KR102116178B1

KR102116178B1 - 간암 고위험군의 간암 발병 모니터링 또는 진단용 바이오마커 및 그 용도

Info

Publication number: KR102116178B1
Application number: KR1020180053027A
Authority: KR
Inventors: 김영수; 임영석; 김현수; 여인준
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2017-05-10
Filing date: 2018-05-09
Publication date: 2020-05-27
Also published as: WO2018208091A3; CN110914689A; WO2018208091A2; KR20180123978A; EP3623814A4; EP3623814A2

Abstract

본원은 간암 발병 고위험군 환자의 조기 간암 발병을 모니터링 또는 진단할 수 있는 바이오마커 및 상기 마커를 이용한 간암 발병 고위험군에서 조기 간암의 발병 여부를 모니터링, 검출 또는 진단하는 방법을 개시한다. 본원에 따른 바이오마커는 단순한 혈액 검사를 통해 간암 간염 및 간경화를 포함하는 간암 고위험군 환자에서 간암을 조기에 정확하게 진단할 수 있다.

Description

간암 고위험군의 간암 발병 모니터링 또는 진단용 바이오마커 및 그 용도 {Biomarker for monitoring or detecting early onset of liver cancer from patient having high risk of liver cancer and its use}

본원은 간암 발병 고위험군 환자로부터 간암 발병을 예측하는 기술에 관한 것이다.

간암은 전 세계에서 다섯 번째 흔한 암이며 암 관련 사망 중 3번째 주요 원인으로, 이중 간세포암(Hepatocellular carcinoma, HCC)이 원발(primary) 간암의 90% 이상을 차지한다(Ferrin, G.; Aguilar-Melero, P.; Rodriguez-Peralvarez, M.; Montero-Alvarez, J. L.; de la Mata, M. Hepatic medicine : evidence and research 2015, 7, 1-10).

비록 간세포암에 대한 연구가 계속되고 있고 그 증상이 잘 알려져 있지만, 상기 질병을 초기 단계에 진단하는 것은 여전히 어렵고 진단 후 생존율이 매우 낮다(Xiao, J. F. et al., Journal of proteome research 2012, 11, 5914-5923). 종양의 완전한 제거를 위해서는 수술치료가 필요하지만 수술이 가능한 경우도 10-20% 정도로 낮다.

간경화 또는 B형 간염 환자는 간암 발병 고위험군으로 명확히 분류되며, B형 간염의 경우 환자의 75%가 간경화를 거쳐 간암으로 발전하고 나머지 25%의 환자에서는 직접 간암으로 발전하는 것으로 알려져 있다. B형 간염 환자에서 간암이 발생될 위험성은 일반인에 비해 70~200배 높으며 연간 간암 발생률은 0.5~1%에 달하고 있다.

따라서 B형 간염이나 간경화가 심하지 않은 환자에서 환자 예후는 간암으로의 발전 가능성에 큰 영향을 주기 때문에 간암의 조기 발견은 간암을 예방하는데 있어서 매우 중요하다고 할 수 있다.

간암의 진단 방법으로는 초음파촬영, 전산화 단층촬영 및 자기공명영상과 같은 영상진단법이 유용하지만, 크기가 작은 종양의 검출이 어렵고 비용이 많이 드는 단점이 있다. 알파태아단백(alpha-fetoprotein, AFP)은 간암의 진단에 사용되어 온 단일 혈청 진단마커이지만, 민감도가 약 50-60%에 불과하고, 알코올간염, 바이러스간염 및 간경화와 같은 양성 간질환에서도 AFP의 양이 증가되어서 특이도가 40- 50%로 낮아 간암 조기 진단의 바이오마커로 사용하기에 부족하다.

특히 간경화에서 간암, 간염에서 간암으로 진행되는 경우, 즉 고위험군에서 간암으로 진행될 때, 진단되어야 하는 간암은 매우 초기이기 때문에, 기존의 진행된 간암의 검출에 사용되는 마커로는 간염에서 간암으로 진행되는 초기 간암을 구분하기가 어렵다. 초기 간암의 경우, 간암 고위험군 환자에게 정기 검사로 권장되는 초음파 검사의 민감도는 45%에 불과하다. 따라서 이러한 간암의 검출에 적합한 특이성과 민감도가 향상된 바이오마커의 지속적인 개발과 함께 여러 마커를 조합하여 진단의 정확성을 향상시킴으로써 단일 마커에 의한 개별검사의 한계를 극복할 필요가 있다. 뚜렷한 병리 생리학적 경로에서 여러 바이오마커를 결합하는 것은 이러한 단점을 극복하고 위험 계층화를 더욱 향상시킬 잠재력을 가지고 있으므로 다중마커 방식을 사용하여 위험 예측을 크게 향상시킬 수 있다.

대한민국 공개특허 제10-2016-0072027호(특허등록번호: 10-1788414)는 간암의 조기 진단, 예후 또는 치료 모니터링이 가능한 마커 또는 마커의 조합을 개시한다. 그러나 이는 정상인, 간경화 또는 간염 환자군과 진행성 간암 환자군과의 비교를 통한 간암 진단검사용 조성물에 관한 것으로 초기 간암 혹은 간암 고위험군에 감시 진단용으로 사용하기 어렵다. 또한, 대한민국 공개특허 제2015-0058465호는 간암으로 진행할 간경화 및 만성 간염을 가지는 피험체의 위험을 평가하는 방법을 개시한다.

본원은 간암 발병의 고위험군 환자의 간암 발병을 모니터링하고 조기 간암을 진단할 수 있는 바이오마커를 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 간암 고위험군의 간암 발병여부에 대한 모니터링 또는 간암을 조기 진단할 수 있는 바이오마커 및 그 용도를 제공한다.

본원에 따른 바이오마커는 상기 바이오마커를 혈액에서 검출할 수 있는 검출용 물질을 포함하는 조성물, 키트 또는 본원에 따른 바이오마커를 이용한 간암 발병여부에 대한 모니터링 방법 또는 간암조기 진단 방법, 또는 모니터링 또는 조기 진단을 위한 바이오마커의 검출 방법의 형태로 사용될 수 있다.

본원에 따른 마커가 사용되는 시료는 간암 고위험군 유래로, 간암 고위험군은 간염 및 간경화 환자를 포함한다.

본원에 따른 간암 고위험군의 간암 발병 모니터링 또는 간암 조기 진단용 마커는 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커이다: ORM1 (Alpha-1-acid glycoprotein 1), SERPINA1 (Alpha-1-antitrypsin), SERPINF2 (Alpha-2-antiplasmin), A2M (Alpha-2-macroglobulin), ALB (Serum albumin), SERPINC1 (Antithrombin-III), APOA1 (Apolipoprotein A-I), APOA4 (Apolipoprotein A-IV), APOB (Apolipoprotein B-100), APOC3 (Apolipoprotein C-III), APOC4 (Apolipoprotein C-IV), APOF (Apolipoprotein F), APOH (Beta-2-glycoprotein 1), APOL1 (Apolipoprotein L1), APOM (Apolipoprotein M), BCO2 (Beta,beta-carotene 9',10'-oxygenase), BTD (Biotinidase), C1RL (Complement C1r subcomponent-like protein), CDH1 (Cadherin-1), CA1 (Carbonic anhydrase 1), CA2 (Carbonic anhydrase 2), CAT (Catalase), CPB2 (Carboxypeptidase B2), CETP (Cholesteryl ester transfer protein), CFH (Complement factor H), C3 (Complement C3), C8B (Complement component C8 beta chain), C9 (Complement component C9), PPBP (Platelet basic protein), HSP90B1 (Endoplasmin), ENTPD5 (Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 5), ESYT1 (Extended synaptotagmin-1), F7 (Coagulation factor VII), F9 (Coagulation factor IX), FABP1 (Fatty acid-binding protein, liver), FCGBP (IgGFc-binding protein), FETUB (Fetuin-B), FGA (Fibrinogen alpha chain), FGB (Fibrinogen beta chain), RACK1 (Receptor of activated protein C kinase 1), GP5 (Platelet glycoprotein V), GSS (Glutathione synthetase), SERPIND1 (Heparin cofactor 2), ICAM1 (Intercellular adhesion molecule 1), IGHM (Immunoglobulin heavy constant mu), IL1RAP (Interleukin-1 receptor accessory protein), ITIH2 (Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H2), ITIH3 (Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H3), KNG1 (Kininogen-1), LMNB1 (Lamin-B1), MPO (Myeloperoxidase), PON1 (Serum paraoxonase/arylesterase 1), PRDX2 (Peroxiredoxin-2), PROC (Vitamin K-dependent protein C), PROS1 (Vitamin K-dependent protein S), PROZ (Vitamin K-dependent protein Z), PSMD1 (26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 1), PVR (Poliovirus receptor), RBP4 (Retinol-binding protein 4), S100A13 (Protein S100-A13), SAA4 (Serum amyloid A-4 protein), UBA2 (SUMO-activating enzyme subunit 2), SELENOP (Selenoprotein P), SPARC (SPARC), TF (Serotransferrin), THBS1 (Thrombospondin-1), UCHL3 (Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L3), VCAM1 (Vascular cell adhesion protein 1), HDLBP (Vigilin), VIM (Vimentin), AZGP1 (Zinc-alpha-2-glycoprotein) 및 SERPINA10 (Protein Z-dependent protease inhibitor).

일 구현예에서 상술한 마커는 LRG1 (Leucine-rich alpha-2-glycoprotein), IGFALS (Insulin-like growth factor-binding protein complex acid labile subunit), AMBP (Protein AMBP [Cleaved into: Alpha-1-microglobulin), BCHE (Cholinesterase), CLU (Clusterin), CNDP1 (Beta-Ala-His dipeptidase), C6 (Complement component C6), C7 (Complement component C7), FBLN1 (Fibulin-1), FCGR3A (Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A), FCN3 (Ficolin-3), AFP (Alpha-fetoprotein), FN1 (Fibronectin), IGFBP3 (Insulin-like growth factor-binding protein 3), IGF2 (Insulin-like growth factor II), JCHAIN (Immunoglobulin J chain), SERPINA5 (Plasma serine protease inhibitor), ITIH1 (Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1), SERPINA4 (Kallistatin), KLKB1 (Plasma kallikrein), LCAT (Phosphatidylcholine-sterol acyltransferase), LGALS3BP (Galectin-3-binding protein), LUM (Lumican), PLG (Plasminogen), QSOX1 (Sulfhydryl oxidase 1), SHBG (Sex hormone-binding globulin), F2 (Prothrombin), GC (Vitamin D-binding protein) 및 VTN (Vitronectin)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 추가로 포함할 수 있다.

일 구현예에서 특히 고위험군에서 간암 발병을 모니터링 또는 조기 진단할 수 있는 마커는 SERPINA1, ALB, APOB, APOC3, APOC4, APOL1, BTD, CDH1, CA1, CAT, CETP, C3, ESYT1, FCGBP, FETUB, FGA, GP5, GSS, SERPIND1, IL1RAP, ITIH2, LMNB1 MPO, PON1, PRDX2, PVR, SAA4, UBA2, SELENOP, TF, THBS1, UCHL3, HDLBP, AZGP1 및 SERPINA10로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커이다.

일 구현예에서 상기 고위험군에서 간암 발병을 모니터링 또는 조기 진단할 수 있는 마커는 LRG1, C7, AFP, JCHAIN, SERPINA5, SERPINA4, LGALS3BP, LUM, QSOX1, SHBG, F2, 및 VTN로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 추가로 포함할 수 있다.

일 구현예에서 특히 간암 고위험군은 간염 환자이며, 상기 간염 환자의 간암 발병을 모니터링 또는 조기 진단할 수 있는 마커는 ORM1, A2M, ALB, SERPINC1, APOA1, APOA4, APOB, APOC3, APOC4, APOF, APOL1, APOH, APOM, BCO2, CDH1, CPB2, CA1, CA2, CAT, CETP, C8B, PPBP, F9, FABP1, ENTPD5, F7, FCGBP, FETUB, FGA, RACK1, GP5, SERPIND1, ICAM1, IGF2, IL1RAP, ITIH2, ITIH3, KNG1, PON1, PROC, PROS1, PROZ, PSMD1, RBP4, S100A13, SAA4, SELENOP, SPARC, THBS1, VCAM1, VIM 및 SERPINA10으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커이다.

일 구현예에서 상기 간염 환자의 간암 발병을 모니터링 또는 조기 진단할 수 있는 마커는 IGFALS, BCHE, CLU, CNDP1, C7, FCGR3A, FCN3, AFP, IGFBP3, ITIH1, SERPINA4, KLKB1, LCAT, LGALS3BP, PLG, QSOX1, SHBG, F2, GC 및 VTN로 구성되는 군으로 선택되는 하나 이상의 마커를 추가로 포함할 수 있다.

일 구현예에서 특히 간암 고위험군은 간경화 환자이며, 상기 간경화 환자의 간암 발병을 모니터링 또는 조기 진단할 수 있는 마커는 SERPINF2, APOA4, APOB, APOL1, APOM, BCO2, C1RL, CA2, CAT, CETP, CFH, C9, PPBP, HSP90B1, F9, FABP1, FGA, FGB, GSS, SERPIND1, IGHM, ITIH2, MPO, PON1, RBP4, SELENOP, UCHL3, HDLBP, AZGP1 및 SERPINA10으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커이다.

일 구현예에서 상기 간경화 환자의 간암 발병을 모니터링 또는 조기 진단할 수 있는 마커는 AMBP, BCHE, CLU, C6, C7, FBLN1, AFP, FN1, SERPINA5, SERPINA4, LUM, QSOX1, SHBG, 및 F2로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 추가로 포함할 수 있다.

일 구현예에서 본원에 따른 마커는 두 개 이상 마커의 조합으로 사용되며, 특히 고위험군에서 간암 발병을 모니터링 또는 조기 진단할 수 있는 마커의 조합은 ALB, APOB, APOL1, BTD, CDH1, CAT, CETP, ESYT1, AFP, FGA, GP5, GSS, SERPINA5, ITIH2, ITIH2, ERPINA4, LUM, MPO, PON1, PVR, SAA4, 및 SERPINA10; APOB, CAT, CETP, C7, AFP, FETUB, FGA, GP5, SERPIND1, SERPINA5, ITIH2, SERPINA4, LGALS3BP, MPO, QSOX1, SHBG, TF, VTN, AZGP1, 및 SERPINA10; LRG1, APOC3, CETP, AFP, SERPINA5, TF, 및 SERPINA10; APOC4, AFP, SERPINA5, LMNB1, MPO, PVR, 및 SERPINA10; SERPINA1, APOB, CAT, CETP, AFP, FETUB, FGA, GSS, SERPINA5, ITIH2, SERPINA4, UBA2, SHBG, F2, THBS1, THBS1, 및 SERPINA10; CETP, C7, AFP, IL1RAP, SERPINA5, LGALS3BP, MPO, HDLBP, 및 SERPINA10; ALB, APOB, CA1, CETP, C3, FCGBP, AFP, FETUB, FGA, JCHAIN, SERPINA5, ITIH2, SERPINA4, PRDX2, SELENOP, SHBG, THBS1, UCHL3, 및 SERPINA10; 또는 ALB, APOB, CA1, CETP, AFP, FETUB, SERPINA5, ITIH2, SERPINA4, MPO, F2, THBS1, 및 SERPINA10, 더욱 특히, 두 개 이상 마커의 조합은 APOB, CAT, CETP, C7, AFP, FETUB, FGA, GP5, SERPIND1, SERPINA5, ITIH2, SERPINA4, LGALS3BP, MPO, QSOX1, SHBG, TF, VTN, AZGP1 및 SERPINA10; 또는 ALB, APOB, CA1, CETP, C3, FCGBP, AFP, FETUB, FGA, JCHAIN, SERPINA5, ITIH2, SERPINA4, PRDX2, SELENOP, SHBG, THBS1, UCHL3, 및 SERPINA10 이다.

