KR101793175B1 - Lcn2 유전자를 이용한 소라페닙 치료에 대한 감수성 예측방법 및 lcn2 저해제를 포함하는 암 치료용 조성물 - Google Patents

Lcn2 유전자를 이용한 소라페닙 치료에 대한 감수성 예측방법 및 lcn2 저해제를 포함하는 암 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 LCN2 유전자를 이용하여 소라페닙 치료에 대한 감수성을 예측하는 방법 및 LCN2 발현 억제를 이용한 소라페닙 내성암 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 LCN2 유전자를 이용한 소라페닙 치료에 대한 감수성을 예측하는 방법은 암 환자에게 적합한 약물을 투여하여 최적의 치료 효과를 달성할 수 있도록 하며, LCN2 억제를 이용한 소라페닙 내성암 치료용 조성물은 항암 치료 효과가 매우 우수하다.

Description

LCN2 유전자를 이용한 소라페닙 치료에 대한 감수성 예측방법 및 LCN2 저해제를 포함하는 암 치료용 조성물 {Method for Prediction of Susceptibility to Sorafenib Using SULF2 Gene and Composition for Treating Cancer Containing SULF2 Inhibitor}
본 발명은 LCN2 유전자를 이용하여 소라페닙 치료에 대한 감수성을 예측하는 방법 및 LCN2 발현 억제를 이용한 소라페닙 내성암 치료용 조성물에 관한 것이다.
현재, 암의 치료를 위해서는 수술 요법, 방사선 치료 요법 및 화학요법 등이 사용되고 있다. 오늘날에는 약 60여 종의 다양한 항암제가 사용되고 있으며, 새로운 항암제 개발에 관한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 그러나, 항암제들은 반복적으로 장기간 투여되거나 암이 재발된 경우에는 암세포가 항암제에 대한 내성을 획득함으로써 치료 효과를 상실하는 단점이 있다.
따라서, 상기와 같은 항암제는 내성이 발생하는 특성 때문에 시장에서는 다양한 종류의 약품 개발이 지속적으로 요구되고 있으며, 특히 환자들의 부작용을 최소화할 수 있는 항암제의 선별적 치료가 필요로 한다.
종래의 항암 화학요법(cancer chemotherapy)에 따르면, 암 환자 개인이 아니라 암의 종류 및 암의 심각도에 따라 적합한 항암제를 선별하고 투여를 하고 있다. 그러나, 대체적인 임상 결과는 환자에 따라 이러한 항암 화학요법의 치료 효과가 크게 차이가 있다.
상술한 화학요법의 단점을 극복하기 위하여, Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE), Cancer Genome Project (CGP), Connectivity Map (CMAP) 및 NC160 패널 등의 약물 유전체 데이터를 이용한 약물-유전자 상호 작용을 밝히는 것이 필요하다. 즉, 암세포에서 약물 감수성을 진단하고 유전자 변이뿐만 아니라 전사, 메틸화 및 DNA 카피 수의 변화를 포함한 각각의 종양에서의 특정 게놈 변화에 대응하는 다양한 약물 후보를 확인하는 것이다 (Basu A et al., Cell 154:1151-61, 2013; Iorio F et al., Cell 166:740-54, 2016). 그러나, 수백 가지의 돌연변이 중 가능한 대상을 발견하기가 쉽지 않아 게놈 데이터로부터 임상 치료법을 개발하는데 어려움이 있으며, 오류를 줄이기 위한 신중하고 엄격한 분석은 의미있는 정보를 폐기하게 되는 단점이 있다.
한편, 소라페닙 (sorafenib)은 정상세포는 그대로 두고 암세포와 암세포에 영양을 공급하는 혈관내피세포만을 공격하여 치료하는 경구용 표적항암제 (Oral Multikinase Inhibitor)로 알려져 있다. 소라페닙은 다양한 고형 종양에 대해 임상연구가 진행되고 있는데, 신세포암종에서 이미 표적항암제로 사용 중이며, 진행 간세포암종에 대한 임상연구가 진행되어 최근 미국 식약청은 절제수술이 불가능한 간세포암종의 치료제로 승인하기도 하였다.
그러나, 다수의 환자가 소라페닙 투여 및 치료에 있어 무반응자로 확인되어 치료를 시작하기 전에 치료 반응을 예측할 수 있는 방법 및 이를 확인할 수 있는 방법이 필요하다. 또한, 신뢰성 있는 유전자마커 (biomarker)에 대한 연구를 통해 소라페닙 치료 대상의 감수성을 예측하면 적합한 약물투여가 가능하다.
이에, 본 발명자들은 약물 유전체 데이터에 대한 체계적인 분석을 통해 암 환자에서 소라페닙 치료에 대한 감수성을 예측하고 증진시키기 위해 예의 노력한 결과, SULF2 - EGFR - LCN2 경로가 소라페닙 감수성 및 간암 세포의 내성에 중요한 역할을 한다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 LCN2 (lipocalin 2) 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하여 소라페닙 치료에 대한 감수성을 예측하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 LCN2 (lipocalin 2) 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제 또는 LCN2 (lipocalin 2) 돌연변이를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 소라페닙 치료에 대한 감수성 예측용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 LCN2 (lipocalin 2)의 발현을 억제할 수 있는 제제를 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 대상체 (subject)로부터 분리된 시료로부터 DNA 또는 단백질을 추출하는 단계; (b) LCN2 (lipocalin 2) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 발현 수준이 대조군에 비해 감소한 경우, 소라페닙 치료에 대한 감수성이 높은 것으로 예측하는 단계를 포함하는 소라페닙 치료에 대한 감수성을 예측하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, LCN2 (lipocalin 2) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 암 환자의 소라페닙 치료에 대한 감수성 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, LCN2 (lipocalin 2)의 발현을 억제할 수 있는 제제를 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 LCN2 유전자를 이용한 소라페닙 치료에 대한 감수성을 예측하는 방법은 암 환자에게 적합한 약물을 투여하여 최적의 치료 효과를 달성할 수 있도록 하며, LCN2 억제를 이용한 소라페닙 내성암 치료용 조성물은 항암 치료 효과가 매우 우수하다.
도 1은 약물 감수성 돌연변이 유전자를 확인하기 위한 순서도이다.
도 2는 24개의 항암 약물에 대한 세포주의 감수성을 분류하기 위한 것으로, 민감 및 내성 세포주는 log10(IC50)의 중간값에 따라 분류되었다.
도 3의 (A)는 NT shRNA 또는 SULF2 shRNA (#1 또는 #2)를 발현하는 Huh7 세포에 0.07813-20μM 농도의 소라페닙을 48시간 처리하여 세포 생존력을 측정한 것이며, (B)는 NT shRNA 또는 SULF2 shRNA가 발현하는 HepG2 세포의 생존력을 측정한 것이고, (C)는 벡터, SULF2-WT 및 SULF2-N491K가 과발현하는 Hep3B 세포의 생존력을 측정한 것이며, (D)는 Huh7 세포에 0.07813-20μM 농도의 소라페닙 또는 200μM OKN-007과 0.07813-20μM 농도의 소라페닙을 함께 처리하여 세포 생존력을 측정한 것이고, (E)는 HepG2 세포의 생존력을 측정한 것이며, (F)는 벡터, SULF2-WT 및 SULF2-N491K가 과발현하는 Hep3B 세포에 소라페닙 또는 OKN-007과 소라페닙을 함께 48시간 처리하여 세포 생존력을 측정한 것이다.
도 4의 (A)는 SULF2-WT와 SULF2-N491K 세포 간에 차등적으로 발현되는 유전자를 보여주는 것이며, (B)는 벡터, SULF2-WT 및 SULF2-N491K 세포에서 LCN2 mRNA 발현 수준을 qRT-PCR 로 측정한 것이고, (C)는 2μM 소라페닙을 72시간 처리한 후 LCN2 mRNA 발현 수준을 qRT-PCR 로 측정한 것이며, (D)는 LCN2 shRNA (# 252 및 # 459)를 발현하는 SULF2-WT 세포에 0.07813-20μM 농도의 소라페닙을 48시간 처리하여 세포 생존력을 측정한 것이다.
