KR20240052222A - 건선의 중증도 진단용 바이오마커 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 건선의 중증도 진단용 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 클러스테린의 발현 억제에 의해 이미퀴모드에 의해 유도된 건선 염증, 체중감소 및 비장의 무게증가가 완화되고, 각질형성세포에서 이미퀴모드와 IL-17에 의해 유도된 염증성 사이토카인의 발현 증가도 억제됨을 확인하였으며, 나아가 건선 환자의 표피내에서 정상 대조군에 비해 높은 클러스테린의 발현을 확인하여 건선의 중증도 진단용 바이오마커 또는 건선의 치료제 등에 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 건선의 중증도 진단용 바이오마커를 제공한다.
건선은 만성 염증성 피부질환으로 악화와 재발을 반복하는 난치성 질환이다. 주로는 홍반인설의 피부병변으로 발생하나, 전신적인 염증 반응도 동반될 수 있다. 그 예로 건선은 염증성 장 질환, 대사질환 등과의 염증성 동반질환과 역학적, 병태생리적 연관관계가 알려져 있다. 건선은 IL-23 및 IL-17과 관련된 면역 반응이 그 병태생리의 핵심으로 알려지고 있으나, 아직까지 질환의 조절만 가능할 뿐 난치성 질환이며 동시에 유병률이 전체 인구의 1% 근처로 상당하며 노출부위를 포함한 전신 피부에 피부 병변을 유발하기에 치료 요구가 높은 질환이다.
한편, 클러스테린은 인간을 포함한 포유류를 구성하는 대부분 세포에서 발현하는 지질단백질의 일종으로 외부 스트레스 요인으로부터 발현된다고 알려졌다. 클러스테린은 조직재생, 세포사멸, 세포 부착, 지질 수송 등의 다양한 분자생물학적 과정에 관여하며, 염증과 같은 스트레스 상황에서 발현이 증가하면서 세포 보호 역할을 시행하는 것으로도 알려졌다. 다른 연구에서 당뇨, 동맥경화 등의 대사질환의 발생과정에 관여하는 것이 알려져 있으며, 암 발생과의 연관성도 연구가 되었다. 하지만, 아직까지 피부질환의 병인기전에서 클러스테린의 역할에 대한 연구는 없는 실정이다.
따라서, 클러스테린의 발현이 건선의 병태생리에 영향을 미치는지 여부를 확인하여 클러스테린을 이용하여 건선의 중증도를 진단하는 기술 개발이 필요한 실정이다.
본 발명의 목적은 클러스테린(Clusterin) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 건선의 중증도 진단용 바이오마커 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 클러스테린(Clusterin) 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 건선 중증도 진단용 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 건선 중증도 진단용 키트을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 건선 환자에서 분리된 시료로부터 클러스테린(Clusterin)의 mRNA 발현 수준 또는 클러스테린(Clusterin) 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 상기 클러스테린(Clusterin)의 mRNA 발현 수준 또는 클러스테린(Clusterin) 단백질의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계: 및 상기 클러스테린(Clusterin)의 mRNA 발현 수준 또는 클러스테린(Clusterin) 단백질의 발현 수준이 대조군보다 높은 경우 건선의 중증도가 높다고 판단하는 단계를 포함하는 건선 중증도 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 클러스테린(Clusterin) 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 건선의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 각질형성세포(keratinocyte)에 이미퀴모드(imquimod)로 자극한 후, 시험 물질을 접촉시키는 단계; 상기 시험물질을 접촉시킨 각질형성세포(keratinocyte)에서 클러스테린(Clusterin) 단백질의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및 시험 물질을 접촉시키지 않은 대조군 각질형성세포(keratinocyte)와 비교하여 상기 클러스테린(Clusterin) 단백질의 발현 또는 활성 정도가 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 건선 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 클러스테린(Clusterin) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 건선의 중증도 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 클러스테린(Clusterin) 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 건선 중증도 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 건선 중증도 진단용 키트을 제공한다.
또한, 본 발명은 건선 환자에서 분리된 시료로부터 클러스테린(Clusterin)의 mRNA 발현 수준 또는 클러스테린(Clusterin) 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;상기 클러스테린(Clusterin)의 mRNA 발현 수준 또는 클러스테린(Clusterin) 단백질의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계: 및 상기 클러스테린(Clusterin)의 mRNA 발현 수준 또는 클러스테린(Clusterin) 단백질의 발현 수준이 대조군보다 높은 경우 건선의 중증도가 높다고 판단하는 단계를 포함하는 건선 중증도 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 클러스테린(Clusterin) 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 건선의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 각질형성세포(keratinocyte)에 이미퀴모드(imquimod)로 자극한 후, 시험 물질을 접촉시키는 단계; 상기 시험물질을 접촉시킨 각질형성세포(keratinocyte)에서 클러스테린(Clusterin) 단백질의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및 시험 물질을 접촉시키지 않은 대조군 각질형성세포(keratinocyte)와 비교하여 상기 클러스테린(Clusterin) 단백질의 발현 또는 활성 정도가 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 건선 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 건선의 중증도 진단용 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 클러스테린 발현 억제에 의해 이미퀴모드에 의해 유도된 건선 염증이 약화되고, 각질형성세포에서 이미퀴모드와 IL-17에 의해 유도된 염증성 사이토카인의 발현 증가도 억제됨을 확인하였으며, 나아가 건선 환자의 표피내에서 정상 대조군에 비해 높은 클러스테린의 발현을 확인하여 건선의 중증도 진단용 바이오마커 또는 건선의 치료제 등에 활용될 수 있다.
