KR101112113B1 - 암 치료에 대한 타겟으로서의 분비 과립 및 과립형성 인자 - Google Patents

암 치료에 대한 타겟으로서의 분비 과립 및 과립형성 인자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 (a) 과립형성 인자(granulogenic factor)-인코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 과립형성 인자의 발현 또는 분비 과립(secretory granule)의 생성을 분석하는 단계를 포함하는 암 치료제의 스크리닝 방법으로, 상기 시험물질이 과립형성 인자의 발현 또는 분비 과립의 생성을 억제시키면 암 치료제로 판단된다. 본 발명에서, 과립형성 인자의 발현은 비-분비성 세포에서 분비성 과립을 유도하고 과립형성 인자의 억제는 분비성 세포에서 분비성 과립 생성을 억제한다. 또한, 본 발명의 과립형성 인자에 의해 생성된 분비 과립은 IP3-의존적 세포내 Ca2+ 조절 기작을 통해 세포 활성을 변화시키며, 세포 내 Ca2+ 항상성의 변화는 암 세포의 발생 및 증식에 영향을 끼친다. 따라서 과립형성 인자 유전자의 발현 또는 과립형성을 억제하거나 또는 과립형성 인자의 작용을 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 암 예방 또는 치료에 이용될 수 있으며, 또한 암 진단용 키트로도 이용될 수 있다.
암, 분비 과립, 크로모그라닌 A, 크로모그라닌 B, 씨크리토그라닌 II

Description

암 치료에 대한 타겟으로서의 분비 과립 및 과립형성 인자{Secretory Granules and Granulogenic Factors as a Target for Cancer Treatment}
본 발명은 암 치료용 생체마커 및 이를 이용한 스크리닝 방법, 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 그리고 암 진단용 키트에 관한 것이다.
뇌에서 신경교세포(glial cells)은 그 자신들뿐만 아니라 주변의 뉴우런들과의 세포내 소통(cellular communication)에 중요한 역할을 수행하는 것으로 생각되어지는데, 이는 뇌에서 소통 네트워크를 발달시키고 풍부하게 한다(Panatier et al. 2006; Montana et al. 2006; Angulo et al. 2004; Fellin et al. 2006; Perea 및 Araque 2005; Volterra 및 Meldolesi 2005; Haydon 및 Carmignoto 2006). 성상교세포(glial astrocyte)는 칼슘-의존적으로 조절되는 엑소사이토시스(exocytotic pathway)에서 다양한 신호 분자들을 저장하고 방출하는 것으로 알려져 있다(Martineau et al. 2008; Bezzi et al. 2004; Coco et al. 2003; Krzan et al. 2003; Montana et al. 2004; Potokar et al. 2008; Parpura 및 Haydon 2000; Kreft et al. 2004; Santello 및 Volterra 2009). 그러므로, 비록 성상 세포에서 다양한 형태의 분비(secretory) 소낭들에 저장된 분자들의 정체성이 부분적으로만 알려져 있을 지라도, 성상 세포에서 세포외(exocytotic) 분비 소낭들은 세포-대-세포 소통에서 본질적인 것으로 보여 진다. 일반적으로, 성상 세포에는 두 가지 형태의 분비 소낭들이 존재한다: (a) 작고 투명한 시냅스-유사 소낭 및 (b) 크고 진한-코어 소낭(large dense-core vesicles)(Bezzi et al. 2004; Crippa et al. 2006; Maienschein et al. 1999; Ramamoorthy 및 Whim 2008). 뉴우런에서 매우 활발한 연구로 인해, 성상 세포의 작고 투명한 시냅스-유사 소낭은 크고 진한-코어 소낭보다 더욱 관심을 받아 왔다.
그럼에도 불구하고, 신경교세포인 성상세포의 크고 진한-코어 소낭은 ATP, 글루타메이트, 신경 펩타이드 및 씨크리토그라닌 II를 포함하는 많은 분자들을 함유하고 있는 것으로 보여져 왔다(Calegari et al. 1999; Coco et al. 2003; Chen et al. 2005; Ramamoorthy 및 Whim 2008; Striedinger et al. 2007). 크로모그라닌 A(CGA) 및 B(CGB)은 그라닌 단백질 패밀리의 주된 두 개의 멤버로서 분비 과립의 원형(prototypical) 마커 단백질이며(Helle 2000; Montero-Hadjadje et al. 2008; Taupenot et al. 2003; Winkler 및 Fischer-Colbrie 1992; Huttner et al. 1991), 씨크리토그라닌 II (SgII) 역시 그라닌 단백질 패밀리의 멤버로 전형적인 분비 과립의 마커 단백질이다(Huttner et al. 1991). 크고 진한-코어 소낭에서 SgII의 존재는 진한-코어 소낭을 전형적인 분비 과립으로 동정하며, 성상 세포에서 진정한(bona-fide) 분비 과립의 존재를 확증한다. 게다가, 버그만 신경교세포는 크로모그라닌 A를 포함하고 있는 것으로 알려져 있다(McAuliffe and Hess 1990). SgII 및 신경 펩타이드(NPY)를 포함하는 크고 진한-코어 소낭에 저장된 분자들은 적절한 자극에 반응하여 칼슘-의존적으로 방출되는 것으로 알려졌으며(Chen et al. 2005; Coco et al. 2003; Ramamoorthy 및 Whim 2008; Striedinger et al. 2007), 이는 성상 세포의 분비 기능에 분비 과립이 관여(participation)되었음을 의미한다.
크로모그라닌 A 및 B, 그리고 씨크리토그라닌 II은 분비 과립의 마커 단백질일 뿐 아니라, 1.5-4.0 mM의 해리상수(Kd)를 가지며 분자당 30-39 Ca2+ 분자가 결합하는 고용량(high-capacity), 저-친화성 칼슘 저장 단백질로 기능한다(Yoo et al. 2001; Yoo 및 Albanesi 1991; Yoo et al. 2007). 소 크로마핀 세포의 분비 과립에서, 2-3 mM의 그라닌 단백질들이 존재함으로써 분비 과립은 약 40 mM의 Ca2+을 저장할 수 있다(Haigh et al. 1989; Hutton 1989). 결과적으로, 분비 과립은 세포 내 소기관(subcellular organelle)으로서 모든 형태의 분비 세포에서 대부분의 칼슘을 포함한다. 다른 분비 세포의 경우에서처럼, 성상 세포의 세포 내 칼슘 농도의 증가([Ca2+]i)는 작은 시냅스-유사 소낭 및 큰 분비 과립으로부터 활성 분자의 엑소사이토시스의 조절에서 매우 중요한 역할을 하며, 세포 내 저장소들로부터 IP3-의존적으로 방출됨에 따라 일차적으로 조절되는 것으로 생각되고 있다(Araque et al. 2000; Hua et al. 2004; Jeremic et al. 2001).
흥미롭게도, 분비 과립은 많은 양의 IP3R/Ca2+ 채널도 포함하고 있으며(Yoo et al. 2001), 크로마핀 세포에 존재하는 세포 내 IP3R/Ca2+ 채널의 반 이상을 차지한다(Huh et al. 2005c). 결과적으로, 분비 과립은 IP3에 반응하여 Ca2+을 빠르게 방출하는데(Gerasimenko et al. 1996; Nguyen et al. 1998; Yoo 및 Albanesi 1990), 이는 신경 내분비 세포에서 IP3-민감한 세포 내 주요 Ca2+ 저장소로서 기능한다(Huh et al. 2006; Huh et al. 2005b). 현재, 분비 과립의 IP3-의존적 Ca2+ 저장 역할은 다양한 형태의 많은 분비 세포들에서 폭넓게 관찰되고 있다(Gerasimenko et al. 2006; Quesada et al. 2003; Quesada et al. 2001; Santodomingo et al. 2008; Srivastava et al. 1999; Xie et al. 2006).
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 암을 치료할 수 있는 신규한 생체타겟을 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 세포 내 과립형성 인자, 예컨대 그라닌 단백질들(크로모그라닌 및 씨크리토그라닌)의 발현을 억제(약화)시킴으로써 분비 과립의 생산을 급격하게 억제시킬 수 있으며, 이는 뇌암인 다형성 교모세포종을 포함하는 암의 진행 및/또는 분비 세포 종양 증식의 억제를 유도할 수 있다는 것을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 암 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 진단용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 과립형성 인자(granulogenic factor)-인코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 과립형성 인자의 발현 또는 분비 과립(secretory granule)의 생성 을 분석하는 단계를 포함하는 암 치료제의 스크리닝 방법으로, 상기 시험물질이 과립형성 인자의 발현 또는 분비 과립의 생성을 억제시키면 암 치료제로 판단된다.
본 발명자들은 암을 치료할 수 있는 신규한 생체타겟을 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 세포 내 과립형성 인자, 예컨대 그라닌 단백질들(크로모그라닌 및 씨크리토그라닌)의 발현을 억제(약화)시킴으로써 분비 과립의 생산을 급격하게 억제시킬 수 있으며, 이는 뇌암인 다형성 교모세포종을 포함하는 암의 진행 및/또는 분비성 세포 종양 증식의 억제를 유도할 수 있다는 것을 발견하였다.
그라닌 단백질(크로모그라닌 또는 씨크리토그라닌)은 다양한 내분비 및 신경-내분비 세포의 분비 과립에 존재하는 산성 단백질 패밀리이다. 이들 단백질은 생체 내 활성 펩타이드의 전구체이며 펩타이드 호르몬 및 신경 펩타이드의 패키징에 도움을 주는 보조 단백질로 기능할 것으로 보고되고 있다.
본 발명에 따르면, 세포 내에서 그라닌 단백질의 발현을 억제시키면 분비 과립의 생산이 억제되며, 이는 암 치료제의 개발을 위해 이용될 수 있다.
본 발명은 다음의 단계를 포함하는 암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
(a) 과립형성 인자(granulogenic factor)-인코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및
(b) 상기 과립형성 인자의 발현 또는 분비 과립의 생성을 분석하는 단계, 상기 시험물질이 과립형성 인자의 발현 또는 분비 과립의 생성을 억제시키면 암 치료 제로 판단된다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 과립형성 인자는 크로모그라닌 A(CGA), 크로모그라닌 B(CGB) 또는 씨크리토그라닌 II(SgII)이며, 보다 바람직하게는 크로모그라닌 B 또는 씨크리토그라닌 II, 가장 바람직하게는 크로모그라닌 B이다.
본 발명의 방법에 따르면, 우선 본 발명 타겟의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시킨다. 본 발명 타겟의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포는 특별하게 제한되지 않으며, 바람직하게는 모든 분비 세포(분비 과립을 갖고 있는 모든 세포)이고, 보다 바람직하게는 신경세포 및 내분비세포이다. 상기 세포는 바람직하게는 초기배양 세포(primary cultured cells), 구축세포주(established cell line) 또는 종양세포이다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포는 인간의 신경 및 교세포종이다. 본 발명 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 “시료”는 본 발명의 마커의 발현량에 영향을 미치는 지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이어, 시료가 처리된 세포에서 본 발명의 타겟의 발현량을 측정한다. 발현량의 측정은 하기 기재한 바와 같이 실시할 수 있으며, 측정 결과, 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 또는 과립의 생성이 억제되는 경우에는 상기 시료는 암의 예방 또는 치료용 물질로 판정될 수 있다.
과립형성 인자 유전자의 발현량 변화의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, RT-PCR(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), 노던 블롯팅(Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 102-108, CRC press), cDNA 마이크로어레이를 이용한 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)) 또는 인 시투(in situ) 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))을 이용하여 실시할 수 있다.
RT-PCR 프로토콜에 따라 실시하는 경우에는 우선, 시료를 처리한 세포에서 총 RNA를 분리한 다음, 올리고 dT 프라이머 및 역전사효소를 이용하여 제1쇄 cDNA를 제조한다. 이어, 제1쇄 cDNA를 주형으로 이용하고, 과립형성 인자 유전자-특이적 프라이머 세트를 이용하여 PCR 반응을 실시한다. 과립형성 인자 유전자-특이적 프라이머 세트는 서열목록 제1서열, 제3서열 및 제5서열에 예시된 뉴클레오타이드 서열에 포함된 서열이다. 그런 다음, PCR 증폭 산물을 전기영동하고, 형성된 밴드를 분석하여 과립형성 인자 유전자의 발현량 변화를 측정한다.
또한, 과립형성 인자 단백질의 양의 변화는 당업계에 공지된 다양한 면역분석 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, 과립형성 인자 단백질의 양의 변화는 면역염색, 방사능면역분석, 방사능면역침전, 웨스턴 블롯팅, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 그리고 샌드위치 분석을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C14, I125, P32 및 S35)로 레이블링된 항체가 본 발명의 마커 분자를 검출하는 데 이용될 수 있다.
본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명은 (i) 분석하고자 하는 미지의 세포 시료 분해물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 일차항체로서의 타겟에 대한 항체와 상기 세포 분해물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 추가적으로 포함한다.