도 5의 (A)는 벡터, SULF2-WT 및 SULF2-N491K 세포에서 단백질 발현을 확인한 것이며, (B)는 SULF2-WT 세포를 OKN-007 (200μM) 및/또는 제피티닙 (5μM)에 48시간 동안 노출 시킨 후 LCN2 mRNA 발현 수준을 qRT-PCR로 측정한 것이고, (C)는 벡터, SULF2-WT 및 SULF2-N491K 세포를 U0126 (10μM)에 48시간 동안 노출 시킨 후 LCN2 mRNA 발현 수준을 qRT-PCR로 측정한 것이며, (D) 및 (E)는 NT shRNA, STAT1 shRNA (#875 또는 #1201) 또는 p65 shRNA (#888 또는 #1488)를 발현하는 SULF2-WT 세포에서 LCN2 mRNA 발현 수준을 qRT-PCR로 측정한 것이고, (F)는 웨스턴블롯으로 확인한 것이다.
도 6의 (A)는 벡터, SULF2-WT 및 SULF2-N491K 세포에 2μM 소라페닙을 72시간 처리한 후, 암피레귤린의 mRNA 수준을 qRT-PCR로 측정한 것이며, (B)는 암피레귤린(50 ng/ml)의 처리에 따른 단백질 발현을 확인한 것이다.
도 7의 (A)는 벡터, SULF2-WT 및 SULF2-N491K 세포에 2μM 소라페닙을 72시간 처리한 후, EGFR 및 암피레귤린 항체로 형광 염색한 것이며, (B)는 non-permeabilized 세포를 SULF2 항체를 사용하여 live 염색하여 간접 면역형광현미경으로 확인한 것이고, (C)는 0.2% Triton X-100으로 permeabilized시킨 세포를 SULF2 항체로 염색항 것이며, (D)는 벡터, SULF2-WT 및 SULF2-N491K 세포를 24시간 배양한 후, 세포 용해물의 설퍼타아제 활성을 확인한 것이다.
도 8의 (A)는 벡터, SULF2-WT 및 SULF2-N491K 세포를 48시간 배양 후, 증식율을 측정한 것이며, (B)는 Hep3B 세포 이동에 대한 SULF2-WT 또는 SULF2-N491K의 영향을 Transwell 이동 분석 시스템을 사용하여 측정한 것이고, (C)는 배양한 세포에서 EFGR 및 인산화된 EGFR을 웨스턴블롯으로 분석한 것이며, (D)는 벡터, SULF2-WT 또는 SULF2-N491K 세포를 PD173074 (0.01, 0.1, 1, 5 또는 10μM)와 함께 48시간 배양 후, 세포 생존능을 측정한 것이고, (E)는 세포 이동에 대한 PD173074의 영향을 Transwell 이동 분석 시스템을 사용하여 분석한 것이며, (F)는 벡터, SULF2-WT 또는 SULF2-N491K 세포를 제피티닙(0.5, 10, 15, 20 또는 25μM)와 함께 48시간 배양 후, 세포 생존능을 측정한 것이고, (G)는 Transwell 이동 분석 시스템을 사용하여 제피티닙이 세포 이동에 미치는 영향을 분석한 것이다.
도 9의 (A)는 HepG2 및 Huh7 세포를 소라페닙(최대 10μM)로 처리한 후, SULF2 mRNA 발현 수준을 qRT-PCR로 측정한 것이며, (B)는 Hep3B-SR, SULF2-WT-SR, HepG2-SR 및 Huh7-SR 세포를 소라페닙(5μM) 및/또는 OKN-007 (200μM)로 72시간 처리한 후, 세포 생존률을 측정하한 것이고, (C)는 HepG2, Huh7, 소라페닙 내성 HepG2 (HepG2-SR) 및 소라페닙 내성 Huh7 (Huh7-SR) 세포 및 (D)는 벡터, SULF2-WT, SULF2-N491K, 소라페닙 내성 벡터(Vector-SR), 소라페닙 내성 SULF2-WT(SULF2-WT-SR), 및 소라페닙 내성 SULF2-N491K (SULF2-N491K-SR) 세포를 배양한 후, LCN2 mRNA 수준을 qRT-PCR로 측정한 것이며, (E)는 Hep3B-SR, SULF2-WT-SR, HepG2-SR 및 Huh7-SR 세포를 24시간 동안 LCN2 siRNA로 일시적으로 형질 감염시킨 다음, 소라페닙 5μM에 48시간 노출시켜 세포 생존률을 측정한 것이다.
도 10은 SULF2-매개 소라페닙 감수성 조절에 대한 도식도이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
돌연변이로 인한 유전자 기능의 변화는 암 발생 및 진행 과정에서 중요한 역할을 한다 (Stratton MR et al., Nature 458:719-724, 2009). 따라서, 약물 유전체 데이터에 대한 체계적인 분석은 실행 가능한 돌연변이와 그 대상 약물에 대한 새로운 후보를 확인할 수 있다. 본 발명에서는 SULF2-EGFR-LCN2 경로가 소라페닙 감수성 및 간암 세포의 내성에 중요한 역할을 한다는 것을 제안하였다 (도 10).
본 발명에서는 새로운 약물-유전자 상호 작용을 발견한다는 목표를 기반으로 약물 유전학 데이터를 재분석하기 위한 전략을 적용하고, 14개의 알려지지 않은 실행 가능한 돌연변이 및 그의 치료 대상 약물을 밝혀냈다. 소라페닙-SULF2, 소라페닙-NTRK3, LBW242-SHC1 및 AEW541-ERC1을 포함한 다수의 약물 돌연변이 상호작용 후보 중에서 소라페닙와 SULF2 (설퍼타아제2) 돌연변이 간의 상호작용에 대한 추가 분석을 수행하였다. 그 결과, SULF2 돌연변이의 하류 신호를 추가 조사한 결과 LCN2가 EGFR 신호의 조절완화를 통해 소라페닙 감수성에 중추적인 역할을 한다는 것을 밝혀냈다. 즉, SULF2 변이 (N491K)는 소라페니브 감수성 및 간암 세포의 내성에 영향을 주고, 이 효과는 EGFR 및 LCN2의 조절 해제를 통해 가능하게 되며, SULF2 돌연변이를 세포 표면에 국한시키는 것에 실패하여, EGFR 리간드와 EGFR 간의 결합이 손상됨으로 인해서 하류 EGFR 신호전달이 억제되었다. 뿐만 아니라, 소라페닙 내성은 SULF2 또는 LCN2의 발현을 억제하는 것을 통해 구제될 수 있음을 확인하였다.
SULF2는 세포 표면 및 세포 외 기질 HS의 내부 S-도메인으로부터 6-O-황산염 그룹의 선택적 제거를 촉매하는 endosulfatase이며, 생리학적 과정에서 배발생 및 조직재생과 같은 다당류의 주요 기능에서 중요한 조절 물질이다 (Vives RR et al., Front Oncol 3:331, 2014). SULF2는 활성화 수용체 타이로신 키나아제와 하류 MAPK 및 AKT 경로 또는 Wnt 신호를 통해 작용하는 종양 유전자로, 그 발현은 HCC 환자의 나쁜 예후에 영향을 미친다 (Lai JP et al., Hepatology 47:1211-22, 2008). 또한, 소라페닙 민감도의 SULF2 매개의 새로운 메커니즘을 확인하였으며, 이러한 상호작용은 적어도 부분적 LCN2의 발현을 통해 매개된다. LCN2는 리포칼린 슈퍼패밀리의 구성원으로 레티노이드, 지방산 및 유기 철 킬레이터와 같은 소수성 분자를 전달하는 단백질 군이다 (Flower DR et al., Biochem Biophys Res Commun 180:69-74, 1991; Schlehuber S et al., Drug Discov Today 10:23-33, 2005). LCN2는 암에서 중요한 역할을 하며 침투, 혈관형성 및 약물 내성에 기여하는 것으로 알려져 있다 (Leung L et al., PLoS One 7:e46677, 2012; Shiiba M et al., Int J Oncol 42:1197-204, 2013). 간암에서 LCN2는 인접한 비종양 간 조직보다 높은 수준으로 발현된다. 본 발명에서는 암세포에서 SULF2의 작용이 LCN2의 발현을 통해 매개된다는 것을 확인하였다.
