KR102000387B1

KR102000387B1 - 췌관내유두상점액종양의 악성도를 감별할 수 있는 단백질 바이오마커 및 그 용도

Info

Publication number: KR102000387B1
Application number: KR1020180017423A
Authority: KR
Inventors: 김영수; 장진영; 도미솔
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2018-02-13
Filing date: 2018-02-13
Publication date: 2019-07-15

Abstract

본원은 췌관내유두상점액종양의 악성도를 감별할 수 있는 바이오마커를 개시한다. 본원에 따른 마커는 췌관내유두상점액종양을 저등급 및 중간등급 이형성증을 포함하는 저위험군과 고등급 이형성증 및 침윤성 암종을 포함하는 고위험군으로 구분할 수 있다. 본원에 따른 마커는 본원의 췌관내유두상점액종양의 악성도를 편리하게 감별할 수 있어 저등급 이형성증 병변을 가진 환자들에게 시행되는 불필요한 수술적 절제를 막을 수 있고, 수술적 절제가 필수적인 고등급 이형성증 또는 침윤성 암종 병변을 가진 환자들에게는 보다 신속한 외과적 치료를 수행할 수 있다.

Description

췌관내유두상점액종양의 악성도를 감별할 수 있는 단백질 바이오마커 및 그 용도 {Protein biomarkers for distinguishing malignancy of intraductal papillary mucinous neoplasm and their use}

본 발명은 췌관내유두상점액종양 환자의 악성도 감별 바이오마커에 관한 것이다.

췌장낭종(Pancreatic cystic tumor)에는 장액성낭성종양(SCN), 췌관내유두상점액종양(Intraductal papillary mucinous neoplasm, IPMN) 및 점액성낭성종량(MCN)의 세종류가 있다.

이중 특히 IPMN은 췌관(주체관 및 분지췌관)에서 발생하는 낭성 병변으로, 췌관내 점액을 분비하는 세포들의 유두 성장이 특징이며, 조직학적으로는 과증식, 선종과 같은 전암 병변부터 침윤 암종까지 다양한 양상을 나타내며, 악성도에 따라 저등급, 중간등급, 고등급 이형성증 및 침윤성 암종으로 분류된다. 이 중 저등급 이형성증은 양성, 중간등급 이형성증은 양성 또는 경계선(boderline) 종양이며, 고등급 이형성증(dysplasia)과 침윤성 암종은 악성으로, 이 경우 췌장암으로 발전될 위험이 큰 병변으로 수술을 필요로 한다. 췌장암은 한국인 암 발생률 9위, 암 사망률 5위, 5년 생존률 7.8%로 예후가 매우 나쁜 암에 속한다.

IPMN은 최근 여러가지 영상 의학적 진단법(CT, MRI)의 발전으로 최근 발견되는 빈도가 증가하는 추세이다. 그러나 영상진단 검사의 발전에도 불구하고 양성 병변으로부터 전암, 낭성 병변까지 다양한 병리 소견을 가지는 췌장의 낭성 병변을 수술 전에 정확히 감별 하는 것은 여전히 어려운 실정이다.

따라서 임상적으로는 췌장의 낭성 병변이 악성화할 가능성이 있는 종양 병변인지 아닌지 그리고 악성화 가능성이 있다면 아직 전암 단계의 병변인지 혹은 이미 악성 병변을 동반하고 있는지 감별하는 것이 중요하다. 대부분 외과적 췌장 절제로 근치적 치료를 하고 있으나, 이로 인한 합병증 발생률과 사망률이 다른 소화기계(위암, 대장암)에 비해 높은 편이며, IPMN은 대부분 노령에서 호발하기 때문에 치료 방침 결정에 어려움을 겪고 있다.

IPMN 병변의 정확한 진단을 위한 여러 가지 연구들로 세포학적 검사, CEA와 CA19-9 바이오 마커, GNAS 변이가 있다. 세포학적 검사는 췌장 낭종액이 충분하지 않을 경우 실시할 수 없다는 한계가 있으며, CEA와 CA 19-9 바이오 마커의 경우는 췌장의 낭성 병변을 구분할 수 있으나 IPMN의 악성도를 구분할 수 없고 IPMN이 점액성인지 비점액성인지만 구분이 가능하다. 또한, GNAS 변이는 악성도를 감별할 수는 있으나, 초기 단계의 IPMN에만 적용할 수 있다는 한계점이 있다. 이와 같이 현재 IPMN의 악성도를 구분할 수 있는 뚜렷한 진단법이 없다.

대한민국 공개특허 2015-0049989호는 췌장암 진단용 조성물 및 이를 이용한 췌장암 진단방법에 관한 것으로, 췌장암의 발병 가능성, 조기 진단 및 질병 정도를 유의적으로 예측 또는 파악할 수 있는 췌장암의 진단 마커를 개시한다. 그러나 이는 췌장암을 진단하기 위한 마커로, IPMN의 악성도를 감별할 수 없다.

따라서, IPMN 환자에 대한 보다 정확한 진단과 치료를 시행하기 위해 IPMN의 악성도를 감별할 수 있는 진단방법을 개발할 필요가 있다.

본원에서는 보다 정확한 진단과 치료를 시행하기 위한 췌관내유두상점액종양의 악성도를 감별할 수 있는 단백질 바이오마커를 제공하고자 한다.

본원은 HOOK1 (Protein HOOK homolog 1), PTPN6 (Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 6), MUC2 (Mucin-2), TYMP (Thymidine phosphorylase), TLN1 (Talin-1), YBX1 (Nuclease-sensitive element-binding protein 1), TEX12 (Testis-expressed sequence 12 protein), FBN1 (Fibrillin-1), CLDN18 (Claudin-18), SERPINA5 (Plasma serine protease inhibitor), AKR1B10 (Aldo-keto reductase family 1 member B10), WFDC2 (WAP four-disulfide core domain protein 2), THY1 (Thy-1 membrane glycoprotein), PIK3IP1 (Phosphoinositide-3-kinase-interacting protein 1), MUC5AC (Mucin-5AC), SERPINA4 (Kallistatin), CST6 (Cystatin-M) 및 TFF1 (Trefoil factor 1)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상 마커를 췌관내유두상점액종양(IPMN)의 악성도 검출용 용도에 관한 것이다.

이런 측면에서 한 양태에서 본원은 하나 이상 마커의 검출용 물질을 포함하는, 췌관내유두상점액종양(IPMN)의 악성도 판별용 조성물 또는 키트를 제공한다.

다른 양태에서 본원은 상기 마커 단백질을 포함하는 췌관내유두상점액종양(IPMN)의 악성도 판별용 조성물 또는 키트를 제공한다.

본원에 따른 마커가 구분하는 IPMN의 악성도는 저위험군 IPMN과 고위험군 IPMN을 구분하는 것이며, 상기 고위험군 IPMN은 고등급 이형성증 및 침윤성 암종을 포함한다.

더 나아가, 본원에 따른 마커 중 HOOK1, PTPN6, MUC2, TYMP, TLN1, TEX12, SERPINA5, AKR1B10, 및 TFF1으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커는 고등급 이형성증과 침윤성 암종을 구분할 수 있다.

본원에 따른 마커는 단백질 또는 핵산 수준에서 검출될 수 있으며, 이를 위한 시약은 당업계에 공지된 것으로 예를 들면 상기 단백질 수준 검출 시약은 웨스턴블랏, ELISA, 방사선면역분석, 면역확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 질량분석, MRM 분석 또는 단백질 마이크로어레이용 시약이고, 상기 핵산 수준 검출 시약은 중합효소연쇄반응, 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, 핵산 마이크로어레이 또는 노던블랏에 사용되는 시약일 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.

또 다른 측면에서 본원은 췌관내유두상점액종양의 악성도 판별에 필요한 정보를 제공하기 위해, 본원에 따른 하나 이상의 마커를 검출하는 방법으로 상기 방법은 췌관내유두상점액종양의 악성도 판별이 필요한 대상체 유래의 시료를 제공하는 단계; 상기 시료로부터 HOOK1 (Protein HOOK homolog 1), PTPN6 (Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 6), MUC2 (Mucin-2), TYMP (Thymidine phosphorylase), TLN1 (Talin-1), YBX1 (Nuclease-sensitive element-binding protein 1), TEX12 (Testis-expressed sequence 12 protein), FBN1 (Fibrillin-1), CLDN18 (Claudin-18), SERPINA5 (Plasma serine protease inhibitor), AKR1B10 (Aldo-keto reductase family 1 member B10), WFDC2 (WAP four-disulfide core domain protein 2), THY1 (Thy-1 membrane glycoprotein), PIK3IP1 (Phosphoinositide-3-kinase-interacting protein 1), MUC5AC (Mucin-5AC), SERPINA4 (Kallistatin), 및 CST6 (Cystatin-M) 및 TFF1 (Trefoil factor 1) 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상 바이오마커를 정량하는 단계; 및 상기 정량결과를 췌관내유두상점액종양의 악성도와 연관시키는 단계를 포함한다.

일 구현예에서 상기 연관시키는 단계에서 저등급 이형성증 대조군과 비교하여 HOOK1, PTPN6, MUC2, TYMP, TLN1, YBX1 및 TEX12의 양은 증가하고, FBN1, CLDN18, SERPINA5, AKR1B10, WFDC2, THY1, PIK3IP1, MUC5AC, SERPINA4, CST6 및 TFF1은 양은 감소하는 경우, 상기 시료를 고위험군으로 판단하는 단계를 포함한다.

