KR102610314B1 - Lrg1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 간질환 진단용 바이오마커 조성물 및 치료용 약학 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 간질환 진단용 바이오마커 조성물에 관한 것으로, 간섬유화의 경우 Lrg1의 증가함을 확인하여 이를 이용하여 간섬유화를 포함한 간질환의 진단에 Lrg1이 활용될 수 있으며, 나아가 Lrg1을 간질환의 치료 타겟으로서의 가능성을 확인하여 간질환의 예방 또는 치료에 활용될 수 있다.
Description
본 발명은Lrg1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 간질환 진단용 바이오마커 조성물 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.
간질환은 알코올, 각종 약물, 독성화학물질, B형 및 C형 간염 바이러스, 담즙정체, 자가면역 등과 같은 다양한 원인에 의해 발생하며, 보통 지방간을 거쳐 간염, 간섬유화 및 간경변으로 진행한다. 지방간은 그 자체로 병적인 상태는 아니며, 원인물질이 제거되면 자연히 회복되는 가역적인 증상이다. 그러나, 간조직에 지방이 과다하게 축적된 상태가 지속적으로 유지되면 지방간염이 발생하고, 그 결과 간세포 괴사와 재생이 반복적으로 일어나며, 이 과정에서 섬유상의 세포외 기질(extracellular matrix: ECM)의 증가 및 축적으로 인하여 간의 섬유화가 진행된다.
간섬유화는 여전히 전세계 인구의 중요한 질환 중 하나이다. 간섬유화는 콜라겐, 피브로넥틴 및 라미닌과 같은 세포외 기질 (ECM) 단백질의 축적과 함께 간의 만성적인 손상의 결과로, 대부분의 종류의 만성적인 질환의 특성은 또한 지속적인 염증, 상처 조직의 형성, 조직 구조 변화 및 장기 부전과 함께 반복적인 간 손상으로 야기된다. 간성상세포(HSC)는 간섬유화에서 핵심적인 역할을 하는 세포로 주목되며, 이는 소섬유 및 비-미소섬유기질 단백질의 주요 근원으로서 섬유화의 중심 과정이다. 휴지 상태의 HSC는 활성화된 상태의 HSC 보다 적은 ECM 단백질을 생산하지만, 반복되는 손상으로 휴지 상태의 HSC가 활성화 상태로 변경되면, 증식하여 활성화로일컬어지는 과정인 근섬유아세포-유사 표현형으로 변형된다.
활성화된 HSC 기능은 과도한 ECM의 축적을 야기하고, 정상적인 구조의 간을 파괴하며, 이는 간에 병리생리학적으로 손상을 입힌다. ECM 단백질의 과발현은 결국 간 부전, 섬유화, 간경변 또는 HSC 활성화에 의한 암을 유발한다. 간 조직에서 축적 및 과발현을 포함하는 ECM 단백질의 비정상적인 상태는 후기 간질환 또는 장애에서 과도한 간기질을 야기한다. 이러한 상태는 진행성 간 질환동안 가장 중요한 단계이다. 따라서, 간섬유화의 예방 및 억제는 만성적인 간질환을 개선하는데 매우 중요하다. 그럼에도 불구하고 현재까지 FDA 승인된 간섬유화 치료제가 개발되지 않았고, 간섬유화에 의해 간암이 발병하는 구체적인 메커니즘에 대해서도 밝혀진 바가 없다.
따라서, 상기 문제를 해결하기 위해서, 간섬유화를 포함한 간질환을 진단하는 방법 및 치료제 개발이 필요한 실정이다.