도 1은 마우스에 이미퀴모드를 3일간 도포한 급성기 동물모델의 등 피부의 염증을 촬영한 결과이다.
도 2는 마우스에 이미퀴모드를 3일간 도포한 급성기 동물모델의 체중변화를 확인한 결과이다.
도 3은 마우스에 이미퀴모드를 3일간 도포한 급성기 동물모델의 PASI 점수 변화를 확인한 결과이다.
도 4는 마우스에 이미퀴모드를 3일간 도포한 급성기 동물모델의 등 피부의 표피를 촬영한 결과이다.
도 5는 마우스에 이미퀴모드를 3일간 도포한 급성기 동물모델의 등 피부의 표피두께를 확인한 결과이다.
도 6은 마우스에 이미퀴모드를 3일간 도포한 급성기 동물모델의 등 피부의 골수세포형과산화효소(MPO) 양성 세포를 촬영한 결과이다.
도 7은 마우스에 이미퀴모드를 3일간 도포한 급성기 동물모델의 등 피부의 골수세포형과산화효소(MPO) 양성 세포를 확인한 결과이다.
도 8은 마우스에 이미퀴모드를 2주간 도포한 만성기 동물모델의 등과 귀의 염증을 촬영한 결과이다.
도 9는 마우스에 이미퀴모드를 2주간 도포한 만성기 동물모델의 PASI 점수 변화를 확인한 결과이다.
도 10은 마우스에 이미퀴모드를 2주간 도포한 만성기 동물모델의 귀 피부의 표피를 촬영한 결과이다.
도 11은 마우스에 이미퀴모드를 2주간 도포한 만성기 동물모델의 귀 피부의 표피 두께를 확인한 결과이다.
도 12는 마우스에 이미퀴모드를 2주간 도포한 만성기 동물모델의 등 피부의 표피를 촬영한 결과이다.
도 13은 마우스에 이미퀴모드를 2주간 도포한 만성기 동물모델의 등 피부의 표피 두께를 확인한 결과이다.
도 14는 마우스에 이미퀴모드를 2주간 도포한 만성기 동물모델의 귀에서의 염증성 사이토카인의 발현 정도와 비장의 비율을 확인한 결과이다.
도 15는 마우스에 이미퀴모드를 6주간 도포한 만성기 동물모델의 생존율을 확인한 결과이다.
도 16은 마우스에 이미퀴모드를 6주간 도포한 만성기 동물모델의 귀 피부의 표피를 촬영한 결과이다.
도 17은 마우스에 이미퀴모드를 6주간 도포한 만성기 동물모델의 귀 피부의 표피 두께를 확인한 결과이다.
도 18은 각질형성세포에 이미퀴모드로 자극을 준 후 TNF-α와 IL-1β의 발현을 확인한 결과이다.
도 19는 각질형성세포에 IL-17A 또는 IL-17A 및 TNF-α로 자극을 준 후 TNF-α와 IL-1β의 발현을 확인한 결과이다.
도 20은 건선 검체와 대조군 검체의 표피와 진피를 촬영한 결과이다.
도 21은 건선 검체와 대조군 검체의 표피와 진피에서의 클러스테린 발현을 확인한 결과이다.
도 22는 건선의 중증도에 따른 클러스테린 발현을 확인한 결과이다.
도 2는 마우스에 이미퀴모드를 3일간 도포한 급성기 동물모델의 체중변화를 확인한 결과이다.
도 3은 마우스에 이미퀴모드를 3일간 도포한 급성기 동물모델의 PASI 점수 변화를 확인한 결과이다.
도 4는 마우스에 이미퀴모드를 3일간 도포한 급성기 동물모델의 등 피부의 표피를 촬영한 결과이다.
도 5는 마우스에 이미퀴모드를 3일간 도포한 급성기 동물모델의 등 피부의 표피두께를 확인한 결과이다.
도 6은 마우스에 이미퀴모드를 3일간 도포한 급성기 동물모델의 등 피부의 골수세포형과산화효소(MPO) 양성 세포를 촬영한 결과이다.
도 7은 마우스에 이미퀴모드를 3일간 도포한 급성기 동물모델의 등 피부의 골수세포형과산화효소(MPO) 양성 세포를 확인한 결과이다.
도 8은 마우스에 이미퀴모드를 2주간 도포한 만성기 동물모델의 등과 귀의 염증을 촬영한 결과이다.