본원에 따른 마커는 또한 고위험군에 속하는 고등급 이형성증과 침윤성 암종을 구분하는 것으로, 상기 마커는 HOOK1, PTPN6, MUC2, TYMP, TLN1, TEX12, SERPINA5, AKR1B10, 및 TFF1으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상이고, 상기 HOOK1, PTPN6, MUC2, TYMP, TLN1, 및 TEX12 마커는 고등급 이형성증과 비교하여 침윤성 암종에서 발현이 증가하고,상기 SERPINA5, AKR1B10, 및 TFF1 마커는 고등급 이형성증과 비교하여 침윤성 암종에서 발현이 감소한다.

본원에 따른 마커는 특히 췌장 낭종액에서 검출될 수 있다.

본원에 따른 방법은 비마커 임상 정보 예를 들면 조직검사 결과로, 위(Gastric), 장(Intestinal), 췌장담관(Pancreatobiliary), 또는 온코사이트(Oncocytic)인지를 포함하는 종양의 형태; 췌관형, 분지췌관형, 또는 혼합형을 포함하는 종양이 발생된 췌관 부위; 단일성 또는 다발성의 낭성 포칼러티(Cyst focality); 낭성 병변 내부의 벽결절의 유무 또는 낭성 병변과 같은 정보를 추가로 포함할 수 있다.

본원의 췌관내유두상점액종양의 악성도를 감별할 수 있는 단백질 바이오마커는 저등급 이형성증 병변을 가진 환자들에게 시행되는 불필요한 수술적 절제를 막을 수 있고, 수술적 절제가 필수적인 고등급 이형성증 또는 침윤성 암종 IPMN 병변을 가진 환자들에게는 보다 신속한 외과적 치료를 수행할 수 있다. 또한 비침습적 방법인 내시경초음파 유도하 세침흡인술(endoscopic ultrasound fine needle aspiration, EUS-FNA)을 통해 췌장 낭종액을 추출한 후 낭종액으로부터 특정 단백질 바이오 마커의 양을 측정하여 IPMN의 악성도를 감별할 수 있다면 IPMN 환자에 대한 보다 정확한 진단과 그에 따른 치료를 시행할 수 있다.

도 1a은 본원에서 사용된 Stage tip 제작 사진이다.
도 1b는 High-pH Fractionation 모식도이다.
도 1c은 Q-Exactive LC-MS/MS (DDA 모드) 분석 모식도이다.
도 2는 본원의 한 구현예에 따른 9개의 췌장 낭종액 시료에서 동정되고 정량된 단백질의 개수를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본원의 한 구현예에 따른 개별환자 시료 각각의 technical replicates간 피어슨 상관계수 값을 나타내는 결과이다.
도 4는 본원의 한 구현예에 따른 개별환자 시료 각각의 technical replicate간 피어슨 상관계수 값과 그 평균값을 나타내는 그래프이다.
도 5는 본원의 한 구현예에 따른 동정된 단백질의 시크리톰 분석 결과이다.
도 6은 본원의 한 구현예에 따른 Human Protein Atlas database와 본 연구에서 동정된 단백질을 비교 분석한 결과이다.
도 7은 본원의 한 구현예에 따른 Ingenuity Pathway Analysis 분석 결과이다.
도 8은 본원의 한 구현예에 따른 통계적으로 유의한 발현 차이를 보이는 단백질들을 이용하여 Hierarchical cluster analysis 수행한 결과이다.
도 9는 본원의 한 구현예에 따른 각 그룹 사이에서 통계적으로 유의한 발현차이를 보이는 단백질들에 대한 Volcano plot 결과이다.
도 10은 본원의 한 구현예에 따른 3 종류의 비교그룹에서 통계적으로 유의한 발현 차이를 보이는 단백질들에 대한 벤다이어그램이다.
도 11은 본원의 한 구현예에 따른 적어도 2개의 비교그룹 사이에서 통계적으로 유의한 발현 차이를 보이는 49개 단백질이다.
도 12는 본원의 한 구현예에 따른 IPMN 악성도에 따라 일정한 패턴을 보이며 발현 차이를 보이는 18개 바이오 마커 후보군이다.
도 13은 본원의 한 구현예에 따른 HOOK1, PTPN6, SERPINA5에 대한 웨스턴 블로팅 결과이다.

본원은 췌관내유두상점액종양의 악성도를 판별할 수 있는 바이오마커의 발견에 근거한 것이다.

따라서 한 양태에서 본원은 HOOK1 (Protein HOOK homolog 1), PTPN6 (Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 6), MUC2 (Mucin-2), TYMP (Thymidine phosphorylase), Talin-1 (TLN1), YBX1 (Nuclease-sensitive element-binding protein 1), TEX12 (Testis-expressed sequence 12 protein), FBN1 (Fibrillin-1), CLDN18 (Claudin-18), SERPINA5 (Plasma serine protease inhibitor), AKR1B10 (Aldo-keto reductase family 1 member B10), WFDC2 (WAP four-disulfide core domain protein 2), THY1 (Thy-1 membrane glycoprotein), PIK3IP1 (Phosphoinositide-3-kinase-interacting protein 1), MUC5AC (Mucin-5AC), SERPINA4 (Kallistatin), CST6 (Cystatin-M) 및 TFF1 (Trefoil factor 1)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 췌관내유두상점액종양의 악성도 판별용 용도에 관한 것이다.

일 구현예에서 본원은 HOOK1, PTPN6, MUC2, TYMP, TLN1, YBX1, TEX12, FBN1, CLDN18, SERPINA5, AKR1B10, WFDC2, THY1, PIK3IP1, MUC5AC, SERPINA4, CST6 및 TFF1으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커 검출용 물질을 포함하는 췌관내유두상점액종양의 악성도 판별용 조성물에 관한 것이다.

본원에서 췌관내유두상점액종양(Intraductal papillary mucinous neoplasm, IPMN)은 췌관에서 발생하는 낭성 병변으로, 췌관내 점액을 분비하는 세포들의 유두 성장이 특징이며, 조직학적으로는 과증식, 선종과 같은 전암 병변부터 침윤 암종까지 다양한 양상을 나타낸다. IPMN은 발생 부위에 따라 주 췌관형(main duct type), 분지 췌관형(branch duct type), 및 혼합형(mixed type)으로 분류할 수 있으며, 병리학적 분류를 근거로한 악성도 측면에서 저등급 이형성증, 중간등급 이형성증, 고등급 이형성증, 및 침윤성 암종으로 나눌 수 있다. 이 중 저등급 이형성증은 양성, 중간등급 이형성증은 양성 또는 경계선(boderline) 종양이며, 고등급 이형성증(dysplasia)과 침윤성 암종은 악성(malignant)종양으로 분류되며, 이 경우 췌장암으로 발전될 위험이 큰 병변으로 수술을 필요로 한다.

본원에서 악성도란, 췌관내유두상점액종양이 다른 조직 또는 기관으로 전이될 가능성이 높거나 또는 췌장암으로 발전될 가능성이 높아 외과적 수술이 필요한 췌관내유두상점액종양의 분류 기준을 일컫는 것이다.

본원에 따른 마커는 IPMN의 악성도에 따라 악성도가 높은 고등급 이형성증 및 침윤성 암종을, 양성 IPMN인 저등급 이형성증으로부터 구분할 수 있다.

췌관내유두상점액종양은 악성도의 진행상태에 따라 저등급 이형성증, 중간 등급 이형성증, 고등급 이형성증, 및 침윤성 암종으로 구분할 수 있으며, 이중 고등급 이형성증(dysplasia)과 침윤성 암종의 경우 췌장암으로 발전될 위험이 큰 병변으로, 본원에 따른 마커는 고등급 이형성증, 및 침윤성 암종을 저등급 이형성증과 구분할 수 있다. 중간등급 이형성증의 경우 저등급 이형성증과 병리학적으로 큰 차이가 없다. 이중 고등급 이형성증 및 침윤성 암종은 췌장암으로 발병할 가능성이 높은 고위험군이며, 저등급 이형성증은 양성 종양으로 저위험군 IPMN에 속한다. 본원에 따른 마커는 또한 IPMN 환자를 저위험군과 고위험군으로 구분할 수 있다. 또한 본원에 따른 마커는 IPMN을 양성과 악성으로 구분할 수 있다.

병변에 따른 저등급 이형성증, 중간등급 이형성증, 고등급 이형성증, 및 침윤성 암종으로 악성도 또는 등급을 구분하는 방법은 당업계에 공지된 것으로 예를 들면 Masao Tanaka, International consensus guidelines 2012 for the management of IPMN and MCN of the pancreas, Pancreatology Volume 12 (2012), doi:10.1016/j.pan.2012.04.004, page 183-197에 개시된 것을 참조할 수 있다.

본원에 따른 바이오마커는 단독 또는 조합으로 사용되어 췌관내유두상점액종양으로 진단된 환자의 악성도를 판단하는 것으로 대조군으로는 저등급 이형성증으로 진단된 대상체 유래의 시료가 사용될 수 있으며, 이들 시료와 비교하여 농도 변화를 나타내는 단백질, 상기 단백질 유래의 폴리펩타이드, 상기 단백질을 코딩하는 유전자 또는 그 단편을 포함한다.