일 구현예에서 본원에 따른 마커는 두 개 이상 마커의 조합으로 사용되며, 특히 고위험군에 속하는 간염 환자에서 간암 발병을 모니터링 또는 조기 진단할 수 있는 마커의 조합은 IGFALS, APOA4, C7, PPBP, F9, FABP1, FCGBP, AFP, ITIH1, SERPINA4, 및 SERPINA10; IGFALS, APOB, APOC3, PPBP, FABP1, FCGBP, AFP, ITIH1, SERPINA4, PROS1, 및 SERPINA10; ALB, IGFALS, CETP, C7, PPBP, FABP1, AFP, IL1RAP, ITIH1, ITIH2, SERPINA4, S100A13, 및 SERPINA10; ALB, APOB, BCO2, CDH1, CA1, BCHE, C7, PPBP, FABP1, FCGBP, AFP, FETUB, ITIH1, SERPINA4, KNG1, LGALS3BP, PSMD1, VCAM1, 및 SERPINA10; IGFALS, CA2, CETP, C7, PPBP, FABP1, FCGBP, FCN3, AFP, FGA, ITIH1, SERPINA4, 및 SERPINA10; IGFALS, SERPINC1, APOA1, CAT, C7, PPBP, F9, FCGBP, AFP, FGA, ITIH2, SERPINA4, PROZ, QSOX1, 및 SERPINA10; APOB, APOC4, APOH, CDH1, PPBP, FABP1, AFP, FETUB, SERPINA4, 및 SERPINA10; 또는 APOB, APOC4, APOH, APOM, CAT, PPBP, FABP1, AFP, FETUB, ITIH1, SERPINA4, 및 SERPINA10, 더욱 특히 두 개 이상 마커의 조합은 IGFALS, APOB, APOC3, PPBP, FABP1, FCGBP, AFP, ITIH1, SERPINA4, PROS1, 및 SERPINA10; 또는 ALB, APOB, BCO2, CDH1, CA1, BCHE, C7, PPBP, FABP1, FCGBP, AFP, FETUB, ITIH1, SERPINA4, KNG1, LGALS3BP, PSMD1, VCAM1, 및 SERPINA10이다.

일 구현예에서 본원에 따른 마커는 두 개 이상 마커의 조합으로 사용되며, 특히 고위험군에 속하는 간경화 환자에서 간암 발병을 모니터링 또는 조기 진단할 수 있는 마커의 조합은 APOB, APOL1, CAT, CETP, C7, FABP1, AFP, FGA, FN1, IGHM, SERPINA5, ITIH2, SERPINA4, PON1, PON1, 및 SERPINA10; BCO2, CAT, CETP, CFH, BCHE, AFP, FGA, SERPINA5, SELENOP, UCHL3, AZGP1, 및 SERPINA10; AMBP, APOB, APOM, C1RL, CAT, CETP, CLU, PPBP, HSP90B1, F9, FGA, GSS, SERPINA5, SERPINA4, RBP4, HDLBP, AZGP1, 및 SERPINA10; APOA4, APOB, C1RL, CETP, AFP, FGB, SERPIND1, SERPINA5, SERPINA4, LUM, QSOX1, SHBG, 및 SERPINA10; APOA4, APOB, APOL1, CETP, C9, FBLN1, AFP, FGA, SERPINA5, ITIH2, 및 SERPINA10; SERPINF2, APOB, CETP, FBLN1, AFP, FGA, SERPINA5, RBP4, HDLBP, 및 SERPINA10; APOB, CETP, AFP, FGA, SERPINA5, SERPINA4, F2, 및 SERPINA10; 또는 APOA4, APOB, APOL1, CA2, CETP, CLU, C6, AFP, FGA, SERPINA5, ITIH2, SERPINA4, AZGP1, 및 SERPINA10, 더욱 특히 두 개 이상 마커이 조합은 BCO2, CAT, CETP, CFH, BCHE, AFP, FGA, SERPINA5, SELENOP, UCHL3, AZGP1, 및 SERPINA10; 또는 APOA4, APOB, C1RL, CETP, AFP, FGB, SERPIND1, SERPINA5, SERPINA4, LUM, QSOX1, SHBG, 및 SERPINA10 이다.

본원에 따른 마커는 혈액에서 검출되며, 혈액은 혈장, 혈청 또는 전혈, 특히 혈청이다.

본원에 따른 바이오마커는 ELISA 분석용, 딥스틱 래피드 키트(dip stick rapid kit) 분석용, MRM 분석용, 마이크로어레이용, 핵산증폭용, 또는 면역분석용의 조성물 또는 키트로 제공될 수 있다.

일 구현예에서 본원에 따른 바이오마커는 특히 MRM 분석용 조성물 또는 키트로 제공되며, 상기 MRM 분석에 사용되는 각 마커의 펩타이드는 표 1-1, 1-2 및 1-3에 기재된 것일 수 있다.

다른 양태에서 본원은 또한 간암 고위험군의 간암 발병 여부를 모니터링 또는 간암을 조기에 진단하기 위해, 상술한 모든 마커 또는 마커의 조합을 검출하는 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서 본원에 따른 방법은 간암 고위험군의 간암 발병 여부를 모니터링 또는 간암을 조기에 진단하는 방법으로, 상기 방법은 상술한 것을 포함하여 본원에 개시된 모든 마커 또는 마커의 조합 검출 또는 정량 결과를 대조군 시료의 해당 마커의 상응하는 결과와 비교하는 단계; 및 상기 대조군 시료와 비교하여, 상기 대상체 시료의 단백질 검출 또는 정량 결과가 변화된 경우, 상기 시료를 조기 간암으로 판정하는 단계를 포함한다.

본원에 따른 바이오마커는 ELISA 분석, 딥스틱 래피드 키트(dip stick rapid kit) 분석, MRM 분석, 마이크로어레이, 핵산증폭, 또는 면역분석 등의 방법으로 수행될 수 있다.

일 구현예에서 본원에 따른 바이오마커는 특히 MRM 분석으로 수행되며, MRM 분석에 사용되는 각 마커의 펩타이드는 표 1-1, 1-2 및 1-3에 기재된 것일 수 있다.

본원에 따른 마커 및 이를 이용한 방법은 간암 고위험군 환자(B형 간염, 간경화)의 간암으로의 발전 위험도 또는 간암을 조기에 정확하게 진단할 수 있다. 특히 현재 간암 고위험군 B형 간염 환자와 간경화 환자의 간암 조기진단을 위한 임상의 가이드라인은 6개월마다 내원하여 초음파 검사와 AFP 검사를 받는 것이다. 하지만 초음파 검사는 전문의가 필요하고 그 숙련도에 따라 진단 정도가 편차가 심하다. 따라서 본원에 따른 마커를 사용하는 경우, 간염 및 간경화를 포함하는 간암 고위험군 환자에서 마커 또는 마커의 조합과 마커들의 발현 상태를 검출하여 극초기를 포함한 조기 간암의 발병을 모니터링하고 조기 진단할 수 있다.

또한 질량분석기반의 MRM(Multiple Reaction Monitoring)을 이용할 경우, 기존 병원 임상 영역에서의 면역분석 방법 대신에 펩타이드를 MRM으로 검사하는 방법으로 실용화가 용이하며, 또한 기존의 간암 마커와 함께 분석할 수 있어 기존의 간암 진단 특히 조기 간암의 진단의 정확성을 현저하게 개선할 수 있다.

또한, 본원에 따른 마커는 혈액을 이용한 비침습성 진단 방식으로 가정 및 일반 의원에서의 조기 발견에 매우 유용하다. 대상 환자의 고통과 경제적 부담을 경감해주며, 나아가 건강 검진 시 단순한 혈액 검사를 통해 간암을 검출할 수 있어 국가적인 관점에서 의료 비용의 절감 효과를 가지고 올 수 있다.

도 1a, 도 1b, 도 1c, 도 1d, 도 1e, 도 1f, 도 1g 및 도 1h는 대조군과 비교하여 발현 차이를 보이는 본원에 따른 마커(표 1-1, 1-2 및 표 1-3 참조)의 ROC (Receiver Operating Characteristic)(Zweig MH, Campbell G (1993) Receiver-operating characteristic (ROC) plots: a fundamental evaluation tool in clinical medicine. Clinical Chemistry 39:561-577) 분석결과이다. ROC 곡선 분석은 특정 마커/특징의 진단과 증후에 대한 의사결정을 위해 사용된다. ROC 곡선 분석에서는 민감도(sensitivity)와 특이도(specificity)를 기준으로 모형을 평가하며, ROC 곡선 분석에서 산출된 민감도와 특이도 결과의 효과 정도를 나타내는 ROC 커브의 면적인 AUC(Area under curve)로 진단적 정확성을 확인할 수 있다. 상기 결과는 본원에 따른 마커가 진단적 정확성을 나타낸다.
도 2는 본원의 일 실시예에 따른 다변수분석 전략을 도식적으로 나타낸 것이다. 본원에서는 로지스틱 회귀분석(logistic regression)과 서포트 벡터 머신(support vector machine)의 두 개의 분석 방법을 사용하였다. 과적합(Overfitting)을 방지하기 위하여 재표본추출법(Resampling)을 사용하여 분석 결과에 대한 통계적 신뢰도를 확보하였다. 재표본추출법에서는 5-배와 10-배로 교차 검증(cross validation)(Kim H. et al., Sci Rep. 2017 Aug 25;7(1):9449 및 Kim H. et al., Mol Cell Proteomics. 2017 Jul;16(7):1312-1323)을 사용하였다. 또한 부트스트랩(bootsrap) 방법에서는 0.7과 0.9의 비율(ratio)로 데이터를 등분하여 이용하였다(Meyers RL et. al., Lancet Oncol. 2017 Jan; 18(1)).
도 3은 MRM 분석의 모식도이다.

본원은 간암 발병 고위험군으로 분류되는 B형간염 환자와 간경화 환자로부터 유래된 혈액시료를 간암 환자 특히 극초기 간암조직(직경 5cm 미만)과 비교하여 차별적 발현을 나타내는, 간암을 조기에 진단할 수 있는 마커의 발견에 근거한 것이다.

이에 한 양태에서 본원은 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상 마커, 또는 상기 마커를 혈액에서 검출할 수 있는 검출용 물질을 포함하는, 간암 고위험군의 간암 조기 진단용 조성물에 관한 것이다.

본원에 따른 하나 이상의 마커는 ORM1 (Alpha-1-acid glycoprotein 1), SERPINA1 (Alpha-1-antitrypsin), SERPINF2 (Alpha-2-antiplasmin), A2M (Alpha-2-macroglobulin), ALB (Serum albumin), SERPINC1 (Antithrombin-III), APOA1 (Apolipoprotein A-I), APOA4 (Apolipoprotein A-IV), APOB (Apolipoprotein B-100), APOC3 (Apolipoprotein C-III), APOC4 (Apolipoprotein C-IV), APOF (Apolipoprotein F), APOH (Beta-2-glycoprotein 1), APOL1 (Apolipoprotein L1), APOM (Apolipoprotein M), BCO2 (Beta,beta-carotene 9',10'-oxygenase), BTD (Biotinidase), C1RL (Complement C1r subcomponent-like protein), CDH1 (Cadherin-1), CA1 (Carbonic anhydrase 1), CA2 (Carbonic anhydrase 2), CAT (Catalase), CPB2 (Carboxypeptidase B2), CETP (Cholesteryl ester transfer protein), CFH (Complement factor H), C3 (Complement C3), C8B (Complement component C8 beta chain), C9 (Complement component C9), PPBP (Platelet basic protein), HSP90B1 (Endoplasmin), ENTPD5 (Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 5), ESYT1 (Extended synaptotagmin-1), F7 (Coagulation factor VII), F9 (Coagulation factor IX), FABP1 (Fatty acid-binding protein, liver), FCGBP (IgGFc-binding protein), FETUB (Fetuin-B), FGA (Fibrinogen alpha chain), FGB (Fibrinogen beta chain), RACK1 (Receptor of activated protein C kinase 1), GP5 (Platelet glycoprotein V), GSS (Glutathione synthetase), SERPIND1 (Heparin cofactor 2), ICAM1 (Intercellular adhesion molecule 1), IGHM (Immunoglobulin heavy constant mu), IL1RAP (Interleukin-1 receptor accessory protein), ITIH2 (Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H2), ITIH3 (Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H3), KNG1 (Kininogen-1), LMNB1 (Lamin-B1), MPO (Myeloperoxidase), PON1 (Serum paraoxonase/arylesterase 1), PRDX2 (Peroxiredoxin-2), PROC (Vitamin K-dependent protein C), PROS1 (Vitamin K-dependent protein S), PROZ (Vitamin K-dependent protein Z), PSMD1 (26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 1), PVR (Poliovirus receptor), RBP4 (Retinol-binding protein 4), S100A13 (Protein S100-A13), SAA4 (Serum amyloid A-4 protein), UBA2 (SUMO-activating enzyme subunit 2), SELENOP (Selenoprotein P), SPARC (SPARC), TF (Serotransferrin), THBS1 (Thrombospondin-1), UCHL3 (Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L3), VCAM1 (Vascular cell adhesion protein 1), HDLBP (Vigilin), VIM (Vimentin), AZGP1 (Zinc-alpha-2-glycoprotein) 및 SERPINA10 (Protein Z-dependent protease inhibitor), LRG1 (Leucine-rich alpha-2-glycoprotein), IGFALS (Insulin-like growth factor-binding protein complex acid labile subunit), AMBP (Protein AMBP [Cleaved into: Alpha-1-microglobulin), BCHE (Cholinesterase), CLU (Clusterin), CNDP1 (Beta-Ala-His dipeptidase), C6 (Complement component C6), C7 (Complement component C7), FBLN1 (Fibulin-1), FCGR3A (Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A), FCN3 (Ficolin-3), AFP (Alpha-fetoprotein), FN1 (Fibronectin), IGFBP3 (Insulin-like growth factor-binding protein 3), IGF2 (Insulin-like growth factor II), JCHAIN (Immunoglobulin J chain), SERPINA5 (Plasma serine protease inhibitor), ITIH1 (Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1), SERPINA4 (Kallistatin), KLKB1 (Plasma kallikrein), LCAT (Phosphatidylcholine-sterol acyltransferase), LGALS3BP (Galectin-3-binding protein), LUM (Lumican), PLG (Plasminogen), QSOX1 (Sulfhydryl oxidase 1), SHBG (Sex hormone-binding globulin), F2 (Prothrombin), GC (Vitamin D-binding protein) 및 VTN (Vitronectin)으로 구성되는 군으로부터 선택된다.

일 구현예에서 상기 마커는 ORM1, SERPINA1, SERPINF2, A2M, ALB, SERPINC1, APOA1, APOA4, APOB, APOC3, APOC4, APOF, APOH, APOL1, APOM, BCO2, BTD, C1RL, CDH1, CA1, CA2, CAT, CPB2, CETP, CFH, C3 (Complement C3), C8B, C9, PPBP, HSP90B1, ENTPD5, ESYT1, F7, F9, FABP1, FCGBP, FETUB, FGA, FGB, RACK1, GP5, GSS, SERPIND1, ICAM1, IGHM, IL1RAP, ITIH2, ITIH3, KNG1, LMNB1, MPO, PON1, PRDX2, PROC, PROS1, PROZ, PSMD1, PVR, RBP4, S100A13, SAA4, UBA2, SELENOP, SPARC, TF, THBS1, UCHL3, VCAM1, HDLBP, VIM, AZGP1 및 SERPINA10로 구성되는 군으로부터 선택된다. 다른 구현예에서 상기 마커는 LRG1, IGFALS, AMBP, BCHE, CLU, CNDP1, C6, C7, FBLN1, FCGR3A, FCN3, AFP, FN1, IGFBP3, IGF2, JCHAIN, SERPINA5, ITIH1, SERPINA4, KLKB1, LCAT, LGALS3BP, LUM, PLG, QSOX1, SHBG, F2, GC 및 VTN로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 추가로 포함할 수 있다.

본원의 바이오마커 또는 마커는 간암 발병 고위험군 환자가 간암으로 이행되었는지를 조기에 발견할 수 있는 마커로, 대조군 검체에 비하여 간암이 발생한 환자 유래의 시료 특히 혈액에서의 농도 변화를 나타내는 단백질, 상기 단백질 유래의 폴리펩타이드, 상기 단백질을 코딩하는 유전자 또는 그 단편을 포함한다.

본원에 따른 바이오마커는 대조군의 시료와 비교하여 간암 환자의 혈액에서 그 양이 증가 또는 감소한 것으로, 그 서열은 예를 들면 표 1-1, 표 1-2 및 표 1-3에 기재된 ID로 UniProt DB (www.uniprot.org)에서 검색가능하다.