도 9는 마우스에 이미퀴모드를 2주간 도포한 만성기 동물모델의 PASI 점수 변화를 확인한 결과이다.
도 10은 마우스에 이미퀴모드를 2주간 도포한 만성기 동물모델의 귀 피부의 표피를 촬영한 결과이다.
도 11은 마우스에 이미퀴모드를 2주간 도포한 만성기 동물모델의 귀 피부의 표피 두께를 확인한 결과이다.
도 12는 마우스에 이미퀴모드를 2주간 도포한 만성기 동물모델의 등 피부의 표피를 촬영한 결과이다.
도 13은 마우스에 이미퀴모드를 2주간 도포한 만성기 동물모델의 등 피부의 표피 두께를 확인한 결과이다.
도 14는 마우스에 이미퀴모드를 2주간 도포한 만성기 동물모델의 귀에서의 염증성 사이토카인의 발현 정도와 비장의 비율을 확인한 결과이다.
도 15는 마우스에 이미퀴모드를 6주간 도포한 만성기 동물모델의 생존율을 확인한 결과이다.
도 16은 마우스에 이미퀴모드를 6주간 도포한 만성기 동물모델의 귀 피부의 표피를 촬영한 결과이다.
도 17은 마우스에 이미퀴모드를 6주간 도포한 만성기 동물모델의 귀 피부의 표피 두께를 확인한 결과이다.
도 18은 각질형성세포에 이미퀴모드로 자극을 준 후 TNF-α와 IL-1β의 발현을 확인한 결과이다.
도 19는 각질형성세포에 IL-17A 또는 IL-17A 및 TNF-α로 자극을 준 후 TNF-α와 IL-1β의 발현을 확인한 결과이다.
도 20은 건선 검체와 대조군 검체의 표피와 진피를 촬영한 결과이다.
도 21은 건선 검체와 대조군 검체의 표피와 진피에서의 클러스테린 발현을 확인한 결과이다.
도 22는 건선의 중증도에 따른 클러스테린 발현을 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 클러스테린(Clusterin) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 건선의 중증도 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
상기 건선은 이미퀴모드(imiquimod)에 의해 유발될 수 있다.
본 발명의 "바이오마커"는 건선이 발생한 대상체의 조직 또는 세포를 정상 대조군의 조직 또는 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 대조군에 비하여 질환이 발생한 대상체의 조직 또는 세포에서 증가 또는 감소 양상을 보이는 단백질 또는 핵산, 지질, 당지질, 당단백질 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다.
본 발명의 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 개체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 개체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 개체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 개체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함한다.
또한, 본 발명은 클러스테린(Clusterin) 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 건선 중증도 진단용 조성물을 제공한다.
상기 클러스테린(Clusterin) 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 클러스테린(Clusterin) 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 상기 클러스테린(Clusterin) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 화합물일 수 있다.
상기 건선은 이미퀴모드(imiquimod)에 의해 유발될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, “프라이머”란 DNA 합성의 기시점이 되는 짧은 유전자 서열로써, 진단, DNA 시퀀싱 등에 이용할 목적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 상기 프라이머들은 통상적으로 15 내지 30 염기쌍의 길이로 합성하여 사용할 수 있으나, 사용 목적에 따라 달라질 수 있으며, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화등으로 변형시킬 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, “프로브”란 효소 화학적인 분리정제 또는 합성과정을 거쳐 제작된 수 염기 내지 수백 염기길이의 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 핵산을 의미한다. 방사성 동위원소나 효소 등을 표지하여 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있으며, 공지된 방법으로 디자인하고 변형시켜 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 “항체”는 당해 기술분야에 공지된 용어로서 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 의미한다. 본 발명에서의 항체는 본 발명의 클러스테린 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 항체를 제조할 수 있다. 상기 항체의 형태는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태를 의미한다. 또한, 상기 항체는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.
본 발명에서 사용된 용어 “펩타이드”는 표적 물질에 대한 결합력 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한, 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다. 구체적으로 고분자 단백질 체인에 붙여서 이용이 가능하므로 진단 키트 및 약물전달 물질로 이용될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 “앱타머”는 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 특별한종류의 단일 가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)으로 구성된 폴리뉴클레오티드의 일종을 의미한다. 상술한 바와 같이, 앱타머는 항체와 동일하게 항원성 물질에 특이적으로 결합할 수 있으면서도, 단백질보다 안정성이 높고, 구조가 간단하며, 합성이 용이한 폴리뉴클레오티드로 구성되어 있으므로, 항체를 대체하여 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 건선 중증도 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 “키트”는 바이오마커 성분에 특이적으로 결합하는 항체, 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체(conjugate), 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액 및 효소 반응 정지액 등을 포함할 수 있으며, 사용되는 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
또한, 본 발명은 건선 환자에서 분리된 시료로부터 클러스테린(Clusterin)의 mRNA 발현 수준 또는 클러스테린(Clusterin) 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 상기 클러스테린(Clusterin)의 mRNA 발현 수준 또는 클러스테린(Clusterin) 단백질의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계: 및 상기 클러스테린(Clusterin)의 mRNA 발현 수준 또는 클러스테린(Clusterin) 단백질의 발현 수준이 대조군보다 높은 경우 건선의 중증도가 높다고 판단하는 단계를 포함하는 건선 중증도 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 시료는 건선 조직일 수 있다.
