CN109001460B - 一种蛋白质芯片筛选生物标志方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种蛋白质芯片筛选生物标志方法，其特征在于，包括如下步骤：制备蛋白质芯片、细胞样本预处理、目标蛋白提取、生物标志筛选，本发明改进了基质材料的表面处理技术，可减少蛋白质的非特异性结合；提供了合适的温度和湿度，能够保持芯片表面蛋白质的稳定性及生物活性。

Description

一种蛋白质芯片筛选生物标志方法

技术领域

本发明涉及生物学领域，具体涉及一种蛋白质芯片筛选生物标志方法。

背景技术

生物芯片最初由美国公司开发，之后芯片技术发展十分迅速，呈现出高度平行性、多样性、微型化和自动化的特点。蛋白质肤芯片为生物芯片的一种，研究对象是蛋白质，其原理是对固相载体进行特殊的化学处理，再将已知的蛋白分子产物固定其上(如酶、抗原、抗体、受体、配体、细胞因子等)，根据这些生物分子的特性，捕获能与之特异性结合的待测蛋白(存在于血清、血浆、淋巴、间质液、尿液、渗出液、细胞溶解液、分泌液等)，经洗涤、纯化，再进行确认和生化分析；它为获得重要生命信息(如未知蛋白组分、序列。体内表达水平生物学功能、与其他分子的相互调控关系、药物筛选、药物靶位的选择等)提供了有力的技术支持，蛋白质芯片能够同时检测生物样品中与某种疾病或者环境因素损伤可能相关的全部蛋白质的含量情况，在医学领域中有着潜在的广阔应用前景。

目前，蛋白检测芯片技术存在以下问题：蛋白芯片的基础是抗原抗体亲和反应，特异性及亲和力有限；不同的蛋白质在临床样品中的丰度不同，抗体抗原反应的亲和力不同，因此，寻找适合蛋白质固定的基底材料，以及高效固定蛋白的方法成为该领域迫切的需求。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了了一种蛋白质芯片筛选生物标志方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、制备蛋白质芯片

蛋白质芯片包括载玻片、中间层和探测层，制备蛋白质芯片的具体步骤如下：

a.选择一块载玻片，载玻片为正方形，厚度为2-5mm，尺寸为6mm×6mm，将其置入30％的过氧化氢中浸泡20-30分钟，再用去离子水冲洗干净，在50-60℃条件下烘干待用；

b.将步骤a处理好的载玻片浸入到100ml25％为巯基乙酸溶液中，20-30℃条件下浸泡30分钟，可得到中间层；

c.将步骤b处理好的载玻片全部浸入到100ml的45％的生物探针中浸泡1-1.5小时，可得到探测层；生物探针为能与目标蛋白结合的抗体；

d.取出步骤c处理好的载玻片用去离子水冲洗干净，可得蛋白质芯片；将生物探针的蛋白质芯片置于50-75℃烘箱中干燥待用；

S2、细胞样本预处理

a.用研钵在-10℃冷冻条件下将细胞样本研成粉末，用4℃的PBS溶液清洗细胞样本2-3次；

b.对每100000个步骤a处理后的细胞样本，加入0.5ml裂解液，裂解20-30分钟，将细胞样本裂解液收集到EP管中，加入10ml细胞样本蛋白提取缓冲液，使用细胞匀浆器匀浆30s；

以重量百分比计，裂解液包括0.05-0.1％的氯化铵、0.05-0.1％的氯化钠、0.1-1.5％的EDTA、0.005-0.01％的过氧化氢、0.02-0.1％TritoAx-100和0.05-0.2％目标蛋白分解酶；余下部分为去离子水；

以重量百分比计，细胞样本蛋白提取缓冲液包括0.01-0.15％的Tris、0.01-0.1％的氯化钠、0.05-0.5％的AP40、0.05-0.2％的Aproti，余下部分为去离子水；

c.将步骤b处理好细胞悬液置于4℃下，以3000rpB转速离心5分钟；放置3-4分钟，直至细胞悬液变清，避开上层漂浮的脂质层，取上清液，得到细胞样本预处理液；

S3、目标蛋白提取

a.取50ml细胞样本预处理液置于EP管中，并放入一块蛋白质芯片，置于4℃条件下3-5小时，让目标组蛋白与蛋白质芯片上的生物探针结合；

b.对应每100000个细胞样本，在装有细胞样本裂解液EP管中，加入20μl100mM氯化钠溶液，轻轻重悬蛋白质芯片上的生物探针；

c.40-50℃水浴加热10分钟后，将EP管放在磁力架上，去除上清，用200ul4℃的0.5mMEDTA溶液洗涤1-2次，用200ul350mM氯化钠溶液洗涤2-3次，用200ul50mMTris-HCl溶液洗涤2-3次，以上洗涤每次10-15分钟；