[표 1-1]

[표 1-2]

[표 1-3]

본원에 따른 마커는 간암 고위험군의 간암 조기 진단에 유용하다.

간암은 간세포가 지속적인 다양한 자극에 의해 자신의 고유 기능을 상실하고 암세포로 변신하여 끊임없는 자기 증식을 이루면서 주변 또는 먼 곳으로 퍼져 나가는 특징을 갖게 되는 종양을 말하며, 원발성 종양과 간에서 발생하여 다른 장기로 이전된 전이암이 있다. 원발성 간암은 간세포의 이상으로 발생하는 간세포암과 담관세포의 이상으로 발생하는 담관암, 맥관육종을 포함하며, 90% 이상이 간세포암(Hepatocellular carcinoma, HCC)이다.

본원에 따른 일 구현예에서 간암은 조직 자체에서 발생하는 원발성 악성 종양이며, 간세포암이다. 간세포암은 알콜 남용, 바이러스성 간염 및 간경변 또는 간경화를 포함하는 대사성 간질환과 같은 위험인자를 갖는 고위험군 환자에서 빈발한다. 간세포암은 섬유성 스트로마가 없어 출혈과 세포괴사가 발생하며, 간문맥 시스템으로의 혈관침윤이 일어나며, 심한 경우 간파열 및 복강내혈액삼출로 이어질 수 있다.

본원에서 간암 발병 고위험군은 B형 간염 바이러스성 간염을 포함하는 간염, 간경변 및 간경화를 포함하는 간질환이 발병한 환자이다. 이러한 환자는 간암 발병 빈도가 높아 의학계에서 간암 발병 고위험 환자군으로 분류된다.

간암 발병 고위험군에서 간암으로 이행되는 과정을 진단하는 선별 검사와 감시 검사가 조기 진단 및 효과적인 치료를 위한 핵심이며 본원은 이러한 효과에 최적의 마커 및 마커의 용도를 제공한다.

간염은 특히 B형 간염 바이러스 감염에 의한 감염으로 나타나는 전염성 질병으로 특히 만성 간염이다. B형 간염 바이러스에 의한 만성 간염은 간경화증 또는 간암으로 발전할 수 있으며, 또한 B형 간염에서 간암으로 발전할 수도 있다.

간경화증은 간에서 발생 된 만성 염증으로, 간조직이 재생결절화되고 섬유화되어 결국 간세포 손상, 반흔, 간기능 감소, 복수, 출열성 질환, 간성 혼수 증상을 나타내는 질환이다. 간경화 환자에서 90% 정도가 간암으로 진단되기 때문에 특히 고위험군에서 간암의 조기 진단이 중요하다.

본원에 따른 마커는 간암 발병 고위험군에서 간암을 조기에 진단할 수 있다. 간암의 진행 단계(grade)에 따른 구분은 당업계에 공지된 것으로 예를 들면 암분화도에 따른 조직학적 그레이딩 방법(histological grade of tumor differentiation)인 에드몬슨 슈타이너 그레이딩 시스템(EdmondsonSteiner grading system)(Pirisi M et al., Arch Pathol Lab Med. 2010 Dec;134(12):1818-22)을 참조할 수 있다. 또한 American Joint Committee on Cancer (AJCC) TNM Staging for Liver Tumors (7th ed., 2010)나 Liver Cancer Study Group of Japan (LCSGJ)-T의 최근판 HCC TNM(Tumor node metastasis) staging을 참고할 수도 있다.

이에 따르면 간세포암은 진행단계에 따라 1 내지 4단계로 구분되는데, 본원에 따른 마커는 1기 또는 전암(前癌) 단계를 검출할 수 있다. 또 다른 구현예에서 조기 진단은 극초기, 특히 간암세포 조직 5cm 미만의 간암을 조기에 진단하는 것이다.

전암(前癌)은 암으로 변하기 직전의 상태(premalignant condition or condition with malignant potential)이다. 이는 암이 발생하기 직전, 또는 극초기 상태로서, 이 단계에서 암의 검출은 치료율과 생존율을 획기적으로 향상시킬 수 있다.

암의 진단 및 병기는 상술한 바와 같이 일반적으로 수술이나 생검으로 획득한 조직을 조직검사를 통해 암 세포의 종류와 분화도, 전이 정도 등에 따라 암종의 진행 병기를 결정한다. 즉 일반적인 고형암은 치료 및 예후가 TNM 병기에 의해 결정된다.

반면 간암의 경우, TNM 병기만으로 치료방법을 선택하거나 예후를 예측하기 어려울 수 있다. 이는 대부분의 간암환자에서 만성 간질환이 병발되어 암과는 별개의 진행된 간질환만으로도 치료방법 선택에 제한이 있기 때문이다. 또한 간암은 다른 암종과 달리 영상 검사만으로도 진단할 수 있다. 현재 간암 고위험군 B형 간염 환자와 간경화 환자의 간암 조기진단을 위한 임상의 가이드라인은 6개월마다 내원하여 초음파 검사와 AFP 검사를 받는 것이다. 하지만 초음파 검사는 전문의가 필요하고 그 숙련도에 따라 진단 정도가 편차가 심하다.

따라서 본원에 따른 마커를 사용하는 경우, 간염 및 간경화를 포함하는 간암 고위험군 환자에서 마커 또는 마커의 조합과 마커들의 발현 상태를 검출하여 극초기를 포함한 조기 간암의 발병을 모니터링하고 조기 진단할 수 있다.

본원에 따른 일 구현예에서 본원에 따른 마커 또는 마커의 조합은 본원의 실시예에 기재된 바와 같이 일차, 이차 시료군 그리고 삼차 시료군 모두에서 높은 AUC 값으로 차별적 발현을 나타낸 것이나, 이로 제한하는 것은 아니다.

일 구현예에서 본원에 따른 마커로서, 특히 고위험군의 간암을 조기에 진단할 수 있는 마커는 SERPINA1, ALB, APOB, APOC3, APOC4, APOL1, BTD, CDH1, CA1, CAT, CETP, C3, ESYT1, FCGBP, FETUB, FGA, GP5, GSS, SERPIND1, IL1RAP, ITIH2, LMNB1 MPO, PON1, PRDX2, PVR, SAA4, UBA2, SELENOP, TF, THBS1, UCHL3, HDLBP, AZGP1 및 SERPINA10로 구성되는 군으로부터 선택된다. 상기 마커는 LRG1, C7, AFP, JCHAIN, SERPINA5, SERPINA4, LGALS3BP, LUM, QSOX1, SHBG, F2, 및 VTN으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 추가로 포함할 수 있다.

또한 본원에 따른 마커는 간암 고위험군 중 간염 환자에서 간암을 조기 진단할 수 있다. 일 구현예에서 이러한 마커는 ORM1, A2M, ALB, SERPINC1, APOA1, APOA4, APOB, APOC3, APOC4, APOF, APOL1, APOH, APOM, BCO2, CDH1, CPB2, CA1, CA2, CAT, CETP, C8B, PPBP, F9, FABP1, ENTPD5, F7, FCGBP, FETUB, FGA, RACK1, GP5, SERPIND1, ICAM1, IGF2, IL1RAP, ITIH2, ITIH3, KNG1, PON1, PROC, PROS1, PROZ, PSMD1, RBP4, S100A13, SAA4, SELENOP, SPARC, THBS1, VCAM1, VIM 및 SERPINA10으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 상기 마커는 IGFALS, BCHE, CLU, CNDP1, C7, FCGR3A, FCN3, AFP, IGFBP3, ITIH1, SERPINA4, KLKB1, LCAT, LGALS3BP, PLG, QSOX1, SHBG, F2, GC 및 VTN 로 구성되는 군으로 선택되는 하나 이상의 마커를 추가로 포함할 수 있다.

나아가 본원에 따른 마커는 간암 고위험군 중 간경화 환자에서 간암을 조기 진단할 수 있다. 일 구현예에서 이러한 마커는 SERPINF2, APOA4, APOB, APOL1, APOM, BCO2, C1RL, CA2, CAT, CETP, CFH, C9, PPBP, HSP90B1, F9, FABP1, FGA, FGB, GSS, SERPIND1, IGHM, ITIH2, MPO, PON1, QSOX1, RBP4, SELENOP, UCHL3, HDLBP, AZGP1 및 SERPINA10로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커이다. 상기 마커는 AMBP, BCHE, CLU, C6, C7, FBLN1, AFP, FN1, SERPINA5, SERPINA4, LUM, SHBG, 및 F2로 구성되는 군으로 선택되는 하나 이상의 마커를 추가로 포함할 수 있다.

본원에 따른 마커는 하나 또는 두 개 이상의 조합, 예를 들면 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60. 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100개의 조합 또는 선택적으로 기존의 마커와 조합하여 그 이상의 조합으로 사용될 수 있다. 또한 기존 마커 및/또는 진단방법 예를 들면 간초음파 등과 함께 사용될 수 있다. 당업자라면 본원 실시예에 기재된 방법 등을 참조로 Logistic regression 분석 및/또는 Support Vector Machine과 같은 방법을 통해 목적하는 민감도 및 특이성을 만족하는 마커의 조합을 선별할 수 있을 것이다.

일 구현예에서 간암 고위험군(HBV+LC)과 간암을 비교하여 SERPINA1, LRG1, ALB, APOB, APOC3, APOC4, APOL1, BTD, CDH1, CA1, CAT, CETP, C3, C7, ESYT1, FCGBP, AFP, FETUB, FGA, GP5, GSS, SERPIND1, JCHAIN, IL1RAP, SERPINA5, ITIH2, SERPINA4, LGALS3BP, LMNB1, LUM, MPO, PON1, PRDX2, PVR, QSOX1, SAA4, UBA2, SELENOP, SHBG, F2, TF, THBS1, UCHL3, HDLBP, VTN, AZGP1, 및 SERPINA10의 마커가 다양하게 조합될 수 있다. 일예로 마커의 조합은 AUC=0.990인 높은 진단력을 확인하였고, 별개의 독립 데이터에서 AUC=0.881로 우수한 진단력을 나타낸다.

다른 구현예에서 간암 고위험군(HBV+LC)과 간암을 비교하여 ALB, APOB, CA1, CAT, CETP, C3, C7, FCGBP, AFP, FETUB, FGA, GP5, SERPIND1, JCHAIN, SERPINA5, ITIH2, SERPINA4, LGALS3BP, MPO, PRDX2, QSOX1, SELENOP, SHBG, TF, THBS1, UCHL3, VTN, AZGP1, 및 SERPINA10의 마커가 조합될 수 있다. 일 예로 이들 마커의 조합은 AUC=0.97의 높은 진단력을 확인하였고, 별개의 독립 데이터(validation set) 에서도 AUC=0.928로 우수한 진단력을 나타낸다.

일 구현예에서 고위험군의 간암 발생을 조기에 진단할 수 있는 상기 마커의 조합은 ALB, APOB, APOL1, BTD, CDH1, CAT, CETP, ESYT1, AFP, FGA, GP5, GSS, SERPINA5, ITIH2, ITIH2, SERPINA4, LUM, MPO, PON1, PVR, SAA4, 및 SERPINA10; APOB, CAT, CETP, C7, AFP, FETUB, FGA, GP5, SERPIND1, SERPINA5, ITIH2, SERPINA4, LGALS3BP, MPO, QSOX1, SHBG, TF, VTN, AZGP1, 및 SERPINA10; LRG1, APOC3, CETP, AFP, SERPINA5, TF, 및 SERPINA10; APOC4, AFP, SERPINA5, LMNB1, MPO, PVR, 및 SERPINA10; SERPINA1, APOB, CAT, CETP, AFP, FETUB, FGA, GSS, SERPINA5, ITIH2, SERPINA4, UBA2, SHBG, F2, THBS1, THBS1, 및 SERPINA10; CETP, C7, AFP, IL1RAP, SERPINA5, LGALS3BP, MPO, HDLBP, 및 SERPINA10; ALB, APOB, CA1, CETP, C3, FCGBP, AFP, FETUB, FGA, JCHAIN, SERPINA5, ITIH2, SERPINA4, PRDX2, SELENOP, SHBG, THBS1, UCHL3, 및 SERPINA10; 또는 ALB, APOB, CA1, CETP, AFP, FETUB, SERPINA5, ITIH2, SERPINA4, MPO, F2, THBS1, 및 SERPINA10이다.

또한 본원에 따른 마커의 조합을 이용하여 간암 발병 고위험군 환자 중, B형 간염 환자의 간암 발병을 조기 진단할 수 있다.

일 구현예에서 간염과 간암을 비교하여 ALB, IGFALS, SERPINC1, APOA1, APOA4, APOB, APOC3, APOC4, APOH, APOM, BCO2, CDH1, CA1, CA2, CAT, CETP, BCHE, C7, PPBP, F9, FABP1, FCGBP, FCN3, AFP, FETUB, FGA, IL1RAP, ITIH1, ITIH2, SERPINA4, KNG1, LGALS3BP, PROS1, PROZ, PSMD1, QSOX1, S100A13, VCAM1, 및 SERPINA10이 다양하게 조합될 수 있다. 일 예로 마커의 조합은 AUC=0.983의 높은 진단력을 확인하였고, 별개의 독립 데이터에서도 AUC=0.858로 우수한 진단력을 나타낸다.

다른 구현예에서 간염과 간암을 비교하여 ALB, IGFALS, APOB, APOC3, BCO2, CDH1, CA1, BCHE, C7, PPBP, FABP1, FCGBP, AFP, FETUB, ITIH1, SERPINA4, KNG1, LGALS3BP, PROS1, PSMD1, VCAM1, 및 SERPINA10 마커가 조합될 수 있다. 일예로 마커의 조합은 최소 AUC=0.970인 높은 진단력을 확인하였고, 별개의 독립 데이터(validation set)에서도 AUC=0.851로 우수한 진단력을 나타낸다.

일 구현예에서 이러한 마커의 조합은 IGFALS, APOA4, C7, PPBP, F9, FABP1, FCGBP, AFP, ITIH1, SERPINA4, 및 SERPINA10; IGFALS, APOB, APOC3, PPBP, FABP1, FCGBP, AFP, ITIH1, SERPINA4, PROS1, 및 SERPINA10; ALB, IGFALS, CETP, C7, PPBP, FABP1, AFP, IL1RAP, ITIH1, ITIH2, SERPINA4, S100A13, 및 SERPINA10; ALB, APOB, BCO2, CDH1, CA1, BCHE, C7, PPBP, FABP1, FCGBP, AFP, FETUB, ITIH1, SERPINA4, KNG1, LGALS3BP, PSMD1, VCAM1, 및 SERPINA10; IGFALS, CA2, CETP, C7, PPBP, FABP1, FCGBP, FCN3, AFP, FGA, ITIH1, SERPINA4, 및 SERPINA10; IGFALS, SERPINC1, APOA1, CAT, C7, PPBP, F9, FCGBP, AFP, FGA, ITIH2, SERPINA4, PROZ, QSOX1, 및 SERPINA10; APOB, APOC4, APOH, CDH1, PPBP, FABP1, AFP, FETUB, SERPINA4, 및 SERPINA10 또는 APOB, APOC4, APOH, APOM, CAT, PPBP, FABP1, AFP, FETUB, ITIH1, SERPINA4, 및 SERPINA10의 조합을 포함한다.

또한 본원에 따른 마커의 조합을 이용하여 간암 발병 고위험군 환자 중, 간경화 환자의 간암 발병을 조기 진단할 수 있다.

일 구현예에서, 간경화와 간암을 비교하여 APOB, APOL1, CAT, CETP, C7, FABP1, AFP, FGA, FN1, IGHM, SERPINA5, ITIH2, SERPINA4, PON1, SERPINA10, BCO2, CFH, BCHE, SELENOP, UCHL3, AZGP1, AMBP, APOM, C1RL, CLU, PPBP, HSP90B1, F9, GSS, RBP4, HDLBP, APOA4, FGB, SERPIND1, LUM, QSOX1, SHBG, C9, FBLN1, SERPINF2, F2, CA2, 및 C6 마커가 다양하게 조합될 수 있다. 일예로 마커의 조합은 AUC=0.970의 높은 AUC 값을 나타냈고, 별개의 독립 데이터에서 AUC=0.890의 우수한 진단력을 나타낸다.