상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다.
상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.
본 발명의 방법이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 본 발명의 타겟에 대한 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 포획항체와 세포 시료를 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있고, 과립형성 인자 단백질에 특이적으로 반응하는 검출항체(detecting antibody)와 반응 시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.
상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질((예컨대, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질( chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.
상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널의 검출은 본 발명의 타겟의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 과립형성 인자의 발현 또는 분비 과립 생성 억제는 세포의 과립형성 인자의 발현 감소, 또는 세포 당 분비 과립의 수를 감소시키거나 또는 세포 총면적 당 분비 과립의 점유 면적을 감소시킨다. 보다 자세하게는, 본 발명에서 분비 과립의 수는 정상 조직에 비해 뇌암 조 직에서 30배 증가하며, 세포 총면적 당 분비 과립의 점유 면적은 정상 조직에 비해 뇌암 조직에서 42배 증가한다(참조: 표 3 및 도 5). 따라서 본 발명의 과립형성 인자의 발현 억제를 통해 뇌암 조직에서 분비 과립의 생산을 억제할 수 있으며, 이를 통해 IP3-의존적 세포 내 Ca2+ 조절 기작을 변화시킴으로써 암의 진행 및/또는 증식의 억제를 유도할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 암은 뇌암, 신경내분비 암, 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 부신암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 및 요관암으로 구성된 군으로부터 선택된다.
상기 신경내분비 암은 유암종(carcinoid), 머켈 세포 종양(Merkel's cell tumor), 가스트린종, 인슐린종, 글루카곤종, VIPoma, PPoma, 소마토스타틴종, CRHoma, 칼시토니노마, GHRHoma, 뉴로텐시노마, ACTHoma, GRFoma, 부갑상선 호르몬-관련 펩타이드 종양, 신경모세포종, 크롬친화성세포종(pheochromocytoma 또는 갈색세포종(pheochromocytoma)), 호크롬성 세포종, 갑상선 수질암종, 소세포성 폐암(SCLC), (폐의) 대세포 신경 내분비암종, 폐외 소세포 암종(ESCC 또는 EPSCC), 경부신경내분비암종(neuroendocrine carcinoma of the cervix), 1형 복합 내분비 종양형성(MEN-1 또는 MEN1), 2형 복합 내분비 종양형성(MEN-2 또는 MEN2), 1형 신경섬유종증(neurofibromatosis type 1), 결절성 경화증, 폰 히펠-린다우 질환, 뇌하수체의 신경 내분비 종양 또는 카니 복합체(Carney's complex)을 포함하지만, 이 에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 암은 분비성 세포 종양이며, 보다 바람직하게는 뇌암, 신경내분비 암, 신경절교종, 뇌하수체 선종, 췌장암, 부신암, 유방암, 자궁암 또는 전립선암이고, 가장 바람직하게는 뇌암이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 과립형성 인자 유전자의 발현 또는 분비 과립의 생성을 억제하거나, 또는 과립형성 인자의 작용을 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA 및 천연물 추출물을 유효성분으로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물은 서열목록 제1서열, 제3서열 및 제5서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 siRNA이다.
본 발명에서 용어 "안티센스 올리고뉴클레오타이드”란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 발명의 안티센스 서열은 각각 서열목록 제1서열, 제3서열 및 제5서열의 크로모그라닌 A, 크로모그라닌 B 및 씨크리토그라닌 II mRNA에 상보적이고 크로모그라닌 A, 크로모그라닌 B 및 씨크리토그라닌 II mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고, 크로모그라닌 A, 크로모그라닌 B 및 씨크리토그라닌 II mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 핵산의 길이는 6내지 100 염기이고, 바람직하게는 8내지 60 염기이고, 보다 바람직하게는 10 내 40 염기이다.
상기 안티센스 핵산은 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5(3):343-55(1995)). 핵산 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-me 피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6 (6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한 본 발명의 안티센스 핵산은 상기 안티센스 핵산의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 콜릭산, 티오에테르, 티오콜레스테롤, 지방성 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민, 헥실아미노-카르보닐-옥시콜에스테롤 모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있고 이에 제한되지는 않는다. 지용성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 제조 방법은 본 발명의 기술 분야에서 이미 잘 알려져 있다(미국특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호). 상기 변형된 핵산은 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드의 경우 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 한 예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.
본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분으로서 서열목록 제1서열, 제3서열 및 제5서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 가지는 siRNA를 포함한다.
본 발명에서 용어 "siRNA”는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(참조: WO 00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 01/29058, WO 99/07409 및 WO 00/44914). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다. siRNA는 식물, 벌레, 초파리 및 기생충에서 처음으로 발견되었으나, 최근에 siRNA를 개발/이용하여 포유류 세포 연구에 응용되었다(Degot S, et al. 2002; Degot S, et al. 2004; Ballut L, et al. 2005).
본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥(크로모그라닌 A 및 B, 그리고 세크레토그라닌 II mRNA 서열에 상응하는(corresponding) 서열)과 안티센스 가닥(크로모그라닌 A 및 B, 그리고 씨크리토그라닌 II mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있다. 또한, 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 siRNA 분자는, 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다.
siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 70 염기이다.
siRNA 말단 구조는 크로모그라닌 A 및 B, 그리고 씨크리토그라닌 II 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다.
본 발명의 siRNA 분자는, 자기-상보성 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오타이드 서열(예컨대, 약 5-15 nt)이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 siRNA는 서열목록 제1서열, 제3서열 및 제5서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 포함된 서열을 갖는다. 본 발명에 따르면, 종양 세포(예: PC12 세포)에 과립형성 인자-siRNA를 처리함에 따라 정상 레벨의 10-20% 수준으로 과립형성 인자의 발현양이 감소하였다(참조: 표 5, 도 12 및 도 13).
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여(예컨대, 정맥내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여)할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환 자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.0001-100 mg/kg(체중)이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 과립형성 인자에 특이적으로 결합하는 결합제를 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 분자 마커는 암의 발생, 발전 및/또는 전이에 대한 지표가 될 수 있으며, 뇌암의 발생, 발전 및/또는 전이의 진단에 이용될 수 있다.
본 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태 를 모니터링 하는 것)을 포함한다.
본 발명에서 과립형성 인자의 발현 분석은 혼성화에 기초하여 실시할 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 타겟들의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브가 이용된다.
본 명세서에서 용어 “상보적(complementary)”은 어떤 특정한 혼성화(hybridization) 또는 어닐링 조건 하에서 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미한다. 따라서 용어 “상보적”은 용어 완전 상보적(perfectly complementary)과는 다른 의미를 가지며, 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도이면, 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.
프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 상술한 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 이러한 프라이머의 디자인은 상술한 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화 할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 단일쇄이며, 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다.
프라이머 또는 프로브 제작 시 참조하여야 하는 본 발명 타겟의 뉴클레오타이드 서열은 GenBank에서 확인할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 타겟인 크로모그라닌 A는 GenBank 접근번호 Gene Id 1113(NM_001819.2; 제1서열), 크로모그라닌 B는 Gene Id 1114(NM_001819.2; 제3서열), 씨크리토그라닌 II는 GenBank 접근번호 Gene Id 7857(NM_003469.3; 제5서열)에 뉴클레오타이드 서열이 개시되어 있으며, 이 서열을 참조하여 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.
상술한 본 발명의 타겟들의 뉴클레오티드 서열에 혼성화 되는 프로브를 이용하여 혼성화-기초 분석을 하여 뇌암 여부를 판단할 수 있다.
프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이 는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민, 리사민(lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5(Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P32 및 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션(nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법(Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법(Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.
분석 대상이 되는 핵산 시료는 다양한 생시료(biosamples)에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있다. 상기 생시료는, 바람직하게는 뇌 세포이다. 프로브 대신에 분석 대상이 되는 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다.
프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO4, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.
혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N- 메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate) 등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다. 따라서 본 발명의 타겟을 검출하는 방법을 혼성화에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (i) 본 발명의 타겟의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브를 핵산 시료에 혼성화시키는 단계; (ii) 상기 혼성화 반응 발생 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 혼성화 과정에 의한 혼성화 시그널의 세기를 분석함으로써, 암/암 전이 여부를 판단할 수 있다. 즉, 시료에서 본 발명의 타겟의 뉴클레오티드 서열에 대한 혼성화 시그널이 정상 시료(예컨대, 뇌 조직)보다 강하게 나오는 경우에는 암/암 전이로 진단된다.
또한, 본 발명의 진단용 키트를 단백질을 이용하여 실시하는 경우에는, 면역분석(immunoassay) 방식, 즉 항원-항체 반응 방식으로 실시될 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 타겟에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시된다.
본 발명에서 이용되는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.
본 발명의 방법을 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시하는 경우, 본 발명은 상술한 면역분석 방법에 따라 실시하여 뇌암을 진단하는 데 이용될 수 있다.
항체 또는 앱타머 제작 시 참조하여야 하는 본 발명 타겟의 아미노산 서열은 GenBank에서 확인할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 마커인 크로모그라닌 A는 GenBank 접근번호 Gene Id 1113(NP_001266.1; 제2서열), 크로모그라닌 B는 GenBank 접근번호 Gene Id 1114(NP_001810.2; 제4서열), 씨크리토그라닌 II는 GenBank 접근번호 Gene Id 7857(NP_003460.2; 제6서열)에 아미노산 서열이 개시되어 있으며, 이 서열을 참조하여 항체 또는 앱타머를 디자인할 수 있다.
본 발명의 다른 변형예에 따르면, 항체 대신에 본 발명의 타겟에 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용할 수 있다. 앱타머는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):142727(1998)에 상세하게 개시되어 있다.
상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 암/암 전이를 진단할 수 있다. 즉, 시료에서 본 발명의 타겟에 대한 시그널이 정상 시료 보다 강하게 나오는 경우(예컨대, 다형성 교모세포종)에는 암/암 전이로 진단된다.
본 발명의 키트는 상기한 성분 이외에도, 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
본 발명의 타겟들은 암/암 전이에서 고발현 되는 생체 분자이다. 이러한 마커의 고발현은 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “고발현”은 조사 대상의 시료에서의 대상이 되는 뉴클레오티드 서열의 발현 정도가 정상 시료와 비교하여 높은 경우를 의미한다. 예컨대, 당업계에서 통상적으로 이용되는 발현 분석 방법, 예컨대 RT-PCR 방법 또는 ELISA 방법(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))에 따라 발현 분석을 한 경우, 발현이 많은 것으로 분석되는 경우를 의미한다. 예를 들어, 상술한 분석 방법에 따라 분석한 결과, 본 발명의 마커들이 정상 세포와 비교하여 암 세포에서 2-80배 정도, 평균적으로 7.6-10.5배 정도 고발현 되는 경우, 본 발명에서의 “고발현”으로 판정하고 암/암 전이로 판정한다(참조: 도 6 및 도 7).
상술한 바와 같이, 본 발명의 과립형성 인자의 고발현은 암 세포(예: 다형성 교모세포종) 내에서 분비 과립의 수 및 표면적을 현저하게 증가시켰다(참조: 도 5, 도 6 및 도 7). 이것은 과립형성 인자가 암 세포 내에서 분비 과립의 생산에 중요한 기능을 한다는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물을 암(특히, 뇌암) 환자에게 투여함으로써 IP3-매개된 세포 내 Ca2+ 조절 기작을 통해 암의 발병(development) 및 증식의 억제를 유도할 수 있다. 따라서 본 발명의 조성물은 암 예방 또는 치료에 이용될 수 있으며, 또한 암 진단용 키트로도 이용될 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 과립형성 인자를 이용한 암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
(b) 본 발명에서, 과립형성 인자의 발현은 비-분비성 세포에서 분비성 과립을 유도하고 과립형성 인자의 억제는 분비성 세포에서 분비 과립을 억제한다.
(c) 본 발명의 과립형성 인자에 의해 생성된 분비 과립은 IP3-의존적 세포내 Ca2+ 조절 기작을 통해 세포 활성을 변화시키며, 세포 내 Ca2+ 항상성의 변화는 암 세포의 발생 및 증식에 영향을 끼친다.
(d) 따라서 과립형성 인자 유전자의 발현 또는 분비 과립의 형성을 억제하거나, 또는 과립형성 인자의 작용을 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 암 예방 또는 치료에 이용될 수 있으며, 또한 암 진단용 키트로도 이용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험방법
항체
본 발명자들은 폴리클로날 항-래빗 CGA 및 CGB 항체를 정제된 천연(intact) 소(bovine) CGA 및 CGB로부터 제조하였으며(Yoo 1995), 천연 소 CGA 및 재조합 소 CGB로부터 친화성 정제하였다(Yoo et al. 2007). 상기 항체의 특이성을 확인하였다(Park et al. 2002; Huh et al. 2003; Yoo et al. 2002; 및 Yoo et al. 2001). 이전의 보고된 바와 같이, 소의 부신수질 크로마핀 세포에서 유래된 분비 과립 용해 단백질을 이용하여 모노클로날 SgⅡ 항체를 생산하였다(Park et al. 2002).