상기 환자로부터 분리된 시료는 구체적으로 대상체로부터 분리되는 세포주, 조직학적 슬라이드, 생검체, 포르말린-고정된 파라핀-포매(formalin fixed paraffin embedded, FFPE) 조직, 신체 유체 (body fluid), 대변, 소변, 혈장, 혈청, 전혈, 단리된 혈액 세포 또는 혈액일 수 있으며, 보다 더 구체적으로는 혈액일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 클러스테린(Clusterin) 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 건선의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 클러스테린(Clusterin) 발현 억제제는 클러스테린(Clusterin) 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이제 제한되는 것은 아니다.
상기 클러스테린(Clusterin) 활성 억제제는 클러스테린(Clusterin) 단백질에 특이적으로 결합하는 저분자 화합물, 펩타이드, 펩타이드 미메틱스, 앱타머, 항체 및 천연물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구체예에서, 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다. 본 발명에 따른 유효성분의 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 투여량이 0.01 mg/kg 내지 200 mg/kg, 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 각질형성세포(keratinocyte)에 이미퀴모드(imquimod)로 자극한 후, 시험 물질을 접촉시키는 단계; 상기 시험물질을 접촉시킨 각질형성세포(keratinocyte)에서 클러스테린(Clusterin) 단백질의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및 시험 물질을 접촉시키지 않은 대조군 각질형성세포(keratinocyte)와 비교하여 상기 클러스테린(Clusterin) 단백질의 발현 또는 활성 정도가 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 건선 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예 등은 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예 등에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예 등은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실험 예 1> 마우스 출처
WT C57/BL6 마우스는 Orient(성남, 한국)에서 구입했으며, IL-10 녹아웃(IL-10-/-) 마우스는 동물자원개발센터(서울, 한국)에서, 클러스테린 녹아웃(clusterin-/-) 마우스는 울산대학교 의과대학(서울, 한국) M.S.KIM 교수로부터 기증받았다.
C57/BL6 배경을 가진 동형 접합 IL-10-/- 및 클러스테린-/- 마우스는 쌍을 이루고 이형 접합 인터루킨-10/클러스테린 이중 녹아웃 마우스는 유전형 분석에 의해 확인되었다. 모든 마우스 실험은 서울시-서울대 보라매병원 동물관리 및 이용위원회(IRB No. 2020-0046, 2020-0052)의 승인을 받았고, 모든 생쥐는 서울특별시 보라매병원 동물실험실에서 표준 온도, 습도, 명암 주기의 조절하에 병원균이 없는 조건에서 유지되었다.
<실험 예 2> 건선 유사 염증 마우스 모델 생성
7 내지 8주령의 클러스테린-/- 및 WT 마우스를 급성 이미퀴모드 유도 건선 유사 염증 모델로 사용했다. 이미퀴모드로 유도된 건선과 유사한 염증은 이미퀴모드 크림(5% Aldara®; 3M Pharmaceuticals, Minnesota, USA)을 마우스의 귀나 면도한 등 피부에 국소 투여(3일 연속)하여 유도되었다. 대조군 마우스의 피부에 바셀린(VAS) 크림을 도포하였다. IL-10 결핍은 현저한 전신 염증을 유발한다는 것을 발견하였다. 따라서 7 내지 8주령 이중 녹아웃 및 IL-10-/- 마우스를 만성 이미퀴모드 유도 건선 유사 염증 모델에 사용했고, 이미퀴모드는 일주일에 세 번 이중 녹아웃 및 IL-10-/- 마우스의 귀 또는 면도된 등 피부에 적용되었다.
체중은 급성 실험 모델의 경우 매일, 만성 실험 모델의 경우 격일로 측정되었고, 체중변화는 다음과 같이 계산하였다. 체중변화(%) = [(후속체중) - (초기체중)]x100. 마우스를 이소플루란 흡입으로 안락사시키고 피부와 비장 샘플을 얻었다.
<실험 예 3> 피부 염증의 중증도 평가
쥐 실험 모델에서 총 피부 염증은 PASI 점수에 의해 평가되었다. PASI 점수는 홍반, 두께 및 비늘의 세 가지 지표의 합으로 계산되었다. 홍반, 두께 및 비늘 점수는 0에서 4까지 독립적으로 점수를 매겼고, 식별된 홍반, 두께 또는 비늘이 심할수록 높은 점수를 부여하였다.
<실험 예 4> IHC분석
피부 샘플을 수집하고 4% 파라포름알데히드에 고정하고 파라핀에 포매했습니다. 피부 절편을 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 및 골수과산화효소(MPO)에 특이적인 항체(1:25, Abcam, Cambridge, UK)로 염색했다. ImageJ(National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 표피 두께(2회의 무작위 측정 평균)와 MPO의 광학 밀도(2회의 무작위 측정 평균)를 분석했다.