본원에 따른 바이오마커 HOOK1 (Protein HOOK homolog 1), PTPN6 (Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 6), MUC2 (Mucin-2), TYMP (Thymidine phosphorylase), TLN1 (Talin-1), YBX1 (Nuclease-sensitive element-binding protein 1), TEX12 (Testis-expressed sequence 12 protein)는 악성도가 높은 고위험군 환자군에서 대조군과 비교하여 그 발현량이 증가되고, FBN1 (Fibrillin-1), CLDN18 (Claudin-18), SERPINA5 (Plasma serine protease inhibitor), AKR1B10 (Aldo-keto reductase family 1 member B10), WFDC2 (WAP four-disulfide core domain protein 2), THY1 (Thy-1 membrane glycoprotein), PIK3IP1 (Phosphoinositide-3-kinase-interacting protein 1), MUC5AC (Mucin-5AC), SERPINA4 (Kallistatin), CST6 (Cystatin-M) 및 TFF1 (Trefoil factor 1)는 악성도가 높은 고위험군 환자에서 대조군과 비교하여 그 발현량이 감소한다.

본원에 따른 마커가 구분하는 악성도는 앞서 언급한 바와 같다.

나아가 일 구현예에서 본원에 따른 마커는 고등급 이형성증과 침윤성을 구분할 수 있으며, 이 경우 상기 마커는 HOOK1, PTPN6, MUC2, TYMP, TLN1, TEX12, SERPINA5, AKR1B10, 및 TFF1으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상이고, 상기 HOOK1, PTPN6, MUC2, TYMP, TLN1, 및 TEX12 마커는 고등급 이형성증과 비교하여 침윤성 암종에서 발현이 증가하고, 상기 SERPINA5, AKR1B10, 및 TFF1 마커는 고등급 이형성증과 비교하여 침윤성 암종에서 발현이 감소한다.

이러한 본원에 따른 바이오마커의 단백질 및 핵산 서열은 예를 들면 도 12에 기재된 ID로 UniProt DB (www.uniprot.org)에서 검색가능하다.

본원에 따른 마커는 하나 또는 두 개 이상의 조합, 예를 들면 두 개, 세 개, 네 개, 다섯 개의 조합으로 사용될 수 있으며, 당업자라면 본원 실시예에 기재된 방법과 같은 정상인 및 환자를 포함하는 대상체의 생물학적 시료를 사용한 분석 및/또는 Logistic regression 분석과 같은 방법을 통해 목적하는 민감도 및 특이성을 만족하는 마커의 조합을 선별할 수 있을 것이다.

본원에 따른 바이오마커는 췌관내유두상점액종양의 악성도 진단을 위한 기존의 비마커 임상 정보와 함께 사용될 수 있다. 비마커 임상정보로는 조직소견에 따른 네 가지 형태(Gastric, Intestinal, Pancreatobiliary, Oncocytic), 췌관의 종류(주췌관형, 분지췌관형, 혼합형), Cyst focality(단일성, 다발성), 낭성 병변 내부의 벽결절의 유무, 낭성 병변의 크기(3cm를 기준으로 더 큰지 작은지)가 있다. 상기 비마커 임상정보에 따라 악성도를 판별하는 기준은 당업계에 공지된 것으로 당업자라면 적절한 것을 선택할 수 있을 것이다.

본원에서 검출이란, 정량 및/또는 정성 분석을 포함하는 것으로, 존재, 부존재의 검출 및 발현량 검출을 포함하는 것으로 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다.

이러한 본원에 따른 마커의 검출은 마커의 기능적 특징 및/또는 항원적 특징에 기반을 둔 것일 수 있다.

일 구현예에서 본원에 따른 마커는 마커의 활성 또는 기능의 검출, 또는 단백질을 코딩하는 핵산, 특히 mRNA 수준 및/또는 단백질 수준에서 특이적으로 상호작용하는 물질을 사용하여 검출될 수 있다.

이런 측면에서 본원에 따른 조성물에 포함되는 검출시약은 본원에 따른 마커를 단백질 또는 핵산 수준에서 다양한 방식으로 정량적 또는 정성적 분석을 통해 검출할 수 있는 시약이다.

본원에 따른 마커의 정량적 및 정성적 분석에는 공지된 단백질 또는 핵산을 정성 또는 정량적으로 검출하는 다양한 방법이 사용될 수 있다.

단백질 수준에서의 정성적 또는 정량적 검출 방법으로는 예를 들면 웨스턴블랏, ELISA, 방사선면역분석, 면역확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 용액/현탁액 중에서 표지된 항체와의 결합, 질량분석기 또는 항체를 이용한 단백질어레이 등을 이용한 방법이 사용될 수 있다.

또는 핵산 수준에서의 정성적 또는 정량적 검출 방법으로는 핵산 전사 및 증폭 방법, eTag 시스템, 표지된 비드를 기본으로 하는 시스템, 핵산 어레이와 같은 어레이 시스템 등을 이용한 방법이 사용될 수 있다.

이러한 방법은 공지된 것으로 예를 들면 chip-based capillary electrophoresis: Colyer et al. 1997. J Chromatogr A. 781(1-2):271-6; mass spectroscopy: Petricoin et al. 2002. Lancet 359: 572-77; eTag systems: Chan-Hui et al. 2004. Clinical Immunology 111:162-174; microparticle-enhanced nephelometric immunoassay: Montagne et al. 1992. Eur J Clin Chem Clin Biochem. 30:217-22 등을 참조할 수 있다.

본원에 따른 일 구현예에서는 질량분석법(Mass spectrometry)를 이용하여 마커를 검출할 수 있으며, 이는 검체로부터 단백질 또는 펩타이드를 분리 한 후 예를 들면 본원 실시예에 기재된 방식대로 분석될 수 있으며, 또한 예를 들면 (Kim, et al. 2010 J Proteome Res. 9: 689-99; Anderson, L et al. 2006. Mol Cell Proteomics 5: 573-88.)를 참조할 수 있다. 한 구현예에서는 예를 들면 Triple Quadrupole LC-MS/MS, QTRAP 등을 이용한 다중반응모니터링(Multiple reaction monitoring, MRM) 기술이 사용된다. MRM은 생체 시료 중에 존재하는 미량의 바이오마커와 같은 물질을 정량적으로 정확하게 다중 측정할 수 있는 방법으로 제1 질량필터(Q1)를 이용하여 이온화원에서 생성된 이온 단편들 중 전구이온 또는 모이온을 선택적으로 충돌관으로 전달한다. 이어 충돌관에 도달한 전구이온은 내부 충돌기체와 충돌하여, 쪼개져 산물이온 또는 딸이온을 생성하여 제2 질량 필터(Q2)로 보내지고, 여기서 특징적인 이온만이 검출부로 전달된다. 이런 방식으로 목적하는 성분의 정보만을 검출할 수 있는 선택성 및 민감도가 높은 분석방법이다. 예를 들면 Gillette et al., 2013, Nature Methods 10:28-34에 기재된 것을 참조할 수 있다.

다른 구현예에서는 각 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자 유래의 mRNA와 특이적으로 결합하는 결합제제 또는 결합제제를 포함하는 어레이가 사용된다.

또 다른 구현예에서는 ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), RIA (Radio Immuno Assay) 등과 같은 샌드위치 방식의 면역분석법이 사용될 수 있다. 이러한 방법은 고상의 기질 예를 들면 글라스, 플라스틱(예를 들면 폴리스티렌), 폴리사카라이드, 나일론 또는 나이트로셀룰로스로 제작된 비드, 막, 슬라이드 또는 마이크로타이터플레이트에 결합된 제1 항체에 생물학적 시료를 추가한 후, 직접 또는 간접 검출이 가능한 표지물질 예를 들면 ³H 또는 ¹²⁵I와 같은 방사선 물질, 형광물질, 화학발광물질, 햅텐, 바이오틴, 디그옥시제닌 등으로 표지되거나 또는 기질과의 작용을 통해 발색 또는 발광이 가능한 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, 말레이트 데하이드로게나아제와 같은 효소와 컨쥬게이션된 항체와의 결합을 통해 단백질은 정성 또는 정량적으로 검출 할 수 있다.

다른 구현예에서는 항원 항체 결합을 통해 마커를 간단하게 검출할 수 있는 Ouchterlony 플레이트, 웨스턴블랏, Crossed IE, Rocket IE, Fused Rocket IE, Affinity IE와 같은 면역 전기영동(Immuno Electrophoresis)이 사용될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984 등에 기재되어 있다. 상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석하여 즉, 정상 시료와의 시그널 대조를 수행함으로써, 질환 발생 여부를 진단할 수 있다.

이러한 방법에 사용되는 시약 또는 물질은 공지된 것으로서, 예를 들면 상기 마커에 특이적으로 결합하는 항체, 기질, 핵산 또는 펩타이드 앱타머, 또는 상기 마커와 특이적으로 상호작용하는 수용체 또는 리간드 또는 보조인자 등이 사용될 수 있다. 상기 본원의 마커와 특이적으로 상호작용 또는 결합하는 시약 또는 물질은 칩 방식 또는 나노입자(nanoparticle)와 함께 사용될 수 있다.

본원의 마커는 또한 핵산 수준 특히 mRNA 수준에서의 공지된 다양한 방법을 사용하여 정량적 및/또는 정성적으로 검출될 수 있다.

핵산 수준에서의 정성적 또는 정량적 검출 방법으로는 예를 들면 mRNA 수준에서의 검출, 발현량 또는 패턴의 검출을 위해 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)/중합효소연쇄반응, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, Nuclease 보호 분석(NPA) 예를 들면 RNase, S1 nuclease 분석, in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 또는 칩 또는 노던블랏 등을 이용한 방식이 사용될 수 있으며, 이러한 분석법은 공지된 것이며, 또한 시중의 키트를 사용하여 수행될 수 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 것을 선택할 수 있을 것이다. 예를 들면 노던블랏은 세포에 존재하는 전사체의 크기를 알 수 있으며, 다양한 프로브를 사용할 수 있는 장점이 있으며, NPA는 다중 마커 분석에 유용하며, in situ 교잡법은 mRNA와 같은 전사체의 세포 또는 조직내 위치 파악에 용이하며, 역전사 중합효소연쇄반응은 적은 량의 시료 검출에 유용하다. 또한 본원에 따른 바이오마커 단백질을 코딩하는 유전자 유래의 mRNA 또는 cRNA와 같은 핵산과 특이적으로 결합하는 결합제제 또는 결합제제를 포함하는 어레이가 사용될 수 있다.