다른 구현예에서, 간경화와 간암을 비교하여 APOA4, APOB, BCO2, C1RL, CAT, CETP, CFH, BCHE, AFP, FGA, FGB, SERPIND1, SERPINA5, SERPINA4, LUM, QSOX1, SELENOP, SHBG, UCHL3, AZGP1, 및 SERPINA10 마커가 조합될 수 있다. 일 구현예에서 마커의 조합은 AUC=0.970의 높은 AUC 값을 나타냈고, 별개의 독립 데이터에서 AUC=0.890의 우수한 진단력을 나타낸다.

일 구현예에서 이러한 마커의 조합은 APOB, APOL1, CAT, CETP, C7, FABP1, AFP, FGA, FN1, IGHM, SERPINA5, ITIH2, SERPINA4, PON1, PON1, 및 SERPINA10; BCO2, CAT, CETP, CFH, BCHE, AFP, FGA, SERPINA5, SELENOP, UCHL3, AZGP1, 및 SERPINA10; AMBP, APOB, APOM, C1RL, CAT, CETP, CLU, PPBP, HSP90B1, F9, FGA, GSS, SERPINA5, SERPINA4, RBP4, HDLBP, AZGP1, 및 SERPINA10; APOA4, APOB, C1RL, CETP, AFP, FGB, SERPIND1, SERPIND1, SERPINA5, SERPINA4, LUM, QSOX1, SHBG, 및 SERPINA10; APOA4, APOB, APOL1, CETP, C9, FBLN1, AFP, FGA, SERPINA5, ITIH2, 및 SERPINA10; SERPINF2, APOB, CETP, FBLN1, AFP, FGA, FGA, SERPINA5, RBP4, HDLBP, 및 SERPINA10; APOB, CETP, AFP, FGA, SERPINA5, SERPINA4, F2, 및 SERPINA10; 또는 APOA4, APOB, APOB, APOL1, CA2, CETP, CLU, C6, AFP, FGA, SERPINA5, ITIH2, SERPINA4, AZGP1, 및 SERPINA10의 조합을 포함한다.

다른 구현예에서 본원에 따른 하나 이상의 마커는 AFP 마커와 조합으로 사용될 수 있다.

본원에 따른 마커는 정량적 또는 정성적 분석을 통해 핵산, 특히 단백질 및/또는 mRNA의 존재 여부의 검출 및/또는 이의 발현량 자체, 발현량의 변화, 발현량 차이의 수준에서 검출 및/또는 정량될 수 있다.

본원에서 검출이란, 정량 및/또는 정성 분석을 포함하는 것으로, 존재, 부존재의 검출 및 발현량 검출을 포함하는 것으로 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다.

이러한 본원에 따른 마커의 검출은 마커의 기능적 특징 및/또는 항원적 특징에 기반을 둔 것일 수 있다.

일 구현예에서 본원에 따른 마커는 마커의 활성 또는 기능의 검출, 또는 단백질을 코딩하는 핵산, 특히 mRNA 수준 및/또는 단백질 수준에서 특이적으로 상호작용하는 물질을 사용하여 검출될 수 있다.

본원에 따른 마커의 정량적 및 정성적 분석에는 공지된 단백질 또는 핵산을 정성 또는 정량적으로 검출하는 다양한 방법이 사용될 수 있다.

단백질 수준에서의 정성적 또는 정량적 검출 방법으로는 예를 들면 웨스턴블랏, ELISA, 방사선면역분석, 면역확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 용액/현탁액 중에서 표지된 항체와의 결합, 질량분석기 또는 항체를 이용한 단백질 어레이 등을 이용한 방법이 사용될 수 있다.

또는 핵산 수준에서의 정성적 또는 정량적 검출 방법으로는 핵산 전사 및 증폭 방법, eTag 시스템, 표지된 비드를 기본으로 하는 시스템, 핵산 어레이와 같은 어레이 시스템 등을 이용한 방법이 사용될 수 있다.

이러한 방법은 공지된 것으로 예를 들면 chip-based capillary electrophoresis: Colyer et al. 1997. J Chromatogr A. 781(1-2):271-6; mass spectroscopy: Petricoin et al. 2002. Lancet 359: 572-77; eTag systems: Chan-Hui et al. 2004. Clinical Immunology 111:162-174; microparticle-enhanced nephelometric immunoassay: Montagne et al. 1992. Eur J Clin Chem Clin Biochem. 30:217-22 등을 참조할 수 있다.

일 구현예에서 본원에 따른 바이오마커는 질량분석법 또는 질량 분석기(Mass spectrometry) 기반의 기술을 이용하여 정량 또는 검출될 수 있으며, 예를 들면 (Kim, et al. 2010 J Proteome Res. 9: 689-99; Anderson, L et al. 2006. Mol Cell Proteomics 5: 573-88.)를 참조할 수 있다.

본원에 따른 일 구현예에서는 이온을 4개의 전극주로 구성되는 사중 양극에 유도하여 질량/전하(m/z) 비율에 따라 분석하는 방식의 예를 들면 Triple Quadrupole (Q1, Q2, Q3) 질량분석기를 이용한 다중반응모니터링(Multiple reaction monitoring, MRM) 기술이 사용된다(도 3 참조). 예를 들면, MRM은 생체 시료 중에 존재하는 미량의 바이오마커와 같은 표지 물질을 정량적으로 정확하게 다중 측정할 수 있는 방법이다. 특정 m/z의 펩타이드 만을 통과시켜서 필터 역할을 수행하는 제1 질량필터(Q1)를 이용하여, 이온화원(ionization source)에서 생성된 이온 단편(펩타이드)들 중 전구이온(Precursor ion) 또는 모이온을 선택적으로 충돌관(Q2)으로 전달한다. 이어 충돌관에 도달한 전구이온은 내부 충돌기체와 충돌하여, 쪼개져 다양한 길이의 펩타이드 단편인 산물이온(Product ion) 또는 딸이온을 생성한 후 제2 질량 필터(Q3)로 보내져 여기서 특정 m/z의 펩타이드 단편이 선별되고, 검출기에서 디지탈 시그널로 전환되어 피크 크로마토그램(peak chromatogram)으로 보여지게 된다. 이러한 원리로 MRM은 목적하는 분석 대상만을 높은 민감도로 선택적으로 검출 및 정량이 가능하다. 분석 대상 펩타이드는 분석 대상의 전체 단백질 서열 중, MRM 분석에 사용되는 일부 서열로, 단백질의 전체 서열 중 일정 조건 예를 들면 분석 대상 단백질에 대한 대표성, 변형가능 여부, MRM 분석에 적합한 길이 등과 같은 조건을 만족하는 최적인 대상 펩타이드가 선정될 수 있다. 예를 들면 아미노산의 길이가 6 - 30개의 길이를 가지는 펩타이드를 선별한다. 상기 범위보다 너무 길이가 짧으면 선택성이 떨어지고, 너무 길면 민감도가 떨어지게 된다. 아울러 메티오닌, 시스테인, 트립토판은 산화와 같이 화학적 변형이 쉬워, 선정 시에 제외시킨다. 또한 MRM에서는 대상 펩타이드에 대응하는 내부표준물질이 사용된다. 내부표준물질은 상술한 대상 펩타이드와 동일한 아미노산 서열을 가지지만 내부표준물질을 구성하는 하나 이상의 아미노산 질량이 상기 대상 펩타이드의 아미노산 질량과 상이하다. 하지만 아미노산 서열과 소수성이 서로 동일하여 대상 펩타이드와 같은 retention time에 용출된다. 이를 통해서 대상 펩타이드가 실제 분석 대상 단백질 유래인지 확인될 수 있다.

일 구현예에서 본원에 따른 마커의 검출은 마커 단백질 유래의 상응하는 펩타이드 예를 들면 표 1-1, 1-2 및 1-3에 기재된 각 마커별로 상응하는 대상 펩타이드의 검출을 통해 수행될 수 있다. 하나의 단백질에 대하여 하나 또는 두 개 이상의 펩타이드가 사용될 수 있다.

본원에 따른 일구현예에서 내부표준물질은 이를 구성하는 하나 이상의 아미노산은 방사성 동위원소 예를 들면 ¹³C 또는 ¹⁵N로 또는 이들의 혼합물(Sable Isotope-Labeled Peptides as Internal Standards peptide; SIS peptides)에 의해 표지화될 수 있다. 예를 들면 Gillette et al., 2013, Nature Methods 10:28-34에 기재된 것을 참조할 수 있다. 모든 시료에 같은 양의 내부표준물질을 넣어주기 때문에 전체 분석 결과에 대한 표준화(normalization)를 할 수 있고, 검출되는 대상 펩타이드가 실제 분석 대상 단백질 유래인지 검증을 할 수 있다.

일 구현예에서 본원에 따른 마커의 검출에 사용되는 다중동시정량법(MRM)은 검체 내 대상 펩타이드에 대한 질량분석, 특정 펩타이드이온 검출, 표준내부물질을 사용, 이들 간의 상대적 혹은 절대적 농도변화의 비율을 계산하여, 생리 상태에서의 특정 단백질 또는 펩타이드의 양을 정량 분석할 수 있다. 본원에 따른 방법에서 MRM 분석은 내부표준물질 및 대상 펩타이드에 대하여 Q1 및 Q3 값을 모니터링하여 수행될 수 있으며, 가장 높은 시그널을 나타내는 Q1/Q3 쌍을 선정하여 사용할 수 있다.

또 다른 구현예에서는 ELISA(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), RIA(Radio Immuno Assay) 등과 같은 샌드위치 방식의 면역분석법이 사용될 수 있다. 이러한 방법은 고상의 기질 예를 들면 글라스, 플라스틱(예를 들면 폴리스티렌), 폴리사카라이드, 나일론 또는 나이트로셀룰로스로 제작된 비드, 막, 슬라이드 또는 마이크로타이터플레이트에 결합된 제1 항체에 생물학적 시료를 추가한 후, 직접 또는 간접 검출이 가능한 표지물질 예를 들면 ³H 또는 ¹²⁵I와 같은 방사선 물질, 형광물질, 화학발광물질, 햅텐, 바이오틴, 디그옥시제닌 등으로 표지되거나 또는 기질과의 작용을 통해 발색 또는 발광이 가능한 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, 말레이트 데하이드로게나아제와 같은 효소와 컨쥬게이션된 항체와의 결합을 통해 단백질을 정성 또는 정량적으로 검출할 수 있다.

다른 구현예에서는 항원 항체 결합을 통해 마커를 간단하게 검출할 수 있는 Ouchterlony 플레이트, 웨스턴블랏, Crossed IE, Rocket IE, Fused Rocket IE, Affinity IE와 같은 면역 전기영동(Immuno Electrophoresis)이 사용될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984 등에 기재되어 있다. 상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석하여, 즉, 정상 시료와의 시그널 대조를 수행함으로써 질환 발생 여부를 진단할 수 있다.

이러한 방법에 사용되는 시약 또는 물질은 공지된 것으로서, 예를 들면 상기 마커에 특이적으로 결합하는 항체, 기질, 핵산 또는 펩타이드 앱타머, 또는 상기 마커와 특이적으로 상호작용하는 수용체 또는 리간드 또는 보조인자 등이 사용될 수 있다. 상기 본원의 마커와 특이적으로 상호작용 또는 결합하는 시약 또는 물질은 칩 방식 또는 나노입자(nanoparticle)와 함께 사용될 수 있다.

본원에 따른 조성물에 포함되는 검출시약은 검출에 사용되는 구체적 방법에 따라 검출을 위해 직접적 또는 샌드위치 형태로 간접적으로 표지될 수 있다. 직접적 표지방법의 경우, 어레이 등에 사용되는 혈청 시료는 Cy3, Cy5와 같은 형광 표지로 표지된다. 샌드위치의 경우, 표지되지 않은 혈청 시료를 먼저 검출시약이 부착된 어레이와 반응시켜 결합시킨 후, 표적 단백질을 표지된 검출 항체와 결합시켜 검출한다. 샌드위치 방식의 경우, 민감도와 특이성을 높일 수 있어서, pg/mL 수준까지 검출이 가능하다. 그 외 방사능 물질, 발색물질, 자기성입자 및 고밀도전자입자 등이 표지물질로 사용될 수 있다. 형광 광도는 스캐닝 콘포칼 현미경이 사용될 수 있으며, 예를 들면 Affymetrix, Inc. 또는 Agilent Technologies, Inc 등에서 입수할 수 있다.

본원의 조성물은 추가로 결합분석에 필요한 하나 이상의 부가 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들면 결합 버퍼, 시료 준비에 필요한 시약, 혈액채취용 주사기 또는 음성 및/또는 양성대조군을 추가로 포함할 수 있다.

상술한 바와 같은 다양한 검출시약을 포함하는 본원의 조성물은 분석양태에 따라 ELISA 분석용, 딥스틱 래피드 키트(dip stick rapid kit) 분석용, MRM 분석용 키트, 마이크로어레이용, 유전자증폭용, 또는 면역분석용 등으로 제공될 수 있으며, 분석 양태에 맞추어 적절한 검출시약을 선별할 수 있을 것이다.

일 구현예에서는 ELISA 또는 딥스틱 래피드 키트가 사용되며, 이 경우 본원에 따른 하나 이상의 마커를 인식하는 항체가 기질, 예를 들면 다중웰 플레이트의 웰 또는 유리 슬라이드의 표면 또는 나이트로셀룰로스에 부착되어 제공될 수 있다. 딥스틱의 경우, POCT(Point of Care Test) 분야에서 널리 이용되는 기술로, 본원에 따른 바이오마커를 인식하는 하나 이상의 항체가 나이트로셀룰로스와 같은 기질에 결합되어 있고, 이를 혈청과 같은 시료와 접촉시 예를 들면 딥스틱의 일 말단을 혈청시료에 담그면, 시료가 모세관 현상에 의해 기질을 이동하여, 기질 중의 항체와 결합시 발색하는 방식으로, 마커를 검출하는 것이다.

다른 구현예에서는 펩타이드를 근간으로 하는 MRM 키트가 제공되며, MRM 방식에 대하여는 앞서 설명한 바와 같다. MRM 방법은 특정 단백질을 선택적으로 인식하는 펩타이드를 이용하는 것으로, 온도, 습도 등 환경에 민감한 항체를 이용하는 기존의 방법과 비교하여, 보다 안정적으로 생체시료에서 마커를 검출할 수 있다. 예를 들면 펩타이드는 본원 표 1-1, 1-2 및 1-3에 기재된 것이 사용될 수 있으며, 하나의 마커에 하나 또는 두 개 이상의 펩타이드가 사용될 수 있다.

다른 구현예에서, 마이크로어레이를 포함하는 어레이 또는 칩의 형태로 제공될 수 있다. 유리 또는 나이트로셀룰로스와 같은 기질의 표면에 검출시약이 부착될 수 있으며, 어레이 제조 기술은 예를 들면 Schena et al.,1996, Proc Natl Acad Sci USA. 93(20):10614-9; Schena et al., 1995, Science 270(5235):467-70; 및 U.S. Pat. Nos. 5,599,695, 5,556,752 또는 5,631,734를 참조할 수 있다. 어레이에 부착될 수 있는 검출시약은 예를 들면 한 단백질에 특이적 결합이 가능한 항체, 항체단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics)를 포함한다.

다른 양태에서 본원은 상술한 마커 또는 마커의 조합을 이용한 간암 고위험군의 간암 모니터링 및 간암의 조기진단하는 방법에 관한 것이다.

또 다른 양태에서 본원은 간암 고위험군의 간암 모니터링 및 간암의 조기 진단을 위해 상술한 마커 또는 마커의 조합을 검출하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 특히 인비트로에서 수행될 수 있다.

또 다른 양태에서 본원은 간암 고위험군의 간암 모니터링 및 조기진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 상술한 마커 또는 마커의 조합을 검출하는 방법에 관한 것이다.

본원에 따른 다양한 방법에 채용되는 마커 및 마커의 조합은 상술한 바를 참조할 수 있다.