<실험 예 5> 인간 각질형성세포 배양
HaCaT 세포(인간 각질형성세포)는 10% 소태아혈청(FBS), 1mM 비필수아미노산, 1mM 피루브산나트륨 및 2mM 항생제가 없는 탄산수소나트륨이 보충된 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)/Earle's 균형 염 용액 배지에서 배양하였다. 모든 세포는 5% CO2에서 37℃에서 배양되었다. 60 내지 80% 세포 컨플루언시에서 세포를 siRNA로 형질감염시켰다. 간단히 말해서, 클러스테린 또는 대조군 siRNA를 무혈청 배지에 희석하고 형질감염 시약(WelGene, 한국)과 혼합하였다. 10분 인큐베이션 후, 혼합물을 각질세포에 첨가하였다. 형질감염 후, 세포를 이미퀴모드 크림 또는 사이토카인으로 처리하였다.
총 250mg의 5% 이미퀴모드 크림 또는 비히클을 1.5mL 디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해하고 2μL의 혼합물을 200μL의 Opti-MEM(Thermo Fischer Scientific, MA, USA)에 첨가한 다음, 6 μL의 Lipofectamine 3000(Thermo Fischer Scientific, MA, USA)을 첨가하였다. 20분 후, 혼합물을 얻기 전에 16시간 동안 각질형성세포에 첨가하였다. siRNA 형질감염 후, 혼합물을 얻기 전에 배지에 24시간 동안 IL-17(200ng/mL; R&D Systems, MN, USA) 및 TNF-α(10ng/mL; Sigma-Aldrich Corp, MO, USA)를 첨가하거나 첨가하지 않았다.
<실험 예 6> 역전사 PCR
RNAiso Plus(Takara Bio Inc., Shiga, Japan)를 사용하여 총 mRNA를 추출하여 First Strand cDNA Synthesis 키트(MBI Fermentas, Vilnius, Lithuania)로 cDNA를 합성했다. 역전사 PCT은 SYBR Premix Ex Taq II 키트(Takara Bio Inc., Shiga, Japan)를 사용하여 수행되었다.
RT-qPCR에 사용된 프라이머 서열은 하기 표 1과 같다.
| Mouse TNF-α | (F) 5′-CAT CTT CTA AAA ATC GAG TGA CAA-3′ (R) 5′-CAT CTT CTA AAA ATC GAG TGA CAA-3′ |
| Mouse IL-17 | (F) 5′-TCT CAT CCA GCA AGA GAT CC-3′ (R) 5′-AGT TTG GGA CCC CTT TAC AC-3′ |
| Human TNF-α | (F) 5′-CCC GAG TGA CAA GCC TGT AG-3′ (R) 5′-GAT GGC AGA GAG GAG GTT GAC-3′ |
| Human IL-1β | (F) 5′-CTT CAG CCA ATC TTC ATT GC-3′ (R) 5′-GTG GTC GGA GAT TCG TAG C-3′ |
| Human CXCL1 | (F) 5′-GCG CCC AAA CCG AAG TCA TA-3′ (R) 5′-ATG GGG GAT GCA GGA TTG AG-3′ |
| Human CCL20 | (F) 5′-TTG CTC CTG GCT GCT TTG-3′ (R) 5′-ACC CTC CAT GAT GTG CAA G-3′ |
<실험 예 7> 통계적 분석
데이터는 GraphPad Prism 7(GraphPad Software, San Diego, Canada) 및 SPSS 소프트웨어(버전 25.0; SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하여 분석되었다. 그룹 간의 차이의 유의성은 짝지어지지 않은 t-검정 또는 Mann-Whitney U 검정을 사용하여 결정되었다. Spearman의 상관 분석을 사용하여 클러스테린 발현과 건선 중증도 간의 상관 관계를 분석했다. 그림의 열은 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)를 나타낸다.
<실험 예 8> 피부 표본 분석
2011년에서 2020년 사이에 서울특별시 보라매병원 피부과를 방문한 건선 및 정상 대조군 환자를 대상으로 하였다. 인체 표본을 이용한 모든 연구는 서울특별시 보라매의료원 기관심사위원회(IRB No. 20-2019-34, 20-2019-45)의 승인을 받았으며 헬싱키 원칙 선언에 따라 수행되었다. 등록된 환자는 이전에 자격을 갖춘 피부과 의사에 의해 건선 진단을 받았다. 환자의 피부 샘플을 이용하여 건선의 중증도를 평가하였고, 비늘, 홍반 및 두께의 등급에 따라 환자를 경증 또는 중증으로 분류하였다. 인간 피부 샘플을 포름알데히드에 고정하고 파라핀에 포매했다. 절단 섹션은 항-클러스테린 항체(1:25, Abcam, Waltham, MA, USA)로 면역염색했다. 표피 또는 진피의 클러스테린 양성 영역(%)은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 분석되었다.