1. Circulation: Heart Failure. 2019;12:e005962 (2019.12.13. 공개)
본 발명의 목적은 Lrg1(Leucine-rich alpha-2-glycoprotein 1) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 간질환 진단용 바이오마커 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 Lrg1 단백질의 발현 또는 활성 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 함유하는 간질환 진단용 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 간질환 진단용 키트를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 (1) 간질환 환자에서 분리된 시료로부터 Lrg1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Lrg1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; (2) 상기 Lrg1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Lrg1 단백질의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및 (3) 상기 Lrg1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Lrg1 단백질의 발현 수준이 대조군의 시료보다 높은 경우 간질환이라고 판단하는 단계를 포함하는 간질환 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 Lrg1 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 간질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 (1) 간질환 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; (2) 상기 시험물질을 접촉한 간질환 세포에서 Lrg1 단백질의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및 (3) 대조군 시료와 비교하여 상기 Lrg1 단백질의 발현 또는 활성 정도가 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 간질환 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Lrg1(Leucine-rich alpha-2-glycoprotein 1) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 간질환 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 Lrg1 단백질의 발현 또는 활성 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 함유하는 간질환 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 간질환 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 간질환 환자에서 분리된 시료로부터 Lrg1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Lrg1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; (2) 상기 Lrg1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Lrg1 단백질의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및 (3) 상기 Lrg1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Lrg1 단백질의 발현 수준이 대조군의 시료보다 높은 경우 간질환이라고 판단하는 단계를 포함하는 간질환 진단 에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 Lrg1 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 간질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 간질환 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; (2) 상기 시험물질을 접촉한 간질환 세포에서 Lrg1 단백질의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및 (3) 대조군 시료와 비교하여 상기 Lrg1 단백질의 발현 또는 활성 정도가 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 간질환 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 간질환 진단용 바이오마커 조성물에 관한 것으로, 간섬유화의 경우 Lrg1의 증가함을 확인하여 이를 이용하여 간섬유화를 포함한 간질환의 진단에 Lrg1이 활용될 수 있으며, 나아가 Lrg1을 간질환의 치료 타겟으로서의 가능성을 확인하여 간질환의 예방 또는 치료에 활용될 수 있다.
도 1은 Runx3 결핍 세포에서 염증이 증가함을 확인한 결과이다.
도 2는 Runx3 결핍 마우스 제조 방법을 나타낸 것이다.
도 3은 Runx3 결핍 마우스에서 간 혈관내피세포 기능이상을 확인한 결과이다.
도 4는 Runx3 결핍 마우스에서 간섬유화 증상을 확인한 결과이다.
도 5는 Runx3 결핍 세포에서 Lrg1이 증가함을 확인한 결과이다.
도 6은 Runx3 결핍 세포에서 Lrg1이 IL-6/JAK/STAT3 경로를 통해 분비됨을 확인한 결과이다.
도 7은 Lrg1이 HSC에서 SMAD2 및 SMAD3 신호를 통해 α-SMA 및 콜라겐 Ⅰ을 증가시킴을 확인한 결과이다.
도 8은 Lrg1의 HSC 활성화는 TGF-βR 신호에 의함을 확인한 결과이다.
도 9는 Lrg1는 TGF-β와 독립적으로 α-SMA 및 콜라겐 Ⅰ을 증가시킴을 확인한 결과이다.
도 10은 Lrg1가 간섬유화에서 증가하고 Runx3ΔEC 마우스 모델에서 더욱 증가함을 확인한 결과이다.
도 2는 Runx3 결핍 마우스 제조 방법을 나타낸 것이다.
도 3은 Runx3 결핍 마우스에서 간 혈관내피세포 기능이상을 확인한 결과이다.
도 4는 Runx3 결핍 마우스에서 간섬유화 증상을 확인한 결과이다.
도 5는 Runx3 결핍 세포에서 Lrg1이 증가함을 확인한 결과이다.
도 6은 Runx3 결핍 세포에서 Lrg1이 IL-6/JAK/STAT3 경로를 통해 분비됨을 확인한 결과이다.
도 7은 Lrg1이 HSC에서 SMAD2 및 SMAD3 신호를 통해 α-SMA 및 콜라겐 Ⅰ을 증가시킴을 확인한 결과이다.
도 8은 Lrg1의 HSC 활성화는 TGF-βR 신호에 의함을 확인한 결과이다.
도 9는 Lrg1는 TGF-β와 독립적으로 α-SMA 및 콜라겐 Ⅰ을 증가시킴을 확인한 결과이다.
도 10은 Lrg1가 간섬유화에서 증가하고 Runx3ΔEC 마우스 모델에서 더욱 증가함을 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 Lrg1(Leucine-rich alpha-2-glycoprotein 1) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 간질환 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
상기 간질환은 간섬유화, 간암, 간염, 간독성, 알코올성 지방간 및 비알코올성 지방간으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 개체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 개체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 개체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 개체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함한다.