인간 조직 시료
본 발명자들은 외과수술을 받는 환자로부터 서면 동의서를 받은 후 적절한 임상적 프로토콜에 따라 본 연구에서 사용된 모든 뇌 조직 시료들을 채취하였으며, WHO 분류에 따라 조직학적으로 다형성 교모세포종(glioblastoma multiforme, GBM)(제4기)으로 진단하였다.
뇌 조직으로부터 단백질의 추출 및 면역블롯 분석
뇌 조직으로부터 총 단백질 추출물을 얻기 위해, -80℃에서 보존되어 있던 조직을 녹인 후, 시료의 두 배 부피의 라이시스 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.02% 소듐 아자이드, 1% NP-40, 0.5% 디옥시콜레이트, 0.1% SDS, 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드 및 20 μg/ml 아프로티닌/류펩틴 혼합물)과 혼합하였다. 이후 조직을 완전히 균질화시키고, 얼음에서 10분간 초음파 분해하였다. 추가적으로 얼음에서 20분간 반응시킨 후, 40℃에서 21,000 x g로 30분간 원심분리하여 조직 잔해(tissue debris)를 제거하였고, 상등액을 단백질 추출물로 이용하였다. 단백질(각각 40 μg)들은 SDS-PAGE에 의해 분리하여 적절한 항체 및 이미지 검출 시스템(UVP Bioimaging system, UVP LLC, Upland, CA 91786, USA)을 사용하는 면역 블롯 분석을 실시하였다.
면역 골드 전자현미경
인간 뇌 조직의 전자현미경 연구를 위해, 정상 뇌 조직 및 GBM 뇌 조직 모두를 약 1 mm3의 조각으로 잘게 써는 외과적인 제거 후에 바로 0.1% 글루타알데하이드 및 4% 파라포름알데하이드를 포함하는 PBS에서 두 시간 동안 4℃에서 고정하였다. PBS로 세 번 세척한 후, 조직을 1% 오스뮴 테트라옥사이드(Sigma-Aldrich, USA)로 두 시간 동안 얼음에서 후고정(postfix)하고 PBS로 세 번 세척하였다. 조직을 다른 농도의 에탄올로 순차적으로 탈수한 후에 Epon 812(Electron Microscopy Sciences, PA 19440, USA)로 임배드하였다. 초박절편(70 nm)을 포름바/탄소-코팅된 니켈 그리드(Electron Microscopy Sciences, PA 19440, USA) 상에 수집하여 상기 그리드를 2.5% 우라닐 아세테이트에서 7분 동안, 리드 시트레이트에서 2분 동안 염색하였다.
면역 골드 표지 실험을 위해, 포름바/탄소-코팅된 니켈 그리드 상에 수집된 상기 초박절편을 신선하게(freshly) 제조된 3% 소듐 메타페리오데이트의 방울(drop)에 40분 동안 띄어놓았다. 에칭 및 세척 후, 상기 그리드에 50 ㎕ 완충액 A(4% 정상 염소 혈청, 1% BSA, 0.1% Tween 20 및 0.1% 소듐 아자이드를 포함하는 인산염 용액(pH 8.2))를 1시간 동안 처리하였다. 충분한 세척 후에, 용액 B(1% 정상 염소 혈청을 포함하는 완충액 A)에 적당하게 희석된 50 ㎕의 폴리클로날 항-래빗 CGA, CGB 또는 모노클로날 항-마우스 SgII 항체를 상기 그리드에 습도 유지 챔버에서 3시간 동안 상온에서 처리하고 용액 B로 린스하였다. 상기 그리드를 용액 A로 희석된 15-nm 골드-컨쥬게이트된 염소 항-래빗 또는 항-마우스 IgG와 반응시켰다. CGA, CGB- 또는 SgII-특이적 면역 골드 표지의 특이성을 위한 대조군들은 다음과 같은 것들을 포함시켰다: (1) 일차 항체를 제외한 것, (2) 일차 항체를 면역전 혈청으로 대체한 것, 및 (3) 과량의 정제된 CGA, CGB 또는 SgII의 존재 하에서 일차 항체를 첨가한 것. PBS 및 탈이온수로 세척한 후, 상기 그리드를 2.5% 우라닐 아세테이트에서 7분 동안, 리드 시트레이트에서 2분 동안 염색하였다. 탈이온수로 세척하고 시료를 건조한 후에, JEOL JEM-1011 전자현미경(JAPAN)으로 조사하였다.
발현 벡터의 제조
소 cDNA를 템플레이트로 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통해 CGA 및 CGB용 발현 벡터를 제조하였으며, 전체 코딩 서열을 포함하는 상기 PCR 생산물을 pCI-neo 포유류 발현 벡터(Promega)의 EcoRI/XbaI 위치에 서브클로닝하였다. 상기 벡터에서 클론된 유전자의 전사는 구조적으로 활성을 가지는 CMV(cytomegalovirus) 프로모터의 지시 하에 이루어진다. 트랜스펙션을 위한 원형 플라스미드 cDNA는 Qiagen maxi-preparation 키트를 이용하여 분리하였다.
NIH3T3, COS-7 세포 배양 및 일과성 트랜스펙션
모든 배양 시약 및 분말 배지는 GibcoBRL로부터 구입하였다. COS-7 및 NIH3T3 세포(ATCC)를 10% 우태아혈청이 첨가된 DMEM(Dulbecco’ modified Eagle’ medium)에서 유지하였다. 원형 플라스미드 DNA를 리포펙타민-플러스 트랜스펙션 시약(GibcoBRL)을 이용하여 세포에 트랜스펙션하였다. 간략하게는, 세포를 웰당 5 x 105 세포 밀도로 직경 100 mm 플레이트에 플레이팅하고 추가적으로 24시간 동안 배양시켰다. 4 ㎍ 플라스미드 DNA를 20 ㎕ 리포펙타민-플러스 트랜스펙션 시약에 넣고 750 ㎕ OPTI-MEM I 배지와 혼합하여 15분 동안 상온에서 반응시켰다. 추가 적으로, 30 ㎕ 리포펙타민 시약을 750 ㎕ OPTI-MEM I 배지와 혼합하여 15분 동안 반응시켰다. 상기 혼합물을 5 ml OPTI-MEM I 배지를 포함하는 배양 플레이트에 플레이팅하였다. 트랜스펙션을 37℃에서 3시간 동안 실시하였다. 트랜스펙션 후, 배지를 전열된(pre-warmed) 신선한 배양 배지로 교체하여 72시간 동안 추가적으로 배양하였다. 본 발명의 배양 조건 하에서, COS-7 및 NIH3T3 세포는 각각 40-50% 및 70-80%로 트랜스펙션되었다. pCI-neo 벡터가 공벡터로 이용되었다.
PC12 세포 배양 및 CGA- 및 CGB-siRNAs의 일과성 트랜스펙션
종양세포의 일종인 PC12 세포(ATCC)를 10% 우태아혈청이 첨가된 RPMI 1640(Gibco BRL)에서 유지하였다. 일과성 siRNA 트랜스펙션을 70-80% 컨풀루언트 배양에서 실시하였다. CGA-siRNA 듀플렉스 센스 및 안티센스 서열은 각각 5'-CAACAACAACACAGCAGCUdTdT-3' 및 5'-dTdTGUUGUUGUUGUGUCGUCGA-3'이며, CGB-siRNA 듀플렉스 센스 및 안티센스 서열은 각각 5'-AUGCCCUAUCCAAGUCCAGdTdT-3' 및 5'-dTdTUACGGGAUAGGUUCAGGUC-3'이다. 2' 데옥시티미딘의 3' 오버행의 2-뉴클레오타이드를 dTdT로 나타내었다. SilencerTM siRNA 트랜스펙션 키트(Ambion)를 이용하여 siRNA들을 세포에 트랜스펙션하였다. 간략하게는, 약 1-2 x 106 PC12 세포를 10% FBS가 첨가된 RPMI 1640 배지에서 4형 콜라겐-코팅된 배양 디쉬(100 mm 직경)에 플레이팅하여 트랜스펙션 전까지 48시간 동안 배양하였다. siRNA 트랜스펙션의 투여량에 따른 반응 실험(dose-response experiments)에서, 5 x 105 세포 당 0.25-2 ㎍ siRNA 및 10 ㎕ siPORT 아민을 이용하였다. 하지만, EM 연구에서는, 5 x 105 세포 당 1 ㎍ siRNA 및 10 ㎕ siPORT 아민을 이용하였다. 더 많은 siRNA의 첨가는 분비성 과립의 수를 추가적으로 감소시키지 않았다. 트래스펙션은 37℃에서 6시간 동안 실시하였다. 트랜스펙션 후, 배지를 전열된(pre-warmed) 신선한 RPMI 1640 배지로 교체하여 48시간 동안 추가적으로 배양하였다. 트랜스펙션 효율을 Silencer CyTM3 siRNA 표지 키트를 이용하여 모니터하였으며 트랜스펙션된 PC12 세포를 이용한 전자현미경 실험을 트랜스펙션 후 48시간에 실시하였다.
실험결과
정상 뇌 조직 및 GBM 뇌 조직 간의 차이를 발견하기 위해서, 본 발명자들은 뇌의 암 부위 및 비-암 부위(폐엽 절제술에 의해 획득)로부터 채취한 뇌 조직 시료들을 전자현미경을 통해 비교 분석하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, 성상세포의 세포체를 둘러싸고 있는 이미지에서 본 발명자들은 정상 뇌 조직의 성상세포에서 0-3개의 분비 과립-유사 소낭(secretory granule-like vesicles(SG); 크고 진한-코어 소낭)을 정상적으로 관찰하였으나(도 1A), 때때로 세포 돌기의 이미지에서 2-3개의 분비 과립-유사 소낭을 관찰할 수 있었는데(도 1B), 이러한 결과는 분비 과립-유사 소낭이 정상 성상 세포의 세포체에서 보다 세포 돌기에서 더 많이 발견된다는 것을 의미한다.
성상 세포에서 분비 과립-유사 소낭들의 존재(identity)를 확인하기 위해, 본 발명자들은 크로모그라닌 B(도 2A) 및 씨크리토그라닌 II(도 2B)에 대한 특이 항체를 이용한 면역 골드 전자현미경을 이용하여 분비 과립-유사 소낭에서 상기 분비 과립 마커 단백질들(크로모그라닌 B 및 씨크리토그라닌 II)의 잠재적인 위치를 조사하였다. 크로모그라닌 A 및 B, 그리고 씨크리토그라닌 II은 과립형성(granulogenic) 인자들로 그들의 발현된 세포에서 분비 과립의 형성을 유도한다(Beuret et al. 2004; Huh et al. 2003; Kim et al. 2001). 그러므로, 상기 그라닌 단백질은 사실상 모든 형태의 분비 세포의 분비 과립에서 발견되기 때문에 이들을 분비 과립 마커 단백질이라 부른다(Huttner et al. 1991). 비록 크로모그라닌 A 및 B가 그라닌 단백질 패밀리의 주요한 두 멤버일 지라도(Helle 2000; Montero-Hadjadje et al. 2008; Taupenot et al. 2003; Winkler 및 Fischer-Colbrie 1992; Huttner et al. 1991), 인간의 분비 과립에서는 크로모그라닌 B가 더 풍부하다.
도 2A에 나타난 바와 같이, 크로모그라닌 B는 소포체(ER) 이외에도 분비 과립-유사 소낭에 존재한다. 분비 단백질인 CGB는 골지체로 이동하기 전에 ER에 위치하며 분비 과립에도 존재하지만, 미토콘드리아에는 없는 것으로 알려져 있다(Huh et al. 2005a). 미토콘드리아에 그라닌 단백질이 없다는 이전의 결과와 일치하게도(Huh et al. 2005a; Huh et al. 2003; Huttner et al. 1991; Winkler 및 Fischer-Colbrie 1992), 크로모그라닌 B는 미토콘드리아에 없었다. 분비 과립-유사 소낭에 CGB의 발현은 이러한 크고 진한-코어 소낭이 진정한 분비 과립이라는 것을 확증한다. 일반적으로, 분비 세포에서 크로모그라닌-함유 분비 과립은 직경이 200 nm 내지 500 nm의 크기를 가질 정도로 거대하며, 평균 직경이 약 300 nm이다(Huh et al. 2005a; Coupland 1968). 다른 연구에서 보고된 결과들처럼(Chen et al. 2005), 정상 성상 세포의 분비 과립의 평균 직경은 약 300 nm인 것처럼 보였다. 또한, 다른 분비 과립 마커 단백질인 씨크리토그라닌 II도 분비 과립-유사 소낭에서 발현하였다(도 2B). 이러한 결과들은 분비 과립-유사 소낭들이 분비 과립임을 나타내준다. 이전의 결과들과 일치하게도, 씨크리토그라닌 II는 ER에 위치하였으나 미토콘드리아에는 존재하지 않았다(Park et al. 2002). ER에 존재하는 양과 비교하여 분비 과립에서 단위 면적 당 CGB- 및 SgII-표지된 골드 파티클이 상대적으로 풍부하였는데(참조: 표 1 및 표 2), 이는 CGB 및 SgII이 성상 세포의 분비 과립에서 상대적으로 많은 양으로 발현한다는 것을 의미한다.
