了蛋白芯片的表面，因此产生了5,5'-二硫代双(琥珀酰亚胺基-2-硝基苯甲酸)的拉曼信号。
图4：实际肝癌病人血清的实验结果示意图，图中A为未加入AFP时的 SERS谱图，B为加入AFP后的SERS谱图，可以发现在1075cm-1处有一个位移。随后加入抗体纳米金后的SERS谱图如图C所示，可以看到在1340cm-1处有一个新峰，根据这个峰的相对强度与1075cm-1的特征峰相比，根据标准曲线可以读出相应异质体的浓度值。
具体实施方式
实施例1：建立标准曲线
首先，通过上述方法制备蛋白芯片和抗体纳米金溶液。
1.在一个200mL烧杯中加入质量分数98％的浓硫酸水溶液和质量分数30％的过氧化氢水溶液，两者的体积比＝7：3。
2.将硅片切成边长为0.5cm的方块。
3.将切好的硅片放进浓硫酸和过氧化氢的混合溶液中，此时溶液开始有气泡产生。
4.将该烧杯加热，直至没有气泡冒出。将酸液倒出，用水稀释。随后将硅片用大量水清洗干净，再在质量分数为1％的PDDA水溶液中浸泡半小时，取出后用大量水冲洗，氮气吹干。
5.再将硅片浸泡到Meisel&Lee方法制备的60nm银溶胶中，浸泡4小时。将硅片从银溶胶中取出用水冲洗，氮气吹干，并浸泡到10-4M 4-MBA乙醇溶液中，4小时后取出，用酒精冲洗，氮气吹干。
6.将硅片经过浓度为1mg/mL的EDC/NHS等浓度混合溶液活化羧基后4小时取出，用水冲洗后氮气吹干，加入500μL、30ng/mL的AFP抗体，反应12小时后取出用缓冲液洗净。再用0.1mg/mL的BSA溶液浸泡半小时取出，用水冲洗后，氮气吹干，保存在离心管中待用，得到所需的蛋白芯片。
7.通过传统的Meisel&Lee法制备20nm的金溶胶，将1mL金溶胶10000转/ 分离心7分钟后去掉上层清液，和100μL、1mg/mL的5,5'-二硫代双(琥珀酰亚胺基-2-硝基苯甲酸)的乙腈溶液混合，反应3小时后，加入20μL饱和的AFP-L3 抗体的磷酸缓冲溶液，反应12个小时，再加入100μL、0.1mg/mL的牛血清蛋白的磷酸缓冲溶液封闭，离心去掉上层清液后用磷酸缓冲溶液重新分散至 500μL并保存于4℃冰箱中，得到抗体纳米金溶液。
8.分别取100μL不同浓度的AFP(0、1、10、100、1000ng/mL)水溶液于 500μL离心管中，将步骤6制备好的多个蛋白芯片分别放入其中，反应12小时；取出蛋白芯片后用水冲净，氮气吹干后，放入样品台，分别进行拉曼检测。经过数据比对发现对巯基苯甲酸的拉曼特征峰在1075cm-1处的位移和不同甲胎蛋白浓度的对数呈现的线性关系：加入AFP(0、1、10、100、1000ng/mL)后拉曼谱图中1075cm-1处对应的拉曼位移分别为0、0.55、1.36、 1.99、3.03。绘制甲胎蛋白浓度的对数与该浓度对应的对巯基苯甲酸的特征峰在 1075cm-1处位移的散点图，拟合得到标准曲线如图1所示，曲线方程为y＝ 0.79601x+0.52596，其中x代表AFP总浓度的对数，y代表对巯基苯甲酸在 1075cm-1处拉曼特征峰的位移，进而根据此标准曲线可用于未知的AFP总浓度的检测。
9.分别取100μL不同浓度的AFP-L3(8、50、100、400、1000ng/mL)水溶液于500μL离心管中，将步骤6制备好的多个蛋白芯片分别放入其中，反应12 小时；取出蛋白芯片后用水冲净，氮气吹干后，重新放入装有400μL磷酸缓冲液的离心管中，分别加入100μL步骤7制备的抗体纳米金溶液，继续反应12小时。随后将蛋白芯片取出用水冲洗，氮气吹干，放入样品台，分别进行拉曼检测。加入AFP-L3(8、50、100、400、1000ng/mL)得到的拉曼谱图中特征峰与内标峰的强度比分别为0.08、0.14、0.2、0.55、1.2。因此，绘制5,5'-二硫代双(琥珀酰亚胺基-2-硝基苯甲酸)在1340cm-1处的特征峰强度与对巯基苯甲酸在 1075cm-1处的特征峰峰强度的比值与AFP-L3浓度的散点图，然后进行拟合，得到的标准曲线如图2所示。线性方程为y＝0.07501+0.00119x，其中x代表 AFP-L3的浓度，y代表两个特征峰强度的比值。利用这个线性方程可以对未知浓度的AFP-L3进行定量。
实施例2：
对高AFP肝病患者的诊断
该方法主要用于对肝病患者进行诊断。对肝癌患者的诊断确认分为两个步骤，第一是对AFP浓度进行检测，其次是对AFP-L3浓度进行检测。