본 발명의 "바이오마커"는 간질환이 발생한 대상체의 조직 또는 세포를 정상 대조군의 조직 또는 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 대조군에 비하여 질환이 발생한 대상체의 조직 또는 세포에서 증가 또는 감소 양상을 보이는 단백질 또는 핵산, 지질, 당지질, 당단백질 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다.
또한, 본 발명은 Lrg1 단백질의 발현 또는 활성 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 함유하는 간질환 진단용 조성물을 제공한다.
상기 Lrg1의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 Lrg1 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 상기 Lrg1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 화합물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, “프라이머”란 DNA 합성의 기시점이 되는 짧은 유전자 서열로써, 진단, DNA 시퀀싱 등에 이용할 목적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 상기 프라이머들은 통상적으로 15 내지 30 염기쌍의 길이로 합성하여 사용할 수 있으나, 사용 목적에 따라 달라질 수 있으며, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화등으로 변형시킬 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, “프로브”란 효소 화학적인 분리정제 또는 합성과정을 거쳐 제작된 수 염기 내지 수백 염기길이의 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 핵산을 의미한다. 방사성 동위원소나 효소 등을 표지하여 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있으며, 공지된 방법으로 디자인하고 변형시켜 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 “항체”는 당해 기술분야에 공지된 용어로서 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 의미한다. 본 발명에서의 항체는 본 발명의 Lrg1에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 항체를 제조할 수 있다. 상기 항체의 형태는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태를 의미한다. 또한, 상기 항체는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.
본 발명에서 사용된 용어 “펩타이드”는 표적 물질에 대한 결합력 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한, 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다. 구체적으로 고분자 단백질 체인에 붙여서 이용이 가능하므로 진단 키트 및 약물전달 물질로 이용될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 “앱타머”는 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 특별한종류의 단일 가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)으로 구성된 폴리뉴클레오티드의 일종을 의미한다. 상술한 바와 같이, 앱타머는 항체와 동일하게 항원성 물질에 특이적으로 결합할 수 있으면서도, 단백질보다 안정성이 높고, 구조가 간단하며, 합성이 용이한 폴리뉴클레오티드로 구성되어 있으므로, 항체를 대체하여 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 조성물을 포함하는 간질환 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 “키트”는 바이오마커 성분에 특이적으로 결합하는 항체, 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체(conjugate), 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액 및 효소 반응 정지액 등을 포함할 수 있으며, 사용되는 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
또한, 본 발명은 (1) 간질환 환자에서 분리된 시료로부터 Lrg1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Lrg1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; (2) 상기 Lrg1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Lrg1 단백질의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및 (3) 상기 Lrg1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Lrg1 단백질의 발현 수준이 대조군의 시료보다 높은 경우 간질환이라고 판단하는 단계를 포함하는 간질환 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 Lrg1 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 간질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 Lrg1 발현 억제제는 Lrg1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 Lrg1 활성 억제제는 Lrg1 단백질에 특이적으로 결합하는 저분자 화합물, 펩타이드, 펩타이드 미메틱스, 앱타머, 항체 및 천연물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구체예에서, 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다. 본 발명에 따른 유효성분의 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 투여량이 0.01 mg/kg 내지 200 mg/kg, 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 (1) 간질환 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; (2) 상기 시험물질을 접촉한 간질환 세포에서 Lrg1 단백질의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및 (3) 대조군 시료와 비교하여 상기 Lrg1 단백질의 발현 또는 활성 정도가 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 간질환 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 Lrg1 발현 수준은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 방사능면역분석(radioimmunoassay), 면역조직화학 (immunohistochemistry), 마이크로어레이(microarray), 웨스턴 블랏(western blotting) 및 유세포 분석법 (FACS)으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나 이상으로 측정할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예 등은 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예 등에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예 등은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실험 예 1> 사람의 간 내피세포에서 Runx3 결핍에 따른 사이토카인 변화 확인
사람의 간 내피세포(Liver sinusoidal endothelial cell, 이하 LSEC라 함.)에서 Runx3 결핍에 따른 사이토카인 변화 확인하기 위해 TMNK-1 cell(사람 불멸화 LSECs)에 siRunx3와 control siRNA를 형질주입 한 후 36시간이 지난 다음에 총 RNA를 분리한 후 qRT-PCR을 진행하였다.