정상 및 다형성 교모세포종 인간 뇌 조직의 성상 세포에서 크로모그라닌 B-표지된 골드 파티클의 분포.
세포 소기관 골드 파티클의 수 관측된 면적 (㎛2) ㎛2 당 골드 파티클의 수
정상a 분비과립 96 7.752 12.38
미토콘드리아 9 24.082 0.37
GBMb 분비 과립 345 28.779 11.98
미토콘드리아 9 24.661 0.36
a세 개의 다른 조직으로부터 얻어진 39 이미지를 이용함.
b세 개의 다른 조직으로부터 얻어진 44 이미지를 이용함.
정상 및 다형성 교모세포종(GBM) 인간 뇌 조직의 성상 세포에서 씨크리토그라닌 II-표지된 골드 파티클의 분포.
세포 소기관 골드 파티클의 수 관측된 면적 (㎛2) ㎛2 당 골드 파티클의 수
정상a 분비 과립 74 7.174 10.31
미토콘드리아 8 20.450 0.39
GBMb 분비 과립 283 32.343 8.70
미토콘드리아 9 29.343 0.31
a세 개의 다른 조직으로부터 얻어진 42 이미지를 이용함.
b세 개의 다른 조직으로부터 얻어진 49 이미지를 이용함.
하지만, 다형성 교모세포종(GBM) 조직으로부터 얻어진 결과는 정상 뇌 조직에서 얻어진 결과와는 매우 달랐다. 정상 뇌 조직의 성상 세포에서 분비 과립의 적은 수(이미지 당 0-3개)와 매우 대조적으로, GBM에서 유래된 성상 세포의 세포체(도 3A) 및 세포 돌기(도 3B) 모두에서 분비 과립-유사 소낭의 수가 현저하게 증가하였다. 교모세포종 조직의 성상 세포에서 분비 과립-유사 소낭 수의 증가는 매우 놀라워서 몇몇 이미지에서 교모세포종 성상 세포의 세포질이 분비 과립-유사 소낭으로 가득차 있는 것으로 보였다(도 3A 및 도 3B). 또한, 이러한 분비 과립-유사 소낭의 존재는 크로모그라닌 B(도 4A) 및 씨크리토그라닌 II(도 4B)에 특이적인 항체를 이용한 면역 골드 전자현미경에 의해서 조사되었다. 도 4A에 나타난 바와 같이, 비록 크로모그라닌 B이 미토콘드리아에 존재하지 않을 지라도, 크로모그라닌 B는 소포체 외에도 분비 과립-유사 소낭에 존재하였다. 이와 유사하게, 씨크리토그라닌 II도 분비 과립-유사 소낭에 존재하였으나(도 4B), 미토콘드리아에는 존재하지 않았다. 이러한 결과는 분비 과립-유사 소낭이 분비 과립이라는 것을 다시 한번 나타낸다.
정상 및 교모세포종 뇌 조직의 성상 세포의 세포 내 소기관에서 CGB- 또는 SgII-표지된 골드 파티클의 분포는 표 1에 요약되어 있다. 표 1에 나타난 바와 같이, 정상 성상 세포에서 분비 과립 영역의 ㎛2 당 CGB-표지된 골드 파티클의 수는 12.38개인 반면에, 미토콘드리아의 ㎛2 당 CGB-표지된 골드 파티클의 수(백그라운드 수)는 0.37개 였으며, 이러한 결과는 분비 과립 내에 CGB의 존재를 확증한다. 한편, GBM 성상 세포에서 분비 과립 영역의 ㎛2 당 CGB-표지된 골드 파티클의 수는 11.98개인 반면에, 미토콘드리아의 ㎛2 당 CGB-표지된 골드 파티클의 수(백그라운드 수)는 0.36개 였으며, 이러한 결과는 성상 세포의 병리학적 상태에도 불구하고 분비 과립 내에 CGB의 존재를 추가적으로 입증하는 것이다.
CGB와 유사하게, 정상 성상 세포에서 분비 과립 영역의 ㎛2 당 SgII-표지된 골드 파티클의 수는 10.31개인 반면에, 미토콘드리아의 ㎛2 당 CGB-표지된 골드 파티클의 수(백그라운드 수)는 0.39개 였는데(표 2), 이러한 결과는 분비 과립 내에 SgII의 존재를 명확하게 보여준다. 또한, GBM 성상 세포에서 분비 과립 영역의 ㎛2 당 SgII-표지된 골드 파티클의 수는 8.70개인 반면에, 미토콘드리아의 ㎛2 당 SgII-표지된 골드 파티클의 수(백그라운드 수)는 0.31개 였으며, 이러한 결과는 뇌 조직의 병리학적 상태에도 불구하고 성상 세포의 분비성 과립 내에 SgII의 존재를 추가적으로 나타내는 것이다. ER의 분포 정도와 비교하여 분비 과립의 단위 면적 당 CGB- 또는 SgII-표지된 골드 파티클의 농축된 존재를 고려해 볼 때, 그로마핀 세포의 경우처럼(Huh et al. 2005a) 정상 및 GBM 성상 세포 모두에서 분비 과립은 CGB 및 SgII을 상대적으로 많은 양을 포함하고 있는 것으로 나타났다.
여섯 개의 서로 다른 정상 및 GBM 조직 시료들로부터 채취한 각각의 성상 세포에서 분비 과립의 수 및 그들이 차지하는 면적은 표 3에 요약되어 있다. 본 연구에서 이용되는 여섯 개의 서로 다른 정상 및 GBM 조직 시료들 중에서 세 개의 정상 및 GBM 조직 시료들은 동일한 환자에게서 나온 것이지만, 나머지 시료들(3개의 정상 조직 시료 및 3개의 GBM 조직 시료)은 서로 다른 환자들로부터 채취한 것이다. 조사된 세포 이미지들 중 거의 반은 세포체를 포함하는 이미지이고 나머지 반은 세포 돌기를 포함하는 이미지이다. 정상 성상 세포에서 세포 이미지 당 분비 과립의 수는 0.18-1.86의 범위이고 세포 이미지 당 분비 과립의 면적은 전체 세포 이미지 면적의 ~0.03-0.16% 범위이다(표 3). 한편, GBM 성상 세포에서 세포 이미지 당 분비 과립의 수는 15.0-22.89이고 세포 이미지 당 분비 과립의 면적은 전체 세포 이미지 면적의 ~2.34-3.82%이다.
정상 및 다형성 교모세포종(GBM) 인간 뇌 조직의 성상 세포에서 분비 과립의 분포.
세포 조직
(이용된 세포 이미지의 수)		 분비 과립의 수a 분비 과립 면적b(㎛2) 세포
면적
(㎛2)		 세포 이미지 당 분비 과립의 수 세포 면적 당 분비 과립 면적(%)
정상 1(11) 2 0.262 852.058 0.16 0.03
2(8) 5 0.343 715.088 0.63 0.05
3(10) 4 0.930 1185.304 0.40 0.08
4(7) 13 1.308 807.477 1.86 0.16
5(10) 2 0.295 526.302 0.20 0.06
6(10) 5 0.662 880.526 0.50 0.08
GBM 1(13) 245 21.126 570.518 18.85 3.70
2(10) 150 14.488 382.306 15.00 3.38
3(11) 194 12.364 529.390 17.64 2.34
4(11) 173 21.021 651.772 15.73 3.22
5(9) 193 14.901 398.316 21.44 3.74
6(9) 206 16.662 436.021 22.89 3.82
a정상 및 다형성 교모세포종 성상 세포의 이미지 사진에서 분비 과립의 수는 각각 0-3개 및 11-46개의 범위에 있었다.
b정상 및 다형성 교모세포종 성상 세포의 이미지 사진에서 세포 총면적 당 분비 과립의 면적은 각각 0-0.16% 및 1.98-6.96%를 차지하였다.
두 개의 군 간의 차이를 보다 명백하게 하기 위해, 표 3의 결과가 도 5에 요약되어 있다. 세포 이미지 당 분비 과립의 평균 수는 정상 세포에서 0.63 ± 0.26(평균값 ± 표준 오차)로부터 GBM 세포에서 18.59 ± 1.23(평균값 ± 표준 오차)로 30배 증가하였다. 분비 과립의 수의 증가와 유사하게, 세포 이미지 당 분비 과립의 평균 표면적은 정상 세포에서 0.08 ± 0.02(평균값 ± 표준 오차)로부터 GBM 세포에서 3.37 ± 0.23(평균값 ± 표준 오차)로 42배 증가하였다. 비록 유사한 결과들이 더 이른 종양(3기 이하)에서 때때로 관찰되었을 지라도, 이러한 결과들은 모든 GBM 성상 세포의 경우에서 분비 과립의 수 및 그들이 차지하는 세포 용적이 모두 폭발적으로 증가하였음을 명백하게 나타낸다.
또한, 분비 과립의 수에서의 증가를 분비 과립 마커 단백질 크로모그라닌 B 및 씨크리토그라닌 II의 발현 레벨을 측정함으로써 검출할 수 있는 지 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 면역블롯 분석을 통해 정상 및 GBM 조직의 단백질 추출물에서 CGB 및 SgII의 발현을 조사하였다(도 6 및 도 7). 이를 위해, 본 발명자들은 표 3에 나열된 조직 시료들과 관련되지 않은 여섯 개의 정상 및 GBM 조직 시료들을 선택하였다. 도 6A에 나타난 바와 같이, 크로모그라닌 B는 정상 및 GBM 조직에서 모두 존재한 반면에, 교모세포종에서 발현된 CGB의 양이 정상 조직의 발현양에 비해 훨씬 더 높다. GBM 조직에서 발현된 CGB의 양은 정상 조직의 발현양보다 2.7-80배 정도 높으며(도 6A), 평균적으로 10.5배 증가한다(도 6B). 유사하게, 씨크리토그라닌 II는 정상 및 GBM 조직에서 모두 존재하고(도 7), 종양 조직에서 발현된 SgII의 양도 정상 조직의 발현양에 비해 훨씬 더 높다. GBM 조직에서 발현된 SgII의 양은 정상 조직의 발현양보다 2.5-16배 정도 높으며(도 7A), 평균적으로 7.6배 증가한다(도 7B). 이러한 결과들은 교모세포종에서 발현된 CGB 및 SgII의 양이 정상 조직에서 발현된 양보다 각각 10.5배 및 7.6배 더 높다는 것을 의미하며, 정상 성상 세포와 비교하여 GBM 성상 세포에서 생산된 분비 과립의 수(30배) 및 표면적(즉, 세포 용적)(42배)의 증가와도 일치되는 결과이다. GBM 조직에서 7.6-10.5배에 걸친 CGB 및 SgII 발현의 증가 배수(fold-increase)가 30-42배에 이르는 분비 과립의 수 및 표면적의 증가보다 더 낮은 이유는 단백질이 추출된 뇌 조직이 뉴우런 및 신경교세포로 구성되지만 전자현미경으로 얻어진 결과들은 절대적으로 뇌 조직의 성상 세포에 기반한다는 사실에서 이해할 수 있다.
세포에서 분비성 과립 형성의 유도 및 억제
분비 과립을 정상적으로 포함하지 않는 비- 분비 세포에서 분비 과립의 유도
NIH3T3 및 COS-7 세포 같은 비-분비 세포에서 크로모그라닌 A(CGA) 및 B(CGB)을 발현하면(도 8, 도 9 및 표 4), NIH3T3 (도 8) 및 COS-7(도 9) 세포 모두에서 신규한 분비 과립이 형성된다(Huh et al. 2003). CGB 발현에 의해 형성된 분비 과립의 수는 CGA 발현에 의해 형성된 것보다 ~60% 더 많았으며(표 4), 이는 크로모그라닌 B의 더 우수한 과립형성 효과를 나타낸다(Huh et al. 2003). CGA 및 CGB의 NIH3T3 또는 COS-7 세포로의 트랜스펙션은 세포에서 각각 CGA 및 CGB를 발현시키는 것으로 판명되었다(도 10 및 도 11).
CGA- 및 CGB-트랜스펙션된 NIH3T3 및 COS-7 세포에서 진한-코어 분비 과립의 분포.