<실시 예 1> 급성기 동물 모델
1. 급성기 동물 모델 생성
wild type(C57BL/6 mice, 이하 WT라 함.) 마우스 및 클러스테린 넉아웃 마우스 각각에 이미퀴모드 또는 바셀린을 등에 매일 3일간 도포하여 건선의 급성기 동물 모델과 대조군을 만들었다. 도포한 등 부위 피부에 유발된 염증을 육안적으로 확인하고, 매일 몸무게 변화를 측정하였다. 4일 차에 희생하여 등 부위 피부의 표피두께 확인 및 MPO(myeloperoxidase) 염색을 시행하였다.
2. 피부 염증, 체중 및 PASI 점수 변화 확인
클러스테린과 건선의 관계를 확인하기 위해 급성기 동물모델을 이용하여 피부 염증, 체중 및 PASI 점수를 확인하였다.
그 결과, 도 1 및 도 2에 따르면, 건선 염증과 관련하여 클러스테린 넉아웃 모델에서 WT 모델에 비해 염증이 경미하였고, 체중과 관련하여 바셀린을 도포한 쪽은 체중의 변화가 없었으나, 3일 동안 이미퀴모드를 도포한 쪽은 몸무게가 지속적으로 감소함을 확인하였다. 이후 4일 차 클러스테린 넉아웃 모델의 경우 WT모델에 비해 체중감소가 유의하게 적음을 확인하였다.
또한, 도 3에 따르면, 이미퀴모드 3일 도포 후 피부의 염증을 평가한 PASI 점수는 클러스테린 넉아웃 모델이 WT 모델에 비해 유의하게 낮음을 확인하였다.
이를 통해, 클러스테린이 넉아웃된 경우에는 피부 염증, 체중 감소, PASI 점수가 넉아웃되지 않은 경우에 비해 적어 클러스테린의 발현 억제가 건선의 증상을 약화시킴을 확인할 수 있었다.
3. 등 피부의 표피 변화 확인
클러스테린과 건선의 관계를 확인하기 위해 급성기 동물모델을 이용하여 등 피부의 표피 변화를 확인하였다.
그 결과, 도 4 및 도 5에 따르면, H&E염색을 통해 관찰한 경우, 바셀린을 도포한 쪽은 등 표피의 두께 변화가 관찰되지 않았고 이미퀴모드를 도포한 쪽은 등 표피의 두께가 상대적으로 두꺼워졌음을 확인할 수 있었다. 그 중 이미퀴모드 넉아웃 모델은 WT 모델에 비해 등 표피 두께가 유의하게 얇음을 확인하였다.
또한, 도 6 및 도 7에 따르면, MPO염색을 통해 관찰한 경우, 바셀린을 도포한 쪽은 MPO 양성세포의 수의 변화가 관찰되지 않았고 이미퀴모드를 도포한 쪽은 MPO 양성세포의 수가 상대적으로 증가함을 확인하였다. 그 중 이미퀴모드 넉아웃 모델은 WT 모델에 비해 MPO 양성세포의 수가 유의하게 적음을 확인하였다.
이를 통해, 클러스테린이 넉아웃된 경우에는 등 표피 두께 및 MPO 양성세포의 수가 넉아웃되지 않은 경우에 비해 적어 클러스테린의 발현 억제가 건선의 증상을 약화시킴을 확인할 수 있었다.
<실시 예 2> 만성기 동물 모델
1. 만성기 동물 모델 생성
IL-10 넉아웃 마우스 및 더블 넉아웃 (IL-10 및 클러스테린 넉아웃) 마우스 각각에 등 또는 귀 피부에 이미퀴모드 또는 바셀린을 주 3회 2주 또는 6주 도포하여 건선의 만성기 동물모델을 만들었다. 도포한 부위 피부에 유발된 염증을 육안적으로 확인하고, 매일 몸무게의 변화 및 생존 수를 측정 및 관찰하였다. 2주 혹은 6주 차에 희생하여 도포 부위 피부의 표피두께 측정 및 MPO염색을 시행하였다. 도포 표피에서 RT-PCR을 시행하여 염증성 사이토카인의 발현을 정량적으로 측정하였다.
2. 2주 만성기 모델의 피부 염증 및 PASI 점수 변화 확인
클러스테린과 건선의 관계를 확인하기 위해 2주 만성기 동물모델을 이용하여 귀 및 등 피부 염증 및 PASI 점수를 확인하였다.
그 결과, 도 8에 따르면, 건선 염증과 관련하여 2주간 바셀린 또는 이미퀴모드를 도포한 경우 바셀린을 도포한 쪽은 염증을 관찰하기 어려웠으며 이미퀴모드를 도포한 경우 염증을 관찰할 수 있었다. 그 중 더블 넉아웃 모델에서 IL-10 넉아웃 모델에 비해 귀와 등 피부 표피 모두에서 염증이 경미하였음을 확인하였다.