또한, SULF2에 의한 LCN2 유도가 AKT, ERK, STAT1 및 NF-κB를 포함하는 EGFR-의존 신호경로의 활성화에 의해 매개됨을 확인하였다. 암피레귤린에 의한 EGFR의 활성화가 SULF2-WT 또는 SULF2-N491K를 발현하는 세포 사이에서는 다르다는 것을 확인하고 (도 6B), EGFR과 SULF2의 상호 작용이 돌연변이에 의해 조절되지 않는 것을 확인하였다. 즉, EGFR이 SULF2-N491K보다 SULF2-WT에서 더 강하게 상호작용 함을 입증하였다. 더욱이, 소라페니브 치료는 EGFR과 SULF2-WT의 상호 작용을 상당히 증가시켰지만, SULF2-N491K와의 상호작용에서는 크게 증가하지 않았다 (도 7A). 이는 돌연변이 SULF2가 세포 표면에 국한되지 않기에 EGFR 리간드 (예를들어 암피레귤린 같은)와 EGFR 간의 결합이 손상된다는 것이다 (도 7B). 아울러, 소라페닙 치료된 HCC 환자는 암피레귤린 혈청 농도를 상승시켰다
한편, SULF2-WT와 SULF2-N491K 세포 간의 증식과 이동의 차이를 확인한 결과, SULF2-WT 세포는 증식 및 이동을 촉진하는 반면, SULF2-N491K 세포는 빠른 증식을 나타내지만 이동을 감소시켰다 (도 8). 이러한 불일치는 야생형 세포와 돌연변이 세포 사이의 FGF 및 EGF 신호경로의 차이로 설명할 수 있다. 본 발명에서는 FGF 신호가 SULF2 돌연변이 및 야생형 세포에서 각각 차별적으로 증식 및 이동을 조절한다는 것을 입증하였다 (도 8D 및 8E). 이와 일치하여, FGF2는 자가 분비 메커니즘을 통해 HCC 증식을 자극하고, HCC 침범을 활성화하며, 혈관형성을 자극한다. 수용체 FGFR 및 헤파린 황산염 프로테오글리칸(HSPGs)에 결합하는 FGF2는 세포 증식 및 혈관생성에 필수적인 복합체의 형성을 촉진하고, 설파타아제 활성화는 heparan sulfate glycosaminoglycans (HS-GAGs)의 탈황을 통해 FGF 신호 전달을 하향 조절한다. 따라서, SULF2-N491K 세포에서 설파타아제 기능의 저해로 인한 FGF 신호의 증가가 증가된 증식 활성에 기여할 수 있다. 그러나, EGFR 신호와는 달리, FGF2는 간암 세포의 이동 활성을 증가시키지 않을 수 있다.
이전에는 MT-1G, IGF / FGF, Mapk14 (p38α) 및 CYP3A4를 포함하여 많은 신호경로 (Tovar V et al., Gut 2015; Rudalska R et al., Nat Med 20:1138-46, 2014; Kuczynski EA et al., Cancer Res 75:2510-9, 2015)가 소라페닙 내성을 유도하는 것으로 알려져 있다. 또한 EGFR 신호 전달은 항-증식 효과를 나타내어 소라페니브 치료에 대한 내성을 유발한다는 것을 뒷받침하기 위해, 소라페니브에 만성적으로 노출된 세포가 높은 암피레귤린 발현과 함께 더 높은 EGFR 활성을 갖는다는 것을 확인했다 (도 6A). 또한, SULF2 발현이 소라페니브 내성의 획득과 관련이 있는지 조사한 결과, SULF2의 녹다운은 EGFR과 LCN2 발현을 억제 할 수 있으며, 이는 소라페니브 내성 세포의 약물 민감도를 회복시킨다는 것을 발견했다. 이러한 결과는 소라페니브 내성이 SULF2-EGFR-LCN2 경로를 억제함으로써 구제될 수 있음을 강력히 시사한다.
실제로 다양한 암 유형에서 돌연변이 및 DNA 복제 수 증폭을 포함한 SULF2의 빈번한 변이가 관찰되며, 간암의 약 60%, 간암 세포주의 약 73%에서 SULF2가 과발현되는 것으로 알려져 있고, 간암 환자의 나쁜 예후와 관련이 있다 (Lai JP et al., Hepatology 47:1211-22, 2008). 이 외에도 소라페닙은 FDA가 간암에 대해 승인한 유일한 약물이지만, 예상 생존 이익이 고비용에 비해 그리 크지 않기 때문에 임상의사가 일상적으로 권장하지 않는다. 따라서, 소라페닙에 민감한 환자의 대상 선택은 임상에서 크게 도움이 될 수 있다.
다수의 간암 환자가 소라페닙 투여 및 치료에 있어 무반응자로 확인되어 치료를 시작하기 전에 치료 반응을 예측할 수 있는 방법 및 이를 확인할 수 있는 방법이 없었고, 신뢰성 있는 유전자마커 (biomarker)에 대한 연구가 부족하여 소라페닙 치료에 대한 대상의 반응성을 예측하여 적합한 약물투여를 하기가 매우 어려운 문제점이 있었다. 나아가, 아직까지 실질적으로 다수의 간암 환자에 대하여 적절한 소라페닙을 투여하여 최적의 치료효과를 달성하여 환자의 불편을 줄이고, 치료비용을 절감할 수 있도록, 소라페닙 치료에 대한 대상의 반응성을 예측할 수 있는 방법에 대한 연구가 부족하다는 문제점이 있었다.
이에 본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, 피시험자로부터 시료를 채취하여 소라페닙(sorafenib) 치료의 반응성에 영향을 끼치는 SULF2 (NCBI GI: 240255476) 또는 LCN2 (NCBI GI: 930697465) 유전자의 발현 또는 상기 유전자의 돌연변이를 분석함으로써, 소라페닙 치료에 대한 반응성을 예측하는 방법을 제공하여 상술한 문제의 해결을 모색하였다.
따라서, 본 발명은 일관점에서 (a) 대상체 (subject)로부터 분리된 시료로부터 DNA 또는 단백질을 추출하는 단계; (b) LCN2 (lipocalin 2) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 발현 수준이 대조군에 비해 감소한 경우, 소라페닙 치료에 대한 감수성이 높은 것으로 예측하는 단계를 포함하는 소라페닙 치료에 대한 감수성을 예측하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 대상체는 소라페닙 투여가 필요한 암 환자인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 암은 간암, 유방암, 폐암, 난소암, 췌장암, 피부암, 뇌종양, 골수성 종양 및 림프종으로 구성되는 군에서 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 즉, 소라페닙 치료를 적용할 수 있는 질병에 적용 가능한 것은 당업자에게 자명한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 복수액 및 복막액으로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서 LCN2 (lipocalin 2) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 암 환자의 소라페닙 치료에 대한 감수성 예측용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 mRNA 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 LCN2 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 또는 LCN2 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 조성물은 또한, 시료의 DNA를 증폭시킬 수 있는 증폭수단을 더 포함할 수 있고, 또한 선택적으로 검체로부터 유전자를 추출하는 수단을 포함할 수도 있다. 상기 PCR을 이용하여 시료의 DNA를 증폭시키는 방법 및 검체로부터 유전자를 추출하는 방법은 당업계에 공지되어 있으므로, 본 명세서에서는 이에 관한 자세한 설명은 생략한다.
본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기 (free 3 hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트 (template)와 염기쌍 (base pair)를 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이트 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4기지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명에서 용어, "프로브" 란 mRAN와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다.
프로브는 올리고뉴클레오타이드 (oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA)프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스소트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단백질 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 LCN2 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적인 항체 또는 압타머인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 단백질 수준에서의 정성적 또는 정량적 검출/측정 방법으로는 예를 들면 웨스턴블랏, ELISA, 방사선면역분석, 면역확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 용액/현탁액 중에서 표지된 항체와의 결합, 질량분석 또는 항체를 이용한 단백질 어레이 등을 이용한 방법이 사용될 수 있다.
이러한 방법에 사용되는 시약 또는 물질은 공지된 것으로서, 예를 들면 상기 마커에 특이적으로 결합하는 항체, 기질, 핵산 또는 펩타이드 앱타머, 또는 상기 마커와 특이적으로 상호작용하는 수용체 또는 리간드 또는 보조인자 등이 사용될 수 있으며, 단백질에 특이적 결합이 가능한 항체, 항체단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics)를 포함한다.