일 구현예에서 본원에 따른 방법은 본원은 간암 고위험군의 간암 발병 모니터링 또는 조기 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 본원에 따른 마커의 검출이 필요한 대상체 유래의 혈액 시료로부터 ORM1 (Alpha-1-acid glycoprotein 1), SERPINA1 (Alpha-1-antitrypsin), SERPINF2 (Alpha-2-antiplasmin), A2M (Alpha-2-macroglobulin), ALB (Serum albumin), SERPINC1 (Antithrombin-III), APOA1 (Apolipoprotein A-I), APOA4 (Apolipoprotein A-IV), APOB (Apolipoprotein B-100), APOC3 (Apolipoprotein C-III), APOC4 (Apolipoprotein C-IV), APOF (Apolipoprotein F), APOH (Beta-2-glycoprotein 1), APOL1 (Apolipoprotein L1), APOM (Apolipoprotein M), BCO2 (Beta,beta-carotene 9',10'-oxygenase), BTD (Biotinidase), C1RL (Complement C1r subcomponent-like protein), CDH1 (Cadherin-1), CA1 (Carbonic anhydrase 1), CA2 (Carbonic anhydrase 2), CAT (Catalase), CPB2 (Carboxypeptidase B2), CETP (Cholesteryl ester transfer protein), CFH (Complement factor H), C3 (Complement C3), C8B (Complement component C8 beta chain), C9 (Complement component C9), PPBP (Platelet basic protein), HSP90B1 (Endoplasmin), ENTPD5 (Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 5), ESYT1 (Extended synaptotagmin-1), F7 (Coagulation factor VII), F9 (Coagulation factor IX), FABP1 (Fatty acid-binding protein, liver), FCGBP (IgGFc-binding protein), FETUB (Fetuin-B), FGA (Fibrinogen alpha chain), FGB (Fibrinogen beta chain), RACK1 (Receptor of activated protein C kinase 1), GP5 (Platelet glycoprotein V), GSS (Glutathione synthetase), SERPIND1 (Heparin cofactor 2), ICAM1 (Intercellular adhesion molecule 1), IGHM (Immunoglobulin heavy constant mu), IL1RAP (Interleukin-1 receptor accessory protein), ITIH2 (Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H2), ITIH3 (Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H3), KNG1 (Kininogen-1), LMNB1 (Lamin-B1), MPO (Myeloperoxidase), PON1 (Serum paraoxonase/arylesterase 1), PRDX2 (Peroxiredoxin-2), PROC (Vitamin K-dependent protein C), PROS1 (Vitamin K-dependent protein S), PROZ (Vitamin K-dependent protein Z), PSMD1 (26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 1), PVR (Poliovirus receptor), RBP4 (Retinol-binding protein 4), S100A13 (Protein S100-A13), SAA4 (Serum amyloid A-4 protein), UBA2 (SUMO-activating enzyme subunit 2), SELENOP (Selenoprotein P), SPARC (SPARC), TF (Serotransferrin), THBS1 (Thrombospondin-1), UCHL3 (Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L3), VCAM1 (Vascular cell adhesion protein 1), HDLBP (Vigilin), VIM (Vimentin), AZGP1 (Zinc-alpha-2-glycoprotein) 및 SERPINA10 (Protein Z-dependent protease inhibitor). LRG1 (Leucine-rich alpha-2-glycoprotein), IGFALS (Insulin-like growth factor-binding protein complex acid labile subunit), AMBP (Protein AMBP [Cleaved into: Alpha-1-microglobulin), BCHE (Cholinesterase), CLU (Clusterin), CNDP1 (Beta-Ala-His dipeptidase), C6 (Complement component C6), C7 (Complement component C7), FBLN1 (Fibulin-1), FCGR3A (Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A), FCN3 (Ficolin-3), AFP (Alpha-fetoprotein), FN1 (Fibronectin), IGFBP3 (Insulin-like growth factor-binding protein 3), IGF2 (Insulin-like growth factor II), JCHAIN (Immunoglobulin J chain), SERPINA5 (Plasma serine protease inhibitor), ITIH1 (Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1), SERPINA4 (Kallistatin), KLKB1 (Plasma kallikrein), LCAT (Phosphatidylcholine-sterol acyltransferase), LGALS3BP (Galectin-3-binding protein), LUM (Lumican), PLG (Plasminogen), QSOX1 (Sulfhydryl oxidase 1), SHBG (Sex hormone-binding globulin), F2 (Prothrombin), GC (Vitamin D-binding protein) 및 VTN (Vitronectin)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상 바이오마커의 핵산 및/또는 단백질의 존재 여부 및/또는 농도를 검출하는 단계; 상기 핵산 또는 단백질의 농도 또는 존재에 대한 검출 결과를 대조군 시료의 해당 마커의 상응하는 결과와 비교하는 단계; 및 상기 대조군 시료와 비교하여, 상기 대상체 시료의 핵산 또는 단백질 농도의 변화가 있거나, 또는 상기 핵산 또는 단백질이 존재여부에 변화가 있는 경우, 이를 기반으로 간암을 판정하는 단계를 포함한다.

일 구현예에서 상기 마커는 ORM1, SERPINA1, SERPINF2, A2M, ALB, SERPINC1, APOA1, APOA4, APOB, APOC3, APOC4, APOF, APOH, APOL1, APOM, BCO2, BTD, C1RL, CDH1, CA1, CA2, CAT, CPB2, CETP, CFH, C3 (Complement C3), C8B, C9, PPBP, HSP90B1, ENTPD5, ESYT1, F7, F9, FABP1, FCGBP, FETUB, FGA, FGB, RACK1, GP5, GSS, SERPIND1, ICAM1, IGHM, IL1RAP, ITIH2, ITIH3, KNG1, LMNB1, MPO, PON1, PRDX2, PROC, PROS1, PROZ, PSMD1, PVR, RBP4, S100A13, SAA4, UBA2, SELENOP, SPARC, TF, THBS1, UCHL3, VCAM1, HDLBP, VIM, AZGP1 및 SERPINA10으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 다른 구현예에서 상기 마커는 LRG1, IGFALS, AMBP, BCHE, CLU, CNDP1, C6, C7, FBLN1, FCGR3A, FCN3, AFP, FN1, IGFBP3, IGF2, JCHAIN, SERPINA5, ITIH1, SERPINA4, KLKB1, LCAT, LGALS3BP, LUM, PLG, QSOX1, SHBG, F2, GC 및 VTN로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 추가로 포함할 수 있다.

본원에 따른 방법은 또한 일 구현예에서 간암 발병 고위험군 중 특히 간경화 환자의 간암 발병 모니터링 또는 조기 진단, 또는 다른 구현예에서 간염 특히 B형 간염 환자의 간암 발병 모니터링 또는 간암 조기 진단에 사용될 수 있으며, 이러한 마커에 대하여는 앞서 언급한 바를 참조할 수 있다.

본원에 따른 방법에 사용되는 마커는 또한 두 개 이상의 조합으로 사용될 수 있으며, 앞서 언급한 바를 참조할 수 있다.

본원에 따른 방법에서 본원에 따른 단백질 또는 이로부터 유래된 대상 펩타이드는 앞서 언급한 방법에 의해 검출될 수 있다.

일 구현예에서 본원에 따른 방법은 MRM 분석으로 진행된다. MRM 분석 방법은 앞서 언급한 바를 참조할 수 있다. 예를 들면 본원에 따른 방법에서, 대상 펩타이드(표 1-1, 1-2 및 표 1-3에 기재된 것 참조)에 대한 MRM 분석 결과를 Skyline 등과 같은 소프트웨어를 사용하여 peak area를 도출한 후, 상기 내부표준물질의 분석결과로 표준화(normalization)하여 상기 검체 시료 중의 본원에 따른 마커의 양을 검출할 수 있다. 검체의 대상 펩타이드의 피크면적을 표준내부물질 펩타이드의 피크 면적으로 나누어 계산할 수 있다.

본원에 따른 방법에서 간암 발병 고위험군의 모니터링 또는 진단을 위해 대조군으로 사용될 수 있는 시료는 B형 간염 환자 및/또는 간경화 환자이다. 따라서 본원에 따른 마커를 이용한 간암 조기 진단은 B형 간염 또는 간경화에서 간암으로 진행되는 환자를 진단할 수 있어 모니터링 및 특히 조기 진단에 유리하다.

이러한 대조군 환자와 비교하여, 조기 간암 환자에서 본원에 따른 마커의 발현량이 변화하며, 증가 또는 감소된다.

본원에 따른 마커에서 대조군과 비교하여 발현량이 증가하는 마커는 대조군 대비 간암에서 증가하는 마커는 다음과 같다: IGHM, C3, HSP90B1, JCHAIN, ESYT1, GSS, CAT, UCHL3, PVR, APOB, FBLN1, CA1, ITIH3, PRDX2, FCGR3A, QSOX1, FABP1, CA2, FGA, LGALS3BP, CDH1, BCO2, ICAM1, A2M, C7, VIM, SERPINA10, FCGBP, AFP, SHBG, VCAM1 및 SERPINA5이다.

본원에 따른 마커에서 대조군과 비교하여 발현량이 감소하는 마커는 대조군에 대비하여 간암에서 감소하는 마커는 다음과 같다: CLU, CPB2, KLKB1, GP5, PROC, THBS1, RBP4, IGFBP3, PPBP, GC, FCN3, BCHE, ENTPD5, ALB, SERPIND1, PROS1, SPARC, F9, KNG1, FGB, MPO, CETP, PLG, SERPINF2, LRG1, C8B, LCAT, IGF2, FETUB, FN1, APOH, SAA4, SELENOP, SERPINA4, F7, TF, ORM1, RACK1, ITIH1, C6, IGFALS, APOC4, APOM, LUM, APOL1, FGA, AZGP1, IL1RAP, LMNB1, VTN, CNDP1, SERPINC1, PON1, APOC3, PROZ, C1RL, CFH, APOF, APOA4, C9, SERPINA1, UBA2, ITIH2, APOA1, BTD, HDLBP, AMBP, S100A13, PSMD1 및 F2 이다.

본원에 따른 조성물, 키트 또는 방법에 사용될 수 있는 생물학적 시료 또는 검체는 전혈, 혈청 또는 혈장을 포함하는 혈액시료이다. 본원의 일 구현예에서 특히 혈청 시료이다.

본원에 따른 조성물, 키트 또는 방법에 사용될 수 있는 생물학적 시료는 포유류 특히 인간으로부터 수득된다. 인간 대상체는 간염, 간경변, 또는 간경화가 발병되어 간암 발병 모니터링 및 간암 진단, 특히 조기 진단 여부가 필요한 사람을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 방법은 간질환 관련 증상 예를 들면 복부통증, 비대간, 복수, 황달, 근육쇠약, 또는 식도 정맥류 등과 같은 증상을 갖는 대상체의 간암 여부를 결정하기 위해 수행될 수 있다.

또 다른 구현예에서, 본 방법은 특정 기간 동안 예를 들어 1년에 걸쳐 수차례 수행될 수 있으며, 발현 패턴의 변화 추이 모니터링에 사용될 수 있다. 마커의 발현의 증가 또는 감소를 간질환 상태와 연관 지을 수 있다. 동일 대상체에 대한 종전의 검사 수치 또는 대조군의 수치와 비교하여, 간암 조기 진단, 진행, 악화 또는 완화 등의 판단에 사용될 수 있다. 시간의 경과에 따른 마커의 변화를 근거로 간암 또는 중증 간암으로의 진행을 막기 위한 예방적 조치를 취할 수 있다.

본원에 따른 방법에서, 하나 이상의 마커의 검출 또는 정량 방법은 앞서 언급한 바를 참조할 수 있으며, ELISA, 딥스틱 래피드 분석, MRM 분석, 마이크로어레이, 핵산증폭, 또는 면역분석 방법을 포함할 수 있다.

일 구현예에서는 MRM 분석이 사용된다. 상기 MRM 분석에 사용되는 각 마커의 펩타이드는 표 1-1, 1-2 및 1-3에 기재된 것이며, 시료로서 혈액을 이용하는 경우, 단백질 고갈 및 변성 후 단백질 분해 효소(예컨대, 트립신)로 분해하여 사용할 수 있다.

본원에 따른 방법과 함께, 또는 방법을 사용한 후에, 간암의 확진을 위해, 본원에 따른 방법은 예를 들면 혈액마커(AFP)검사, 초음파, 컴퓨터단층촬영 (computerized axial tomography (CT scan)) 또는 자기공명영상(magnetic resonance imaging (MRI)) 검사와 함께 사용될 수 있다.

일 구현예에서 본원에 따른 마커를 이용하여 간암으로 조기진단된 경우, MRI 및/또는 PET-CT와 같은 정밀 검사를 통해 암을 확진하고, 적절한 치료가 수행될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실 시 예

실시예 1: 본원에 사용된 임상시료 정보

서울 아산병원의 임상시험심사위원회의 승인(IRB approval No. 2015-1156) 받은 간암 고위험군 환자들(B형 간염과 간경화)과 간암 확진 판정 환자 총 440명의 혈청 시료를 이용하였다. 각 환자에서 혈액시료를 채취한 즉시 4℃, 3000 rpm에서 10분 간 원심분리하여 혈청을 수집하였다. 혈청은 분석에 사용할 때까지 50μl 단위로 분주하여 80℃에서 보관하였다.

서울아산병원에서 간암 고위험군 환자들과 간암 확진 판정 환자 모두 20세 이상의 간 기능이 양호(Child-Pugh class A)한 것으로 진단받은 환자들로, 간암 환자의 경우 영상 검사(CT 혹은 MRI) 및 조직 검사에서 5cm 미만의 극초기 간암 환자만을 선별하였다. 간암 고위험군 환자의 시료의 경우 영상 검사나 혈액 검사에서 만성 B형 간염 또는 간경화로 진단된 비 간암 환자의 시료를 이용하였다. 총 440개의 혈청시료를 3차례에 걸쳐 시료를 전달받았다. 1차 실험용 시료는 B형 간염 환자 50명, 간경화 환자 50명, 간암 환자 50명의 혈청 시료 총 150개의 혈청 시료를 전달받았고, 2차 실험용 시료는 B형 간염 환자 50명, 간경화 환자 50명, 간암 환자 50명의 혈청 시료 총 150개의 혈청시료를 전달받았다. 3차 실험의 시료는 B형 간염 환자 57명, 간경화 환자 43명, 간암 환자 40명의 혈청 시료 총 140개의 혈청 시료를 전달받았다. 전달받은 총 440개의 혈청 시료에 대한 임상 정보는 표 2에 표시하였다.

[표 2] 환자 정보

실시예 2. 마커 선별

실시예 2-1: 마커 타겟 후보군 선정

현재 간 질환과 관련된, 가장 comprehensive resource인 LiverAtlas database 1,152개의 단백질과 Human Protein Atals에서 59개의 단백질이 선별되었고, 6쌍의(normal=6, HCC=6) 조직 시료(tissue)를 이용한 proteome profiling에서 1,304개의 단백질을 선별하였다. Food and Drug Administration (FDA) 혹은 Laboratory Developed Test (LDT)에서 승인된 28개의 단백질과 선행 연구에서 개발된 간암 진단 마커 1개를 통합하여 Hepatic disease 와 관련 있다고 알려진 단백질 총 2189개가 선정되었다. 2189개 단백질 중에서 혈액에서의 정량적 분석이 가능하도록 secretion 되는 혈액 단백질 만을 선정하기 위하여 총 8가지의 예측 툴(prediction tool)인 Plasma proteome database, TargetP, SignalP, SecretomeP, GO annotation, ExoCarta, TMHMM prediction, Uniprot DB)을 이용하였다. 이후에, UniprotKB database를 통해서 문헌이나 큐레이터(curator)에 의해 bioinformatical analysis 과정으로 검증된(reviewed) 단백질 만을 선별한 결과 총 1738개 단백질이 선별되었다. 질량 분석 장비로 검출이 가능한 단백질을 최종 마커후보 그룹으로 선정하기 위해 Public spectral library (ISB, NIST, SWATHAtlas)와 homemade serum/tissue spectrum library를 이용하여 peptide MS/MS data 가 존재하는 단백질 만을 선정한 결과, 총 1,693개 단백질과 상기 단백질로부터 유래된 23,184개 펩타이드가 최종 선정되었다.

실시예 2-2: 검출가능한 마커 타겟 후보군 선정

이어 실시예 2-1에서 선정된 후보 단백질 1,693개 및 펩티드 23,184개 중에에서 재현성 있는 검출(Technical Reproducibility)이 가능하고, 간경화군과 간염군, 그리고 간암군 간의 발현 차이를 보이는 타겟을 선정하기 하였다.