정상 공벡터 트랜스펙션 CGA 트랜스펙션 CGB 트랜스펙션
관측된 면적(㎛2) 당 과립의 수 세포 당 과립들 관측된 면적(㎛2) 당 과립의 수 세포 당 과립들 관측된 면적(㎛2) 당 과립의 수 세포 당 과립들 관측된 면적(㎛2) 당 과립의 수 세포 당 과립들
NIH3T3a 1/9130 0 14/9840 0.11± 0.32c 236/8205 2.51± 1.07d 317/7114 4.02± 0.75d
COS-7b 1/20314 0 61/46556 0.10± 0.22c 596/41620 1.44± 0.89d 839/43271 2.23± 1.34d
a네 개의 다른 세포 준비물로부터 절편된 70-78개의 세포들이 각 군에서 카운팅되었다.
b열 개의 다른 세포 준비물로부터 절편된 150-300개의 세포들이 각 군에서 카운팅되었다.
c평균값 ± 표준 편차
d평균값 ± 표준 편차, 대응 t-검정(paired t-test)에 의한 p<0.0001.
분비 과립을 내재적으로 포함하는 분비 세포에서 분비 과립의 억제
또한, 크로모그라닌 A 및 B의 발현을 억제함으로써 내재적으로 분비 세포에 존재하는 분비 과립의 생산은 억제될 수 있다. 예를 들어, 전형적인 분비 신경 내분비 PC12 세포에서 크로모그라닌 A 및 B의 발현을 억제함으로써 내재적인 분비 과립의 생산은 심각하게 억제되었다(도 12 및 표 5). CGB 발현의 억제는 PC12 세포에서 생산된 분비 과립의 수를 78%까지 감소시켰으며 CGA 발현의 억제는 PC12 세포에서 생산된 분비 과립의 수를 41%까지 감소시켰다(도 12 및 표 5). 이는 CGB의 더욱 더 우수한 억제 효과를 입증하는 것이다. PC12 세포에서 크로모그라닌 A 또는 크로모그라닌 B 발현의 억제는 PC12 세포에 siRNA-CGA 또는 siRNA-CGB 처리에 의해 이루어졌다(Huh et al. 2003). siRNA 처리에 의해 세포에서 동족 크로모그라닌들의 발현은 정상 레벨의 10-20%까지 감소되었다(도 13).
CGA- 및 CGB-siRNA-트랜스펙션된 PC12 세포a에서 진한-코어 분비 과립의 분포.
정상 PC12 세포 공벡터 트랜스펙션 CGA-siRNA 트랜스펙션 CGB-siRNA 트랜스펙션
관측된 면적(㎛2) 당 과립의 수 세포 당 과립들 관측된 면적(㎛2) 당 과립의 수 세포 당 과립들 관측된 면적(㎛2) 당 과립의 수 세포 당 과립들 관측된 면적(㎛2) 당 과립의 수 세포 당 과립들
12244/3222 68.75± 8.50b 12504/3283 70.19± 13.80b 7015/3187 40.73± 7.49c 2632/3069 14.99± 6.30c
a네 개의 다른 세포 준비물로부터 절편된 100개의 세포들이 각 군에서 카운팅되었다.
b평균값 ± 표준 편차
c평균값 ± 표준 편차, 대응 t-검정(paired t-test)에 의한 p<0.0001.
dPC12 세포는 핵의 가운데 부분을 지나는 중앙 절편에서 51-54 ㎛2의 표면적을 가지기 때문에, 세포 당 과립들은 각 군에서 각 세포의 평균적인 중앙-절편의 면적에 의해 구분되어 발견된 총 과립의 수를 의미한다.
추가 논의 사항
이러한 점에서, 인간 뇌 조직의 성상 세포에서 크고 진한-코어 소낭 내에 크로모그라닌 B 및 씨크리토그라닌 II의 존재를 나타내는 본 발명의 결과들은 인간 교모세포종에서 분비 과립의 존재와 일치하며, 현재까지 이해되고 있는 상술한 소기관(소낭)의 우수한 분비 활성을 분명히 나타내고 있다. 따라서 다형성 교모세포종의 성상 세포에서 분비 과립의 수가 폭발적으로 증가한 것은 마치 악성 뇌 종양의 결정적인 사인을 나타내는 것처럼 매우 흥미로운 것이다(도 3, 도 4 및 표 3). GBM 성상 세포의 세포 이미지 당 분비 과립의 평균 수 및 GBM 성상 세포의 전체 세포 이미지 면적 중 분비 과립 면적의 상대적인 비는 정상 세포에 비해 각각 30배 및 42배 증가하였다(표 3 및 도 5). 정상 및 교모세포종 성상 세포 간의 분비 과립의 수에서 현격한 대조는 정상 및 교모세포종 조직으로부터 추출된 단백질 중에서 크로모그라닌 B 및 씨크리토그라닌 II의 발현 레벨에서 추가적으로 보여졌는데(도 6 및 도 7), 각각 10.5배 및 7.6배 증가하였다(도 6B 및 도 7B). 뇌 조직이 뉴우런 및 회돌기아교세포 및 미세아교세포 같은 다른 신경교세포로 구성되어 있다는 것을 고려할 때, 단백질 추출물에서 CGB 및 SgII의 발현 레벨에서 7.6-10.5배의 증가는 다형성 교모세포종의 성상 세포에서 그라닌-함유 분비 과립의 수에서 급격한 증가를 분명하게 나타낸다.
한편, 유사한 현상들이 뉴우런 및 신경교세포을 포함하는 종양의 일종인 신경절교종(ganglioglioma)에서도 일어나는데, 이 종양에서 종양성 뉴우런, 특히 신경 세포체(neuronal perikarya) 내 진한-코어 소낭의 수가 뚜렷하게 증가한다(Hirose et al. 1997; Sikorska et al. 2007). 또한, 크로모그라닌 A의 발현도 신경절교종의 종양성 뉴우런에서 현저하게 증가하였는데(Hirose et al. 1997), 이는 상기 세포들에서 분비 과립의 증가를 의미한다. 더욱이, 뉴우런 및 성상 세포에서 분비 과립의 필수적인 성분들 중의 하나인 신경 펩타이드 Y의 발현이 신경절교종의 종양성 뉴우런에서 매우 활발하다는 것이 알려져 있다(Hirose et al. 1997). 크로모그라닌들이 발현된 세포에서 분비 과립의 형성을 유도하는 과립형성 인자들인 점을 고려하면(Beuret et al. 2004; Huh et al. 2003; Kim et al. 2001), 상술한 결과들은 종양성 뉴우선에서 분비 과립의 수의 증가를 나타내는데, 이는 뉴우런의 종양성 상태(state)에 분비 과립이 포함되어 있다는 것을 강하게 의미한다.
그라닌 패밀리 단백질인 크로모그라닌 A 및 B, 그리고 씨크리토그라닌 II는 신경 내분비 세포의 분비 과립의 주요한 단백질들이며(Helle 2000; Montero-Hadjadje et al. 2008; Taupenot et al. 2003; Winkler 및 Fischer-Colbrie 1992; Huttner et al. 1991), 고용량(high-capacity), 저-친화성 Ca2+ 저장 단백질이다(Yoo et al. 2001; Yoo 및 Albanesi 1991; Yoo et al. 2007). 그라닌 단백질 패밀리로 인해, 분비 세포의 모든 세포 내 소기관 중에서 분비 과립은 20-40 mM 범위의 고농도 Ca2+을 가진다(Haigh et al. 1989; Hutton 1989). 또한, 분비 과립은 막 상에 많은 양의 IP3R/Ca2+ 채널을 가지는데(Huh et al. 2005c; Yoo et al. 2001), 이러한 막에 크로모그라닌 A 및 B가 직접적으로 결합되어 있다(Yoo et al. 2000; Yoo 2000). 결합된 크로모그라닌들은 IP3R/Ca2+ 채널을 활성화시켜(Yoo 및 Jeon 2000), 채널의 개방 가능성(open probability) 및 평균적인 개방 시간을 각각 8-16배 및 9-42배 증가시킨다(Thrower et al. 2002; Thrower et al. 2003).
따라서 분비 과립은 분비 세포에서 IP3-의존적 세포 내 Ca2+ 조절에 주요한 기능을 수행한다(Gerasimenko et al. 2006; Quesada et al. 2003; Quesada et al. 2001; Santodomingo et al. 2008; Srivastava et al. 1999; Xie et al. 2006; Gerasimenko et al. 1996; Nguyen et al. 1998; Yoo 및 Albanesi 1990): 분비 과립은 신경 내분비 세포의 세포질에서 IP3-매개된 Ca2+ 이동의 >70%을 책임지는 것으로 나타났다(Huh et al. 2006; Huh et al. 2005b). 따라서 성상 세포에서 분비 과립의 존재는 상기 세포들의 분비 활성의 작동을 나타낼 뿐 아니라, 활발한 IP3-의존적 Ca2+ 저장 및 조절 기작의 존재 및 작동을 강하게 나타낸다. 그럼에도 불구하고, 신경교세포에서 분비 과립의 존재의 기능적 중요성에 대한 연구는 매우 제한적으로 남아 있다. 본 연구에서, 본 발명자들은 비록 분비 과립이 세포체 보다 세포 돌기에서 더 많이 위치할 지라도 정상 신경교아 성상 세포들(glial astrocytes)이 적은 양의 분비 과립을 세포체 및 세포 돌기에서 발현한다는 것을 확인하였다. 하지만, 본 발명의 교모세포종 성상 세포에서 분비 과립이 세포체 및 세포 돌기에서 광범위하게 분포하는 것으로 보였는데(도 3A 및 도 3B), 이는 상술한 영향받은 세포들의 세포질에서 분비 과립이 일반적인 역할을 한다는 것을 의미한다.
글루타메이트, ATP 및 펩타이드 같은 아교세포전달물질(gliotransmitters)이 뇌에서 신경교세포 및 뉴우런들 간의 세포-대-세포 소통에서 중요한 역할을 수행하고 이러한 아교세포전달물질의 방출이 내부 소스들로부터 방출된 Ca2+에 의존한다(Angulo et al. 2004; Fellin et al. 2006; Perea 및 Araque 2005; Volterra 및 Meldolesi 2005; Montana et al. 2006; Panatier et al. 2006; Haydon 및 Carmignoto 2006)는 것을 고려해보면, 성상 세포의 정상 기능에서 세포 내 Ca2+ 저장의 특이적 중요성은 명백하게 된다. 성상 세포는 뉴우런들의 신경성 시냅스에 존재하고 전압개폐성(voltage-gated) Ca2+ 채널과 접하는 “활성 부위(active zone)”를 가지지 않는다는 것은 성상 세포의 많은 Ca2+-의존적 활성들의 조절에서 세포 내 Ca2+ 소스가 매우 중요하다는 것을 추가적으로 나타낸다(Santello 및 Volterra 2009; Haydon 및 Carmignoto 2006).
더욱이, 성상 세포에서 Ca2+-의존적 글루타메이트 방출은 IP3-의존적 세포 내 Ca2+ 방출 때문인 것으로 알려져 있다(Araque et al. 2000; Hua et al. 2004; Jeremic et al. 2001). 따라서 분비 경로의 조절로 이끄는 세포 내 저장소로부터의 Ca2+ 방출이 IP3-의존적 Ca2+ 방출과 일차적으로 연결되어 있다는 것을 고려했을 때, 성상 세포의 IP3-민감적 세포 내 Ca2+ 저장이 성상 세포의 정상 기능에 매우 중요한 역할을 하는 것이 명확해 보인다(Hua et al. 2004; Jeremic et al. 2001; Araque et al. 2000). 이러한 면에서, 분비 함유물의 운반체 및 세포 내 Ca2+ 저장소로서 분비 과립의 참여는 성상 세포의 정상 생리학에서 분비 과립의 중요성을 더욱 부가시키는 것으로 보인다. 그러므로, IP3-민감적 세포 내 Ca2+ 저장소로서 기능할 수 있는 소기관들의 수는 그들이 위치하는 세포의 Ca2+-의존적 세포 활성을 결정하는 데 결정적일 것이며, 또한 이러한 이유로 세포에 존재하는 분비 과립의 수는 세포의 IP3-의존적 세포 내 Ca2+ 조절에 중요한 결정인자(key determinant)인 것으로 보인다.