首先，通过上述方法制备蛋白芯片和抗体纳米金。
1.在一个200mL烧杯中加入质量分数98％的浓硫酸水溶液和质量分数30％的过氧化氢水溶液，两者的体积比＝7：3。
2.将硅片切成边长为0.5cm的方块。
3.将切好的硅片放进浓硫酸和过氧化氢的混合溶液中，此时溶液开始有气泡产生。
4.将该烧杯加热，直至没有气泡冒出。将酸液倒出，用水稀释。随后将硅片用大量水清洗干净，再在质量分数为1％的PDDA水溶液中浸泡半小时，取出后用大量水冲洗，氮气吹干。
5.再浸泡到Meisel&Lee方法制备的60nm银溶胶中，浸泡4小时。将硅片从银溶胶中取出用水冲洗，氮气吹干，并浸泡到10-4M 4-MBA乙醇溶液中，4 小时后取出，用酒精冲洗，氮气吹干。
6.经过浓度为1mg/mL的EDC/NHS等浓度混合溶液活化羧基后4小时取出，用水冲洗后氮气吹干，加入500μL、30ng/mL的AFP抗体，反应12小时后取出用缓冲液洗净。再用0.1mg/mL的BSA溶液浸泡半小时取出，用水冲洗后，氮气吹干，得到所需蛋白芯片，并保存在离心管中待用。
7.通过传统的Meisel&Lee法制备20nm的金溶胶，将1mL金溶胶10000转离心7分钟后去掉上层清液，和100μL的1mg/mL的5,5'-二硫代双(琥珀酰亚胺基-2-硝基苯甲酸)的乙腈溶液混合，反应3小时后，加入20μL饱和的AFP-L3 抗体的磷酸缓冲溶液，反应12个小时，再加入100μL、0.1mg/mL的牛血清蛋白的磷酸缓冲溶液封闭，离心去掉上层清液后用磷酸缓冲溶液重新分散至 500μL并保存于4℃冰箱中，得到抗体纳米金溶液。
取100μL患者血清，分散到400μL的磷酸缓冲液中，室温下将蛋白芯片浸泡在其中4小时后取出，用磷酸缓冲溶液冲洗后，氮气吹干。将吹干后蛋白芯片放入样品台进行拉曼检测，如图4所示，根据标准品绘制的标准曲线1可以得到特征峰的位移对应该患者的AFP浓度为548.1ng/mL。随后将芯片重新浸泡在磷酸缓冲液中，加入100μL抗体纳米金溶液，室温下反应4小时后，用磷酸缓冲液冲洗，氮气吹干后进行第二步检测。
如图4所示，A为未加入AFP时的SERS谱图，B为加入AFP后的SERS 谱图，可以发现在1075cm-1处有一个位移。随后加入抗体纳米金后的SERS谱图如图C所示，可以看到在1340cm-1处有一个新峰，根据这个峰的相对强度与 1075cm-1的特征峰相比，根据标准曲线可以读出相应异质体的浓度值。根据标准品与内标峰的相对强度绘制的标准曲线得出，该特征峰的相对强度对应该患者的AFP-L3浓度为547.5ng/mL。根据公式c(AFP-L3)/c(AFP)＝AFP-L3％计算，结果远大于10％，因此可以诊断此肝病患者为肝癌。分别用化学反光法和AFP-L3试剂盒对实验实例结果进行验证，通过化学发光法检测该患者血清得到的AFP总浓度为540.6ng/mL；AFP-L3试剂盒检测得到AFP-L3的浓度为 527ng/mL。结果表明本发明芯片检测精度高，诊断肝癌具有良好的准确性。
Meisel&Lee参考文献：
Lee,P.C.；Meisel,D.J.Phys.Chem.1982,86,3391-3395

Claims (1)

1.一种基于SERS位移和强度相结合的异质体分辨糖蛋白检测芯片在检测AFP-L3％中的应用，其特征在于：该芯片是由如下步骤制备得到，
(1)羟基化
将硅片放入质量分数95～98％的浓硫酸水溶液和质量分数25～30％的过氧化氢水溶液混合溶液中，两种溶液的体积比7：3，直至溶液不再有气泡出现为止，将硅片取出并用水清洗，然后浸泡在水溶液中；
(2)将步骤(1)羟基化得到的硅片浸泡在质量百分数为1～3％的聚二烯基丙二甲基氯化铵PDDA水溶液30～40分钟，取出后用水清洗，氮气吹干；
(3)将步骤(2)修饰了PDDA分子的硅片放入银溶胶中浸泡4～6个小时，取出后用水冲洗，氮气吹干，得到表面组装银的SERS纳米芯片；
(4)纳米芯片对巯基苯甲酸-AFP抗体的修饰