상기 핵산 수준에서의 바이오마커의 검출 방법에 사용되는 시약 또는 물질은 공지된 것으로서, 예를 들면 mRNA의 존재 여부와 그 양을 RT-PCR로 측정하기 위한 방법에서 검출시약으로는 예를 들면 중합효소, 본원 마커의 mRNA에 특이적인 프로브 및/또는 프라이머쌍을 포함한다. “프라이머” 또는 “프로브”는 주형과 상보적으로 결합할 수 있고 역전사효소 또는 DNA 중합효소가 주형의 복제를 개시할 수 있도록 하는 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열을 의미한다. 본원에 사용되는 상기 검출 시약은 신호검출을 위해 상술한 바와 같은 발색, 발광 또는 형광물질과 같은 것으로 표지될 수 있다. 일구현예에서는 mRNA 검출을 위해 노던블랏 또는 역전사 PCR(중합효소연쇄반응)이 사용된다. 후자의 경우 검체의 RNA를 특히 mRNA를 분리한 후, 이로부터 cDNA를 합성한 후, 특정 프라이머, 또는 프라이머 및 프로브의 조합을 사용하여, 검체 중의 특정 유전자를 검출하는 것으로, 특정 유전자의 존재/부존재 또는 발현량을 결정할 수 있는 방법이다. 이러한 방법은 예를 들면 (Han, H. et al, 2002. Cancer Res. 62: 2890-6)에 기재되어 있다.

본원에 따른 조성물에 포함되는 검출시약은 검출에 사용되는 구체적 방법에 따라 검출을 위해 직접적 또는 샌드위치 형태로 간접적으로 표지될 수 있다. 직접적 표지방법의 경우, 어레이 등에 사용되는 혈청 시료는 Cy3, Cy5와 같은 형광 표지로 표지된다. 샌드위치의 경우, 표지되지 않은 혈청 시료를 먼저 검출시약이 부착된 어레이와 반응시켜 결합시킨 후, 표적 단백질을 표지된 검출 항체와 결합시켜 검출한다. 샌드위치 방식의 경우, 민감도와 특이성을 높일 수 있어, pg/mL 수준까지 검출이 가능하다. 그 외 방사능 물질, 발색물질, 자기성입자 및 고밀도전자입자 등이 표지물질로 사용될 수 있다. 형광 광도는 스캐닝 콘포칼 현미경이 사용될 수 있으며, 예를 들면 Affymetrix, Inc. 또는 Agilent Technologies, Inc 등에서 입수할 수 있다.

본원의 조성물은 추가로 결합분석에 필요한 하나 이상의 부가 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들면 결합 버퍼, 시료 준비에 필요한 시약, 혈액채취용 주사기 또는 음성 및/또는 양성대조군을 추가로 포함할 수 있다.

상술한 바와 같은 다양한 검출시약을 포함하는 본원의 조성물은 분석양태에 따라 ELISA 분석용, 딥스틱 래피드 키트(dip stick rapid kit) 분석용, MRM 분석용 키트, 마이크로어레이용, 유전자증폭용, 또는 면역분석용 등으로 제공될 수 있으며, 분석 양태에 맞추어 적절한 검출시약을 선별할 수 있을 것이다.

일 구현예에서는 ELISA 또는 딥스틱 래피드 키트가 사용되며, 이 경우 본원에 따른 하나 이상의 마커를 인식하는 항체가 기질, 예를 들면 다중웰 플레이트의 웰 또는 유리 슬라이드의 표면 또는 나이트로셀룰로스에 부착되어 제공될 수 있다. 딥스틱의 경우, POCT (Point of Care Test) 분야에서 널리 이용되는 기술로, 본원에 따른 바이오마커를 인식하는 하나 이상의 항체가 나이트로셀룰로스와 같은 기질에 결합되어 있고, 이를 혈청과 같은 시료와 접촉시 예를 들면 딥스틱의 일 말단을 혈청시료에 담그면, 시료가 모세관 현상에 의해 기질을 이동하여, 기질 중의 항체와 결합시 발색하는 방식으로, 마커를 검출하는 것이다.

다른 구현예에서는 펩타이드를 근간으로 하는 MRM 키트가 제공되며, MRM 방식에 대하여는 앞서 설명한 바와 같다. MRM 방법은 특정 단백질을 선택적으로 인식하는 펩타이드를 이용하는 것으로, 온도, 습도 등 환경에 민감한 항체를 이용하는 기존의 방법과 비교하여, 보다 안정적으로 생체시료에서 마커를 검출할 수 있다. 예를 들면 펩타이드는 상술한 바와 같이 기재된 것이 사용될 수 있으며, 하나의 마커에 하나 또는 두 개 이상의 펩타이드가 사용될 수 있다.

다른 구현예에서, 마이크로어레이를 포함하는 어레이 또는 칩의 형태로 제공될 수 있다. 유리 또는 나이트로셀룰로스와 같은 기질의 표면에 검출시약이 부착될 수 있으며, 어레이 제조 기술은 예를 들면 Schena et al., 1996, Proc Natl Acad Sci USA. 93(20):10614-9; Schena et al., 1995, Science 270(5235):467-70; 및 U.S. Pat. Nos. 5,599,695, 5,556,752 또는 5,631,734를 참조할 수 있다. 어레이에 부착될 수 있는 검출시약은 예를 들면 한 단백질에 특이적 결합이 가능한 항체, 항체단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics)를 포함한다.

다른 양태에서 본원은 바이오마커의 검출시약을 포함하는 악성도 판별용 키트 또는 시스템에 관한 것이다. 검출 시약 및 이러한 시약이 사용되는 방법은 상술한 바와 같다. 이러한 본원의 마커를 검출할 수 있는 시약은 구획이 되어 있는 용기에 개별적으로 분주되어 존재할 수 있으며, 이러한 의미에서 본원은 또한 본원의 마커 검출시약을 구획되어 포함하는 장치/기구에 관한 것이다. 또한 키트는 사용안내서를 추가로 포함할 수 있다.

또 다른 양태에서 본원은 췌관내유두상점액종양의 악성도 판별에 필요한 정보를 제공하기 위해, 췌관내유두상점액종양의 악성도 판별이 필요한 대상체 유래의 시료로부터 본원에 따른 바이오마커의 핵산 및/또는 단백질의 존재 여부 및/또는 농도를 검출 (또는 정량)하는 단계; 및 상기 결과를 악성도와 연관시키는 단계를 포함하는 췌관내유두상점액종양의 악성도 판별 마커를 검출하는 방법에 관한 것이다.

본원에 따른 방법은 추가로 본원에 따른 바이오마커의 핵산 또는 단백질의 농도 또는 존재에 대한 검출결과를 대조군 값과 비교하는 단계; 및 상기 대조군 값과 비교하여, 상기 대상체 유래의 시료의 핵산 또는 단백질의 농도의 변화가 있거나, 또는 상기 핵산 또는 단백질의 존재 여부에 변화가 있는 경우, 췌관내유두상점액종양이 저위험군인지, 고위험군 인지를 판별할 수 있다.

추가로 본원에 따른 마커는 고위험군에 속하는 고등급 이형성증 및 침윤성 암종을 추가로 판별할 수 있다.

본원에 따른 방법에 대조군으로 사용될 수 있는 시료는 정상인, 비침윤성 췌관내유두상점액종양(아데노마, 저등급 또는 중간정도 이형성증)으로 진단된 대상체, 또는 침윤성 췌관내유두상점액종양으로 인해 치료후 완치된 환자 유래의 시료가 사용될 수 있다. 특히 췌장 낭종액이 시료로 사용되는 경우에 대조군은 저등급 이형성증 시료가 대조군으로 사용된다.

본원에 따른 방법의 연관시키는 단계에서 본원에 따른 바이오마커의 정량결과 대조군과 비교하여 HOOK1, PTPN6, MUC2, TYMP, Talin-1, YBX1 및 TEX12의 양은 증가하고, FBN1, CLDN18, SERPINA5, AKR1B10, WFDC2, THY1, PIK3IP1, MUC5AC, SERPINA4, CST6 및 TFF1은 양은 감소하는 경우, 상기 시료 또는 대상체를 고위험군으로, 위와 같은 발현양상을 나타내지 않는 경우를 저위험군으로 판단한다.

일 구현예에서는 대조군으로 저등급 이형성증로 확진 또는 판단된 시료가 사용될 수 있으며, 이 경우 본원에 따른 각 마커의 발현 양상은 앞서 언급한 바와 같이 대조군과 비교하여 HOOK1, PTPN6, MUC2, TYMP, Talin-1, YBX1 및 TEX12의 양은 증가하고, FBN1, CLDN18, SERPINA5, AKR1B10, WFDC2, THY1, PIK3IP1, MUC5AC, SERPINA4, CST6 및 TFF1은 양은 감소한 경우, 상기 시료 또는 대상체를 고위험군으로, 대조군과 비교하여 동일하거나 실질적 차이가 없는 경우를 저위험군으로 판단한다. 동일하거나 실질적 차이가 없다는 것은 본원에 개시된 사항 및 본 기술분야에 속하는 당업자의 수준내에서 용이하게 판별할 수 있을 것이다.

