WO2013187052A1 - 大腸癌治療剤 - Google Patents

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WO2013187052A1
WO2013187052A1 PCT/JP2013/003669 JP2013003669W WO2013187052A1 WO 2013187052 A1 WO2013187052 A1 WO 2013187052A1 JP 2013003669 W JP2013003669 W JP 2013003669W WO 2013187052 A1 WO2013187052 A1 WO 2013187052A1
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WO
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fam83h
cells
colon cancer
protein
antibody
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PCT/JP2013/003669
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毅 朝長
貴寿 久家
秀明 久米
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独立行政法人医薬基盤研究所
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    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57419—Specifically defined cancers of colon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.

Definitions

  • the present invention relates to a colorectal cancer therapeutic agent containing an FAM83H protein expression inhibitor or function inhibitor as an active ingredient, and a method for collecting data for evaluating the risk of colorectal cancer onset and recurrence.
  • FAM83H protein is known as a protein involved in tooth enamel formation, and its gene mutation has been reported to cause failure of enamel formation (see, for example, Non-Patent Document 1), so FAM83H protein is a stage of tooth development. It was thought that it only had important functions.
  • Non-Patent Document 2 a paper in which the FAM83H gene has been reported as a candidate for a new blood vessel marker for uterine cancer has been published (for example, see Non-Patent Document 2). Therefore, it can be said that the FAM83H protein may play a predetermined role not only in tooth enamel formation but also in other tissues, but there is no report about having an inhibitory effect on colorectal cancer.
  • An object of the present invention is to provide a colorectal cancer therapeutic agent that is more effective and has fewer side effects.
  • the present inventors perform gene expression analysis of colorectal cancer tissue and identify a gene whose expression is elevated at the transcriptional level in colorectal cancer and a protein that is a product thereof, thereby suppressing the growth / metastasis of colorectal cancer. Although the mechanism was continuously examined, it was confirmed by chance that the expression of FAM83H protein known as a protein involved in dental enamel formation was increased at the transcriptional level in cancer tissues of colon cancer patients. The inventors continue to further examine the function of FAM83H protein in colon cancer cells and its application to cancer treatment, and administration of FAM83H siRNA suppresses the growth of (1) colon cancer cell lines. It was found that apoptosis of cancer cell lines is induced, and (3) suppresses the motor function of colon cancer cell lines. The present invention has been completed based on the above findings.
  • the present invention is characterized in that [1] a therapeutic agent for colorectal cancer containing an FAM83H protein expression inhibitor or function inhibitor as an active ingredient, and [2] an FAM83H protein expression inhibitor is an FAM83H siRNA.
  • the therapeutic agent for colorectal cancer according to [2] above, which is a siRNA comprising a double-stranded RNA sequence comprising the RNA sequence shown in FIG. 5 and a complementary sequence thereof, and [4] siRNA of FAM83H are incorporated into a vector It is related with the colon cancer therapeutic agent as described in said [2] or [3] characterized by the above-mentioned.
  • the present invention also provides [5] (a) a step of quantifying FAM83H protein in a biological sample derived from a subject; (b) the amount of FAM83H protein in the biological sample, and a non-colon cancer patient or colorectal cancer. Comparing and evaluating the amount of FAM83H protein in a biological sample derived from an affected person, the present invention relates to a method for collecting data for evaluating the risk of colorectal cancer onset and recurrence.
  • colorectal cancer therapeutic agent of the present invention colorectal cancer can be treated without side effects such as tooth enamel formation failure by devising the administration method.
  • (A) is a graph showing the results of plotting the mRNA expression level by microarray analysis of FAM83H in non-cancerous tissue and colorectal cancer tissue.
  • (B) is a graph showing the results of plotting mRNA expression levels by qPCR of FAM83H in non-cancerous tissue and colon cancer tissue.
  • the image of the large intestine tissue immunohistochemically stained with the anti-FAM83H antibody is shown.
  • “Non-tumor” in the left figure indicates normal colon epithelial tissue
  • “Tumor” indicates colon cancer tissue.
  • the scale in the image on the left shows 1 mm.
  • the staining level by is higher than that of the normal colon epithelial tissue sample (N).
  • the vertical axis in the right figure shows the number of samples.
  • FIG. 1 shows an image of a colon cancer tissue immunohistochemically stained with an anti-FAM83H antibody.
  • the scale in the image indicates 1 mm.
  • enlarged images of two regions (1 [region with high staining level with anti-FAM83H antibody] and 2 [region with low staining level with anti-FAM83H antibody]) surrounded by a solid line are shown in the lower row (“ FAM83H high ”and“ FAM83H low ”).
  • (B) shows immunofluorescence staining of colon cancer tissue in which FAM83H is lowly expressed (“FAM83H low” in the figure) or highly expressed (“FAM83H high” in the figure) using anti-FAM83H antibody and anti-E-cadherin antibody.