将步骤(3)制备好的表面组装银的SERS纳米芯片在10-3～10-4M的对巯基苯甲酸乙醇溶液中浸泡4～6个小时，将纳米芯片取出后用酒精冲洗，氮气吹干；将氮气吹干的纳米芯片再浸泡在0.5～2mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺等浓度的混合水溶液中12～15小时，活化羧基；最后将活化羧基的SERS纳米芯片取出后用水冲洗，氮气吹干，再浸泡在30ng/mL的AFP抗体的磷酸缓冲溶液中反应12～15小时，将SERS纳米芯片取出后用磷酸缓冲溶液冲洗，氮气吹干；
(5)牛血清蛋白封闭
将步骤(4)得到的SERS纳米芯片浸泡在0.1mg/mL的牛血清蛋白的磷酸缓冲溶液中1～3小时，将SERS纳米芯片取出后用磷酸缓冲溶液冲洗，氮气吹干，得到基于SERS位移和强度相结合的异质体分辨糖蛋白检测芯片；
利用步骤(5)得到的芯片进行AFP-L3％检测的步骤如下，
A、分别取100μL不同浓度的AFP水溶液于500μL离心管中，将多个步骤(5)制备的蛋白检测芯片分别放入其中，反应12～16小时；取出蛋白芯片后用水冲净，氮气吹干后，放入样品台，分别进行拉曼检测；绘制甲胎蛋白AFP总浓度的对数与该浓度对应的对巯基苯甲酸的特征峰在1075cm-1处位移的散点图，再拟合得到标准曲线1；
B、将步骤A中的不同浓度的AFP水溶液替换为血清样品水溶液，重复步骤A的操作，得到血清样品的对巯基苯甲酸特征峰在1075cm-1处位移，再根据该标准曲线1的线性方程，得到血清样品的AFP总浓度；
C、分别取100μL不同浓度的AFP-L3水溶液于500μL离心管中，将多个步骤(5)制备的蛋白检测芯片分别放入其中，反应12～16小时；取出蛋白芯片后用水冲净，氮气吹干后，重新放入装有400μL磷酸缓冲液的离心管中，分别加入100μL抗体纳米金溶液，继续反应12～16小时；随后将蛋白芯片取出用水冲洗，氮气吹干，放入样品台，分别进行拉曼检测；绘制5,5'-二硫代双(琥珀酰亚胺基-2-硝基苯甲酸)在1340cm-1处的特征峰强度与对巯基苯甲酸在1075cm-1处的特征峰峰强度的比值与AFP-L3浓度的散点图，然后进行拟合，得到的标准曲线2；
所述的抗体纳米金溶液是将1mL金溶胶8000～15000转/分钟离心5～10分钟后去掉上层清液，然后和100μL、1mg/mL的5,5'-二硫代双(琥珀酰亚胺基-2-硝基苯甲酸)的乙腈溶液混合，反应3～6小时后，加入20μL饱和的AFP-L3抗体的磷酸缓冲溶液，反应12～16小时，再加入100μL、0.1mg/mL的牛血清蛋白的磷酸缓冲溶液封闭，离心去掉上层清液后用磷酸缓冲溶液重新分散至500μL并保存于4℃冰箱中得到；
D、将步骤C中不同浓度的AFP-L3水溶液替换为血清样品水溶液，重复步骤C的操作，得到血清样品水溶液的5,5'-二硫代双(琥珀酰亚胺基-2-硝基苯甲酸)在1340cm-1处的特征峰强度与对巯基苯甲酸在1075cm-1处的特征峰峰强度的比值，再根据该标准曲线2的线性方程，得到血清样品的AFP-L3浓度；
E、步骤D得到的AFP-L3浓度与步骤B得到的AFP总浓度的比值即血清样品中AFP-L3％。
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CN103411948A (zh) * 2013-06-24 2013-11-27 吉林大学 基于探针标记免疫金-磁性复合材料检测甲胎蛋白的sers方法
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Ultrasensitive, Multiplex Raman Frequency Shift Immunoassay of Liver Cancer Biomarkers in Physiological Media";Bochong Tang et al;《ACS Nano》;20160105;第873页左栏倒数第1段至第878页左栏倒数第1段以及图1-5、示意图1 *
Detection of the potential tumor marker of AFP using surface-enhanced Raman scattering based immunoassay;Aijing Wang et al;《J. Raman Spectrosc》;20130902;第1650页倒数第2段至第1653页第1段以及图1-3、示意图1-2 *

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