본원에 따른 방법은 고위험군을 추가로 고등급 이형성증, 및 침윤성 암종으로 판단할 수 있다. 이러한 마커는 HOOK1, PTPN6, MUC2, TYMP, TLN1, TEX12, SERPINA5, AKR1B10, 및 TFF1으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커이고, 상기 HOOK1, PTPN6, MUC2, TYMP, TLN1, 및 TEX12 마커는 고등급 이형성증과 비교하여 침윤성 암종에서 발현이 증가하고, 상기 SERPINA5, AKR1B10, 및 TFF1 마커는 고등급 이형성증과 비교하여 침윤성 암종에서 발현이 감소한다.

본원에서 생물학적 시료란 바이오마커 검출이 가능한 하나 이상의 성분을 포함하는 물질 또는 물질의 혼합물을 일컫는 것으로 생물체의 체액 중, 특히 췌장 낭종액을 일컫는다.

본원에 따른 방법은 앞서 언급한 방법, 또는 검출 시약을 사용하는 방법을 이용하여 수행될 수 있으며, 특히 단백질 또는 핵산 마이크로어레이 분석법, 핵산증폭, 항원-항체 반응, 또는 질량분석 방식으로 실시될 수 있다.

본원의 방법은 포유류 특히 인간을 대상으로 포함한다. 인간 대상체는 췌관내유두상점액종양이 저등급 이형성증, 고등급 이형성증 또는 침윤성 암종인지에 대한 진단이 필요한 사람으로 예를 들면 췌관내유두상점액종양으로 진단된 사람, 췌관내유두상점액종양으로 진단된 사람으로 저등급 이형성증, 고등급 이형성증 또는 침윤성 암종인지 여부에 대한 판단이 필요한 사람, 췌관내유두상점액종양이 의심되는 사람, 또는 췌관내유두상점액종양 특히, 저등급 이형성증, 고등급 이형성증 또는 침윤성 암종을 치료 후 완치된 환자를 포함한다.

다른 양태에서 본원은 생물학적 시료에서 본원에 따른 하나 이상의 마커를 인비트로에서 검출하는 방법에 관한 것이며, 생물학적 시료, 바이오마커 검출 방법 등은 앞서 언급한 바를 참조할 수 있다.

본원에 따른 방법은 상기와 같은 본원에 따른 하나 이상의 바이오마커의 검출 이외의 비마커 임상정보를 추가로 포함할 수 있다. 비마커 임상정보와 관련되어서는 앞서 언급한 바를 참조할 수 있다.

상술한 본원에 따른 방법을 사용하여 두 개 이상을 포함하는 마커의 조합을 사용하는 경우 프로파일, 즉 시료 중 마커 단백질 발현과 관련된 정량적 정보를 포함하는 데이터세트가 생성될 수 있다.

마커를 이용하여 프로파일을 수득한 후에, 참조군 또는 대조군과의 결과 비교를 통해 대상체의 시료의 악성도 여부를 판별한다. 대조군 또는 참조군으로는 앞서 언급한 바를 참조할 수 있다.

본원에 따른 일 구현예에서는 정상인 유래의 시료, 췌관내유두상점액종양으로 치료 후 완치된 환자 유래의 시료가 대조군 또는 참조군으로 사용되어, 수득 된 프로파일의 비교에 사용된다.

대조군과 시료를 이용한 시험군 사이의 마커 프로파일의 비교에는 공지된 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면 발현 프로파일의 디지털 영상 비교, 발현 데이터에 대한 DB를 이용한 비교, 또는 U.S. 특허 6,308,170 및 6,228,575에 기재된 것을 참조할 수 있다.

본원에 따른 마커 검출을 통하여 수득 된 프로파일은 공지의 데이터 분석방법을 이용하여 처리될 수 있다. 예로는 nearest neighbor classifier, partial-least squares, SVM, AdaBoost 및 clustering-based classification 방법이 사용될 수 있으며, 예를 들면 Ben-Dor et al (2007, J. Comput. Biol. 7: 559-83), Nguyen et al (2002, Bioinformatics 18:39-50), Wang et al (2003, BMC Bioinformatics 4:60), Liu et al (2001, Genome Inform. Ser. Workshop Genome Inform.12:14-23), Yeang et al (2001, Bioinformatics 17 Suppl 1:S316-22) 및 Xiong (2000, Biotechniques 29(6):1264-8, 1270) 등을 포함하는 문헌을 참조할 수 있다.

또한 본원의 마커를 통하여 검출된 결과가 악성도 예측에 유의한 것으로 판정하기 위해 다양한 통계처리 방법이 사용될 수 있다. 통계적 처리 방법으로 일 구현예에서는 logic regression 방법이 사용되며, Ruczinski, 2003, Journal of Computational and Graphical Statistics 12:475-512를 참조할 수 있다. 상기 방법은 클래시파이어가 바이너리 트리로 제시되는 CART 방법과 유사하나, 각 노드는 CART에 의해 생성되는 "and" 연산자와 비교하여 보다 일반적인, 특성과 관련된 불린(Boolean) 연산자가 사용된다. 다른 분석 방법의 예로는 nearest shrunken centroids (Tibshirani. 2002 PNAS. 99:6567-72), random forests (Breiman. 2001. Machine Learning 45:5-32 및 MART (Hastie. 2001. The Elements of Statistical Learning, Springer)을 들 수 있다.

일 구현예에서, 통계처리를 통해 악성도를 예측하기 위해 대상체 시료와 대조군 간의 유의한 차이에 관한 신뢰수준을 결정할 수 있다. 통계 처리에 사용되는 원 데이터는 각 마커에 대하여 이중, 삼중 또는 다중으로 분석된 값이다.

이러한 통계적 분석 방법은 바이오마커는 물론, 임상 및 유전적 데이터의 통계적 처리를 통하여 임상적으로 유의한 판단을 하는데 매우 유용하다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

본 실시예에서는 질량분석기를 이용하여 본원의 마커를 발굴하였다.

본 실시예에 사용된 질량분석장비는 초고분해능 질량분석기(High-Resolution Mass Spectrometry: Q-Exactive)로 기존의 분석법보다 높은 감도로 샘플 분석이 가능하다. 시료 전처리 과정을 통해 펩타이드 단위로 단편화 된 시료를 이온화 시킨 후 질량분석기에 주입하게 된다. 이온화된 펩타이드는 질량/이온화 비율 값에 따라 분류가 되며, 가장 양이 많은 20개의 이온들이 선택된다. 이 이온들은 HCD(High-energy collision dissociation) collision cell로 이동하게 되며, 이곳에서 이온들은 전기적인 에너지에 의해 단편화 된다. 단편화 된 이온들은 detector에서 peak chromatogram으로 보여지게 된다.

본 실시예에 사용된 시료 준비 과정 중, High-pH fractionation은 펩타이드를 pH가 높은 용액 상태에서 소수성에 따라 펩타이드가 분획되게 하는 시료 처리 기술이다. 소수성에 따라 분획한 펩타이드를 질량분석장비를 이용하여 분석하게 되면 동정되는 펩타이드의 개수를 늘릴 수 있으며 이는 곧 시료 분석을 통해 동정되는 단백질 전체 개수가 늘어나는 효과를 준다. 바이오 마커를 선별하기 위한 여러 가지 기술적 조건들 중에서 첫 번째 조건은 우선적으로 많은 단백질들을 동정 및 정량하는 것이기 때문에 High-pH fractionation 과정을 통해 이를 충족시킬 수 있다.

1-1. 췌장 낭종액 시료 샘플링

본원에서는 췌장절제술을 통해 절제한 IPMN 병변에서 췌장 낭종액 (최소 200μL)을 주사기를 이용하여 채취하였으며, 채취한 췌장 낭종액을 담은 tube에 labeling 후 즉시 액체 질소로 급속 냉동시킨 이후 -80℃에 즉시 보관하였다.

1-2. 췌장 낭종액 점액질 제거 과정

상기 실시예 1-1에 따라 -80℃에서 냉동보관한 췌장 낭종액을 ice 조건에서 천천히 녹였다. 녹인 췌장 낭종액을 100 ~ 200μL를 Eppendorf tube로 옮겼다. 이때 점액질 때문에 마이크로피펫으로 제대로 채취가 되지 않는 시료는 Sonicator를 이용하여 점액질을 제거하였다 (amplitude : 23, cycle time : 5). 시료가 담긴 Eppendorf tube를 4℃, 15,000rpm에서 20분 간 원심분리하고 Supernatant와 Pellet을 분리하여 각각의 tube에 보관하였다. BCA (Bicinchoninic acid) assay 방식으로 Supernatant의 단백질 농도 정량하였다.

1-3. 췌장 낭종액 단백질, 아세톤을 이용한 단백질 침전 과정

100μg에 해당하는 췌장 낭종액 시료를 마이크로피펫을 이용하여 Eppendorf tube로 옮겼다. 시료 부피의 5배에 해당하는 아세톤을 넣은 후 시료와 아세톤을 천천히 혼합하고, 아세톤과 혼합된 시료를 -20℃에서 16시간 동안 incubation하였다. Incubation 끝난 시료를 4℃ 15,000rpm에서 10분간 원심분리하고 아세톤을 쏟아낸 후 차가운 아세톤 500μL를 Eppendorf tube 벽면을 따라 흘리면서 주입하였다. 4℃15,000rpm에서 10분간 원심분리하고 아세톤을 쏟아낸 후 Eppendorf tube 뚜껑을 열어 둔 채로 2시간 동안 tube 안에 남은 아세톤을 모두 기화시켜 제거하였다.