d.加50ul洗脱缓冲液在37℃洗脱30分钟，转上清至新的离心管中加2.5ug目标蛋白分解酶，在50-75℃条件下解交联过夜；再用150ul洗脱缓冲液在37℃洗脱蛋白质芯片上的生物探针20-30分钟，溶出目标蛋白；

以重量百分比计，洗脱缓冲液包括5-15％的氯化镁、10-20％的氯化钠、20-25％的乙二醇、0.001-0.01％的硫氰酸钠和0.5-0.2％SDS；余下部分为去离子水；

S4、生物标志筛选

通过质谱分析和等离子共振对蛋白质芯片进行检测，提取目标蛋白质的功能注释条目，分析目标蛋白集中度；常采用基于超几何分布的假设检验方法，其计算方法如公式一所示：

公式一：

如果R>1，则目标蛋白相对集中，通过公式二计算相应的疾病相关蛋白质与非疾病相关蛋白的差值r：

公式二：

如果R<1，则目标蛋白相对分散，通过公式三计算相应的疾病相关蛋白质与非疾病相关蛋白的差值r：

公式三：

其中，R表示标准数据库中疾病相关蛋白在目标蛋白的注释条目中的集中度；A为蛋白质数据库中存储的所有蛋白质的数目，a为蛋白质数据库中目标蛋白的数目；B为疾病相关标准数据库中存储的蛋白质的数目，b为疾病相关标准数据库目标蛋白的数目，i为小于或等于a的正整数；

r为相应的疾病相关蛋白质与非疾病相关蛋白的差值，通过限定其分布，可筛选出与疾病相关的注释条目。

本发明的有益成果为：本发明提供了了一种蛋白质芯片筛选生物标志方法，改进了基质材料的表面处理技术，可减少蛋白质的非特异性结合；提供了合适的温度和湿度，能够保持芯片表面蛋白质的稳定性及生物活性。

具体实施方式

为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行详细的说明；应当说明的是，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，能实现同样功能的产品属于等同替换和改进，均包含在本发明的保护范围之内；具体方法如下：

实施例1：

用H4蛋白质芯片结合SELDI-TOF-MS方法和本发明蛋白质芯片筛选生物标志方法对20例少精子症患者及20例生育男性精浆样本进行检测，比较两者间蛋白质图谱表达差异。结果表明，运用H4蛋白质芯片结合SELDI-TOF-MS方法，在H4蛋白质芯片上，少精子症患者精浆与生育男性精浆蛋白质图谱相比，有1处蛋白质峰明显增高，差异有显著性(P<0.05)，其相对分子质量(Mr)为11507.4，有1处蛋白质峰明显降低，差异有显著性(P<0.05)，其Mr为13312.9；运用本发明蛋白质芯片筛选生物标志方法，蛋白质芯片上，少精子症患者精浆与生育男性精浆蛋白质图谱相比有1处蛋白质峰明显增高，差异有显著性(P<0.05)，其Mr为18625.6。实验结果说明本发明具有良好的疾病诊断效果。

实施例2：

运用蛋白质芯片技术检测Vero细胞感染HSV-1后蛋白质的差异表达，从而为从蛋白质水平研究HSV-1感染的致病机制奠定基础。常规方法培养Vero细胞，感染HSV-1，孵育12h，24h，48h后用细胞裂解液裂解细胞。裂解上清经蛋白定量后应用蛋白质芯片，检测细胞感染HSV-1前后蛋白质表达的差异。结果感染24小时细胞出现明显病变，感染12小时质谱分析即可见蛋白的差异表达。

Claims (1)