본 발명의 SULF2 또는 LCN2 단백질 검출은 SULF2 또는 LCN2 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머와 SULF2 또는 LCN2 단백질의 복합체를 검출하는 방법에 기초한다. 복합체의 검출을 용이하게 하기 위해 본 발명의 SULF2 또는 LCN2 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 형광물질, 예를 들어 플루오레세인 (fulorescein) Cy3 또는 Cy5, 방사성물질 또는 화학물질, 예를 들어 비오틴 (biotin)으로 표지되거나 1차 아민 (primary amine)으로 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
본 발명의 SULF2 또는 LCN2 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 예를 들어, 비오티닐화 (biotinylated)화될 수 있고, 이는 스트랩트아비딘 (streptavidin)이 코팅된 well상에 성공적으로 고정 시킬 수 있다. well상에 고정화된 본 발명의 SULF2 또는 LCN2 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 SULF2 또는 LCN2 단백질이 결합될 수 있으며, 이와 같이 well 고정 DNA 앱타머에 결합된 SULF2 또는 LCN2 단백질은 다시 SULF2 또는 LCN2 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 이용하여 포획 유무를 시각화할 수 있다.
본 발명에서 용어, "예측"이란 환자가 화학요법 등 치료법에 대해 선호적으로 또는 비선호적으로 반응하여 환자의 치료, 예를 들어 특정 치료제, 및/또는 원발성 종양의 수술로 제거, 및/또는 암 재발 없이 특정 시기 동안 화학요법으로 치료된 후 생존할 여부 및/또는 가능성과 관련된다. 본 발명의 예측 방법은 간암 발병 환자에 대한 가장 적절한 치료 방식을 선택함으로써 치료 결정을 하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 예측 방법은 환자가 예를 들어 소정 치료제 또는 조합물, 외과적 개입, 화학요법 등의 투여를 비롯한 소정 치료 처방과 같은 치료 처방에 선호적으로 반응하는지를 확인하거나, 치료 처방 후 환자의 장기 생존이 가능한지 여부를 예측할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서 LCN2 (lipocalin 2)의 발현을 억제할 수 있는 제제를 포함하는 암 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 암은 소라페닙 내성암인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 내성암은 간암, 유방암, 폐암, 난소암, 췌장암, 피부암, 뇌종양, 골수성 종양 및 림프종으로 구성되는 군에서 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 LCN2의 발현을 억제할 수 있는 제제는 LCN2에 특이적인 siRNA, 항체, 압타머 또는 소분자 화합물로 구성되는 군에서 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 "발현을 억제할 수 있는 제제"란, 유전자에서 발현되어 생산되는 전사체 또는 단백질의 생성을 억제할 수 있는 물질을 의미한다. 상기 제제로는 유전자에 결합하여 전사수준에서 억제하는 전사인자; 전사되어 합성된 전사체에 결합하여 전사체를 분해하는 miRNA, siRNA, shRNA 등의 간섭 RNA; 발현된 SULF2 또는 LCN2 단백질과 결합할 수 있는 항체 등이 될 수 있다.
본 발명의 용어 "간섭 RNA(short interfering RNA)"란, 유전자의 활성을 억제하는 RNAi를 유발시킬 수 있는 이중가닥 RNA를 의미한다. 본 발명에 있어서 상기 간섭 RNA는 SULF2 또는 LCN2의 발현을 억제할 수 있는 miRNA, siRNA, shRNA 등이 될 수 있는데, 상기 간섭 RNA는 SULF2 또는 LCN2의 mRNA를 유발시키기만 하면 어떠한 형태의 것도 가능하며, 예를 들면, 화학합성 또는 생화학적 합성 또는 생체내 합성에 의해 수득되는 siRNA, 혹은 약 40개 염기 이상의 이중가닥 RNA가 체내에서 분해된 10개 염기쌍 이상의 이중가닥 RNA 등을 사용할 수 있다.
상기 간섭 RNA는 SULF2 또는 LCN2 RNA의 핵산서열의 일부에 대하여 약 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 100%의 상동성을 가지는 서열로 구성될 수 있고, 이중가닥 부분을 포함하는 RNA 또는 그의 개변체를 사용할 수도 있다. 상동성을 가지는 서열부분은, 통상적으로 적어도 15 뉴클레오티드 이상이고, 바람직하게는 약 19 뉴클레오티드 이상이며, 보다 바람직하게는 적어도 20 뉴클레오티드 이상이고, 더욱 바람직하게는 21 뉴클레오티드 이상이 될 수 있다.
본 발명의 용어 "항체"란, 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미하는데, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있을 뿐만 아니라, 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항체는 SULF2 또는 LCN2 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 될 수 있고, 바람직하게는 SULF2 또는 LCN2 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 그의 일부가 될 수 있다.
본 발명의 용어 "내성암"이란, 항암제 치료 또는 방사선 치료 등에 대하여 극히 낮은 감수성을 나타내어 상기 치료법에 의하여 암의 증세가 호전, 완화, 경감 또는 치료증상을 나타내지 않는 암을 의미한다. 상기 내성암은 특정한 항암제 또는 방사선 치료에 대하여 처음부터 내성을 갖을 수도 있고, 최초에는 내성을 나타내지 않았으나, 긴 시간의 치료로 인하여 암세포 내의 유전자가 변이되어 동일한 치료제에 대하여 더 이상 감수성을 나타내지 않게 되어 발생할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 내성암은 특별이 이에 제한되지 않으나, 구체적으로는 방사선 치료 또는 항암제 치료에 대하여 내성을 나타내는 모든 암이 될 수 있고, 그 예로는 SULF2 또는 LCN2의 과발현에 의하여 방사선 치료 또는 항암제 치료에 대하여 내성을 나타내는 간암, 폐암, 자궁경부암, 대장암, 유방암 등이 될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서 방사선 또는 항암제를 사용한 병용치료에 사용되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 항암제는 소라페닙, OKN-007, 제피티닙, 독소루비신, 빈블라스틴, 탁솔, 에디포사이드, 시스플라틴, 5-FU, 이포스파마이드 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 방사선 또는 약물내성 암의 치료용 약학 조성물은 SULF2 또는 LCN 억제제를 포함하여, SULF2 또는 LCN에 의하여 제공되는 방사선 또는 약물에 대한 내성을 억제하는 효과를 나타내므로, 단독으로 방사선 또는 약물내성 암이 발병된 환자에게 투여하여 방사선 또는 약물내성 암을 치료할 수도 있고, 본 발명의 약학 조성물과 SULF2 또는 LCN에 의하여 발생한 내성에 의하여 별다른 치료효과를 나타내지 못한 종래의 항암제를 병행하여 투여함으로써, 방사선 또는 약물내성 암을 치료할 수 있다. 특히, 상기 본 발명의 약학 조성물과 종래의 항암제를 병용투여할 경우에는, 종래의 항암제가 나타내는 항암활성과 본 발명의 약학 조성물이 나타내는 항암활성이 중복되어 보다 효과적으로 암을 치료할 수 있다. 이때, 사용될 수 있는 종래의 항암제는 SULF2 또는 LCN에 의하여 내성을 형성하는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 소라페닙, OKN-007, 제피티닙 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 약학 조성물에 포함된 상기 제제의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총중량을 기준으로 0.0001 내지 50 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 10 중량%의 함량으로 포함할 수 있다.
상기 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 약학조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물을 사람을 포함하는 포유동물에 하루 동안 10 내지 100 ㎎/㎏, 보다 바람직하게는 10 내지 30 ㎎/㎏으로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 내지 3회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다.
본 발명의 용어 "개체" 또는 "대상체"란, 상기 내성 암이 발병된 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다. 본 발명의 조성물을 개체에 투여함으로써, 내성 암을 치료할 수 있다.
본 발명에서 용어 "치료"란, 본 발명의 약학 조성물을 투여함으로써, 방사선 또는 약물내성 암이 호전되거나 이롭게 변경시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어 "투여"란, 어떠한 적절한 방법으로 대상에게 본 발명의 약학 조성물을 도입하는 행위를 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
세포, 항체 및 시약
Hep3B, Huh7, HepG2 및 PLC/PRF5의 인간 간암 세포는 10% FBS, 100U/ml 페니실린 및 100㎍/ml 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM에서 배양하였다.
SULF2 항체는 Novus Biologicals로부터 구입하였고, EGFR, p-EGFR(Tyr1068), ERK(1/2), p-ERK(1/2), AKT, p-AKT, STAT1, p-STAT1(Tyr701), STAT3, p-STAT3(Tyr705), IκBα, LCN2, p-FGFR(Tyr653/654), FGFR 및 β 액틴 항체는 Cell signaling Biotechnology (Danvers, MA, USA)를 통해 구입하였으며, 암피레귤린, p65 및 U-0126 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA)에서 구입하였다.