<실험 예 2> Runx3 결핍 마우스 모델 제조
조직 특이적 Cre-loxP 시스템을 이용하여 혈관내피세포(endothelial cells, 이하 EC라 함.) 특이적 Runx3 결핍마우스를 제작하였다. 도 2에서 보여주듯이 Cre recombinase와 Tie2 프로모터를 클로닝하여 Tie2가 발현되는 EC에서 특이적으로 Cre가 활성화되도록 한 쥐(Tie2-Cre mouse)와 Runx3의 exon4의 앞뒤에 loxP site를 넣어 제작한 유전자가 발현되는 Runx3 floxed mouse(Runx3f/f mouse)를 교배하여 EC에서 Runx3 exon4가 결손된 마우스를 제작하였다.
<실험 예 3> 면역조직화학방법
마우스 간을 포름알데히드에 고정한 후 파라핀 블록을 만들고, 이 파라핀 블록 조직을 5μm 두께로 잘라 슬라이드에 얹어 사용하였다. 이 파라핀 조직절편에서 파라핀을 제거하고 여러 과정을 거쳐 수화시킨 후 시트레이트 용액(pH 6.0) 안에서 95℃에서 10 내지 20분 처리한 후 면역조직화학방법(이하 IHC라함.)를 진행하였다. 3% H2O2 용액에서 10분 처리한 후 10% 염소 혈청(goat serum)으로 블로킹하고 1차 항체 용액으로 4℃ 오버나잇하였다. 비오틴이 붙은 2차 항체를 염소혈청이 함유된 용액에 적절히 희석하여 1시간 처리한 후 VECTASTAIN Elite ABC 용액 반응을 30분간 한 후 DAB substrate kit을 처리하여 염색하였다. 또한 동결조직 절편 슬라이드도 사용하였다. 조직절편을 3% BSA/PBS 용액으로 블로킹 과정을 거친 후, 1차 항체를 희석한 용액(1% BSA. 0.3% triton X-100)에서 4℃ 오버나잇 하였다. 2차 형광 항체 용액으로 1시간 처리한 후 DAPI용액이 함유된 용액으로 마운팅한 후 형광현미경 또는 공초점 현미경으로 관찰하였다.
<실험 예 4> 웨스턴 블롯
간조직을 로딩 용액과 섞어 95℃에서 10분간 끓인 후 SDS-PAGE 전기영동으로 단백질을 크기별로 분리 시킨 후 겔을 0.45μm 니드로 섬유소막에 옮긴 후 막을 5% skim milk로 블로킹 하였다. 1차 항체 용액으로 4℃ 오버나잇 한 후 HRP-결합 2차 항체로 1시간 반응시킨 후 ECL substrate로 단백질 밴드를 확인하였다.
<실험 예 5> 혈청 ALT 및 AST 측정
쥐 혈청에서 1시간 응고시키고 4℃ 1500g에서 15분간 원심분리하여 AST, ALT kit(Bio-Vision)으로 측정하였다.
<실험 예 6> 조직학적염색
파리핀조직 슬라이드를 68°C에서 1시간을 둔 다음 여러 농도의 에탄올 용액으로 수화시킨 후 물로 수세한 후 H&E 염색, Masson’s trichrome 염색 및 시리우스 레드 염색의 표준 프로토콜에 따라 염색하였다.
<실험 예 7> Single cell RNA-sequencing
각 마우스 그룹에서 간세포 및 이외의 세포를 따로 분리하여 간세포 10%, 이외의 세포를 90%의 비율로 그룹별 2x107수의 세포를 분석한 후 GOBP 분석을 실시하였다. 또한 조직에서 IHC를 통해 단백질 발현을 확인하였다.
<실시 예 1> 사람의 간 내피세포에서 Runx3 결핍에 따른 사이토카인 변화 확인
사람의 간 내피세포(Liver sinusoidal endothelial cell, 이하 LSEC라 함.)에서 Runx3 결핍에 따른 사이토카인 변화 확인하기 위해 qRT-PCR을 진행하였다.
그 결과, 도 1에 따르면, Runx3 결핍시킨 경우 IL-1β, IL-6, TNF-α, MCP-1, ICAM-1 및 VCAM-1의 발현양이 대조군에 비해 유의하게 증가함을 확인하였다.