1-4. 췌장 낭종액 , 단백질 펩타이드화 과정 ( FASP , Filter aided sample preparation)

침전된 단백질에 30μL의 SDT buffer (4% SDS, 0.1M DTT, 0.1M Tris-Cl (pH7.4))를 주입하고 반복적으로 vortexing하여 침전된 단백질을 SDT buffer에 골고루 녹였다. SDT buffer에 녹인 시료를 100℃에서 30분간 물 중탕 후 상온에서 식힌 후 spin-down하였다. Ultracel filter와 Centrifugal tube를 접합시킨 후 Ultracel filter (30K)에 Urea buffer (8M Urea, 0.1M Tris-Cl(pH8.5)) 350μL 넣은 후 SDT buffer에 녹인 시료를 주입하였다. 20℃ 14,000g로 15분간 원심분리를 수행하고, Ultracel filter에 Urea buffer 350μL를 주입한 후 20℃ 14,000g로 15분간 원심분리를 2회 반복하였다. Ultracel filter에 50mM IAA 200μL를 주입한 후 시료와 50mM IAA를 천천히 볼텍싱하여 혼합한 후에 상온에서 45분 간 incubation하였다. 20℃ 14,000g로 15분간 원심분리를 수행하고, Ultracel filter에 Urea buffer 350μL를 주입한 후 20℃ 14,000g로 15분간 원심분리를 2회 반복하였다. Ultracel filter에 40mM ammonium bicarbonate(ABC) 350μL를 주입한 후 20℃ 14,000g로 15분간 원심분리를 3회 반복하였다. 상기 Ultracel filter를 새로운 Centrifugal tube에 접합시켰으며 Ultracel filter에 40mM ABC 100μL와 Trypsin (Trypsin : Protein = 1 : 50)을 주입한 후 18시간 동안 37℃에서 incubation하였다. Incubation이 끝난 시료는 20℃ 14,000g로 15분간 원심분리하였다. 40mM ABC 100μL 주입한 후 20℃ 14,000g로 15분간 원심분리하였다. HPLC 전용 distilled water(DW) 50μL 주입한 후 20℃ 14,000g로 20분간 원심분리하였다. Centrifugal tube에 모인 시료를 Eppendorf tube로 옮겼다.

1-5. 췌장 낭종액 펩타이드 , C18 Stage tip desalting 과정

도 1a과 같이 Stage tip에 C18 membrane을 이용하여 tip 앞쪽을 막은 후 MeOH에 녹인 C18 resin을 tip에 1cm 정도 채웠다. 상기 C18 Stage tip에 MeOH 100μL씩 3번, Acetonitrile (ACN) 100μL씩 3번, 0.1% Trifluoroacetic acid (TFA) 100μL씩 3번 흘려서 resin activation 및 equilibration을 수행하였다. 상기 C18 Stage tip에 펩타이드 시료 흘려준 후 나온 flow-through를 다시 C18 Stage tip에 흘려준 후에 0.1% TFA 100μL씩 3번 흘려주며 세척하였다. 40% ACN / 0.1% formic acid 100μL, 60% ACN / 0.1% formic acid 100μL, 60% ACN / 0.1% formic acid 100μL, 80% ACN / 0.1% formic acid 100μL를 차례로 흘려주어 peptide elution 수행하였다. 1시간 이상 80℃에서 냉동 후, speed-vac으로 동결건조시켰다.

1-6. 췌장 낭종액 펩타이드 , high-pH fractionation 과정

도 1a과 같은 Stage tip에 C18 membrane을 이용하여 tip 앞쪽을 막은 후 MeOH에 녹인 C18 resin을 tip에 1cm 정도 채웠다. C18 Stage tip에 MeOH 100μL씩 5번, Acetonitrile (ACN) 100μL씩 5번, 2% ACN / 15mM Ammonium Hydroxide (pH10) 100μL씩 5번 흘려서 resin activation 및 equilibration을 수행하였다. 상기 동결건조시킨 펩타이드 시료에 로딩 버퍼(2% ACN / 15mM Ammonium Hydroxide (pH10)) 150μL 넣은 후 볼텍싱하여 펩타이드를 로딩 버퍼에 모두 용해시켰다. C18 Stage tip에 펩타이드 시료 흘려준 후 나온 flow-through를 다시 C18 Stage tip에 흘려주었다. ACN 비율이 각각 2%, 5%, 7.5%, 10%, 12.5%, 15%, 17.5%, 20%, 22.5%, 25%, 27.5%, 30%, 32.5%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 100%인 15mM ammonium hydroxide 버퍼를 C18 Stage tip에 50μL씩 순차적으로 흘려주면서 flow-through를 받는 Eppendorf tube 6개를 도 1b와 같이 교체해 주었다.

1-7. Q- Exactive LC-MS/MS 분석 과정 (Data dependent acquisition mode, DDA 모드 )

도 1c과 같이 S-lens를 통해 들어간 precursor ion들은 Quadrupole mass filter를 통과하여 C-Trap에 모이게 되고, 충분한 이온이 C-Trap에 모이면 이온들은 Orbitrap mass analyzer로 보내진다. Orbitrap mass analyzer에서 precursor ion들을 detection한 후, 이 중 양이 많은 20개의 precursor ion들만 Quadrupole mass filter에서 선택되어 순차적으로 HCD cell로 보내지고, fragmentation이 일어나 product ion으로 분해된다. Product ion들은 다시 Orbitrap mass analyzer로 보내지고, detector에서 digital signal로 전환되어 peak chromatogram으로 보여지게 된다.

1-8. raw file search 및 통계분석 통한 최종 바이오마커 도출 과정

Q-Exactive LC-MS/MS 분석을 통해 나온 MS 데이터는 MaxQuant (version 1.5.5.1)을 이용하여 protein search 하였다. Protein search 과정은 참고 문헌에 제시된 과정대로 수행하였다[Cox J, Mann M.: MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol 2008, 26:1367-1372]. protein search에 이용한 데이터베이스는 Uniprot Human database (2014. 12월, 88,717 entries)이다.

펩타이드와 단백질 동정 시, false discovery rate (FDR)을 1%로 설정하고, 통계분석은 Perseus (version 1.5.8.5)을 이용하여 진행하였으며, Student’s t-test 분석을 통해 IPMN의 각 그룹간 통계적으로 유의하게 발현 차이를 보이는 단백질을 도출하였다. Benjamini-Hochberg FDR 0.05를 기준으로 각 비교 그룹간 단백질 발현 차이의 통계적 유의성을 도출하였다. 비교 그룹은 총 3개로 비교 그룹 1 저등급 이형성증과 고등급 이형성증, 비교 그룹 2 고등급 이형성증과 침윤성 암종, 비교 그룹 3 저등급 이형성증과 침윤성 암종으로 구성하였다. 적어도 2개의 비교 그룹에서 통계적으로 유의한 발현 차이를 보이는 단백질 중에서 IPMN의 악성도에 따라 순차적으로 증가하거나 감소하는 단백질을 최종 바이오마커로 선정하였다.

1-9. 동정된 단백질에 대한 바이오인포매틱스 분석 과정

동정된 단백질들을 여러 가지 바이오인포매틱스 기법들을 이용하여 분석하였다. 바이오인포매틱스 기법으로는 시크리톰 분석, Human Protein Atlas database와의 비교 분석, 그리고 Ingenuity Pathway Analysis 분석을 이용하였다. 시크리톰 분석은 SignalP 4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/), SecretomeP 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP/), 그리고 TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)을 통해 수행하였다. 시크리톰 분석을 통해 동정한 단백질들 중, 세포 밖으로 분비되는 단백질들을 도출하였다. Human Protein Atlas database (http://www.proteinatlas.org/, 2017.05.31 버전)를 이용하여 췌장에서 발현된다고 알려진 단백질과 본 연구에서 동정된 단백질들이 얼마나 일치하는지 비교 분석하였다. Ingenuity Pathway Analysis (Ingenuity Systems, http://www.ingenuity.com/)를 이용하여 각 비교 그룹에서 통계적으로 유의한 발현 차이를 보이는 단백질들이 어떤 생물학적 pathway term과 연관성이 있는지에 대해 조사하였다.

1-10. 웨스턴 블로팅 실험을 통한 바이오마커 검증 과정

총 19개의 췌장 낭종액 시료를 이용하여 웨스턴 블로팅 실험을 수행하였다. 시료 구성은 10례의 저등급 이형성증, 4례의 고등급 이형성증, 그리고 5례의 침윤성 암종이다. 각 췌장 낭종액 시료 40μg을 5X SDS loading dye (250mM Tris-Cl(pH6.8), 10% SDS, 50% glycerol, 0.5M DTT, 0.1% bromophenol blue)와 혼합한 후 5분간 100℃에서 가열하였다. 전기영동을 통해 10% SDS-PAGE gel에 로딩한 단백질을 polyvinylidene fluoride (PVDF) 멤브레인으로 이동시켰다. 상기 PVDF 멤브레인을 Ponceau S dye로 염색시켜 동량의 단백질이 로딩되었는지 확인하였다. 상기 PVDF 멤브레인을 5% BSA 용액에 넣은 후 상온에서 2시간 동안 반응시켜 추후 처리할 항체의 비특이적 결합을 방지하였다. PVDF 멤브레인 1차 항체: rabbit monoclonal anti-HOOK1, mouse monoclonal anti-PTPN6, mouse polyclonal anti-SERPINA5 와 18시간 동안 4℃에서 반응시켰다. 1차 항체와의 반응이 끝난 후 TBS-T 용액(Tris-buffered saline, Tween-20)을 이용하여 PVDF 멤브레인을 세척하고 2차 항체 (HRP-conjugated anti-rabbit antibody, HRP-conjugated anti-mouse antibody)와 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. ECL 용액을 이용하여 멤브레인 developing을 수행하였으며, LAS-4000 기계를 이용하여 시그널을 검출하였다.