이를 위해 1차로 접수한 간암 환자 50명, 간경화 환자 50명, B형 간염 환자 50명의 혈액 시료를 group 별로 통합(pooling)한 시료를 준비하였다. 이어 실시예 3의 시료 전처리 과정과 펩타이드화 과정을 수행하여 얻어진 시료를 Agilent사의 6490-QqQ 질량분석기를 사용하여 세트 당 3회씩 MRM 분석을 진행하였으며, 분석방법은 실시예 3에 기재된 바와 같다.

검출 가능한 타켓으로 선정되는 펩타이드 선정 조건은 피크의 검출이 예측된 Retention time의 앞뒤로 5분 범위 안에 검출되는지, 같은 RT에 transition이 3개 이상 관찰되는지, 보이는 피크가 예측된 단백질이 맞을 확률을 나타내는 dot product(dotp)라는 점수가 0.6이상 인지 확인한 결과, 총 681개 단백질 및 이로부터 유래된 총 1,583개의 펩타이드가 최종 선정되었다.

실시예 2-3: 정량가능한 마커 타겟 후보군 선정

실시예 2-2에서 선정된 681개 단백질 및 이로부터 유래된 1,583개 펩타이드를 대상으로 MRM 플랫폼 기반의 간암 발병 고위험군 모니터링/진단을 위한 정량가능한 마커 후보군 선정을 위해 개별시료를 이용하여 Semi-Quantitative MRM으로 분석하였다.

이를 위해 1차 접수한 간암(HCC) 환자 50명, 간경화(LC) 환자 50명, B형 간염(HBV) 환자 50명의 혈액 시료 총 150개에 대해 난수를 생성해 각각 15개씩 10개의 batch로 나누었고 각 batch에는 각 그룹에 포함되는 시료들이 비슷한 비율로 들어가도록 조정하여 개별 시료를 준비하였다.

고순도 합성 펩티드를 합성할 타겟들을 필터링(filtering)하기 위하여 150개 혈청시료에 대한 반정량(Semi-quantitative) MRM 분석을 진행하였다. 반정량(Semi-quantitative) MRM 분석은 Biognosys 사의 자연에 존재하지 않는(non-naturally occurring) 11개의 합성 펩타이드로 구성된 iRT (Indexed retention time) Kit를 이용하였다. B형 간염군(HBV)과 간암군(HCC) 비교(HBV vs. HCC), 간경화군(LC)과 간암군(HCC) 비교(LC vs. HCC), B형 간염군(HBV)과 간경화군(LC) 비교(HBV vs. LC), 그리고 간암 고위험군(B형 간염과 간경화, HBV+LC)과 간암군(HCC)을 비교(HBV+LC vs. HCC)하여, AUC ≥ 0.65인 펩타이드를 선별하였고 AUC 값이 0.65 이상으로 차이나지 않는 비교군에 대해서는 AUC ≥ 0.60으로 일부 선별한 결과 276개 단백질, 542개의 펩타이드가 선별되었다.

다음으로, 상기 276개 단백질 및 542개의 펩타이드에 해당하는 SIS(stable isotope labeled synthetic) 펩타이드(내인성 펩타이드에 상응하는 안정동위원소-표지된 합성(SIS) 펩타이드로 내부표준물질 펩타이드)를 이용하여 간암 환자 50명, 간경화 환자 50명, B형 간염 환자 50명의 혈액을 통합(pooling)한 시료를 대상으로 상기 선정된 단백질과 펩타이드가 실제 혈액 내에 존재하는지 여부를 상술한 바와 같이 MRM 분석을 이용하여 재확인했다. MRM 분석으로부터 나온 모든 타겟 펩타이드의 peak area 값을 해당 internal standard peptide(내부표준물질 펩타이드)의 peak area 값으로 표준화하는 작업을 거쳤다. 50-fmol의 동일한 SIS 펩타이드를 주입하여 생체 내에 내인성 대상 펩타이드(endogeneous)의 검출 여부를 확인한 결과 181개 단백질 및 421개의 펩타이드가 검출되었다.

이어 MRM 분석 시에, 복합(Complex) 혈액 시료에서 내인성 대상 펩타이드 이외의 다른 펩타이드에 의한 시그널 간섭(interference) 현상을 보이는지 확인하기 위해서, 상기 181개 단백질, 421개의 펩타이드에 대하여, 병변에 따라 각각 50명씩 통합(pooling)한 시료를 3번 반복 분석 진행하여, SIS 펩타이드와 혈액 내인성(endogeneous) 펩타이드의 생성 이온(Q3) 강도 패턴(intensity pattern)을 확인했다. 시그널 간섭현상 여부를 판단하기 위해 AuDIT (Automated detection of inaccurate and imprecise transitions) 프로그램을 이용하였으며 혈액 내 펩타이드와 SIS 펩타이드의 상대적인 생성이온 강도를 비교하고(P-value threshold : 0.05), 혈액 내 펩타이드와 SIS 펩타이드의 피크 면적 값이 반복 측정 시 일정하게 검출되는지 여부(CV threshold : 0.2)를 확인하였다. 그 결과 타켓 간에 시그널 간섭 현상이 없이 정량 가능한 혈액의 내인성 대상 단백질 및 펩타이드가 최종적으로 177개 단백질이며, 이로부터 유래된 385 펩타이드가 최종 대상으로 선정되었다.

실시예 3: MRM 분석 방법

실시예 3-1: 임상시료 혈청의 전처리 및 혈청 단백질의 펩타이드화

혈액 내에 저농도로 존재하는 마커 발굴을 위해 혈액 내에 고량(high-abundant)으로 존재하는 단백질 6종 albumin, IgG, IgA, haptoglobin, transferrin, alpha-1-antitrypsin의 감손(depletion) 과정을 실시하였다. 6개 다량 단백질 제거를 통해서, 혈액의 총 단백질 중 질량기준으로 85% 정도가 제거 되고, 나머지 15% 단백질 질량에 해당되는 단백질만 남게 되어 이를 분석에 사용하였다. 감손(depletion) 과정은 MARS (Multiple affinity removal system, Agilent, USA) 컬럼(column)을 이용하여 제조사의 방법에 따라 진행하였다.

감손(depletion) 과정 후 얻어진 혈청 시료는 농축한 다음, BCA (Bicinchoninic acid) 분석 방식으로 단백질 농도를 정량하였다. 100 ㎍ 혈청 시료를 취한 다음, 0.2% Rapigest (waters)/20 mM DTT/100 nM ABC Buffer로 처리(Tris pH 8.0)한 다음, 60℃에서 60분 동안 인큐베이션을 진행하였다. 최종 농도 100 mM IAA 처리하고 상온에서 30분 동안 인큐베이션을 진행하였다. 트립신과 혈청 농도 비율이 1:50이 되도록 트립신을 처리한 후, 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션을 진행하였다. 10% FA 처리하고 37℃에서 1시간 반응시킨 후 15,000 rpm, 4℃ 조건으로 1시간 동안 원심분리 하여 상층액 만을 취득하였다.

실시예 3-2: 내부표준 펩타이드

내부표준 펩타이드는 독일 JPT사에서 합성한 중방사능으로 표지되어 합성된 표준참조펩타이드(SIS peptide; stable-isotope labeled standard peptide)를 사용하였다. SIS 펩타이드는 펩타이드 C-말단의 라이신(Lys, K)이나 아르기닌(Arg, R) 아미노산에 있는 ¹²C 와 ^14N를 ¹³C 와 ¹⁵N로 치환한 펩타이드이다. 이는 혈액 내에 존재하는 내인성 펩타이드(endogenous peptide)와는 질량 값이 차이가 나지만, 동일한 아미노산 서열과 펩타이드 소수성(hydrophobicity)으로 인하여 크로마토그램 상에서 혈액 내 대상 펩타이드와 동일한 시간(RT)에 용출(elution)된다. 내부표준 펩타이드는 MRM 분석 전에 50fmol 농도로 혈청 펩타이드 시료에 추가하여 사용하였으며, 각 시료의 생체내(endogeneous) 펩타이드의 검출 여부 확인과 표준화(normalized)에 사용하였다.

실시예 3-3: MRM을 이용한 정량

두 개의 펌프로 구성된 1260 Capillary LC system (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)과 결합된, Jetstream electrospray source를 탑재한 Agilent사의 6490 triple quadrupole (QqQ) 질량분석기를 이용하여 모든 MRM-MS 분석을 수행하였다.

액체 크로마토그래피(Liquid chromatography)로 이동상 A [물 0.1% (v/v) 포름산]와 이동상 B [아세토나이트릴 0.1% (v/v) 포름산]에 의한 탈염(desalting)과 펩타이드 분획(peptide separation)을 진행했다. 분석 시료는 10.0μL를 guard column을 통과하여 analytical column으로 injection 되도록 주입하였다. Flow rate는 40 μL/min 으로 사용하였다. 주입된 시료는 guard column (Agilent Zorbax StableBond C18) (30 mm × 2.1, 1.8 μm, 600 bar)을 통과하며 탈염(desalting) 및 일차(1D) 분획되었다. 일차 분획된 펩타이드가 이동상 A와 이동상 B에 의해 Analytical column (Agilent Zorbax Eclipse SB-C18) (150 mm ×0.5 mm, 3.5 μm)을 통과하며 2차(2D) 분획되어 용출되었다. 이동상 B (0.1% formic acid in acetonitrile)로 5 min 간, 10%에서 60%까지, 1분간 90%의 농도 구배를 통해 peptide 를 용출하였다. 질량분석기(Mass spectrometry)는 용출된 펩타이드에 대한 트랜지션(transition)을 MRM mode 로 monitoring 하였다. 가스 온도는 250 ℃, gas flow는 15 L/min으로 사용하였으며, nebulizer는 30 psi, sheath gas temperature는 350℃, sheath gas flow는 12 L/min으로 사용하였다. Capillary voltage 및 nozzle voltage는 각각 2500 V, 2000 V로 사용하였다. Quadruple 1(Q1)과 Quadruple 3(Q3)에서의 resolution은 unit으로 설정하였다. Dwell time은 total cycle time이 2 sec 정도가 되도록 설정하여 모든 대상 펩타이드에 대해서 분석을 한 다음, 용출되는 retention time을 선정하였다. 이를 근거로 window size 5 min 으로 scheduled MRM 방법으로 분석을 진행하였다.

실시예 3-4: MRM 데이터 분석

실시예 3-3에서 수득한 결과는 Skyline (http://proteome.gs.washington.edu/software/skyline)을 사용하여 MRM 분석용 펩타이드 및 단편 이온을 선별하였다. Skyline은 MRM 방법 개발 및 분석용의 오픈 소스 소프트웨어이다(Stergachis AB, et al., 2011, Nat Methods 8: 1041-1043). 질량분석기에서 생산된 MRM 분석 원데이터(raw data) 파일를 skyline 프로그램에 입력(import) 및 조정(align)하여 형상(feature)을 정량하였다. Savitzky-Golay 방법을 적용시켜 데이터 포인트를 완화시켰다(smoothen). MRM-MS 분석 결과를 가시적으로 검사하여, 전이(transition)의 피크 면적을 계산하였다. 내부표준물질 펩타이드(SIS 펩타이드)에 대하여 표준화(normalized)된 피크 면적을 사용하여 상대적 농도(abundance)를 비교하였다.

실시예 3-5: 통계 분석

간암 고위험군과 간암군에서 발현 차이를 보이는 바이오마커를 확인하기 위하여 3개의 비교-대조군으로 구성하여 단변수분석(univariable analysis)과 다변수분석(multivariable analysis)으로 다음과 같은 비교군에 대하여 마커를 평가했다: 고위험군(HBV+LC) vs. 간암군(HCC); B형 간염군(HBV) vs. 간암군(HCC); 간경화군(LC) vs. 간암군(HCC).

첫 번째로 단변수 분석은, 마커 후보군 177개의 단백질의 385개의 펩타이드를 대상으로 3개의 비교-대조군을 로지스틱 회귀 분석(logistic regresson) 방법으로 1:1 비교하였다. 3회의 실험에 대하여 각각 분석하였다. 분석 결과는 ROC (Receiver Operator Characteristic) 커브를 이용하여 개발 마커의 효능을 평가하였다. ROC 커브는 민감도와 특이도가 서로 어떤 관계를 갖고 변하는지를 이차원 평면 상에 표현한 것으로 ROC 아래의 면적에 해당하는 AUC (Area Under Curve) 값이 클수록 우수한 진단 방법이라고 할 수 있다. 본 원에서는 AUC ≥ 0.60인 마커를 비교-대조군에서 발현 차이를 보이는 마커로 선별하였다.

두 번째로, 마커 후보군 177개의 단백질의 385개의 펩타이드를 대상으로 3개의 비교-대조군에 각각 다변수분석을 실시하였다. 1차와 2차 실험을 통합하여 분석 데이터로 사용했고, 3차 실험 결과로 다변수 분석 결과를 검증하였다. 분석 방법은 로지스틱 회귀분석(logistic regression)과 서포트 벡터 머신(support vector machine)의 2종을 사용했다. 선행 기술을 참조하여 2종의 재표본추출법(Resampling) 방법을 이용했다. 선행 기술 Kim H. et al., Sci Rep. 2017 Aug 25;7(1):9449 및 Kim H. et al.,M ol Cell Proteomics. 2017 Jul;16(7):1312-1323을 참조한 교차 검증(cross validation) 방법은 5-fold 와 10-fold로 설정하여 분석하였다. 선행 기술 Meyers RLet. al., Lancet Oncol. 2017 Jan; 18(1)을 참조한 부트스트랩(bootsrap) 방법은 분석 데이터를 0.7과 0.9 의 비율(ratio)로 등분하여 분석하였다. ROC 커브와 Accuracy를 사용하여 다변수분석 기반 모형의 진단력과 정확도를 확인하였다. 본 원에서는 AUC ≥ 0.80으로 조합되는 다중 마커 조합을 간암군과 대조군을 구별하는데 영향이 있는 마커로 선별하였다. 통계 분석은 SPSS ver.23 (IBM, USA) 과R (Ver. 3.4.1)을 이용하여 분석하였다.

실시예 4: 최종 마커 도출

실시예 4-1. 실제 개별 시료 적용을 통한 간암 조기진단 마커 후보군 도출

실시예 2-3에 기재된 최종 MRM 분석을 위한 타켓 마커 177개 단백질의 385개 펩타이드를 대상으로 아산병원으로부터 시료를 전달받은 시점마다 MRM 분석을 수행하였다. MRM 분석을 위한 임상시료의 전처리 과정부터 질량분석기 주입하는 순서까지 맹검(blind)법과 무작위 배치(randomization batch)에 의한 실험 계획(experimental design)을 수립하였다. 1차 실험으로 총 150명(50 B형 간염, 50 간경화, 50 간암)의 혈액 시료를 MRM 분석하였다. 2차 실험으로 총 150명(50 B형 간염, 50 간경화, 50 간암)의 혈액 시료를 MRM 분석 하였다. 3차 실험으로 총 140명(57 B형 간염, 43 간경화, 40 간암)의 혈액 시료를 MRM 분석 하였다. MRM 분석은 기본적으로 실시예 3에 기재된 방법과 동일하게 수행하였다.

요약하면, Agilent 사의 두 개의 펌프로 구성된 1260 Capillary LC system (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)에 결합되어 있고, Jetstream electrospray source를 탑재한 Agilent 사의 6490 triple quadrupole (QqQ) mass spectrometer를 이용하여 모든 MRM-MS 분석을 수행하였다. MRM 분석 결과는 스카이라인(Skyline)을 사용하여 처리하였다.

실시예 2에서 선정된 177개 단백질 및 이로부터 유래된 385개 펩타이드에 대하여 단변수분석(univariable analysis)과 다변수분석(multivariable analysis) 통해 최종 마커를 도출하였다. 단변수 분석으로 간암군을 고위험군(HBV+LC), B형 간염군(HBV), 그리고 간경화군(LC)을 비교하여 발현 양상 차이와 단일 마커에 대한 개별 진단력을 확인하였다.