<실시 예 2> Runx3 결핍 마우스에서 간 혈관내피세포 기능이상과 간섬유화 증상 확인
(1) Runx3 결핍 마우스 모델 제조
조직 특이적 Cre-loxP 시스템을 이용하여 혈관내피세포(endothelial cells, 이하 EC) 특이적 Runx3 결핍마우스를 제작하였다. 도2에서 보여주듯이 Cre recombinase와 Tie2 promoter를 cloning 하여 Tie2가 발현되는 EC에서 특이적으로 Cre가 활성화되도록 한 쥐(Tie2-Cre mouse)와 Runx3의 exon4의 앞뒤에 loxP site를 넣어 제작한 유전자가 발현되는 Runx3 floxed mouse(Runx3f/f mouse)를 교배하여 EC에서 Runx3 exon4가 deletion된 마우스를 제작하였다.
(2) 어린 Runx3
ΔEC
마우스 모델의 경우
어린 Runx3ΔEC 마우스 모델에서 Runx3 결핍에 따라 변화하는 단백질을 면역조직화학방법 (immunohistochemistry, IHC analysis)으로 유전자를 확인하였다.
그 결과, 도 3에 따르면, 생후 2 내지 3개월된 어린 Runx3ΔEC 마우스 모델의 경우, CD34 및 vWF의 발현양이 Runx3f/f에 비해 증가함을 확인하였으며 생후 6개월된 어린 Runx3ΔEC 마우스 모델의 경우, CD31 및 CD34의 발현양이 Runx3f/f에 비해 증가함을 확인하였다.
(3) 늙은 Runx3
ΔEC
마우스 모델의 경우
늙은 Runx3ΔEC 마우스 모델에서 Runx3 결핍에 따라 변화하는 유전자를 확인하였다.
그 결과 도 4에 따르면, 생후 1년된 늙은 Runx3ΔEC 마우스 모델의 경우, Runx3f/f에 비해 CD31 및 CD34의 발현양이 증가하였으며, 간 조직에서 α-SMA 및 콜라겐 Ⅰ(Collagen Ⅰ)의 발현양이 유의하게 증가함을 확인하여 간섬유화 증상이 발생하였음을 알 수 있었다.
<실시 예 3> Runx3 결핍에 따른 Lrg1 발현양 증가 및 분비 경로 확인
LSEC 세포에서 Runx3를 결핍시킨 경우 어느 유전자의 발현이 변화하는지 알아보기 위해 Single cell RNA-sequencing과 qRT-PCR을 실시하였다.
그 결과, 도 5에 따르면, Lrg1의 발현양이 Runx3를 결핍시키지 않은 경우에 비해 유의하게 증가하였음을 확인하였고 이를 통해 Lrg1이 간섬유화와 같은 간질환의 치료 타겟으로서의 가능성을 확인하였다.
또한, LSEC 세포에서 Lrg1이 분비되는 경로를 찾기 위해 세포 용해물과 컨디셔닝 미디어를 가지고 웨스턴 블롯을 실시하였다.
그 결과, 도 5와 도 6에 따르면, Lrg1은 Runx3를 결핍시킨 경우 발현양이 증가한 반면, Runx3를 결핍시키고 JAK 억제제인 룩소리티닙(Ruxolitinib)을 함께 처리하거나 IL-6 중화 항체인 토실리주맙(Tocilizumab)을 함께 처리한 경우, Lrg1의 발현양이 감소함을 확인하였다. 이를 통해 Lrg1은 IL-6/JAK/STAT3경로를 통해 분비됨을 알 수 있었다.
<실시 예 4> Lrg1을 통한 α-SMA 및 콜라겐 Ⅰ발현양 증가 확인
간성상세포(이하 HSC라함.)가 간섬유화에 관여하는 주된 세포이므로 간성상세포주인 LX-2세포를 사용하여 Lrg-1이 간섬유화에 관여하는지 알아보았다. Lrg-1 재조합 단백질을 LX-2 세포에 처리한 후 α-SMA 및 콜라겐 Ⅰ의 발현을 웨스턴 블롯으로 확인하였다.
그 결과, 도 7에 따르면, HSC에 Lrg1을 처리한 경우 α-SMA 및 콜라겐 Ⅰ의 발현이 증가함을 확인하였다. 이를 통해 Lrg1이 간섬유화를 악화시키는 것을 알 수 있다.