1.一种蛋白质芯片筛选生物标志方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、制备蛋白质芯片

所述蛋白质芯片包括载玻片、中间层和探测层，制备所述蛋白质芯片的具体步骤如下：

a.选择一块所述载玻片，所述载玻片为正方形，厚度为2-5mm，尺寸为6mm×6mm，将其置入30％的过氧化氢中浸泡20-30分钟，再用去离子水冲洗干净，在50-60℃条件下烘干待用；

b.将步骤a处理好的所述载玻片浸入到100ml 25％的巯基乙酸溶液中，20-30℃条件下浸泡30分钟，可得到所述中间层；

c.将步骤b处理好的所述载玻片全部浸入到100ml的45％的生物探针中浸泡1-1.5小时，可得到所述探测层；所述生物探针为能与目标蛋白结合的抗体；

d.取出步骤c处理好的所述载玻片用去离子水冲洗干净，可得所述蛋白质芯片；将所述含有生物探针的蛋白质芯片置于50-75℃烘箱中干燥待用；

S2、细胞样本预处理

a.用研钵在-10℃冷冻条件下将细胞样本研成粉末，用4℃的PBS溶液清洗所述细胞样本2-3次；

b.对每100000个步骤a处理后的所述细胞样本，加入0.5ml裂解液，裂解20-30分钟，将细胞样本裂解液收集到EP管中，加入10ml细胞样本蛋白提取缓冲液，使用细胞匀浆器匀浆30s；

以重量百分比计，所述裂解液包括0.05-0.1％的氯化铵、0.05-0.1％的氯化钠、0.1-1.5％的EDTA、0.005-0.01％的过氧化氢、0.02-0.1％Triton x-100和0.05-0.2％目标蛋白分解酶；余下部分为去离子水；

以重量百分比计，所述细胞样本蛋白提取缓冲液包括0.01-0.15％的Tris、0.01-0.1％的氯化钠、0.05-0.5％的NP-40、0.05-0.2％的Aprotinin，余下部分为去离子水；

c.将步骤b处理好细胞悬液置于4℃，以3000rpB转速离心5分钟；放置3-4分钟，直至所述细胞悬液变清，避开上层漂浮的脂质层，取上清液，得到细胞样本预处理液；

S3、目标蛋白提取

a.取50ml所述细胞样本预处理液置于EP管中，并放入一块蛋白质芯片，置于4℃条件下3-5小时，让目标组蛋白与所述蛋白质芯片上的所述生物探针结合；

b.对应每100000个所述细胞样本，在装有所述细胞样本裂解液的EP管中，加入20μl100mM氯化钠溶液，轻轻重悬所述蛋白质芯片上的所述生物探针；

c.40-50℃水浴加热10分钟后，将所述EP管放在磁力架上，去除上清，用200ul 4℃的0.5mM EDTA溶液洗涤1-2次，用200ul 350mM氯化钠溶液洗涤2-3次，用200ul 50mM Tris-HCl溶液洗涤2-3次，以上洗涤每次10-15分钟；

d.加50ul洗脱缓冲液在37℃洗脱30分钟，转上清至新的离心管中加2.5ug目标蛋白分解酶，在50-75℃条件下解交联过夜；再用150ul所述洗脱缓冲液在37℃洗脱所述蛋白质芯片上的所述生物探针20-30分钟，溶出所述目标蛋白；

以重量百分比计，所述洗脱缓冲液包括5-15％的氯化镁、10-20％的氯化钠、20-25％的乙二醇、0.001-0.01％的硫氰酸钠和0.5-0.2％SDS；余下部分为去离子水；

S4、生物标志筛选

通过质谱分析和等离子共振对所述蛋白质芯片进行检测，提取目标蛋白的功能注释条目，分析所述目标蛋白集中度；常采用基于超几何分布的假设检验方法，其计算方法如公式一所示：

公式一：

如果R>1，则所述目标蛋白相对集中，通过公式二计算相应的疾病相关蛋白质与非疾病相关蛋白的差值r：

公式二：

如果R<1，则所述目标蛋白相对分散，通过公式三计算相应的疾病相关蛋白质与非疾病相关蛋白的差值r：

公式三：

其中，R表示标准数据库中疾病相关蛋白在所述目标蛋白的注释条目中的集中度；A为蛋白质数据库中存储的所有蛋白质的数目，a为所述蛋白质数据库中所述目标蛋白的数目；B为疾病相关标准数据库中存储的蛋白质的数目，b为疾病相关标准数据库所述目标蛋白的数目，i为小于或等于a的正整数；

r为相应的疾病相关蛋白质与非疾病相关蛋白的差值，通过限定其分布，可筛选出与疾病相关的注释条目。