상기 도출된 마커 후보군에 대하여 단변수 및 다변수분석을 통한 최종 마커를 도출하였다. 단변수 및 다변수 분석은 각각 하기 실시예 4-2 및 4-3에 기재되어 있으며, 이를 통해 최종 선별된 마커는 앞서 기재된 표 1-1, 1-2 및 표 1-3에 개시되어 있으며, AUC 값은 평균값으로 나타냈다.

실시예 4-2. 단변수분석 ( univariable analysis)을 통한 마커 도출

실시예 2-3에서 선정된 177개 단백질 및 385개 펩타이드를 개별시료에 적용하여 단일 마커로서 사용될 수 있는 마커를 도출하였다.

간암군을 고위험군(HBV+LC), B형 간염군(HBV), 그리고 간경화군(LC)에서 각각 1:1로 비교하여 대조군에 따른 개별 단일 마커마다 간암 발병에 따른 발현 양상을 비교 확인하였다.

3개의 비교군(B형 간염 vs. 간암, 간경화 vs. 간암, B형 간염 + 간경화 vs. 간암)에 대하여 간암 감시 진단 마커 후보군 177개 단백질, 385개 펩타이드를 로지스틱 회귀 분석(logistic regresson) 방법으로 1:1 비교하였다. ROC 커브에 의한 AUC 값으로 비교 그룹 간에 차이를 보이는 단일 마커를 확인하였다. 통계 분석은 SPSS ver.23 (IBM, USA)과 R (Ver. 3.4.1)을 이용하여 분석하였다.

간암 모니터링/진단을 위한 마커 후보는 3개의 비교군에서 1차, 2차, 3차 실험에서 모두 AUC ≥ 0.60으로 발현 차이를 보이고 동일한 발현 양상을 보이는 마커만을 선별하였다(표 3-1 및 3-2 참조). 그 결과 간암 고위험군과 간암군에서 발현 차이를 보이는 총 55개 단백질과 이로부터 유래된 122개 펩타이드가 선별되었다. 마커 리스트 및 펩타이드는 표 3-1 및 3-2에 개시되어 있다.

[표 3-1]

[표 3-2]

상기 55개 마커 중에서, 특히 52개의 마커는 B형 간염군(HBV) vs. 간암군(HCC) 비교했을 때 52개 단백질의 118개 펩타이드가 서로 다르게 발현되는 것을 확인하였고 표 4-1 및 4-2에 표시하였다. 이 중 13개 단백질의 30개 펩타이드가 간암군에서 높게 발현되었고, 39 단백질의 88개 펩타이드가 B형 간염군에서 높게 발현되었다. 이 중 특히 6개의 단백질 VCAM1, C7, IGFALS, CLU, PPBP7, 및 SERPIND1이 3회의 실험에서 모두 AUC≥ 0.70으로 확인되었다. 이중 VCAM1과 C7은 간암군에서 높게 발현하였고 IGFALS, CLU, PPBP7, 및 SERPIND1 는 B형 간염군에서 높게 발현되었다.

[표 4-1]

[표 4-2]

상기 55개 마커 중에서, 특히 간경화군(LC) vs. 간암군(HCC) 비교 결과, 5개 단백질 APOB, AFP, SERPINA5, CETP, 및 MPO의 6개 펩타이드가 3번의 실험에서 AUC ≥ 0.60으로 확인되었고 표 4-3에 표시하였다. 마커(APOB, AFP, SERPINA5)는 간암군에서 높게 발현되었고, 2개 마커(CETP, MPO)는 간경화군에서 높게 발현되는 것을 확인하였다.

[표 4-3]

상기 55개 마커 중에서, 특히 간암 고위험군(HBV+LC) vs. 간암군(HCC) 비교에서는 AFP, SERPINA5, CETP 및 FETUB 4개 단백질의 4개의 펩타이드가 3회의 실험에서 공통으로 AUC ≥ 0.60으로 확인되었고 표 4-4에 표시하였다. 이중, AFP와 SERPINA5가 간암군에서 높게 발현되었고, CETP와 FETUB 는 간암 고위험군에서 높게 발현되었다. AFP는 1차 실험에서만 AUC ≥ 0.70으로 간암군에서 높게 발현되었고, 3차 실험에서 CETP, FETUB, SERPINA5가 확인되었다. SERPINA5는 3차 실험에서 AUC=0.915를 보여 매우 높은 구분력을 보였다.

간암 고위험군(간염군+간경화군)은 두 질병군의 데이터를 통합하여 분석을 하였다. 임상적으로는 간경화의 경우 B형 간염이 발병 원인이기도 하므로 연구에 사용된 시료 또한 B형 간염을 거쳐 간경화로 질병이 진행된 환자의 시료가 포함되어 있을 수도 있다. 하지만 B형 간염에서 곧바로 간암으로 진행되는 경우도 있다. 따라서 간염에서 간경화로 진행되었다 하더라도 간경화가 간염을 포함한다고 할 수 없다. 왜냐하면 간경화가 과거 간염이었던 상태를 대변하는 것은 아니고 현재 간경화 만을 나타내기 때문에다.

상기 마커는 특히 간염 또는 간경화로 진단되지 않은 만성 간염 환자의 간암 조기 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

[표 4-4]

실시예 4-3. 다변수분석(multivariable analysis)을 통한 마커 선별

3개 비교군 (B형 간염 vs. 간암, 간경화 vs. 간암, B형 간염 + 간경화 vs. 간암) 대해서, 간암 감시진단 마커 후보군 177개 단백질의 385개 펩타이드를 동시에 다변수분석하여 다중 마커들 간의 인과 관계를 확인하였고 단일 마커들과 인과 관계가 있는 다중 마커 조합을 확인하였다.

다변수분석을 위해서 1차 실험과 2차 실험을 통합한 데이터를 사용하여 여러 변수들에 의한 교란 효과(confounding effect)를 방지하였다. 3차 실험 데이터는 1-2차 실험에서 도출한 다변수분석 기반 모형을 검증하는 독립 데이터로 사용하였다. 다변수 분석에 의해 간암 발병에 영향력 있는 마커들의 조합된 모형은 간암군과 대조군을 구분할 수 있는데, 분석 방법에 따라 결과에 영향을 미치는 마커가 다르게 선별 및 조합될 수 있다. 이를 보완하기 위하여 로지스틱 회귀분석(logistic regression) 과 서포트 벡터 머신(support vector machine) 2종을 사용했다. 다변수분석에 의하여 선별되고 조합된 모형은 단일 마커에 비하여 높은 진단력과 정확도로 간암군과 대조군을 구분할 수 있다. 하지만, 주어진 데이터 전체를 사용해 모형을 만들 경우 해당 데이터에서는 좋은 결과를 보여주지만 과적합(Overfitting)과 같은 이유로 새로운 데이터에서는 좋지 않은 결과를 보이는 모형을 만들어질 가능성이 있다. 이를 해결하기 위하여 재표본추출법(Resampling) 방법을 이용하였다. 선행 기술을 참조하여, Kim H. et al., Sci Rep. 2017 Aug 25;7(1):9449 및 Kim H. et al., Mol Cell Proteomics. 2017 Jul;16(7):1312-1323을 참조하여 교차 검증(Cross validation) 방법을 5-fold 와 10-fold로 사용하여 다변수 분석에 의한 모형 확인을 하였다. 선행 기술 Meyers RLet. al., Lancet Oncol. 2017 Jan; 18(1): 122131을 참조하여 0.7과 0.9 의 비율(ratio)로 데이터를 등분한 부트스트랩(bootsrap)방법을 다변수 분석에 의한 모형 확인을 하였다. 최종적으로 ROC 커브와 Accuracy를 사용하여 다변수분석 기반 모형의 진단력과 정확도를 확인하였다. 통계 분석은 SPSS ver.23 (IBM, USA)과 R (Ver. 3.4.1)을 이용하여 분석하였다.

다변수 분석 결과, 간암군 발현 차이가 있는 단일 마커를 포함하여 인과 관계에 있는 다중 마커가 조합된 모형으로 단일마커 대비 향상된 진단력으로 간암군과 대조군을 구분할 수 있는 것을 확인하였다.

간암 모니터링/진단을 위한 마커 후보는 2종의 분석 방법과 재표본추출법에 의해 AUC ≥ 0.80으로 조합되는 마커이다(표 5-1 및 5-2 참조). 그 결과 간암군과 고위험군을 구분할 수 있는 모형으로 조합될 수 있는 총 81개 단백질과 이로부터 유래된 121개 펩타이드가 선별되었고 표 5-1 및 5-2에 기재하였다.

[표 5-1]

[표 5-2]

실시예 4-4. 다변수분석에서 선별된 마커를 이용한 다중 마커 조합의 생성

실시예 4-3에서 선별된 마커 리스트(표 5-1 및 5-2 참조)로 부터, “간암 고위험군 (간염 + 간경화) vs. 간암군, 간경화군 vs. 간암군, B형 간염군 vs. 간암군”에 대해서 로지스틱 회귀분석(logistic regression)과 서포트 벡터 머신(support vector machine)에 의하여 다중마커들이 조합된 모형을 AUC와 Accuracy를 기준으로 선별하였다.

3개의 비교군에 대한 2종의 재표본추출법과 2종의 분석 방법에서, AUC ≥ 0.80으로 간암 발병에 영향력이 있는 마커들로 조합되는 24개의 모형을 선별하였다.

이 중 교차 검증(Cross validation)을 사용했을 때, 다수의 마커들이 조합되어 AUC ≥ 0.80으로 확인된 모형 12개를 표 6-1에 표시하였다.

[표 6-1]

부트스트랩(bootsrap)을 사용했을 때, 다수의 마커들이 조합되어 AUC ≥ 0.80으로 확인된 모형 12개를 표 6-2에 표시하였다.

[표 6-2]

상기 표 6-1 및 6-2에서, 2종의 분석 방법에 의해 다중 마커가 조합된 모형 중 가장 높은 AUC와 Accuracy를 보이는 모형은, 로지스틱 회귀분석(logistic regression)에 의한 모형 중 21개 마커가 조합된 모형이 AUC=0.970, Accuracy=0.933으로 가장 좋은 모형이었고, 서포트 벡터 머신(support vector machine) 방법에서는 19개의 마커가 조합된 모형이 AUC=0.923, Accuracy=0.874으로 가장 우수했다. 3차 데이터(Valdation set)에서 로지스틱 회귀분석에 의한 21개의 마커 조합 모형이 AUC=0.928, Accuracy=0.821로 확인되었다. 서포트 벡터 머신에 의한 19개의 마커 조합 모형은 AUC=0.894, Accuracy=0.812으로 모형의 분별력이 검증되었다. CETP, FGA, SERPINA5, MPO, SERPINA10, SHBG, ALB, APOB, AFP, ITIH2, SERPINA4, PVR, FETUB, TF, F2, THBS1 마커가 2종의 분석 방법(logistic regression과 support vector machine)에서 공통으로 조합되었다.

상기 표 6-1과 표 6-2에 개시된 마커의 조합에서 간암 고위험군과 간암군을 비교(HBV + LC vs. HCC)했을 때, 47개 단백질, 62개 펩타이드가 조합가능한 마커로 선별되었으며, 조합에 사용된 마커 리스트는 표 7-1에 표시하였다.

[표 7-1]

상기 표 6-1과 표 6-2에 개시된 마커의 조합에서 간경화군(LC)과 간암군(HCC)의 비교(LC vs. HCC)에서는 43개 단백질, 53개 펩타이드가 조합가능한 마커로 선별되었고, 조합에 사용된 마커 리스트는 표 7-2에 표시하였다.

[표 7-2]

상기 표 6-1 및 표 6-2에서 선별된 마커 중에서 12개 이상의 마커가 조합되면 AUC > 0.90으로 매우 좋은 진단력을 보여주었기에 3차 데이터(Valdation set)까지 확인하였다. CAT, APOL1, RBP4, HDLBP, AZGP1, CETP, FGA, APOB, SERPINA5, SERPINA4, SERPINA10, APOA4, AFP, ITIH2가 2종의 분석 방법(logistic regression과 support vector machine)에서 공통으로 조합되었다. 2종의 분석 방법에 의해 다중 마커가 조합된 모형 중 가장 높은 AUC와 Accuracy를 보이는 모형은, 로지스틱 회귀분석(logistic regression)으로 12개의 마커가 조합된 모형이 AUC=0.940, Accuracy=0.950으로 가장 우수했고, 서포트 벡터 머신(support vector machine)으로 14개 마커 조합 모형이 AUC=0.970, Accuracy=0.950으로 가장 우수했다. 3차 데이터(Valdation set)에서는 로지스틱 회귀분석(logistic regression)의 12 마커 조합 모형과 서포트 벡터 머신(support vector machine)에 의한 14개의 마커 조합 모형의 AUC 값이 0.923, 0.890이었고 Accuracy 값은 0783, 0.819로 2종의 모형의 진단력과 정확도가 검증되었다.

표 6-1과 표 6-2에 개시된 마커의 조합에서 B형 간염군과 간암군 비교(HBV vs. HCC)에서는 39개 단백질, 47개 펩타이드가 조합되었고, 조합에 사용된 마커 리스트는 표 7-3에 표시하였다.

[표 7-3]

상기 표 6-1 및 표 6-2에서 APOB, CETP, AFP, ITIH2, SERPINA4, SERPINA10, CAT, IGFALS, C7, PPBP, FABP1, FCGBP, ITIH1 마커가 두 알고리즘(logistic regression과 support vector machine)에서 공통으로 조합되었다. 2종의 분석 방법에 의해 다중 마커가 조합된 모형 중 가장 높은 AUC와 Accuracy를 보이는 모형은, 로지스틱 회귀분석(logistic regression)으로 11개 마커가 조합된 모형은 AUC=0.970, Accuracy=0.930이었고, 서포트 벡터 머신(support vector machine)으로 19개 마커가 조합된 모형이 AUC=0.960, Accuracy=0.800으로 확인되었다. 2종의 모형을 3차 데이터(Valdation set)에서 검증했을 때 11개 마커 조합 모형은 AUC와 Accuracy가 0.851, 0.773으로 검증되었다. 19개 마커 조합 모형은 AUC와 Accuracy가 각각 0.910, 0.825로 모형의 진단력과 정확도가 검증되었다.

상기 표 6-1 및 6-2에 나열된 다중 마커 조합에서, AUC ≥ 0.90, accuracy ≥ 0.80인 다변수 기반 모형 중 3차 데이터(validation set)에서도 AUC ≥ 0.85으로 진단력이 검증된 모형의 마커 리스트는 표 8에 개시되었다.

다변수 분석 결과, 특히 간암 고위험군 대비 간암군에서 개별 단일 마커보다 다수의 마커를 조합할 경우 진단력이 향상되는 것을 확인하였다.

[표 8]

본 발명에서는 총 440개의 혈청시료를 이용한 분석결과 간암 고위험군인 B형 간염(HBV) 군 및 간경화(LC) 군과 간암(HCC) 군과의 비교에서 차별적 발현 양상을 나타내는 100개의 단백질 및 이로부터 유래된 총 196종의 펩타이드를 최종적으로 선별하였으며, 이러한 마커 또는 마커의 조합은 간암 고위험군에서 간암을 조기에 진단할 수 있는 마커로 유용하게 사용될 수 있다.