소라페닙은 LC laboratirues (Woburn, MA, USA)에서 구매하였고, 재조합 인간 암피레귤린은 R&D systems (Minneapolis, MN, USA)에서, AEW541는 AdoQ bioscience (Burlington, Canada)에서, 제피티닙 및 PD173074는 Tocris Bioscience (Bristol, UK)에서, 그리고 OKN-007 및 LBW242는 MedKoo Biosciences (Chapel Hill, NC, USA)에서 구입하였다.
발현 구조체 및 렌티 바이러스 벡터 트랜스펙션
STAT1 shRNA, p65 shRNA 및 LCN2 shRNA를 발현하는 렌티 바이러스 구조체는 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. 야생형 SULF2, SULF2-N491K, 야생형 ERC1, ERC1-H721Q, 야생형 NTRK3, NTRK3-N522K, 야생형 SHC1 및 SHC1-P5S cDNA 구조체를 cDNA 발현을 위한 렌티 바이러스 벡터인 pCMV-MCS-EF1-Puro (System Biosciences, Mountain View, CA, USA)에 클로닝 하였다. 모든 렌티 바이러스 벡터를 Lipofectamin 3000 transfection reagent (Invitrogen, Waltham, MA, USA)를 사용하여 293TN 세포 (System Biosciences)에 형질감염시켰다. 렌티 바이러스 플라스미드 형질감염 2일 후에 파티클을 수집하여 HCC 세포를 감염시키는데 사용하였다. 렌티 바이러스에 감염된 HDD 세포를 1주간 퓨로마이신으로 선별하였다.
실시예 1: 약물-돌연변이 상호 작용 확인
1-1: 약물 민감성 돌연변이 후보
약물 감수성의 돌연변이 특이적 변화를 확인하기 위해 CCLE 데이터를 평가하였다. CCLE의 돌연변이와 약물 민감도 데이터는 http://www.broadinstitue.org/ccle 에서 입수하였다.
먼저, 유방, 중추신경계, 조혈 및 림프계 종양, 폐, 난소, 췌장 및 피부의 종양을 포함하여 7가지 조직유형의 데이터를 선택하였으며, 각각은 25가지 이상의 세포주에 의해 제시된다. 선택된 데이터는 290개의 세포주와 33,444개의 서열 변이체로 구성되었다. 돌연변이의 특징에 따라, 넌센스, 프레임시피트 삽입 또는 결실, 스플라이스 부위를 포함한 기능상실 돌연변이 (LOF)를 "mutLOF"로 분류하고, 미스센스 돌연변이는 "nnMS"로 분류하였으며, mutLOF와 nnMS의 특징이 결합된 돌연변이는 "mutLOF+nnMS"로 분류하였다 (Barretina J et al., Nature 483:603-7, 2012).
그 결과, 돌연변이는 mutLOF (n=1,907), mutLOF+nnMS (n=3,472) 및 nnMS (n=1,565)으로 나타났다.
그 다음, 돌연변이의 약물 감수성은 피셔 정확검정 (Fishers exact test) 및 탄성적 넷 회귀분석 (elastic net regression)을 적용하여 평가하였다 (도 1).
세포주는 각 약물의 로그-변환된 IC50 값의 중간 값에 근거하여 내성(R)과 민감성(S)의 두 개의 그룹으로 계층화한 후, 약물 민감성 그룹과 약물 민감성 간의 연관성은 elastic net regression 및 Fishers exact T-test를 각각 적용하여 추정하였다. 즉, elastic net regression은 R 패키지 라이브러리 glmnet을 사용하여 실행하였으며 (Barretina J et al., Nature 483:603-7, 2012), α와 λ에 대한 매개 변수 최적화는 10개의 leave-group-out 교차 검증에 의해 추정한 다음, 약물 돌연변이 상호작용의 중요성을 200 부트스트랩 절차를 수행하여 결정했다. 또한, Fishers exact test을 실행하여 유의성은 교차비 (odds ratios (OR)) >5 및 P<0.01에 의해 결정되었다.
그 결과, 증가된 약물 민감성을 가진 돌연변이를 선택할 수 있으며, 약물-돌연변이 상호작용을 위한 잠재적인 후보로써 89개의 약물-돌연변이 쌍을 확인했다. 그 중, PubChem 데이터베이스 (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)에 나와있는 약물과 상호작용하는 것으로 알려진 유전자 (n=41)을 필터링하였다. 다음으로, 공개적으로 사용 가능한 웹사이트 (http://www.bushmanlab.org/links/genelists, allOnco, n=2,125)의 정보를 사용하여 암 관련 유전자 (n=44)를 선택하였다. 추가로, PubMed 문헌을 검색하여 알려진 약물-유전자 상호 작용을 확인하고 (n=30)을 필터링하였다. 최종적으로, 돌연변이에 의해 약물 민감도가 변경될 수 있는 14개의 약물-돌연변이 쌍의 후보를 결정했다 (표 1).
Figure 112017027335080-pat00001
1-2: 검정
14개의 후보의 약물 민감도에 대한 특이적 변이를 조사하여 4개의 약물-돌연변이 상호 작용을 평가하였다. RBBP8 돌연변이가 AZD0530 약물과 가장 유의한 연관성 (p=0.002)을 보였으나 돌연변이 제작이 어려워, SULF2-N491K, SHC1-P5S, NTRK3-N522K, 및 ERC1-H721Q 돌연변이의 약물-돌연변이 상호 작용을 평가하였다.
그 결과, SHC1-WT를 발현하는 세포에 비하여, SHC1-P5S 돌연변이는 LBW242에 의해 Huh7 세포가 감작 (sensitized)되는 것을 관찰하였다 (SHC1-WT: IC50=4.260 및 SHC1-P5S: IC50=2.256). 또한, NTRK3-N522K 돌연변이가 소라페닙 민감도에 영향을 주는지에 대해서 조사한 결과, NTRK3-N522K 돌연변이를 발현하는 Huh7 세포는 야생형 NTRK3-WT 세포보다 소라페닙에 대한 IC50 값이 낮았다 (NTRK3-WT: IC50=7.64 μM 및 NTRK3-N522K: IC50=5.80 μM). 유사하게, 돌연변이 ERC1-H721Q는 AEW541에 의해HepG2 세포를 감작시켰다 (ERC1-WT: IC50=4.25 μM 및 ERC1-H721Q: IC50=2.63 μM).
이러한 분석 결과는 새로운 약물-돌연변이 상호작용 확인하기 위한 분석전략이 적절하고 신뢰할만 하다는 것을 시사한다.
실시예 2: SULF2 돌연변이에 의한 간암 세포의 소라페닙 감수성 증가
SULF2 돌연변이는 소라페닙 감수성에 중요한 변화를 나타냈다 (표 1). nMS (p=0.006, odds ratio [OR]=11.10) 및 mutLOF+nnMS (p=0.007, OR=10.74) 특징의 SULF2 돌연변이를 갖는 세포는 소라페닙 치료에 상당히 감작되었다. 따라서, 이후 실시예에서는 상기 돌연변이와 관련된 분자 기작 및 신호전달 경로를 분석하였다 (도 1). 특히, 간암에서 소라페닙과 SULF2 돌연변이간 상호작용의 기초가 되는 분자 메커니즘을 더 연구하였다. 여러 간암 세포주에서 SULF2가 발현되며, SULF2가 가장 많이 발현되는 Huh7 및 HepG2 세포를 선택하였다.
2-1: SULF2 돌연변이 과발현
먼저 shRNA로 SULF2를 녹다운시킨 후, 웨스턴 블롯으로 SULF2 단백질의 녹다운을 확인하였다. 그 결과, SULF2의 녹다운에 의해 Huh7 및 HepG2 세포에서의 소라페닙 치료에 대한 IC50 값이 각각 IC50=6.17 μM 및 IC50=2.38 μM로 NT의 10.17 μM 및 4.97 μM에 비해 현저하게 감소하였다 (도 3A 및 3B).
다음으로 SULF2 돌연변이가 약물 감수성을 변화시켰는지 확인하기 위해, 내인성 SULF2를 거의 발현하지 않는 Hep3B 세포에서 야생형 SULF2 및 SULF2-N491K 돌연변이체에 대한 과발현 시스템을 확립하였다 (Lai JP et al., Hepatology 47:1211-22, 2008). 벡터, SULF2-WT 또는 SULF2-N491K로 형질 감염된 Hep3B 세포에서 소라페닙의 IC50 값을 WST-1 분석으로 측정하였다.