또한, 도 9에 따르면, 바셀린 및 이미퀴모드 2주 도포 후 피부의 염증을 평가한 PASI 점수는 바셀린을 도포한 쪽은 점수가 0에 가까웠으며 이미퀴모드를 도포한 경우 PASI 점수가 더블 넉아웃 모델에서 IL-10 넉아웃 모델에 비해 유의하게 낮음을 확인하였다.
이를 통해, 더블 넉아웃된 경우에는 피부 염증 및 PASI 점수가 IL-10 넉아웃만 된 경우에 비해 적어 클러스테린의 발현 억제가 건선의 증상을 약화시킴을 확인할 수 있었다.
3. 2주 만성기 모델의 귀 및 등 피부의 표피 변화 확인
클러스테린과 건선의 관계를 확인하기 위해 2주 만성기 동물모델을 이용하여 귀 및 등 피부의 표피 변화를 확인하였다.
그 결과, 도 10 및 도 11에 따르면, 귀 표피와 관련하여 바셀린을 도포한 쪽은 귀 표피의 두께 변화가 관찰되지 않았고 이미퀴모드를 도포한 쪽은 귀 표피의 두께가 상대적으로 두꺼워졌음을 확인할 수 있었다. 그 중 더블 넉아웃 모델에서 IL-10 넉아웃 모델에 비해 귀 표피 두께가 유의하게 얇음을 확인하였다.
또한, 도 12 및 13에 따르면, 등 표피와 관련하여 바셀린을 도포한 쪽은 등 표피의 두께 변화가 관찰되지 않았고 이미퀴모드를 도포한 쪽은 등 표피의 두께가 상대적으로 두꺼워졌음을 확인할 수 있었다. 그 중 더블 넉다웃 모델에서 IL-10 넉아웃 모델에 비해 귀 표피 두께가 유의하게 얇음을 확인하였다.
이를 통해, 더블 넉아웃된 경우에는 피부 염증 및 PASI 점수가 IL-10 넉아웃만 된 경우에 비해 적어 클러스테린의 발현 억제가 건선의 증상을 약화시킴을 확인할 수 있었다.
4. 2주 만성기 모델의 비장 무게 및 사이토카인 발현 변화 확인
클러스테린과 건선의 관계를 확인하기 위해 2주 만성기 동물모델을 이용하여 비장의 무게와 사이토카인의 발현 변화를 확인하였다.
그 결과, 도 14에 따르면, 바셀린을 도포한 쪽은 몸무게 대비 비장의 무게의 변화가 없었지만 이미퀴모드를 도포한 쪽은 몸무게 대비 비장의 무게가 증가함을 확인할 수 있었다. 그 중 더불 넉아웃 모델에서 IL-10 넉아웃 모델에 비해 비장의 무게가 낮은 경향이 있음을 확인하였다. 또한, 사이토카인 발현과 관련하여 이미퀴모드를 도포한 쪽의 귀에서 TNF-α의 발현은 더블 넉아웃 모델에서 IL-10 넉아웃 모델에 비해 유의하게 낮았으며, IL-17의 발현 또한 유의하진 않았으며 더블 넉아웃 모델이 더 낮음을 확인하였다.
이를 통해, 더블 넉아웃된 경우에는 사이토카인 발현 정도가 IL-10 넉아웃만 된 경우에 비해 낮아 건선의 염증을 약화시킴을 확인할 수 있었다.
5. 6주 만성기 모델의 생존율
도 15에 따르면, 6주간 등과 귀에 바셀린 또는 이미퀴모드를 도포한 결과, 바셀린을 도포한 쪽과 이미퀴모드를 도포하고 더블 넉아웃한 모델의 경우 마우스가 한 마리도 죽지 않아 생존율이 높은 반면, 이미퀴모드를 도포하고 IL-10 넉아웃만한 모델은 40일 후에 생존율이 50%로 떨어지는 것을 확인하였다.
6. 6주 만성기 모델의 귀 피부 표피의 변화 확인
클러스테린과 건선의 관계를 확인하기 위해 6주 만성기 동물모델을 이용하여 귀 피부의 표피 변화를 확인하였다.
그 결과, 도 16 및 도 17에 따르면, 바셀린을 도포한 쪽은 두께 변화가 관찰되지 않았으며 이미퀴모드를 도포한 쪽은 귀 표피가 두꺼워짐을 확인하였다, 그 중 더블 넉아웃 모델에서 IL-10 넉아웃 모델에 비해 유의하게 얇음을 확인하였다.
이를 통해, 더블 넉아웃된 경우에는 IL-10 넉아웃만 된 경우에 비해 건선에의한 표피의 두꺼워짐을 완화시켜 건선의 증상을 약화시킴을 확인할 수 있었다.
<실시 예 3> 세포 실험을 통한 사이토카인의 변화 확인
각질형성세포에 이미퀴모드, IL-17A 또는 IL-17A+TNF-α 자극을 주어 유도되는 사이토카인(TNF-α 및 IL-1β)의 변화를 확인하였다.