2-1. 본원에 사용된 임상 시료

IPMN 악성도에 따라 발현 차이를 보이는 단백질 후보군 선정을 위해, 저등급 이형성증(N=3), 고등급 이형성증(N=3), 및 침윤성 암종(N=3) 각각에 해당하는 췌장 낭종액 시료 총 9개를 이용하여 Q-Exactive LC-MS/MS 분석을 수행하였다. 저등급 이형성증은 병리학적으로 가장 악성도가 낮은 양성 종양에 해당하고, 중간등급 이형성증의 경우 양성 또는 borderline(양성과 악성의 경계선상)이라고도 분류한다. 따라서, 저등급 이형성증이 대조군으로 보다 적합하기 때문에, 고등급 이형성증과 침윤성 암종의 대조군으로 채택하였다. IPMN 악성도에 따라 통계적으로 유의한 발현 차이를 보이는 18개의 단백질 중 3개에 대해 독립적인 19개의 시료를 이용하여 웨스턴 블로팅 방법으로 검증 실험을 수행하였다.

2-2. Q- Exactive LC-MS/MS ( DDA mode) 분석 및 protein search

IPMN 환자의 췌장 낭종액 시료 9개를 전처리 후에 Q-Exactive 질량분석기를 이용하여 In-depth proteome 분석을 수행하였으며, 모든 개별 시료는 3회 반복 분석을 수행하였다. 기기로 투입된 시료는 ACN gradient는 6%에서 60%로 증가시키면서 235분 동안 분획되었고, DDA mode로 top 20 precursor ion들을 product ion으로 fragmentation하였다. Orbitrap mass analyzer가 detection하는 m/z 범위는 350에서 1700으로 설정되었다. Q-Exactive 분석 후 나온 raw file들은 MaxQuant (version 1.5.5.1) 소프트웨어 프로그램을 이용하여 protein search 진행하였으며, Protein search 시 사용된 데이터베이스는 Uniprot human database (2014. 12, 88,717 entries)를 사용하였다.

2-3. 단백질 동정 및 정량

MaxQuant를 이용한 protein search 후, 개별시료 전체에서 동정된 단백질은 2,963개이며, 정량된 단백질은 2,837이었다. 9명의 개별환자 시료에서 각각 동정되었으며 정량된 단백질 개수가 상이했다. 동정되고 정량된 단백질 개수는 도 2에 나타낸 바와 같이 저등급 이형성증 환자 시료1에서 2,311개, 1,888개, 저등급 이형성증 환자 시료2에서 1,254개, 840개, 저등급 이형성증 환자 시료3에서 1,855개, 1,358개, 고등급 이형성증 환자 시료1에서 2,330개, 1940개, 고등급 이형성증 환자 시료2에서 2,336개, 1,781개, 고등급 이형성증 환자 시료3에서 1,387개, 906개, 침윤성 암종 환자 시료1에서 2,567개, 2,225개, 침윤성 암종 환자 시료2에서 1,788개, 1,353개, 침윤성 암종 환자 시료3에서 1,606개, 1,178개였다. 개별환자 시료 전체를 3번씩 반복 분석하여 LC-MS/MS 분석 진행한 결과, 동일한 시료에 대한 반복분석 결과가 재현성 있게 검출(Technical reproducibility)되었다. 개별환자 시료 각각의 technical replicates간 피어슨 상관계수값이 도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이 모두 0.900 이상으로 높은 재현성을 보였다.

2-4. 동정된 단백질에 대한 바이오인포매틱스 분석

SecretomeP, SignalP, TMHMM 서버를 이용한 시크리톰 분석 결과, 동정된 단백질의 60.5%(2992개의 단백질 중 1810개)가 세포에서 분비되는 단백질인 것으로 도출되었다. 이 결과는 췌장의 상피 세포로부터 분비된 단백질들이 췌장 낭종액의 대부분을 구성하고 있음을 시사하는 것이다. 도 5와 같이 SecretomeP를 통해 1,527개, SignalP를 통해 682개, 그리고 TMHMM를 통해 381개의 분비 단백질이 도출되었다. Human Protein Atlas database와 비교 분석을 진행하기 위해 protein accession number를 모두 gene name으로 변환해 주었으며, 총 2,886개의 gene name을 이용하여 분석을 진행하였다. Human Protein Atlas database에서 췌장에서 발현된다고 알려진 단백질과 mRNA를 본 연구에서 동정된 단백질과 비교 분석한 결과, 2,021개의 단백질이 일치하고, 2,613개의 mRNA가 일치하였다. 이는 본 연구에서 분석한 췌장 낭종액 시료에 포함된 단백질이 췌장 특이적인 단백질임을 보여주고 있으며, 췌장 낭종액 시료에서 발굴한 바이오마커가 IPMN의 악성도를 대표할 수 있는 유용한 마커가 될 가능성이 높음을 알 수 있다(도 6).

Ingenuity Pathway Analysis (IPA)분석을 통해 비교 그룹 1(저등급 이형성증과 고등급 이형성증)과 비교 그룹 3(저등급 이형성증과 침윤성 암종)에서 각각 통계적으로 유의한 발현 차이를 보이는 단백질들이 악성도와 관련된 생물학적 pathway term과 얼마나 연관성을 확인하였다. 도 7의 a, b, c 와 같이 비교 그룹 1의 단백질들 중 일부가 악성도와 관련된 term들에서 발현이 증가했으며, 비교 그룹 3의 단백질들은 거의 모든 악성도와 관련된 term들(angiogenesis, cell spreading, migration of cells, 등)에서 발현이 증가하였다. 또한 도 7 d와 같이 비교 그룹 1의 단백질보다 비교 그룹 3의 단백질이 췌장 관련 질병(alcoholic chronic pancreatitis, idiopathic chronic pancreatitis, pancreatic acinar cell carcinoma, 등)과 더 큰 연관성이 있음을 알 수 있었다. 이는 IPMN의 grade가 증가할수록 췌장 낭종액의 암의 악성화와 관련된 단백질의 발현양이 증가함을 나타내며, 이는 본 연구의 통계 분석을 통해 도출된 바이오마커가 실제 IPMN의 악성도와 관련되어 있어, IPMN의 악성도 검출 바이오마커로서 우수한 역할을 할 수 있는 것으로 판단된다.

2-5. 통계분석을 통한 IPMN 악성도에 따른 바이오 마커 후보군 선정

Perseus(version 1.5.8.5) 소프트웨어 프로그램을 이용하여 IPMN 그룹 간 발현 차이를 보이는 단백질을 도출해 내기 위한 통계분석을 수행하였다. 적어도 하나의 IPMN 그룹에서 6개 이상의 정량값을 가지는 1,751개 단백질들을 Student’s t-test 통계분석에 사용하였다. Benjamini-Hochberg FDR 값이 0.05 미만인 단백질을 그룹 간 유의한 차이가 있는 단백질로 선정하였다. 이 중 149개의 단백질들이 저등급 이형성증 그룹과 고등급 이형성증 그룹에서 통계적으로 유의한 발현 차이가 있었으며, 48개의 단백질이 고등급 이형성증 그룹과 침윤성 암종 그룹에서 통계적으로 유의한 발현 차이를 나타냈다. 또한, 98개의 단백질들이 저등급 이형성증 그룹과 침윤성 암종 그룹에서 통계적으로 유의한 발현 차이를 나타냈다. 통계적으로 유의한 발현 차이를 보이는 단백질들을 이용하여 Hierarchical cluster analysis (위계적 군집 분석)을 수행한 결과, 도 8과 같이 각 IPMN 그룹이 명확하게 나누어지는 것을 확인할 수 있었다.

도 9를 참조하면 저등급 이형성증 그룹과 고등급 이형성증 그룹에서 통계적으로 유의한 발현 차이를 보이는 149개 단백질들 중 75개는 고등급 이형성증 그룹에서 증가하는 단백질, 74개는 감소하는 단백질로 확인되었다. 고등급 이형성증 그룹과 침윤성 암종 그룹에서 통계적으로 유의한 발현 차이를 보이는 48개의 단백질들 중 32개는 침윤성 암종 그룹에서 증가하는 단백질, 16개는 감소하는 단백질로 확인되었다. 저등급 이형성증 그룹과 침윤성 암종 그룹에서 통계적으로 유의한 발현 차이를 보이는 98개 단백질들 중 64개는 치윤성 암종 그룹에서 증가하는 단백질, 34개는 감소하는 단백질로 확인되었다.

도 10 및 도 11과 같이 각 그룹 간 통계적으로 유의한 발현 차이를 보이는 전체 243개 단백질들 중, 49개의 단백질이 적어도 2개의 비교 그룹에서 발현 차이를 나타내는 단백질로 확인되었다.