따라서 분비 과립들은 그들이 위치하는 세포의 Ca2+을 저장하고 세포 내 Ca2+ 농도를 조절하는 주요한 세포 내 소기관이므로(Gerasimenko et al. 1996; Haigh et al. 1989; Huh et al. 2006; Huh et al. 2005b; Hutton 1989; Yoo 및 Albanesi 1990; Quesada et al. 2003; Nguyen et al. 1998), GBM 성상 세포에서 비정상적으로 많은 수의 분비 과립의 존재는 성상 세포를 포함하는 뇌 종양의 병인학에서 Ca2+의 매우 중요한 역할을 강하게 나타낸다. 또한, 성상 세포에서 Ca2+의 과도한 유용성은 세포의 건강한 상태(well-being)에 대한 징조가 아니며 Ca2+-조절 기관인 분비 과립 수의 변화는 세포 내 Ca2+ 항상성(homeostasis)을 조절하는 세포의 전체적인 능력을 변화시켰다. 다양한 세포 기능의 조절에서 Ca2+의 중요성을 볼 때, 세포 내 Ca2+ 항상성을 조절하는 세포의 전체적인 능력의 변화는 세포의 분화에 쉽게 영향을 끼칠 수 있으며, 이는 암 세포의 발생 및 증식을 잠재적으로 초래할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명자들은 신경교아 성상 세포에서 발현되는 분비 과립의 수가 인간 뇌 조직의 병리학적 상태와 직접적으로 관련되어 있음을 제시한다. Ca2+을 저장하고 방출하는데 있어서 영향 받은 성상 세포의 비정상적인 고용량은 뇌 종양의 병리학에서 중요한 기능을 할 것이다. 결과적으로, 이러한 변화들은 GBM 성상 세포의 병인학적 상태 및 세포 내 분비 과립의 증가된 수 간에 밀접한 연관성이 있음을 의미한다.
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이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
도 1은 정상 뇌 조직의 성상 세포에서 분비 과립-유사 소낭들(크고 진한-코어 소낭들)을 나타내는 전자현미경 사진이다.
전자현미경을 이용하여 정상 인간 뇌 조직을 조사하였으며, 성상 세포의 세포체(A) 및 세포 돌기(B)에서 분비 과립-유사 소낭이 관찰되었다. 분비 과립-유사 소낭(SG)이 화살표로 표시되었다. Nu, 핵; M, 미토콘드리아; ax, 축색돌기; fm, 필라멘트. 막대 = 200 nm.
도 2는 CGB 및 SgII이 정상 뇌 조직의 성상 세포에서 분비 과립-유사 소낭들(크고 진한-코어 소낭들)에 위치함을 나타내는 면역 골드 전자현미경 사진이다.
정상 인간 뇌 조직에서 유래한 성상 세포들이 CGB(A) 및 SgII(B)(15 nm 골드)에 대해 친화성 정제된 CGB 및 SgII 항체로 각각 면역 표지(immunolabel)되었다. 분비 과립-유사 소낭(SG)이 화살표로 표시되었다. CGB- 및 SgII-표지된 골드 파티클이 미토콘드리아(M)가 아니라 소포체(er)에 있는 몇몇 분비 과립-유사 소낭들에 일차적으로 위치하였다. 일차 항체를 처리하지 않은 대조군 실험에서, 어떠한 골드 파티클도 분비 과립-유사 소낭에서 발견되지 않았다(결과를 보이지 않음). 막대 = 200 nm.
도 3은 다형성 교모세포종 뇌 조직의 성상 세포에서 분비 과립을 나타내는 전자현미경 사진이다.
다형성 교모세포종 뇌 조직을 전자현미경을 이용하여 조사하고 성상 세포의 세포체(A) 및 세포 돌기(B)에서 분비 과립이 표시되었다. 분비 과립(SG) 및 미토 콘드리아(M)이 다른 화살표로 나타내었다. Nu, 핵; er, 소포체. 막대 = 200 nm.
도 4는 다형성 교모세포종 뇌 조직의 성상 세포 내 분비 과립의 CGB 및 SgII의 위치를 나타내는 면역 골드 전자현미경 사진이다.
GBM 조직으로부터 분리한 성상 세포가 CGB(A) 및 SgII(B)(15 nm 골드)에 대해 친화성 정제된 CGB 및 SgII 항체로 각각 면역 표지되었다. 분비 과립-유사 소낭(SG) 및 미토콘드리아(M)가 검은색 화살표(closed arrows)로 표시되었다. CGB-(A) 및 SgII(B)-표지된 골드 파티클이 미토콘드리아(M)가 아니라 소포체(er)에 있는 몇몇 분비 과립-유사 소낭들에 일차적으로 위치하였다. 일차 항체를 처리하지 않은 대조군 실험에서, 어떠한 골드 파티클도 분비 과립-유사 소낭에서 발견되지 않았다(결과를 보이지 않음). 막대 = 200 nm.
도 5는 정상 및 다형성 교모세포종 뇌 조직의 성상 세포 내 분비 과립의 분포를 나타내는 그래프이다.
정상 및 GBM 뇌 조직의 성상 세포에서 분비 과립의 수 및 분비 과립에 의해 점유된 면적이 대응 t-검정(paired t-test)에 따른 결과를 막대 그래프에서 (평균값 ± 표준 오차)로 표시하였다. 세포 이미지 당 분비 과립의 수(왼쪽) 및 전체 세포 이미지 면적 당 분비 과립에 의해 점유된 면적(오른쪽, %)을 나타냈다.
도 6은 정상 및 GBM 뇌 조직으로부터 추출된 단백질 추출물에서 크로모그라닌 B 발현의 면역블롯 분석 결과이다.
여섯 개의 서로 다른 정상(N1-N6) 및 GBM(G1-G6) 조직 시료들로부터 추출한 단백질 추출물을 10% SDS-폴리아크릴아마이드 젤에 전기영동(resolve)한 후 친화성 정제된 CGB 항체(A)를 이용하여 면역블롯으로 분석하였다. 면역블롯 결과는 위쪽 패널에 나타내었으며, 면역블롯에 대한 밀도 분석 결과를 나타내는 막대 그래프는 아래쪽 패널에 나타냈다. 밀도 분석을 통해 결정된 정상 및 GBM 조직에서의 CGB 발현 레벨은 대응 t-검정에 따른 결과를 막대 그래프에서 (평균값 ± 표준 오차)로 표시하였다(B).
도 7은 정상 및 GBM 뇌 조직으로부터 추출된 단백질 추출물에서 씨크리토그라닌 II 발현의 면역블롯 분석 결과이다.
여섯 개의 서로 다른 정상(N1-N6) 및 GBM(G1-G6) 조직 시료들로부터 추출한 단백질 추출물을 10% SDS-폴리아크릴아마이드 젤에 전기영동(resolve)한 후 친화성 정제된 SgII 항체(A)를 이용하여 면역블롯으로 분석하였다. 면역블롯 결과는 위쪽 패널에 나타내었으며, 면역블롯에 대한 밀도 분석 결과를 나타내는 막대 그래프는 아래쪽 패널에 나타냈다. 밀도 분석을 통해 결정된 정상 및 GBM 조직에서의 SgII 발현 레벨은 대응 t-검정에 따른 결과를 막대 그래프에서 (평균값 ± 표준 오차)로 표시하였다(B).
도 8은 비-신경 내분비 세포인 NIH3T3 세포에서 새롭게 형성된 진한-코어 과립들을 나타내는 전자현미경 사진이다.
비-신경 내분비 세포인 NIH3T3 세포를 pCI-CGA 또는 pCICGB로 트랜스펙션시킨 후, 전자현미경을 이용하여 새롭게 형성된 진한-코어 과립들의 출현을 조사하였다. 정상 NIH3T3 세포(A), CGA-(B), CGB-(C) 및 공벡터(D)-트랜스펙션된 세포들. 여러 개의 새롭게 형성된 진한-코어 과립들을 화살표로 나타내었다(큰 화살표 머 리, 큰 과립; 작은 화살표, 작은 과립). Nu, 핵; M, 미토콘드리아; G, 골지체; er, 소포체. 막대 = 200 nm.
도 9는 비-신경 내분비 세포인 COS-7 세포에서 새롭게 형성된 진한-코어 과립들을 나타내는 전자현미경 사진이다.
비-신경 내분비 세포인 COS-7 세포를 pCI-CGA 또는 pCICGB로 트랜스펙션시킨 후, 전자현미경을 이용하여 새롭게 형성된 진한-코어 과립들의 출현을 조사하였다. CGA-(A), CGB-(B) 및 공벡터(C)-트랜스펙션된 COS-7 세포들. 여러 개의 새롭게 형성된 진한-코어 과립들을 화살표로 나타내었다(큰 화살표 머리, 큰 과립; 작은 화살표, 작은 과립). M, 미토콘드리아; G, 골지체; er, 소포체. 막대 = 200 nm.
도 10은 일시적으로 트랜스펙션된 NIH3T3 세포에서 소 CGA 및 소 CGB의 발현을 나타내는 면역 블롯 결과이다.
pCI-CGA(A) 또는 pCICGB(B)로 트랜스펙션된 NIH3T3 세포로부터 추출된 전체 단백질 추출물을 10% SDS-젤에 전기영동(resolve)한 후 항-CGA 또는 항-CGB 항체로 프로빙하였다. 또한, 로딩된 단백질 양을 확인하기 위해 첫 번째 블롯을 디프로빙한 후에 상기 블롯을 α-튜블린 항체로 재 프로빙하였다. 트랜스펙션되지 않은 세포(정상) 및 pCI-neo 벡터-트랜스펙션된 세포(pCI-empty)로부터 추출된 단백질 추출물을 대조군으로 이용하였다.
도 11은 NIH3T3 및 COS-7 세포의 새롭게 형성된 진한-코어 과립들에서 CGA 및 CGB의 위치를 나타내는 면역 골드 전자현미경 사진이다.
CGA 또는 CGB로 트랜스펙션된 NIH3T3 세포가 CGA(A) 및 CGB(B)(10 nm 골드) 에 대해 친화성 정제된 CGA 및 CGB 항체로 각각 면역 표지되었다. 또한, CGB로 트랜스펙션된 COS-7 세포가 CGB(C)(10 nm 골드)에 대해 친화성 정제된 CGB 항체로 각각 면역 표지되었다. 여러 개의 새롭게 형성된 진한-코어 과립들을 화살표로 나타내었다(큰 화살표 머리, 큰 과립; 작은 화살표, 작은 과립). CGA- 또는 CGB-표지된 골드 파티클이 미토콘드리아(M)가 아니라 소포체(er)에 있는 몇몇 분비성 과립-유사 소낭들에 일차적으로 위치하였다. 일차 항체를 처리하지 않은 대조군 실험에서, 어떠한 골드 파티클도 분비성 과립-유사 소낭에서 발견되지 않았다(결과를 보이지 않음). 막대 = 200 nm.
도 12는 신경 내분비 세포인 PC12 세포에서 분비 과립들을 나타내는 전자현미경 사진이다.
정상 신경 내분비 세포인 PC12 세포는 내재적으로 많은 분비 과립들을 포함하였다(A). 하지만 CGA-siRNA(B) 또는 CGB-siRNA(C)로 트랜스펙션된 세포들은 현저하게 감소된 수의 분비 과립들을 포함하는 반면에, siRNA 없이 트랜스펙션된 세포들(D)은 같은 수의 분비 과립들을 포함하고 있었다. 여러 개의 분비 과립들이 화살표로 표시되었다. Nu, 핵; M, 미토콘드리아; G, 골지체; er, 소포체. 막대 = 200 nm.
도 13은 PC12 세포에서 CGA-siRNA 및 CGB-siRNA에 의한 크로모그라닌 A 및 B의 발현 억제를 나타내는 면역 블롯 결과이다.
CGA-siRNA(A) 또는 CGB-siRNA(B)의 전결정된 양이 5 x 105 PC12 세포로 트랜 스펙션되고 48시간 후에 CGA 및 CGB의 발현 레벨이 면역 블롯을 통해 분석되었다. CGA-siRNA 처리된 세포(A)에서는 CGA-(왼쪽 패널) 및 CGB-특이적(오른쪽 패널) 항체를 이용하여 발현된 단백질을 분석하였으며, CGB-siRNA 처리된 세포(B)에서는 CGB-(왼쪽 패널) 및 CGA-특이적(오른쪽 패널) 항체를 이용하여 발현된 단백질을 분석하였다. 디프로빙한 후에 상기 블롯을 α-튜블린 항체로 재 프로빙하였다.