그 결과, Hep3B-SULF2-WT (SULF2-WT) 세포는 IC50 값 7.511μM로 Hep3B-벡터 (Vector) 세포의 IC50 값 3.372μM와 비교하여 현저히 증가하였으며, 이는 소라 페닙 내성이 증가한 것을 나타낸다. 대조적으로, SULF2-N491K (SULF2-N491K)를 발현하는 세포는 SULF2-WT 세포보다 상당히 높은 소라페닙 민감도 (IC50 = 3.54 μM)를 나타냈다 (도 3C). 즉, SULF2 돌연변이에 의해 소라페닙 감수성이 증가한 것을 나타낸다. 이러한 결과는 SULF2 발현 정도가 간암 세포에서 소라페닙 감수성과 밀접하게 관련되어 있음을 시사한다.
2-2: SULF2 억제
SULF2 억제제인 (2,4-disulfonylphenyl-tert-butylnitrone, OKN-007)가 소라페닙 감수성에 미치는 영향을 평가하였다.
그 결과, 야생형 SULF2를 발현하는 여러 간암 세포인 Huh7, HepG2 및 Hep3B에 OKN-007 처리시 소라페닙 감수성이 증가 (Huh7: IC50=5.062μM, HepG2: IC50=1.755μM, Hep3B: IC50=3.169μM)하였으며 (도 3D, 3E 및 3F), 이는 SULF2 녹다운 결과와 일치하였다. 대조적으로, 벡터 및 SULF2-N491K 세포의 소라페닙 감수성은 OKN-007 처리시에도 변함이 없었다. 종합하면, 이러한 결과는 SULF2가 간암 세포에서 소라페닙 감수성의 중요한 조절 인자임을 시사한다.
실시예 3: SULF2 의존적 소라페닙 감수성의 이펙터 유전자인 LCN2
3-1: SULF2-WT와 SULF2-N491K 세포간 유전자 발현 분석
SULF2 발현이 소라페닙 감수성에 미치는 영향을 알아보기 위해, SULF2-WT 또는 SULF2-N491K를 발현하는 Hep3B 세포의 유전자 발현을 분석하였다.
총 RNA는 제조사 (mirVana total RNA extraction Kit, Ambion, Austin, Tx)의 지시에 따라서 추출하고, 샘플당 총 RNA 500ng으로 illumine RNA 증폭 키트 (Ambion)를 사용하여 cRNA를 제조하였다. 총 750 ng의 cRNA를 인간 HT12-v4 일루미나 비드칩 유전자 발현 배열 (Illumina)에 대한 하이브리드화에 사용하였다. 데이터 정규화는 로그 2 변환 및 양자화 정규화를 적용하였으며, 데이터 처리 및 통계 분석은 R/Bioconductor 패키지를 사용하여 수행하였다.
그 결과, SULF2-WT와 SULF2-N491K의 두 세포 사이에서 1.4 배 이상의 차이가 나는 92개의 상향 조절 및 17개의 하향 조절의 차별발현유전자 (differentially expressed genes, DEGs)를 확인하였으며 (도 4A), LCN2가 SULF2-WT 세포에서 최고 순위의 상향 조절 유전자임을 확인하였다.
3-2: SULF2-WT 및 SULF2-N491K 세포에서의 LCN2 발현 분석
그 다음, LCN2의 발현을 벡터 세포, SULF2-WT 및 SULF2-N491K 세포에서 qRT-PCR을 통해 다시 한번 확인하였다.
RNeasy kit (Qiagen, Venlo, Netherlands)를 사용하여 각 세포를 수확하고, 총 RNA를 분리하였다. The PrimeScript RT kit (Takara, Shiga, Japan)를 사용하여 mRNA를 cDNA로 역전사시킨 후, Ssoadvanced Universal Supermixes (Bio-Rad)를 장착한 CFX96 Real Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 프라이머의 서열은 하기 표 2에 나타내었다. 각 샘플의 분석은 각 실험에 대해 적어도 3회 실행되었으며, 그 숫자의 데이터는 상대적인 정량으로 보고되었다: 2- ΔΔCT±S.D의 평균값 (표준편차)
Figure 112017027335080-pat00002
그 결과, 벡터 세포와 비교하여 SULF2-WT 세포에서 LCN2가 과발현 (> 1,400 배)되고, SULF2-N491K 세포에서는 LCN2의 발현이 감소 (200 배)한 것을 확인하였다 (도 4B). 따라서, LCN2가 SULF2-의존 소라페닙 감수성의 핵심 이펙터 유전자인 것을 알 수 있다.
3-3: 소라페닙 처리에 의한 LCN2 발현 분석
벡터, SULF2-WT 및 SULF2-N491K 세포에 소라페닙을 처리하여 LCN2 mRNA 발현을 확인하였다.
그 결과, 소라페닙 처리는 SULF2-WT 세포에서 LCN2 mRNA 발현을 현저하게 유도하였으나, 벡터 및 SULF2-N491K 세포에서는 LCN2 발현을 단지 적은 양으로 유도하였다 (도 4C). 이는 야생형을 발현하는 세포와 돌연변이 SULF2를 발현하는 세포간 소라페닙의 차별적 조절을 의미한다.
이를 더 확인하기 위해, 추가로 LCN2, SULF2-WT-LCN2sh-252 및 SULF2-WT-LCN2sh-459를 표적하는 2개의 상이한 shRNA로 SULF2-WT 세포를 형질감염 시켰다.
그 결과, shRNA에 의한 LCN2의 녹다운은 SULF2-WT 세포에서 소라페닙 감수성을 IC50 7.51 μM에서 3.95 μM로 현저하게 감소시켰고 (도 4D), 세포 성장률을 약 30% 감소시켰다. 종합적으로, 이러한 결과는 LCN2가 SULF2 발현과 관련된 소라페닙 감작을 매개한다는 것을 시사한다.
실시예 4: SULF2 -매개 LCN2 발현과 관련된 EGFR / STAT1 및 NF - κB 신호전달
4-1: SULF2에 의해 유도되는 신호 경로
LCN2 발현은 EGFR의 활성화를 통해 STAT1 및 NF-κB 신호에 의해 유도된다 (Viau A et al., J Clin Invest 120:4065-76, 2010; Zhao P et al., Mol Metab 2:161-70, 2013). 따라서, EGFR/STAT1 및 NF-κB 신호 경로가 간암 세포에서 SULF2에 의해 유도되는지 여부를 조사하였다.
전체 세포 용해물을 제조하기 위해, 고염도 용해 완충액 (20 mM Tris-HCl [pH 8.0], 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 및 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride) 에서 세포를 용해시키고, 얼음에서 20분 동안 배양한 후 20분 동안 원심 분리하여 세포 잔해물을 제거하였다. SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동에 총 20μg의 전체 세포 용해물을 사용하고, 단백질을 니트로 셀룰로오스 멤브레인으로 이동시키고 4℃에서 각 항체와 함께 밤새 배양했다. 그 다음 멤브레인을 페록시다아제가 결합 된 2차 항체 (PIERCE, Rockford, IL, USA)와 함께 실온에서 1시간 동안 상온 배양하고, chemi-luminescence detection kit (PIERCE)를 사용하여 신호를 검출하였다.
그 결과, SULF2-WT 세포는 EGFR, AKT, ERK 및 STAT1의 활성형의 발현이 증가하였으나, 벡터 및 SULF2-N491K 세포는 증가하지 않았다. 또한, 다른 세포 유형에 비해 SULF2-WT 세포에서 IκBα 단백질의 발현이 감소되어, SULF2-WT 세포에서 NF-κB 신호는 활성화 되었지만 SULF2-N491K 세포에서는 활성화되지 않았다. NF-κB p65 서브유닛 수준은 검사된 세포에서는 변하지 않았다. 그 다음, 세균 감염이나 부분적인 간 절제술 후 LCN2 생성을 유도하는 STAT3 경로 (Xu MJ et al., Hepatology 61:692-702, 2015)도 확인하였으나, 시험된 세포 중 어느 것에서도 STAT3의 유의한 활성화는 검출되지 않았다 (도 5A).
종합하면, SULF2는 EGFR/STAT1 및 NF-κB 신호 경로를 조절하지만, STAT3는 조절하지 않는다는 것을 알 수 있다.