49개의 단백질들 중, 최종적으로 도 12와 같이 18개의 단백질들이 IPMN 악성도에 따라 점차적으로 증가하거나 감소하는 단백질로 바이오 마커 후보군으로 적합한 것으로 나타났으며 7개의 단백질 (Protein HOOK homolog 1 (HOOK1), Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 6 (PTPN6), Mucin-2 (MUC2), Thymidine phosphorylase (TYMP), Talin-1 (TLN1), Nuclease-sensitive element-binding protein 1 (YBX1), Testis-expressed sequence 12 protein (TEX12))은 IPMN 악성도가 높아질수록 증가하는 패턴을 나타냈다. 나머지 11개의 단백질(Fibrillin-1 (FBN1), Claudin-18 (CLDN18), Plasma serine protease inhibitor (SERPINA5), Aldo-keto reductase family 1 member B10 (AKR1B10), WAP four-disulfide core domain protein 2 (WFDC2), Thy-1 membrane glycoprotein (THY1), Phosphoinositide-3-kinase-interacting protein 1 (PIK3IP1), Mucin-5AC (MUC5AC), Kallistatin (SERPINA4), Cystatin-M (CST6), Trefoil factor 1 (TFF1)) 은 IPMN 악성도가 높아질수록 감소하는 패턴을 보였다. 18개의 바이오마커 중 특히 Protein HOOK homolog 1 (HOOK1), Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 6 (PTPN6), Mucin-2 (MUC2), Thymidine phosphorylase (TYMP), Talin-1 (TLN1), Testis-expressed sequence 12 protein (TEX12), Plasma serine protease inhibitor (SERPINA5), Aldo-keto reductase family 1 member B10 (AKR1B10), 및 Trefoil factor 1 (TFF1)고위험군 IPMN 중에서도 고등급 이형성증과 침윤성 암종에서 발현 차이를 보이는 단백질들이었다. (* < p-value 0.05, ** < p-value 0.01, *** < p-value 0.001, **** < p-value 0.0001, INV: invasive IPMN).

2-6. 실제 개별 시료에 적용 ( 웨스턴 블로팅 시행 결과)

질량분석기 이외의 다른 플랫폼을 이용하여 단백질 정량 분석을 하였을 때도 동일한 결과를 얻기 위해 검증 실험을 수행하였다. 19개의 췌장 낭종액 시료(10개의 저등급 이형성증, 4개의 고등급 이형성증, 5개의 침윤성 암종)를 이용하여 18개의 바이오 마커 후보군 중 3개(Protein HOOK homolog 1 (HOOK1), Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 6 (PTPN6), Plasma serine protease inhibitor (SERPINA5))에 대해 웨스턴 블로팅을 수행하였다. Protein HOOK homolog 1 (HOOK1) 단백질의 웨스턴 블로팅 시행 결과, 도 13과 같이 저위험군 IPMN(저등급 이형성증)과 고위험군 IPMN(고등급 이형성증, 침윤성 암종) 사이에서 p-value 0.01의 유의한 발현 차이를 보이며 고위험 IPMN 그룹에서 발현이 증가하였다. 저등급 이형성증과 고등급 이형성증 사이에서 p-value 0.01의 유의한 발현 차이를 보이며 고등급 이형성증에서 발현이 증가하였다. 저등급 이형성증과 침윤성 암종 사이에서 p-value 0.01의 유의한 발현 차이를 보이며 침윤성 암종에서 발현이 증가하였다. 이는 LC-MS/MS 분석 결과와 일치하는 결과를 나타낸다. Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 6 (PTPN6) 단백질의 웨스턴 블로팅 시행 결과, 저위험군 IPMN과 고위험군 IPMN 사이에서 p-value 0.05의 유의한 발현 차이를 보이며 고위험 IPMN(고등급 이형성증, 침윤성 암종)에서 발현이 증가하였다. 또한 저등급 이형성증, 고등급 이형성증, 침윤성 암종 각각 그룹 간에도 점차적으로 발현이 증가하는 패턴을 보였다. 이는 LC-MS/MS 분석 결과와 일치하는 결과이다. Plasma serine protease inhibitor (SERPINA5) 단백질의 웨스턴 블로팅 시행 결과, 저위험군 IPMN(저등급 이형성증)과 고위험군 IPMN(고등급 이형성증, 침윤성 암종) 사이에서 뚜렷한 발현 차이를 보이며 고위험 IPMN에서 발현이 감소하였다. 또한 저등급 이형성증, 고등급 이형성증, 침윤성 암종 각각 그룹 간에도 점차적으로 발현이 감소하는 패턴을 보였다. 이는 LC-MS/MS 분석 결과와 일치하는 결과이다.

이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims

HOOK1 (Protein HOOK homolog 1), PTPN6 (Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 6), TYMP (Thymidine phosphorylase), TLN1(Talin-1), YBX1 (Nuclease-sensitive element-binding protein 1), TEX12 (Testis-expressed sequence 12 protein), FBN1 (Fibrillin-1), CLDN18 (Claudin-18), SERPINA5 (Plasma serine protease inhibitor), AKR1B10 (Aldo-keto reductase family 1 member B10), WFDC2 (WAP four-disulfide core domain protein 2), THY1 (Thy-1 membrane glycoprotein), PIK3IP1 (Phosphoinositide-3-kinase-interacting protein 1), MUC5AC (Mucin-5AC), SERPINA4 (Kallistatin), CST6 (Cystatin-M) 및 TFF1 (Trefoil factor 1)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상 마커의 검출용 물질을 포함하는, 췌관내유두상점액종양(IPMN)의 악성도 판별용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 악성도 판별은 저위험군 IPMN과 고위험군 IPMN을 구분하는 것이며,
상기 고위험군 IPMN은 고등급 이형성증 및 침윤성 암종을 포함하는 것인, 췌관내유두상점액종양의 악성도 판별용 조성물.
제 2 항에 있어서,
상기 마커는 고위험군 내에서 고등급 이형성증과 침윤성 암종을 구분하는 것이고,
상기 마커는 HOOK1, TYMP, TEX12, 및 AKR1B10으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커인, 췌관내유두상점액종양의 악성도 판별용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 검출용 물질은 상기 바이오마커를 단백질 또는 핵산 수준에서 검출할 수 있는 시약으로,
상기 단백질 수준 검출 시약은 웨스턴블랏, ELISA, 방사선면역분석, 면역확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 질량분석, MRM 분석 또는 단백질 마이크로어레이용 시약이고,
상기 핵산 수준 검출 시약은 중합효소연쇄반응, 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, 핵산 마이크로어레이 또는 노던블랏에 사용되는 시약인, 췌관내유두상점액종양의 악성도 판별용 조성물.
췌관내유두상점액종양의 악성도 판별에 필요한 정보를 제공하기 위해,
췌관내유두상점액종양의 악성도 판별이 필요한 대상체 유래의 췌장낭종액을 제공하는 단계;
상기 시료로부터 HOOK1 (Protein HOOK homolog 1), PTPN6 (Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 6), TYMP (Thymidine phosphorylase), TLN1 (Talin-1), YBX1 (Nuclease-sensitive element-binding protein 1), TEX12 (Testis-expressed sequence 12 protein), FBN1 (Fibrillin-1), CLDN18 (Claudin-18), SERPINA5 (Plasma serine protease inhibitor), AKR1B10 (Aldo-keto reductase family 1 member B10), WFDC2 (WAP four-disulfide core domain protein 2), THY1 (Thy-1 membrane glycoprotein), PIK3IP1 (Phosphoinositide-3-kinase-interacting protein 1), MUC5AC (Mucin-5AC), SERPINA4 (Kallistatin), 및 CST6 (Cystatin-M) 및 TFF1 (Trefoil factor 1) 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상 바이오마커를 정량하는 단계; 및
상기 정량 결과를 췌관내유두상점액종양의 악성도와 연관시키는 단계를 포함하는, 췌관내유두상점액종양의 악성도 판별을 위한 마커의 검출 방법.
제 5 항에 있어서,
상기 악성도 판별은 저위험군 IPMN과 고위험군 IPMN을 구분하는 것이며,
상기 고위험군 IPMN은 고등급 이형성증 및 침윤성 암종을 포함하는 것인, 췌관내유두상점액종양의 악성도 판별을 위한 마커의 검출 방법.
제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
상기 연관시키는 단계에서, 대조군과 비교하여 상기 HOOK1, PTPN6, TYMP, TLN1, YBX1 및 TEX12의 양은 증가하고, 상기 FBN1, CLDN18, SERPINA5, AKR1B10, WFDC2, THY1, PIK3IP1, MUC5AC, SERPINA4, CST6 및 TFF1은 양은 감소하는 경우, 상기 시료를 악성도가 높은 고위험군으로 판단하는 것인, 췌관내유두상점액종양의 악성도 판별을 위한 마커의 검출 방법.
제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
상기 악성도는 고등급 이형성증과 침윤성 암종을 구분하는 것으로,
상기 마커는 HOOK1, TYMP, TEX12 및 AKR1B10으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커이고,
상기 HOOK1, TYMP, 및 TEX12 마커는 고등급 이형성증과 비교하여 침윤성 암종에서 발현이 증가하고,
상기 AKR1B10 마커는 고등급 이형성증과 비교하여 침윤성 암종에서 발현이 감소하는 것인, 췌관내유두상점액종양의 악성도 판별을 위한 마커의 검출 방법.
삭제
제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
상기 연관시키는 단계는 비마커 임상 정보를 추가로 사용하는 것인, 췌관내유두상점액종양의 악성도 판별을 위한 마커의 검출 방법.
제 10 항에 있어서,
상기 비마커 임상정보는 조직검사 결과로, 위(Gastric), 장(Intestinal), 췌장담관(Pancreatobiliary), 또는 온코사이트(Oncocytic)인지를 포함하는 종양의 형태; 췌관형, 분지췌관형, 또는 혼합형을 포함하는 종양이 발생된 췌관 부위; 단일성 또는 다발성의 낭성 포칼러티(Cyst focality); 낭성 병변 내부의 벽결절의 유무 또는 낭성 병변을 포함하는 것인, 췌관내유두상점액종양의 악성도 판별을 위한 마커의 검출 방법.