<110> Inha University <120> Secretory Granules and Granulogenic Factors as a Target for Cancer Treatment <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1374 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgcgctccg ccgctgtcct ggctcttctg ctctgcgccg ggcaagtcac tgcgctccct 60 gtgaacagcc ctatgaataa aggggatacc gaggtgatga aatgcatcgt tgaggtcatc 120 tccgacacac tttccaagcc cagccccatg cctgtcagcc aggaatgttt tgagacactc 180 cgaggagatg aacggatcct ttccattctg agacatcaga atttactgaa ggagctccaa 240 gacctcgctc tccaaggcgc caaggagagg gcacatcagc agaagaaaca cagcggtttt 300 gaagatgaac tctcagaggt tcttgagaac cagagcagcc aggccgagct gaaagaggcg 360 gtggaagagc catcatccaa ggatgttatg gagaaaagag aggattccaa ggaggcagag 420 aaaagtggtg aagccacaga cggagccagg ccccaggccc tcccggagcc catgcaggag 480 tccaaggctg aggggaacaa tcaggcccct ggggaggaag aggaggagga ggaggaggcc 540 accaacaccc accctccagc cagcctcccc agccagaaat acccaggccc acaggccgag 600 ggggacagtg agggcctctc tcagggtctg gtggacagag agaagggcct gagtgcagag 660 ccagggtggc aggcaaagag agaagaggag gaggaggagg aggaggaggc tgaggctgga 720 gaggaggctg tccccgagga agaaggcccc actgtagtgc tgaaccccca cccgagcctt 780 ggctacaagg agatccggaa aggcgagagt cggtcggagg ctctggctgt ggatggagct 840 gggaagcctg gggctgagga ggctcaggac cccgaaggga agggagaaca ggagcactcc 900 cagcagaaag aggaggagga ggagatggca gtggtcccgc aaggcctctt ccggggtggg 960 aagagcggag agctggagca ggaggaggag cggctctcca aggagtggga ggactccaaa 1020 cgctggagca agatggacca gctggccaag gagctgacgg ctgagaagcg gctggagggg 1080 caggaggagg aggaggacaa ccgggacagt tccatgaagc tctccttccg ggcccgggcc 1140 tacggcttca ggggccctgg gccgcagctg cgacgaggct ggaggccatc ctcccgggag 1200 gacagccttg aggcgggcct gcccctccag gtccgaggct accccgagga gaagaaagag 1260 gaggagggca gcgcaaaccg cagaccagag gaccaggagc tggagagcct gtcggccatt 1320 gaagcagagc tggagaaagt ggcccaccag ctgcaggcac tacggcgggg ctga 1374 <210> 2 <211> 457 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Arg Ser Ala Ala Val Leu Ala Leu Leu Leu Cys Ala Gly Gln Val 1 5 10 15 Thr Ala Leu Pro Val Asn Ser Pro Met Asn Lys Gly Asp Thr Glu Val 20 25 30 Met Lys Cys Ile Val Glu Val Ile Ser Asp Thr Leu Ser Lys Pro Ser 35 40 45 Pro Met Pro Val Ser Gln Glu Cys Phe Glu Thr Leu Arg Gly Asp Glu 50 55 60 Arg Ile Leu Ser Ile Leu Arg His Gln Asn Leu Leu Lys Glu Leu Gln 65 70 75 80 Asp Leu Ala Leu Gln Gly Ala Lys Glu Arg Ala His Gln Gln Lys Lys 85 90 95 His Ser Gly Phe Glu Asp Glu Leu Ser Glu Val Leu Glu Asn Gln Ser 100 105 110 Ser Gln Ala Glu Leu Lys Glu Ala Val Glu Glu Pro Ser Ser Lys Asp 115 120 125 Val Met Glu Lys Arg Glu Asp Ser Lys Glu Ala Glu Lys Ser Gly Glu 130 135 140 Ala Thr Asp Gly Ala Arg Pro Gln Ala Leu Pro Glu Pro Met Gln Glu 145 150 155 160 Ser Lys Ala Glu Gly Asn Asn Gln Ala Pro Gly Glu Glu Glu Glu Glu 165 170 175 Glu Glu Glu Ala Thr Asn Thr His Pro Pro Ala Ser Leu Pro Ser Gln 180 185 190 Lys Tyr Pro Gly Pro Gln Ala Glu Gly Asp Ser Glu Gly Leu Ser Gln 195 200 205 Gly Leu Val Asp Arg Glu Lys Gly Leu Ser Ala Glu Pro Gly Trp Gln 210 215 220 Ala Lys Arg Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Glu Ala Gly 225 230 235 240 Glu Glu Ala Val Pro Glu Glu Glu Gly Pro Thr Val Val Leu Asn Pro 245 250 255 His Pro Ser Leu Gly Tyr Lys Glu Ile Arg Lys Gly Glu Ser Arg Ser 260 265 270 Glu Ala Leu Ala Val Asp Gly Ala Gly Lys Pro Gly Ala Glu Glu Ala 275 280 285 Gln Asp Pro Glu Gly Lys Gly Glu Gln Glu His Ser Gln Gln Lys Glu 290 295 300 Glu Glu Glu Glu Met Ala Val Val Pro Gln Gly Leu Phe Arg Gly Gly 305 310 315 320 Lys Ser Gly Glu Leu Glu Gln Glu Glu Glu Arg Leu Ser Lys Glu Trp 325 330 335 Glu Asp Ser Lys Arg Trp Ser Lys Met Asp Gln Leu Ala Lys Glu Leu 340 345 350 Thr Ala Glu Lys Arg Leu Glu Gly Gln Glu Glu Glu Glu Asp Asn Arg 355 360 365 Asp Ser Ser Met Lys Leu Ser Phe Arg Ala Arg Ala Tyr Gly Phe Arg 370 375 380 Gly Pro Gly Pro Gln Leu Arg Arg Gly Trp Arg Pro Ser Ser Arg Glu 385 390 395 400 Asp Ser Leu Glu Ala Gly Leu Pro Leu Gln Val Arg Gly Tyr Pro Glu 405 410 415 Glu Lys Lys Glu Glu Glu Gly Ser Ala Asn Arg Arg Pro Glu Asp Gln 420 425 430 Glu Leu Glu Ser Leu Ser Ala Ile Glu Ala Glu Leu Glu Lys Val Ala 435 440 445 His Gln Leu Gln Ala Leu Arg Arg Gly 450 455 <210> 3 <211> 2034 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atgcagccaa cgctgcttct cagcctcctg ggagccgtgg ggctggcggc tgtcaattcc 60 atgccagtgg ataacaggaa ccacaatgaa ggaatggtga ctcgctgcat cattgaggtc 120 ctctcaaatg ccttgtcgaa gtccagcgct ccacccatca cccctgagtg ccgccaagtc 180 ctgaagacga gtagaaaaga cgtcaaagac aaagagacaa ctgaaaatga aaacacaaag 240 tttgaagtaa gattgttaag agacccagct gatgcctcgg aagcccacga gtcctccagc 300 aggggagagg caggagcccc aggggaggag gacatccaag gcccaacaaa ggcagacaca 360 gagaaatggg cagagggagg cgggcacagc cgagagcgag cggatgagcc ccagtggagc 420 ctctatccct ccgacagcca agtctctgaa gaagtgaaga cacgccattc tgagaagagc 480 cagagagagg atgaggagga ggaggaggga gagaactatc aaaaagggga gcgaggggaa 540 gatagcagtg aagagaaaca ccttgaagag ccaggagaga cacaaaacgc ttttctcaat 600 gaaagaaagc aggcttcagc tataaaaaaa gaggagttag tggccagatc ggaaacacat 660 gctgccgggc attctcagga gaagacacat agccgagaga agagtagcca ggagagtgga 720 gaggagacag ggagccagga gaatcacccc caggagtcta aaggccaacc ccgaagccag 780 gaagaatctg aggaaggtga ggaagatgcc acctctgagg tggacaaacg acgcacgagg 840 cccagacacc accacgggag gagcaggccc gacaggtcct ctcaaggagg gagtcttccc 900 tctgaggaaa agggacaccc ccaggaggaa tctgaggagt caaacgtcag catggccagt 960 ttaggggaaa agagggacca ccattcaacc cactacaggg cttcagagga agaacctgaa 1020 tatggagaag aaataaaggg ttatccaggc gtccaggccc ctgaggacct ggagtgggag 1080 cgctataggg gcagaggaag tgaagaatac agggctccaa gacctcagag tgaggagagt 1140 tgggatgagg aggacaagag aaactacccc agcttagagc ttgataagat ggcacatgga 1200 tatggtgaag aaagtgagga agagaggggc cttgagccgg gaaagggacg ccatcacaga 1260 ggcaggggag gggagccacg tgcctatttc atgtctgaca ccagagaaga gaaaaggttc 1320 ttgggtgaag gacaccaccg tgtccaagaa aaccagatgg acaaggcaag gaggcatcca 1380 caaggtgcgt ggaaagagct ggacagaaat tatctcaact acggtgagga aggagcccca 1440 gggaagtggc agcagcaggg agacctgcag gacactaaag aaaacaggga ggaagctagg 1500 tttcaagata aacaatatag ctcccatcac acagctgaaa agaggaagag attaggggaa 1560 ctgttcaacc catactacga ccctctccag tggaagagca gccattttga aagaagagac 1620 aacatgaatg acaattttct cgagggtgag gaggaaaatg agctgacctt gaacgagaag 1680 aatttcttcc cagaatacaa ctatgactgg tgggagaaaa agcccttctc tgaggatgtg 1740 aactgggggt atgagaagag aaacctcgcc agggtcccca agctggacct gaaaaggcaa 1800 tatgacaggg tggcccaact ggaccagctc cttcactaca ggaagaagtc agctgagttt 1860 ccagacttct atgattctga ggagccggtg agcacccacc aggaggcaga aaatgaaaag 1920 gacagggctg accagacagt cctgacagag gacgagaaaa aagaactcga aaacttggct 1980 gcaatggatt tggaactaca gaagatagct gagaaattca gccaaagggg ctga 2034 <210> 4 <211> 677 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Gln Pro Thr Leu Leu Leu Ser Leu Leu Gly Ala Val Gly Leu Ala 1 5 10 15 Ala Val Asn Ser Met Pro Val Asp Asn Arg Asn His Asn Glu Gly Met 20 25 30 Val Thr Arg Cys Ile Ile Glu Val Leu Ser Asn Ala Leu Ser Lys Ser 35 40 45 Ser Ala Pro Pro Ile Thr Pro Glu Cys Arg Gln Val Leu Lys Thr Ser 50 55 60 Arg Lys Asp Val Lys Asp Lys Glu Thr Thr Glu Asn Glu Asn Thr Lys 65 70 75 80 Phe Glu Val Arg Leu Leu Arg Asp Pro Ala Asp Ala Ser Glu Ala His 85 90 95 Glu Ser Ser Ser Arg Gly Glu Ala Gly Ala Pro Gly Glu Glu Asp Ile 100 105 110 Gln Gly Pro Thr Lys Ala Asp Thr Glu Lys Trp Ala Glu Gly Gly Gly 115 120 125 His Ser Arg Glu Arg Ala Asp Glu Pro Gln Trp Ser Leu Tyr Pro Ser 130 135 140 Asp Ser Gln Val Ser Glu Glu Val Lys Thr Arg His Ser Glu Lys Ser 145 150 155 160 Gln Arg Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Gly Glu Asn Tyr Gln Lys Gly 165 170 175 Glu Arg Gly Glu Asp Ser Ser Glu Glu Lys His Leu Glu Glu Pro Gly 180 185 190 Glu Thr Gln Asn Ala Phe Leu Asn Glu Arg Lys Gln Ala Ser Ala Ile 195 200 205 Lys Lys Glu Glu Leu Val Ala Arg Ser Glu Thr His Ala Ala Gly His 210 215 220 Ser Gln Glu Lys Thr His Ser Arg Glu Lys Ser Ser Gln Glu Ser Gly 225 230 235 240 Glu Glu Thr Gly Ser Gln Glu Asn His Pro Gln Glu Ser Lys Gly Gln 245 250 255 Pro Arg Ser Gln Glu Glu Ser Glu Glu Gly Glu Glu Asp Ala Thr Ser 260 265 270 Glu Val Asp Lys Arg Arg Thr Arg Pro Arg His His His Gly Arg Ser 275 280 285 Arg Pro Asp Arg Ser Ser Gln Gly Gly Ser Leu Pro Ser Glu Glu Lys 290 295 300 Gly His Pro Gln Glu Glu Ser Glu Glu Ser Asn Val Ser Met Ala Ser 305 310 315 320 Leu Gly Glu Lys Arg Asp His His Ser Thr His Tyr Arg Ala Ser Glu 325 330 335 Glu Glu Pro Glu Tyr Gly Glu Glu Ile Lys Gly Tyr Pro Gly Val Gln 340 345 350 Ala Pro Glu Asp Leu Glu Trp Glu Arg Tyr Arg Gly Arg Gly Ser Glu 355 360 365 Glu Tyr Arg Ala Pro Arg Pro Gln Ser Glu Glu Ser Trp Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Lys Arg Asn Tyr Pro Ser Leu Glu Leu Asp Lys Met Ala His Gly 385 390 395 400 Tyr Gly Glu Glu Ser Glu Glu Glu Arg Gly Leu Glu Pro Gly Lys Gly 405 410 415 Arg His His Arg Gly Arg Gly Gly Glu Pro Arg Ala Tyr Phe Met Ser 420 425 430 Asp Thr Arg Glu Glu Lys Arg Phe Leu Gly Glu Gly His His Arg Val 435 440 445 Gln Glu