4-2: SULF-매개 LCN2 발현에 관여하는 신호 경로
다음으로, STAT1과 NF-κB 신호가 SULF-매개 LCN2 발현에 관여하는지 조사하였다.
SULF2 억제제 (OKN-007, 200μM) 또는 EGFR 억제제 (제피티닙, 5μM)로 SULF2-WT 세포를 처리하면, 두 억제제 모두 LCN2 mRNA 발현을 상당히 억제했다. 또한 OKN-007과 제피티닙을 함께 처리한 결과, LCN2의 억제가 상승되었다 (도 5B). 또한, EGFR/MAP (ERKs 1 및 2) 경로는 LCN2 발현도 유도 (Zhao P et al., Mol Metab 2:161-70, 2013; Ding G et al., Prostate 75:957-68, 2015)하므로, MEK 억제제를 처리하면 SULF2-WT 세포에서는 LCN2 발현이 유의하게 억제되었지만 벡터 또는 SULF2-N491K 세포에서는 그렇지 않았다 (도 5C). 그 다음, STAT1 shRNA 또는 p65 shRNA를 SULF2-WT 세포에 형질 감염시켜 STAT1 및 NF-κB 신호를 조사한 결과, mRNA 및 단백질 수준에서 LCN2 발현을 상당히 억제시켰다 (도 5D 내지 5F).
종합하면, SULF2-매개 LCN2 발현은 EGFR/STAT1, MAPK 및 NF-κB의 활성화에 의해 가능하게 된다는 것을 시사한다.
실시예 5: SULF2 -WT 및 SULF2 - N491K 세포에서 EGFR 신호의 매커니즘
5-1: SULF2 -WT와 SULF2 - N491K에서 EGFR 차등조절
EGFR 신호는 암세포 성장에 대한 소라페닙 영향과 관련된 주요 신호전달 경로로, EGFR 리간드인 암피레귤린의 발현은 소라페닙 치료를 받는 HCC 환자와 HCC 세포주에서도 증가한다 (Blivet-Van Eggelpoel MJ et al., J Hepatol 57:108-15, 2012). 이러한 암피레귤린 발현은 소라페닙 처리 후 벡터, SULF2-WT 및 SULF2-N491K 세포에서 상당히 증가하므로, EGFR이 소라페닙에 의해 활성화된다는 것을 알 수 있었다 (도 6A).
따라서, 소라페닙-매개 EGFR 활성화가 SULF2-WT와 SULF2-N491K 간에 다르게 조절되는 매커니즘을 보다 자세히 알아보기 위해, 세 가지 세포 유형에 대해서 재조합 인간 암피레귤린 (rhAR) 처리에 의한 EGFR의 외인성 자극의 효과를 비교했다.
그 결과, SULF2-WT에서는 암피레귤린 처리에 의해 STAT1 및 ERK를 포함하는 EGFR 및 EGFR의 하류 신호경로의 상승된 활성화를 발견하였지만, Vector 또는 SULF2-N491K 세포에서는 그렇지 않았다. 또한, AKT/NF-κB 신호가 SULF2-WT에서는 활성화되었지만 SULF2-N491K 세포에서는 활성화되지 않는다는 것을 발견했다. IκBα 단백질 수준은 벡터 및 SULF2-N491K 세포보다 SULF2-WT 세포에서 상당히 높게 나타났다. 암피레귤린으로 처리하면 SULF2-WT 세포에서 p65와 LCN2 단백질 수준이 상당히 증가하였다 (도 6B). 즉, 이러한 결과는 SUFL2에 의해 유도된 LCN2 발현이 MAPK, STAT1 및 AKT/NF-κB 신호를 포함하는 하류 경로를 통한 EGFR 신호의 활성화에 의해 매개되는 것을 시사한다.
SULF2-N491K 세포에서 EGFR의 인산화와 하류 신호 활성은 감소하였지만 (도 6B), 소라페닙에 의해 유도된 암피레귤린의 발현은 세가지 세포 유형 간에 큰 차이가 없었다 (도 6A). 따라서, SULF2-WT와 SULF2-N491K의 설퍼타제 효소 활성을 측정 (Biovision, Milpitas, CA, USA)하여 비교하였다.
벡터, SULF2-WT 또는 SULF2-N491K 세포를 발현하는 Hep3B 세포 (2ⅹ106 cells/ml)를 프로테아제 억제제가 함유된 PBS에서 균질화하고, 4℃에서 10,000g 로 10분간 원심분리하여 상청액을 수집하였다. 상청액 10 μl을 90 μl반응 혼합물 (50 μl 설파타아제 분석 완충액과 40 μl 설파타아제 기질)을 함유하는 96웰 플레이트에 옮기고, 37℃에서 30분간 배양한 다음 microplate reader (OD 515 nm)를 통해 판독하였다. 모든 실험은 각 샘플에 대해 적어도 3번 반복하였다.
그 결과, 설퍼타제 효소 활성은 큰 차이가 없었다 (도 7D).
5-2: 암피레귤린과 EGFR 간의 상호작용
공초점 현미경 분석을 실행하여 암피레귤린과 EGFR 간의 직접적인 상호작용을 평가하였다.
단백질의 공존을 검출하기 위해, 세포를 Lab-Tek four-well 유리 챔버 슬라이드 (NUNC, Rockford, IL, USA)에서 성장시켰다. 24 시간 배양 후, 세포를 고정시키고 5 분 동안 냉 메탄올을 사용해 투과시키고, 인산 완충 식염수 (PBS)로 세척한 후에, 1 차 항체 및 2 차 항체 접합체와 함께 배양하였다. SULF2의 세포 표면 최적화 탐지를 위해, 세포를 혈청이 없는 DMEM에서 SULF2 항체와 함께 4℃에서 한 시간 동안 배양하고, PBS로 세척한 후에, 4 % 파라포름알데히드로 고정시켰다. 2 % 소태아 혈청으로 차단한 후에, 세포를 donkey anti-mouse IgG 제2 항체로 표지하고 Alexa-594로 접합했다. 이미지는 아르곤 (488 nm) 및 크립톤 (568 nm) 레이저가 장착된 레이저 주사 공초점 현미경 LSM710 (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)에서 40 × 수침 대물렌즈를 사용하여 수집했다. 이미지들은 ZEN 2009 light edition (Carl Zeiss)을 사용하여 처리되었다.
그 결과, 벡터 세포에서 EGFR과 암피레귤린은 세포질 전반에 걸쳐 확산되어 있으나, 소라페닙 치료시 핵 주위에 공존하였다 (도 7A). SUFL2-WT 세포에서는 EGFR과 암피레귤린은 이미 공존하고 있었고, 이는 소라페닙 치료에 의해 증가되었다. 대조적으로, SULF2-N491K 세포는 소라페닙 치료시 공존의 증가를 나타내지는 않았다. 종합하면, SULF2에 의해 유도된 EGFR 활성화가 암피레귤린과 EGFR 간의 상호 작용을 촉진시킴으로써 매개된다는 것을 시사한다. 즉, SULF2-N491K 세포의 기능적 변화는 이러한 상호작용을 손상시켜서 EGFR 신호를 억제하는 것을 알 수 있다.
그 다음으로, SULF2 단백질의 N491K 돌연변이는 SULF2의 세포 포면 국소화에 필수적인 친수성 도메인 (HD)에 위치하므로 (Frese MA et al., J Biol Chem 284:28033-44, 2009; Tang R et al., J Biol Chem 284:21505-14, 2009), SULF2 돌연변이가 세포 표면의 단백질 위치에 영향을 줄 수 있는지를 공초점 현미경 검사로 조사하였다.
그 결과, SULF2-WT는 세포 표면에 널리 분포되어 있는 반면, SULF2-N491K는 막에 잘 유지되어 있지 않았다 (도 7B). 투과된 세포의 면역형광법 분석은 SULF2-WT와 SULF2-N491K에서 강한 세포 염색을 나타냈다 (도 7C). 즉, 돌연변이 SULF2는 효소적으로 활성화된 경우에도 SULF2 단백질이 세포 표면에 국소화되지 않기때문에 SULF2-N491K 세포에서의 암피레귤린과 EGFR간 손상된 상호작용이 야기된다.
실시예 6: 암세포의 성장 및 이동에 대한 SULF2 발현 및 돌연변이의 효과
6-1: SULF2 -WT 또는 SULF2 - N491K의 세포 증식 및 이동
SULF2-WT 또는 SULF2-N491K의 세포 증식 및 이동에 대한 영향을 조사하였다.