그 결과, 도 18에 따르면, 각질형성세포에 이미퀴모드로 자극을 주어 TNF-α 및 IL-1β를 정량적으로 분석한 결과, TNF-α 및 IL-1β의 발현 증가는 모두 클러스테린 siRNA를 가하였을 때, 유의하게 억제되었음을 확인하여 염증이 감소함을 확인할 수 있었다.
또한, 도 19에 따르면, 각질형성세포에 IL-17A 또는 IL-17A+TNF-α 자극을 주어 TNF-α 및 IL-1β를 정량적으로 분석한 결과, IL-17A 자극에 의한 경우는 TNF-α, CXCL1 및 IL-1β의 발현 증가는 모두 클러스테린 siRNA를 가하였을 때 유의하게 억제되었음을 확인하였다. 나아가, IL-17A에 더하여 TNF-α 자극이 함께 가해진 때에는 상기와 같은 억제 효과는 제거됨을 확인하였다.
<실시 예 4> 인체 검체 연구
1. 건선과 대조군 검체에서 클러스테린의 발현 확인
총 29명의 건선 환자 (평균 연령 34.66±3.57세, 남자 17명, 여자 12명)의 검체와 19명의 대조군 (평균 연령 38.58±3.56세, 남자 10명, 여자 9명) 검체가 대상이 되어 클러스테린의 발현 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 20 및 도 21에 따르면, 건선 검체의 표피에서 대조군 검체의 표피에 비해 유의하게 높은 클러스테린의 발현이 관찰되었으며, 건선 검체의 진피에서 대조군 검체의 진피에 비해 유의하지는 않으나 클러스테린의 발현이 높은 경향이 있음을 확인하였다.
2. 건선의 중증도에 따른 클러스테린의 발현 확인
건선의 중증도에 따른 클러스테린과의 상관관계를 확인하기 위해 대조군과 약한(mild) 건선, 심한(severe) 건선의 클러스테린 발현양을 비교하였다.
그 결과, 도 22에 따르면, 대조군에 비해 약한 건선과 심한 건선의 클러스테린의 발현양이 유의하게 증가함을 확인하였으며, 약한 건선에 비해 심한 건선의 경우 유의하지는 않았지만 클러스테린의 발현양이 증가함을 확인하였다.
따라서, 건선의 중증도가 증가함에 따라 클러스테린의 발현양이 증가함을 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (12)
- 클러스테린(Clusterin) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 건선의 중증도 진단용 바이오마커 조성물.
- 청구항 1에 있어서,
상기 건선은 이미퀴모드(imiquimod)에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는 건선의 중증도 진단용 바이오마커 조성물. - 클러스테린(Clusterin) 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 건선 중증도 진단용 조성물.
- 청구항 3에 있어서,
상기 클러스테린(Clusterin) 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 클러스테린(Clusterin) 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 상기 클러스테린(Clusterin) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 화합물인 것을 특징으로 하는 건선 중증도 진단용 조성물. - 청구항 3에 있어서,
상기 건선은 이미퀴모드(imiquimod)에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는 건선 중증도 진단용 조성물. - 청구항 3의 조성물을 포함하는 건선 중증도 진단용 키트.
- (1) 건선 환자에서 분리된 시료로부터 클러스테린(Clusterin)의 mRNA 발현 수준 또는 클러스테린(Clusterin) 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;
(2) 상기 클러스테린(Clusterin)의 mRNA 발현 수준 또는 클러스테린(Clusterin) 단백질의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계: 및
(3) 상기 클러스테린(Clusterin)의 mRNA 발현 수준 또는 클러스테린(Clusterin) 단백질의 발현 수준이 대조군보다 높은 경우 건선의 중증도가 높다고 판단하는 단계를 포함하는 건선 중증도 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법. - 청구항 7에 있어서,
상기 시료는 건선 조직인 것을 특징으로 하는 건선 중증도 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법. - 클러스테린(Clusterin) 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 건선의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 청구항 9에 있어서,
상기 클러스테린(Clusterin) 발현 억제제는 클러스테린(Clusterin) 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 건선의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 청구항 9에 있어서,
상기 클러스테린(Clusterin) 활성 억제제는 클러스테린(Clusterin) 단백질에 특이적으로 결합하는 저분자 화합물, 펩타이드, 펩타이드 미메틱스, 앱타머, 항체 및 천연물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 건선의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - (1) 각질형성세포(keratinocyte)에 이미퀴모드(imquimod)로 자극한 후, 시험 물질을 접촉시키는 단계;
(2) 상기 시험물질을 접촉시킨 각질형성세포(keratinocyte)에서 클러스테린(Clusterin) 단백질의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및
(3) 시험 물질을 접촉시키지 않은 대조군 각질형성세포(keratinocyte)와 비교하여 상기 클러스테린(Clusterin) 단백질의 발현 또는 활성 정도가 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 건선 치료제 스크리닝 방법.
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|---|---|---|---|---|
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