이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims

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하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 마커 조합의, 혈액에서 검출용 물질을 포함하는, 간암 고위험군의 간암 감시 진단용 조성물로, 상기 간암 고위험군은 B형 간염 또는 간경화 환자인, 간암 고위험군의 간암 감시 진단용 조성물:
ALB, APOB, APOL1, BTD, CDH1, CAT, CETP, ESYT1, AFP, FGA, GP5, GSS, SERPINA5, ITIH2, ITIH2, ERPINA4, LUM, MPO, PON1, PVR, SAA4, 및 SERPINA10;
APOB, CAT, CETP, C7, AFP, FETUB, FGA, GP5, SERPIND1, SERPINA5, ITIH2, SERPINA4, LGALS3BP, MPO, QSOX1, SHBG, TF, VTN, AZGP1, 및 SERPINA10;
LRG1, APOC3, CETP, AFP, SERPINA5, TF, 및 SERPINA10;
APOC4, AFP, SERPINA5, LMNB1, MPO, PVR, 및 SERPINA10;
SERPINA1, APOB, CAT, CETP, AFP, FETUB, FGA, GSS, SERPINA5, ITIH2, SERPINA4, UBA2, SHBG, F2, THBS1, THBS1, 및 SERPINA10;
CETP, C7, AFP, IL1RAP, SERPINA5, LGALS3BP, MPO, HDLBP, 및 SERPINA10;
ALB, APOB, CA1, CETP, C3, FCGBP, AFP, FETUB, FGA, JCHAIN, SERPINA5, ITIH2, SERPINA4, PRDX2, SELENOP, SHBG, THBS1, UCHL3, 및 SERPINA10; 및
ALB, APOB, CA1, CETP, AFP, FETUB, SERPINA5, ITIH2, SERPINA4, MPO, F2, THBS1, 및 SERPINA10.
하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 마커 조합의, 혈액에서 검출용 물질을 포함하는 간암 고위험군의 간암 감시 진단용 조성물로, 상기 간암 고위험군은 B 형 간염 환자인, 간암 고위험군의 간암 감시 진단용 조성물:
IGFALS, APOA4, C7, PPBP, F9, FABP1, FCGBP, AFP, ITIH1, SERPINA4, 및 SERPINA10;
IGFALS, APOB, APOC3, PPBP, FABP1, FCGBP, AFP, ITIH1, SERPINA4, PROS1, 및 SERPINA10;
ALB, IGFALS, CETP, C7, PPBP, FABP1, AFP, IL1RAP, ITIH1, ITIH2, SERPINA4, S100A13, 및 SERPINA10;
ALB, APOB, BCO2, CDH1, CA1, BCHE, C7, PPBP, FABP1, FCGBP, AFP, FETUB, ITIH1, SERPINA4, KNG1, LGALS3BP, PSMD1, VCAM1, 및 SERPINA10;
IGFALS, CA2, CETP, C7, PPBP, FABP1, FCGBP, FCN3, AFP, FGA, ITIH1, SERPINA4, 및 SERPINA10;
IGFALS, SERPINC1, APOA1, CAT, C7, PPBP, F9, FCGBP, AFP, FGA, ITIH2, SERPINA4, PROZ, QSOX1, 및 SERPINA10;
APOB, APOC4, APOH, CDH1, PPBP, FABP1, AFP, FETUB, SERPINA4, 및 SERPINA10; 및
APOB, APOC4, APOH, APOM, CAT, PPBP, FABP1, AFP, FETUB, ITIH1, SERPINA4, 및 SERPINA10.
하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 마커 조합의, 혈액에서 검출용 물질을 포함하는 간암 고위험군의 간암 감시 진단용 조성물로, 상기 간암 고위험군은 간경화 환자인, 간암 고위험군의 간암 감시 진단용 조성물:
APOB, APOL1, CAT, CETP, C7, FABP1, AFP, FGA, FN1, IGHM, SERPINA5, ITIH2, SERPINA4, PON1, PON1, 및 SERPINA10;
BCO2, CAT, CETP, CFH, BCHE, AFP, FGA, SERPINA5, SELENOP, UCHL3, AZGP1, 및 SERPINA10;
AMBP, APOB, APOM, C1RL, CAT, CETP, CLU, PPBP, HSP90B1, F9, FGA, GSS, SERPINA5, SERPINA4, RBP4, HDLBP, AZGP1, 및 SERPINA10;
APOA4, APOB, C1RL, CETP, AFP, FGB, SERPIND1, SERPINA5, SERPINA4, LUM, QSOX1, SHBG, 및 SERPINA10;
APOA4, APOB, APOL1, CETP, C9, FBLN1, AFP, FGA, SERPINA5, ITIH2, 및 SERPINA10;
SERPINF2, APOB, CETP, FBLN1, AFP, FGA, SERPINA5, RBP4, HDLBP, 및 SERPINA10;
APOB, CETP, AFP, FGA, SERPINA5, SERPINA4, F2, 및 SERPINA10; 및
APOA4, APOB, APOL1, CA2, CETP, CLU, C6, AFP, FGA, SERPINA5, ITIH2, SERPINA4, AZGP1, 및 SERPINA10.
제 10 항에 있어서,
상기 마커의 조합은 다음 중 어느 하나인, 간암 고위험군의 간암 감시 진단용 조성물:
APOB, CAT, CETP, C7, AFP, FETUB, FGA, GP5, SERPIND1, SERPINA5, ITIH2, SERPINA4, LGALS3BP, MPO, QSOX1, SHBG, TF, VTN, AZGP1 및 SERPINA10; 또는
ALB, APOB, CA1, CETP, C3, FCGBP, AFP, FETUB, FGA, JCHAIN, SERPINA5, ITIH2, SERPINA4, PRDX2, SELENOP, SHBG, THBS1, UCHL3, 및 SERPINA10.
제 11 항에 있어서,
상기 마커의 조합은 다음 중 어느 하나인, 간암 고위험군의 간암 감시 진단용 조성물:
IGFALS, APOB, APOC3, PPBP, FABP1, FCGBP, AFP, ITIH1, SERPINA4, PROS1, 및 SERPINA10; 또는
ALB, APOB, BCO2, CDH1, CA1, BCHE, C7, PPBP, FABP1, FCGBP, AFP, FETUB, ITIH1, SERPINA4, KNG1, LGALS3BP, PSMD1, VCAM1, 및 SERPINA10.
제 12 항에 있어서,
상기 마커의 조합은 다음 중 어느 하나인, 간암 고위험군의 간암 감시 진단용 조성물:
BCO2, CAT, CETP, CFH, BCHE, AFP, FGA, SERPINA5, SELENOP, UCHL3, AZGP1, 및 SERPINA10; 또는
APOA4, APOB, C1RL, CETP, AFP, FGB, SERPIND1, SERPINA5, SERPINA4, LUM, QSOX1, SHBG, 및 SERPINA10.
제 10 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 혈액은 혈장, 혈청 또는 전혈인, 간암 고위험군의 간암 감시 진단용 조성물.
제 10 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 ELISA 분석용, 딥스틱 래피드 키트(dip stick rapid kit) 분석용, MRM 분석용, 마이크로어레이용, 핵산증폭용, 또는 면역분석용인, 간암 고위험군의 간암 감시 진단용 조성물.
제 17 항에 있어서,
상기 조성물은 MRM 분석용이며, 상기 MRM 분석에 사용되는 각 마커의 펩타이드 서열은 하기 표 1-1, 1-2 및 1-3의 오른쪽 다섯번째 컬럼에 기재된 것인, 간암 고위험군의 간암 감시 진단용 조성물:
[표 1-1]

[표 1-2]

[표 1-3]
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간암 고위험군의 간암 모니터링 또는 간암 조기 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여,
상기 간암 고위험군 유래의 혈액 시료로부터 하나 이상 마커의 조합을 검출 또는 정량하는 단계로, 상기 간암 고위험군은 B형 간염 또는 간경화 환자이고, 상기 하나 이상의 마커의 조합은 하기로 구성되는 군으로부터 선택되며,
ALB, APOB, APOL1, BTD, CDH1, CAT, CETP, ESYT1, AFP, FGA, GP5, GSS, SERPINA5, ITIH2, ITIH2, ERPINA4, LUM, MPO, PON1, PVR, SAA4, 및 SERPINA10;
APOB, CAT, CETP, C7, AFP, FETUB, FGA, GP5, SERPIND1, SERPINA5, ITIH2, SERPINA4, LGALS3BP, MPO, QSOX1, SHBG, TF, VTN, AZGP1, 및 SERPINA10;
LRG1, APOC3, CETP, AFP, SERPINA5, TF, 및 SERPINA10;
APOC4, AFP, SERPINA5, LMNB1, MPO, PVR, 및 SERPINA10;
SERPINA1, APOB, CAT, CETP, AFP, FETUB, FGA, GSS, SERPINA5, ITIH2, SERPINA4, UBA2, SHBG, F2, THBS1, THBS1, 및 SERPINA10;
CETP, C7, AFP, IL1RAP, SERPINA5, LGALS3BP, MPO, HDLBP, 및 SERPINA10;
ALB, APOB, CA1, CETP, C3, FCGBP, AFP, FETUB, FGA, JCHAIN, SERPINA5, ITIH2, SERPINA4, PRDX2, SELENOP, SHBG, THBS1, UCHL3, 및 SERPINA10; 및
ALB, APOB, CA1, CETP, AFP, FETUB, SERPINA5, ITIH2, SERPINA4, MPO, F2, THBS1, 및 SERPINA10;
상기 검출 또는 정량 결과를 대조군 시료의 해당 마커의 상응하는 결과와 비교하는 단계로, 상기 대조군 시료는 간암이 발생하지 않은 B형 간염 또는 간경화 환자 유래이고; 및
상기 대조군 시료와 비교하여, 상기 환자 시료의 마커의 검출 또는 정량 결과가 하기 표 1-1, 표 1-2 및 표 1-3의 오른쪽 마지막 컬럼에 기재된 것과 같이 변화된 경우, 상기 환자 시료를 조기 간암으로 판정하는 단계를 포함하는, 간암 고위험군의 간암 감시 진단 마커를 검출하는 방법:
[표 1-1]

[표 1-2]

[표 1-3]

.
간암 고위험군의 간암 모니터링 또는 간암 조기 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여,
상기 간암 고위험군 유래의 혈액 시료로부터 하나 이상 마커의 조합을 검출 또는 정량하는 단계로, 상기 간암 고위험군은 B형 간염환자이고, 상기 하나 이상의 마커의 조합은 하기로 구성되는 군으로부터 선택되며,
IGFALS, APOA4, C7, PPBP, F9, FABP1, FCGBP, AFP, ITIH1, SERPINA4, 및 SERPINA10;
IGFALS, APOB, APOC3, PPBP, FABP1, FCGBP, AFP, ITIH1, SERPINA4, PROS1, 및 SERPINA10;
ALB, IGFALS, CETP, C7, PPBP, FABP1, AFP, IL1RAP, ITIH1, ITIH2, SERPINA4, S100A13, 및 SERPINA10;
ALB, APOB, BCO2, CDH1, CA1, BCHE, C7, PPBP, FABP1, FCGBP, AFP, FETUB, ITIH1, SERPINA4, KNG1, LGALS3BP, PSMD1, VCAM1, 및 SERPINA10;
IGFALS, CA2, CETP, C7, PPBP, FABP1, FCGBP, FCN3, AFP, FGA, ITIH1, SERPINA4, 및 SERPINA10;
IGFALS, SERPINC1, APOA1, CAT, C7, PPBP, F9, FCGBP, AFP, FGA, ITIH2, SERPINA4, PROZ, QSOX1, 및 SERPINA10;
APOB, APOC4, APOH, CDH1, PPBP, FABP1, AFP, FETUB, SERPINA4, 및 SERPINA10; 및
APOB, APOC4, APOH, APOM, CAT, PPBP, FABP1, AFP, FETUB, ITIH1, SERPINA4, 및 SERPINA10;
상기 검출 또는 정량 결과를 대조군 시료의 해당 마커의 상응하는 결과와 비교하는 단계로, 상기 대조군 시료는 간암이 발생하지 않은 B 형 간염 환자 유래이고; 및
상기 대조군 시료와 비교하여, 상기 환자 시료의 마커의 검출 또는 정량 결과가 표 1-1, 표 1-2 및 표 1-3의 오른쪽 마지막 컬럼에 기재된 것과 같이 변화된 경우, 상기 환자 시료를 조기 간암으로 판정하는 단계를 포함하는, 간암 고위험군의 간암 감시 진단 마커를 검출하는 방법:
[표 1-1]

[표 1-2]

[표 1-3]

.
간암 고위험군의 간암 모니터링 또는 간암 조기 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여,
상기 간암 고위험군 유래의 혈액 시료로부터 하나 이상 마커의 조합을 검출 또는 정량하는 단계로, 상기 간암 고위험군은 간경화 환자이고, 상기 하나 이상의 마커의 조합은 하기로 구성되는 군으로부터 선택되며,
APOB, APOL1, CAT, CETP, C7, FABP1, AFP, FGA, FN1, IGHM, SERPINA5, ITIH2, SERPINA4, PON1, PON1, 및 SERPINA10;
BCO2, CAT, CETP, CFH, BCHE, AFP, FGA, SERPINA5, SELENOP, UCHL3, AZGP1, 및 SERPINA10;
AMBP, APOB, APOM, C1RL, CAT, CETP, CLU, PPBP, HSP90B1, F9, FGA, GSS, SERPINA5, SERPINA4, RBP4, HDLBP, AZGP1, 및 SERPINA10;
APOA4, APOB, C1RL, CETP, AFP, FGB, SERPIND1, SERPINA5, SERPINA4, LUM, QSOX1, SHBG, 및 SERPINA10;
APOA4, APOB, APOL1, CETP, C9, FBLN1, AFP, FGA, SERPINA5, ITIH2, 및 SERPINA10;
SERPINF2, APOB, CETP, FBLN1, AFP, FGA, SERPINA5, RBP4, HDLBP, 및 SERPINA10;
APOB, CETP, AFP, FGA, SERPINA5, SERPINA4, F2, 및 SERPINA10; 또는
APOA4, APOB, APOL1, CA2, CETP, CLU, C6, AFP, FGA, SERPINA5, ITIH2, SERPINA4, AZGP1, 및 SERPINA10;
상기 검출 또는 정량 결과를 대조군 시료의 해당 마커의 상응하는 결과와 비교하는 단계로, 상기 대조군 시료는 간암이 발생하지 않은 간경화 환자 유래이고; 및
상기 대조군 시료와 비교하여, 상기 환자 시료의 마커의 검출 또는 정량 결과가 표 1-1, 표 1-2 및 표 1-3의 오른쪽 마지막 컬럼에 기재된 것과 같이 변화된 경우, 상기 시료를 조기 간암으로 판정하는 단계를 포함하는, 간암 고위험군의 간암 감시 진단 마커를 검출하는 방법:
[표 1-1]

[표 1-2]

[표 1-3]

.
제 28 항에 있어서,
상기 마커의 조합은 다음 중 어느 하나인, 간암 고위험군의 간암 감시 진단 마커를 검출하는 방법:
APOB, CAT, CETP, C7, AFP, FETUB, FGA, FGA, GP5, SERPIND1, SERPINA5, ITIH2, SERPINA4, LGALS3BP, MPO, QSOX1, SHBG, TF, VTN, AZGP1 및 SERPINA10;
또는
ALB, APOB, CA1, CETP, C3, FCGBP, AFP, FETUB, FGA, JCHAIN, SERPINA5, ITIH2, SERPINA4, PRDX2, SELENOP, SHBG, THBS1, UCHL3, 및 SERPINA10.
제 29 항에 있어서,
상기 마커의 조합은 다음 중 어느 하나인, 간암 고위험군의 간암 감시 진단 마커를 검출하는 방법:
IGFALS, APOB, APOC3, PPBP, FABP1, FCGBP, AFP, ITIH1, SERPINA4, PROS1, 및 SERPINA10; 또는
ALB, APOB, BCO2, CDH1, CA1, BCHE, C7, PPBP, FABP1, FCGBP, AFP, FETUB, ITIH1, SERPINA4, KNG1, LGALS3BP, PSMD1, VCAM1, 및 SERPINA10.
제 30 항에 있어서,
상기 마커의 조합은 다음 중 어느 하나인, 간암 고위험군의 간암 감시 진단 마커를 검출하는 방법:
BCO2, CAT, CETP, CFH, BCHE, AFP, FGA, SERPINA5, SELENOP, UCHL3, AZGP1, 및 SERPINA10; 또는
APOA4, APOB, C1RL, CETP, AFP, FGB, SERPIND1, SERPINA5, SERPINA4, LUM, QSOX1, SHBG, 및 SERPINA10.
삭제
제 28 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 정량 또는 검출하는 단계는 ELISA, 딥스틱 래피드 분석, MRM 분석, 마이크로어레이, 핵산증폭, 또는 면역분석 방법에 의해 수행되는 것인, 간암 고위험군의 간암 감시 진단 마커를 검출하는 방법.
제 35 항에 있어서,
상기 방법은 MRM 분석용이며, 상기 MRM 분석에 사용되는 각 마커의 펩타이드 서열은 표 1-1, 1-2 및 1-3의 오른쪽 다섯번째 컬럼에 기재된 것인, 간암 고위험군의 간암 감시 진단 마커를 검출하는 방법:
[표 1-1]

[표 1-2]

[표 1-3]

.