Asn Gln Met Asp Lys Ala Arg Arg His Pro Gln Gly Ala Trp 450 455 460 Lys Glu Leu Asp Arg Asn Tyr Leu Asn Tyr Gly Glu Glu Gly Ala Pro 465 470 475 480 Gly Lys Trp Gln Gln Gln Gly Asp Leu Gln Asp Thr Lys Glu Asn Arg 485 490 495 Glu Glu Ala Arg Phe Gln Asp Lys Gln Tyr Ser Ser His His Thr Ala 500 505 510 Glu Lys Arg Lys Arg Leu Gly Glu Leu Phe Asn Pro Tyr Tyr Asp Pro 515 520 525 Leu Gln Trp Lys Ser Ser His Phe Glu Arg Arg Asp Asn Met Asn Asp 530 535 540 Asn Phe Leu Glu Gly Glu Glu Glu Asn Glu Leu Thr Leu Asn Glu Lys 545 550 555 560 Asn Phe Phe Pro Glu Tyr Asn Tyr Asp Trp Trp Glu Lys Lys Pro Phe 565 570 575 Ser Glu Asp Val Asn Trp Gly Tyr Glu Lys Arg Asn Leu Ala Arg Val 580 585 590 Pro Lys Leu Asp Leu Lys Arg Gln Tyr Asp Arg Val Ala Gln Leu Asp 595 600 605 Gln Leu Leu His Tyr Arg Lys Lys Ser Ala Glu Phe Pro Asp Phe Tyr 610 615 620 Asp Ser Glu Glu Pro Val Ser Thr His Gln Glu Ala Glu Asn Glu Lys 625 630 635 640 Asp Arg Ala Asp Gln Thr Val Leu Thr Glu Asp Glu Lys Lys Glu Leu 645 650 655 Glu Asn Leu Ala Ala Met Asp Leu Glu Leu Gln Lys Ile Ala Glu Lys 660 665 670 Phe Ser Gln Arg Gly 675 <210> 5 <211> 1854 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 atggctgaag caaagaccca ctggcttgga gcagccctgt ctcttatccc tttaattttc 60 ctcatctctg gggctgaagc agcttcattt cagagaaacc agctgcttca gaaagaacca 120 gacctcaggt tggaaaatgt ccaaaagttt cccagtcctg aaatgatcag ggctttggag 180 tacatagaaa acctccgaca acaagctcat aaggaagaaa gcagcccaga ttataatccc 240 taccaaggtg tctctgtccc ccttcagcaa aaagaaaatg gcgatgaaag ccacttgccc 300 gagagggatt cactgagtga agaagactgg atgagaataa tactcgaagc tttgagacag 360 gctgaaaatg agcctcagtc tgcaccaaaa gaaaataagc cctatgcctt gaattcagaa 420 aagaactttc caatggacat gagtgatgat tatgagacac agcagtggcc agaaagaaag 480 cttaagcaca tgcaattccc tcctatgtat gaagagaatt ccagggataa cccctttaaa 540 cgcacaaatg aaatagtgga ggaacaatat actcctcaaa gccttgctac attggaatct 600 gtcttccaag agctggggaa actgacagga ccaaacaacc agaaacgtga gaggatggat 660 gaggagcaaa aactttatac ggatgatgaa gatgatatct acaaggctaa taacattgcc 720 tatgaagatg tggtcggggg agaagactgg aacccagtag aggagaaaat agagagtcaa 780 acccaggaag aggtgagaga cagcaaagag aatatagaaa aaaatgaaca aatcaacgat 840 gagatgaaac gctcagggca gcttggcatc caggaagaag atcttcggaa agagagtaaa 900 gaccaactct cagatgatgt ctccaaagta attgcctatt tgaaaaggtt agtaaatgct 960 gcaggaagtg ggaggttaca gaatgggcaa aatggggaaa gggccaccag gctttttgag 1020 aaacctcttg attctcagtc tatttatcag ctgattgaaa tctcaaggaa tttacagata 1080 cccccagaag acttaattga gatgctcaaa actggggaga agccgaatgg atcagtggaa 1140 ccggagcggg agcttgacct tcctgttgac ctagatgaca tctcagaggc tgacttagac 1200 catccagacc tgttccaaaa taggatgctc tccaagagtg gctaccctaa aacacctggt 1260 cgtgctggga ctgaggccct accagacggg ctcagtgttg aggatatttt aaatctttta 1320 gggatggaga gtgcagcaaa tcagaaaacg tcgtattttc ccaatccata taaccaggag 1380 aaagttctgc caaggctccc ttatggtgct ggaagatcta gatcgaacca gcttcccaaa 1440 gctgcctgga ttccacatgt tgaaaacaga cagatggcat atgaaaacct gaacgacaag 1500 gatcaagaat taggtgagta cttggccagg atgctagtta aataccctga gatcattaat 1560 tcaaaccaag tgaagcgagt tcctggtcaa ggctcatctg aagatgacct gcaggaagag 1620 gaacaaattg agcaggccat caaagagcat ttgaatcaag gcagctctca ggagactgac 1680 aagctggccc cggtgagcaa aaggttccct gtggggcccc cgaagaatga tgatacccca 1740 aataggcagt actgggatga agatctgtta atgaaagtgc tggaatacct caaccaagaa 1800 aaggcagaaa agggaaggga gcatattgct aagagagcaa tggaaaatat gtaa 1854 <210> 6 <211> 617 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Ala Glu Ala Lys Thr His Trp Leu Gly Ala Ala Leu Ser Leu Ile 1 5 10 15 Pro Leu Ile Phe Leu Ile Ser Gly Ala Glu Ala Ala Ser Phe Gln Arg 20 25 30 Asn Gln Leu Leu Gln Lys Glu Pro Asp Leu Arg Leu Glu Asn Val Gln 35 40 45 Lys Phe Pro Ser Pro Glu Met Ile Arg Ala Leu Glu Tyr Ile Glu Asn 50 55 60 Leu Arg Gln Gln Ala His Lys Glu Glu Ser Ser Pro Asp Tyr Asn Pro 65 70 75 80 Tyr Gln Gly Val Ser Val Pro Leu Gln Gln Lys Glu Asn Gly Asp Glu 85 90 95 Ser His Leu Pro Glu Arg Asp Ser Leu Ser Glu Glu Asp Trp Met Arg 100 105 110 Ile Ile Leu Glu Ala Leu Arg Gln Ala Glu Asn Glu Pro Gln Ser Ala 115 120 125 Pro Lys Glu Asn Lys Pro Tyr Ala Leu Asn Ser Glu Lys Asn Phe Pro 130 135 140 Met Asp Met Ser Asp Asp Tyr Glu Thr Gln Gln Trp Pro Glu Arg Lys 145 150 155 160 Leu Lys His Met Gln Phe Pro Pro Met Tyr Glu Glu Asn Ser Arg Asp 165 170 175 Asn Pro Phe Lys Arg Thr Asn Glu Ile Val Glu Glu Gln Tyr Thr Pro 180 185 190 Gln Ser Leu Ala Thr Leu Glu Ser Val Phe Gln Glu Leu Gly Lys Leu 195 200 205 Thr Gly Pro Asn Asn Gln Lys Arg Glu Arg Met Asp Glu Glu Gln Lys 210 215 220 Leu Tyr Thr Asp Asp Glu Asp Asp Ile Tyr Lys Ala Asn Asn Ile Ala 225 230 235 240 Tyr Glu Asp Val Val Gly Gly Glu Asp Trp Asn Pro Val Glu Glu Lys 245 250 255 Ile Glu Ser Gln Thr Gln Glu Glu Val Arg Asp Ser Lys Glu Asn Ile 260 265 270 Glu Lys Asn Glu Gln Ile Asn Asp Glu Met Lys Arg Ser Gly Gln Leu 275 280 285 Gly Ile Gln Glu Glu Asp Leu Arg Lys Glu Ser Lys Asp Gln Leu Ser 290 295 300 Asp Asp Val Ser Lys Val Ile Ala Tyr Leu Lys Arg Leu Val Asn Ala 305 310 315 320 Ala Gly Ser Gly Arg Leu Gln Asn Gly Gln Asn Gly Glu Arg Ala Thr 325 330 335 Arg Leu Phe Glu Lys Pro Leu Asp Ser Gln Ser Ile Tyr Gln Leu Ile 340 345 350 Glu Ile Ser Arg Asn Leu Gln Ile Pro Pro Glu Asp Leu Ile Glu Met 355 360 365 Leu Lys Thr Gly Glu Lys Pro Asn Gly Ser Val Glu Pro Glu Arg Glu 370 375 380 Leu Asp Leu Pro Val Asp Leu Asp Asp Ile Ser Glu Ala Asp Leu Asp 385 390 395 400 His Pro Asp Leu Phe Gln Asn Arg Met Leu Ser Lys Ser Gly Tyr Pro 405 410 415 Lys Thr Pro Gly Arg Ala Gly Thr Glu Ala Leu Pro Asp Gly Leu Ser 420 425 430 Val Glu Asp Ile Leu Asn Leu Leu Gly Met Glu Ser Ala Ala Asn Gln 435 440 445 Lys Thr Ser Tyr Phe Pro Asn Pro Tyr Asn Gln Glu Lys Val Leu Pro 450 455 460 Arg Leu Pro Tyr Gly Ala Gly Arg Ser Arg Ser Asn Gln Leu Pro Lys 465 470 475 480 Ala Ala Trp Ile Pro His Val Glu Asn Arg Gln Met Ala Tyr Glu Asn 485 490 495 Leu Asn Asp Lys Asp Gln Glu Leu Gly Glu Tyr Leu Ala Arg Met Leu 500 505 510 Val Lys Tyr Pro Glu Ile Ile Asn Ser Asn Gln Val Lys Arg Val Pro 515 520 525 Gly Gln Gly Ser Ser Glu Asp Asp Leu Gln Glu Glu Glu Gln Ile Glu 530 535 540 Gln Ala Ile Lys Glu His Leu Asn Gln Gly Ser Ser Gln Glu Thr Asp 545 550 555 560 Lys Leu Ala Pro Val Ser Lys Arg Phe Pro Val Gly Pro Pro Lys Asn 565 570 575 Asp Asp Thr Pro Asn Arg Gln Tyr Trp Asp Glu Asp Leu Leu Met Lys 580 585 590 Val Leu Glu Tyr Leu Asn Gln Glu Lys Ala Glu Lys Gly Arg Glu His 595 600 605 Ile Ala Lys Arg Ala Met Glu Asn Met 610 615

Claims (21)

  1. (a) 과립형성 인자(granulogenic factor)-인코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 과립형성 인자의 발현 또는 분비 과립(secretory granule)의 생성을 분석하는 단계를 포함하는 암 치료제의 스크리닝 방법으로, 상기 시험물질이 과립형성 인자의 발현 또는 분비 과립의 생성을 억제시키면 암 치료제로 판단된다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 과립형성 인자는 크로모그라닌 A(CGA), 크로모그라닌 B(CGB) 또는 씨크리토그라닌 II(SgII)인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 과립형성 인자는 크로모그라닌 B(CGB) 또는 씨크리토그라닌 II(SgII)인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 과립형성 인자의 발현 또는 분비 과립 생성 억제는 세포의 과립형성 인자의 발현 감소, 또는 세포 당 분비 과립의 수를 감소시키거나 또는 세포 총면적 당 분비 과립의 점유 면적을 감소시키는 것을 특징으로 하는 방 법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 암은 뇌암, 신경 내분비 암, 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 부신암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 및 요관암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 암은 분비 세포 종양인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 분비 세포 종양은 뇌암, 신경 내분비 암, 신경절교종, 뇌하수체 선종, 췌장암, 부신암, 유방암, 자궁암 또는 전립선암인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 크로모그라닌 B(CGB) 또는 씨크리토그라닌 II(SgII) 유전자의 발현 또는 분비 과립의 생성을 억제하거나, 또는 크로모그라닌 B(CGB) 또는 씨크리토그라닌 II(SgII)의 작용을 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제 8 항에 있어서, 상기 암은 뇌암, 신경 내분비 암, 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 부신암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 및 요관암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 암은 분비 세포 종양인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 분비 세포 종양은 뇌암, 신경 내분비 암, 신경절교종, 뇌하수체 선종, 췌장암, 부신암, 유방암, 자궁암 또는 전립선암인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  14. 제 8 항에 있어서, 상기 유효성분은 크로모그라닌 B(CGB) 또는 씨크리토그라닌 II(SgII) 유전자의 발현을 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 siRNA인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  15. 크로모그라닌 B(CGB) 또는 씨크리토그라닌 II(SgII)에 결합하는 결합제를 포함하는 암 진단용 키트.
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 제 15 항에 있어서, 상기 암은 뇌암, 신경 내분비 암, 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 부신암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 및 요관암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암인 것을 특징으로 하는 키트.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 암은 분비 세포 종양인 것을 특징으로 하는 키트.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 분비 세포 종양은 뇌암, 신경 내분비 암, 신경절교종, 뇌하수체 선종, 췌장암, 부신암, 유방암, 자궁암 또는 전립선암인 것을 특징으로 하는 키트.
  21. 제 15 항에 있어서, 상기 결합제는 항체 또는 앱타머인 것을 특징으로 하는 키트.
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