세포 증식 분석을 위해, 세포 5ⅹ103개를 96웰 플레이트에 나누고, 각 농도의 항암제 및 5% FBS를 함유하는 DMEM에서 48시간 동안 배양하였다. 세포 생존력은 WST-1 분석법 (Roche, Gangnam-gu, Seoul, Korea)으로 측정하였으며, 각 실험은 4회 반복하여 적어도 3회 실행하였다. 세포 이동 분석은 24웰 보이덴 챔버 (8μm pore size; Coastar; Corning Life Sciences, Lowell, MA)에서 수행하였으며, 1 × 105개 세포를 혈청이 없는 0.2 ml DMEM에 현탁시켜 상부 챔버 입구에 넣고, 하부 챔버에는 0.6 ml DMEM / 10 %의 소태아 혈청으로 채웠다. 6 시간 후 멤브레인 밑면의 세포를 고정시키고 염색하여 네 개의 현미경으로 ⅹ200 배율로 계수하였다.
그 결과, SULF2-WT 및 SULF2-N491K 세포는 벡터 세포보다 빠르게 성장한 것을 알 수 있었다 (도 8A). 또한, SULF2-WT 세포는 세포 이동이 상당히 증가하는 반면, SULF2-N491K 세포는 벡터 세포보다 이동 활기가 낮았다 (도 8B). 이는 SULF2-WT 세포와 SULF2-N491K 세포간 세포 성장 및 이동의 조절이 다를 수 있음을 의미한다.
이와 관련하여 FGF2는 자가 분비 메커니즘을 통해 HCC의 증식을 자극한다고 알려져 있다 (Wang L et al., Mol Cancer Ther 11:864-72, 2012; Sandhu DS et al., Hepatology 59:1166-73, 2014). FGF2 신호는 기능성 FGF/FGFR/HS의 3가지 복합체의 형성에 의해 활성화된다. SULF는 HS와 FGF2의 결합에 영향을 미치는 HS의 6-O-탈황화를 촉매하여 FGF 신호전달 복합체의 생성을 방지한다 (Vives RR et al., Front Oncol 3:331, 2014). 따라서, 인산화된 FGFR의 활성 및 FGF2 억제에 의한 세포 증식을 확인하였다.
그 결과, 인산화된 FGFR의 활성 형태가 SULF2-WT 세포보다는 SULF2-N491K 세포에서 더 높다는 것을 확인하였다 (도 8C). 또한, FGF2 억제제 PD173074를 처리하면 벡터 및 SULF2-N491K 세포에서 세포 증식이 상당히 농도 의존적으로 억제되지만, SULF2-WT 세포에서는 억제되지 않는 것을 확인했다 (도 8D). 그러나, PD173074로 처리된 세포에서 큰 이동의 억제를 발견하지는 못하였다 (도 8E). 따라서, SULF2-N491K에서 FGF2의 증가된 활성이 이들 세포의 가속화된 증식을 일으킬 수 있음을 제시한다. 그러나 FGF2는 이동 매개에 중요한 역할을 수행하지 않을 수도 있다.
6-2: EGFR 신호전달의 증식 및 이동에 대한 영향
EGFR 신호전달이 SULF2-WT 및 SULF2-N491K 세포의 증식 및 이동에 미치는 영향을 조사하였다.
그 결과, SULF2-WT 세포에 제피티닙을 처리하면 세포 성장과 이동이 벡터 및 SULF2-N491K 세포와 비교하여 상당히 억제됨을 확인하였다 (도 8F 및 8G). 즉, SULF2에 의한 EGFR 활성화가 SULF2-WT에서는 세포 성장 및 이동 활성을 촉진하지만, SULF2-N491K 세포에서는 증가시키지 않는 것을 알 수 있다. 이러한 결과는 벡터 및 SULF2-N491K 세포가 높은 FGF2 활성을 갖는 반면, SULF2-WT 세포는 높은 EGFR 활성을 갖는다고 추측할 수 있다. 결과적으로, SULF2-WT 세포는 더 높은 성장 및 이동 활기를 갖는 반면, SULF2-N491K 세포는 성장 속도는 더 높지만 벡터 세포보다는 더 적은 이동 활성을 갖는 것을 확인하였다.
실시예 7: LCN2 또는 SULF2 억제에 의한 소라페닙 내성 구제
7-1: SULF2 억제
소라페닙 치료에 대한 내성 획득은 간암 환자의 관리에 있어서 주요한 방해요소 중 하나이다 (Berasain C et al., Gut 62:1674-5, 2013; Chow AK et al., PLoS One 8:e78675, 2013). 따라서, SULF2 및 LCN2 발현 변화가 소라페닙 내성을 구제할 수 있는지 여부를 조사하였다. 먼저, Hep3B 세포를 점진적으로 농도가 증가하는 소라페닙 (최대 5 μM)에 지속적으로 노출시킴으로써 소라페닙 내성 세포를 확립했다. 수개월 동안 배양 후, 소라페닙 내성 (SR) 세포주 Vector-SR, SULF2-WT-SR 및 SULF2-N491K-SR을 수득하였다.
소라페닙이 SULF2 발현에 미치는 영향을 밝히기 위해, HepG2 및 Huh7 세포에 1, 2, 4, 12주간 소라페닙을 처리 (최대 10 μM)하면서 SULF2 mRNA 발현 정도를 측정하였다. 그 결과, SULF2 mRNA 발현은 소라페닙 처리에 의해 시간 의존적으로 상당히 증가하였다 (도 9A).
따라서, 소라페닙 내성을 구제하기 위해 소라페닙과 SULF2 억제제인 OKN-007의 조합을 처리한 결과, 소라페닙과 OKN-007의 공동 처리는 소라페닙 내성 세포의 민감도를 증가시켰다 (도 9B).
7-2: LCN2 억제
또한, 소라페닙 내성 HepG2 (HepG2-SR) 및 소라페닙 내성 Huh7 세포 (Huh7-SR)가 모세포에 비해 LCN2를 상당히 과발현하는 것을 확인하였다 (도 9C). 놀랍게도, SULF2 발현 Hep3B 세포의 소라페닙 내성 클론이 LCN2를 현저하게 발현하고, 모세포에 비해 60 배까지 증가한다는 것을 발견하였다 (도 9D). 따라서, 소라페닙 내성은 간암 세포에서 LCN2 발현을 유도한다는 것을 알 수 있었다.
따라서, 인간 LCN2에 대한 대조군 siRNA 및 siRNA는 Santa Cruz Biotechnology로부터 구입하고, 제조사의 지시에 따라 형질전환 시약 (Santa Cruz)을 사용하여 siRNA로 각 세포를 형질 감염시켰다. LCN2 발현을 siRNA 매개 녹다운시킨 결과, 소라페닙 감수성이 회복되어 소라페닙 처리시 성장이 억제되었다 (도 9E).
종합하면, 이러한 결과들은 SULF2와 LCN2 발현이 소라페닙 내성과 감수성 획득에 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다. 특히 소라페닙 내성 환자에 있어서 소라페닙와 SULF2 억제제의 조합은 새로운 치료 전략을 제시할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (14)

  1. 다음 단계를 포함하는 소라페닙 치료에 대한 감수성을 예측하는 방법:
    (a) 간암 환자로부터 분리된 시료로부터 DNA 또는 단백질을 추출하는 단계;
    (b) LCN2 (lipocalin 2) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 발현 수준이 대조군에 비해 감소한 경우, 소라페닙 치료에 대한 감수성이 높은 것으로 예측하는 단계.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 복수액 및 복막액으로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. LCN2 (lipocalin 2) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 간암 환자의 소라페닙 치료에 대한 감수성 예측용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 mRNA 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 LCN2 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 또는 LCN2 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 LCN2 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적인 항체 또는 압타머인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 삭제
  9. LCN2 (lipocalin 2)의 발현을 억제할 수 있는 LCN2에 특이적인 siRNA, 항체 또는 압타머를 포함하는 간암 치료용 약학 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 간암은 소라페닙 내성 간암인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제9항에 있어서, 방사선 또는 항암제를 사용한 병용치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 항암제는 소라페닙, OKN-007, 제피티닙, 독소루비신, 빈블라스틴, 탁솔, 에디포사이드, 시스플라틴, 5-FU, 이포스파마이드 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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