또한, HSC에 Lrg1 처리 후 p-SMAD2 및 p-SMAD3의 발현이 증가함을 확인하여 Lrg1는 p-SMAD2/p-SMAD3 경로를 통함을 알 수 있었으며, 도 8에 따르면 TGF-β 수용체 타입 1 억제제인 갈루니서팁(Galunisertib) 처리 시 Lrg1 처리에 의해 증가한 α-SMA, 콜라겐 Ⅰ, p-SMAD2 및 p-SMAD3이 모두 감소함을 확인하여 Lrg1은 TGF-βR/p-SMAD2/p-SMAD3 경로를 이용함을 확인하였다.
나아가, 도 9에 따르면, Lrg1와 TGF-β을 각각 단독 처리한 경우 α-SMA 및 콜라겐 Ⅰ의 발현이 증가하였고, Lrg1와 TGF-β를 병용 처리한 경우에도 α-SMA 및 콜라겐 Ⅰ의 발현이 증가함을 확인하여 Lrg1는 TGF-β와 독립적으로 α-SMA 및 콜라겐 Ⅰ을 증가시킴을 확인하였다.
<실시 예 5> Lrg1의 간섬유화 치료 타겟 확인
Lrg1이 간섬유화의 치료 타겟이 됨을 확인하기 위해 동물모델에서 분리한 간조직을 IHC를 실시하였다.
그 결과, 도 10에 따르면, 티오아세트아미드(Thioacetamide, TAA) 유도 간섬유화 모델 마우스는 생리식염수를 주사한 대조군에 비해 Lrg1의 발현양이 증가하였으며, 또한 Runx3ΔEC의 경우가 Runx3f/f에 비해 Lrg1의 발현양이 증가함을 확인하였다. 나아가 간섬유화 증상을 보이는 1년생 마우스의 경우에서도 Runx3ΔEC의 경우가 Runx3f/f에 비해 Lrg1의 발현양이 증가함을 확인하였다. 이를 통해 Lrg1은 간섬유화의 경우 발현이 증가함을 확인하여 이는 간섬유화에 대한 치료 타겟이 될 수 있음을 알 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (11)
- Lrg1(Leucine-rich alpha-2-glycoprotein 1) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 간섬유화 또는 간경화 진단용 바이오마커 조성물.
- 청구항 1에 있어서,
상기 간섬유화 또는 간경화는 α-SMA 또는 콜라겐 Ⅰ이 증가된 환자의 간섬유화인 것을 특징으로 하는 간섬유화 또는 간경화 진단용 바이오마커 조성물. - Lrg1 단백질의 발현 또는 활성 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 함유하는 간섬유화 또는 간경화 진단용 조성물.
- 청구항 3에 있어서,
상기 Lrg1의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 Lrg1 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 상기 Lrg1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 화합물인 것을 특징으로 하는 간섬유화 또는 간경화 진단용 조성물. - 청구항 3 또는 청구항 4의 조성물을 포함하는 간섬유화 또는 간경화 진단용 키트.
- (1) 환자에서 분리된 시료로부터 Lrg1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Lrg1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;
(2) 상기 Lrg1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Lrg1 단백질의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및
(3) 상기 Lrg1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Lrg1 단백질의 발현 수준이 대조군의 시료보다 높은 경우 간섬유화 또는 간경화라고 판단하는 단계를 포함하는 간섬유화 또는 간경화 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법. - Lrg1 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 간섬유화 또는 간경화 예방 또는 치료용 약학 조성물로서, 상기 Lrg1 발현 억제제는 Lrg1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나이거나, 상기 Lrg1 활성 억제제는 Lrg1 단백질에 특이적으로 결합하는 저분자 화합물, 펩타이드, 펩타이드 미메틱스, 앱타머, 항체 및 천연물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 간섬유화 또는 간경화 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| KR20180123978A (ko) * | 2017-05-10 | 2018-11-20 | 서울대학교산학협력단 | 간암 고위험군의 간암 발병 모니터링 또는 진단용 바이오마커 및 그 용도 |
| US20190339288A1 (en) * | 2016-08-24 | 2019-11-07 | Oxford University Innovation Limited | Clinical diagnosis of non-alcoholic fatty liver disease using a panel of human blood protein biomarkers |
-
2023
- 2023-01-27 KR KR1020230010999A patent/KR102610314B1/ko active IP Right Grant
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 1. Circulation: Heart Failure. 2019;12:e005962 (2019.12.13. 공개) |
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