  • the image observed by the method is shown.
  • the scale in the image indicates 10 ⁇ m. It is a graph which shows the number of living cells of S1, S2 and control cells every 24, 48 and 72 hours after siRNA introduction (for details of “S1 cells”, “S2 cells” and “control cells”) See Example 2). It is a figure which shows the result of the Western blot analysis of S1 cell and control cell at the time of 2 days after siRNA introduction
  • (B) is a graph showing the normal formation rate of spindles at the cell division stage in S1 cells, S2 cells, their control cells, and D-S1 cells and D-control cells.
  • (A) shows an image of S1 cells observed with a confocal microscope using anti-lamin B2 antibody and anti- ⁇ -tubulin antibody as primary antibodies. The scale in the image is 500 ⁇ m.
  • (B) is a graph showing the normal formation rate of the Lamin B spindle matrix during cell division in S1 cells, S2 cells and control cells.
  • (A) is a figure which shows the image of the cell sheet immediately after the wound and 24 hours after in Wound healing analysis.
  • (B) is a graph which shows the movement distance of the cell located in the front-end
  • (A) is a figure which shows the image of the cell sheet immediately after the wound in Wound healing analysis, and 6 hours after. The scale in the image is 10 ⁇ m.
  • (B) is a graph which shows the length of the cell projection of the cell located in the front-end
  • FIG. 1 shows an image obtained by observing HCT116 cells expressing FLAG tag-fused FAM83H (“Full-FLAG”) by immunofluorescence staining using anti-FLAG antibody and anti-keratin 18 antibody.
  • the scale in the upper image shows 10 ⁇ m.
  • enlarged images of two regions (1 [region with high staining level with anti-FAM83H antibody] and 2 [region with low staining level with anti-FAM83H antibody]) surrounded by a square are shown in the lower row (“ Region 1 ”and“ Region 2 ”).
  • the upper part of (b) shows an image obtained by observing HCT116 cells expressing FLAG tag fusion FAM83H (“Full-FLAG”) by immunofluorescence staining using anti-FLAG antibody and anti-CK-1 ⁇ antibody
  • (b) The lower row shows an image obtained by observing HCT116 cells expressing FLAG tag fusion FAM83H (“Full-FLAG”) by immunofluorescence staining using anti-keratin 18 antibody and anti-CK-1 ⁇ antibody.
  • An enlarged view of a region surrounded by a dotted line in each image is shown in the upper right or lower left of each image.
  • HCT116 cells expressing FLAG tag fusion FAM83H (“Full-FLAG”) are treated with CK-1 ⁇ siRNA, and images observed by immunofluorescence staining using anti-FLAG antibody and anti-keratin 8 antibody are shown (“si”). CK-1 ⁇ "). The scale in the image indicates 10 ⁇ m.
  • FIG. B shows four types of antibodies (anti-FLAG antibody, anti- ⁇ -catenin antibody, anti-phosphorylated [Ser45] ⁇ -catenin antibody, and anti-FLAG antibody fused with FLAG tag-fused FAM83H (“Full-FLAG”)). It is a figure which shows the result analyzed by the Western blot method using an actin antibody.
  • A Observation of colon cancer tissue in which FAM83H is lowly expressed (“Low” in the figure) or highly expressed (“High” in the figure) by immunofluorescence staining using anti-FAM83H antibody and anti-keratin 18 antibody The image is shown. The scale in the image indicates 10 ⁇ m.
  • FIG. 1 An enlarged view of a region surrounded by a dotted line in each image is shown in the upper right of each image.
  • B shows an image obtained by observing colon cancer tissue in which FAM83H is highly expressed by immunofluorescence staining using anti-FAM83H antibody and anti-CK-1 ⁇ antibody. The scale in the image indicates 10 ⁇ m.
  • C shows immunofluorescence staining of colon cancer tissue in which FAM83H is lowly expressed (“FAM83H low” in the figure) or highly expressed (“FAM83H high” in the figure) using anti-FAM83H antibody and anti- ⁇ -catenin antibody The image observed by the method is shown. The scale in the image indicates 10 ⁇ m.
  • the therapeutic agent for colorectal cancer of the present invention is not particularly limited as long as it contains an FAM83H protein expression inhibitor or function inhibitor as an active ingredient, and data for evaluating the risk of colorectal cancer onset and recurrence according to the present invention is not limited.
  • a method of collecting (a method for assisting the evaluation of the risk of developing / recurrent colorectal cancer), (a) a step of quantifying FAM83H protein in a biological sample derived from a subject; and (b) And a step of comparing and evaluating the amount of FAM83H protein and the amount of FAM83H protein in a biological sample derived from a non-colon cancer affected person and / or a biological sample derived from a colorectal cancer affected person.
  • the colorectal cancer in the present invention include ascending colon cancer, transverse colon cancer, descending colon cancer, sigmoid colon cancer, rectal cancer, and cecal cancer.
  • the subject of administration of the agent may be exemplified human, monkey, mouse, rat, hamster, guinea pig, cow, pig, horse, rabbit, sheep, goats, cats, mammals dogs like.
  • the FAM83H protein expression-suppressing substance in the present invention may be any substance that completely or significantly suppresses FAM83H protein expression at the FAM83H gene transcription level or translation level.
  • Inhibitors include FAM83H siRNA, antisense RNA, antisense DNA, and the like, as well as ribozymes having FAM83H mRNA cleavage activity and FAM83H miRNA.
  • the FAM83H siRNA includes a sense RNA having a sequence homologous to a partial sequence of the FAM83H mRNA, which can be used in RNAi (RNA interference) that suppresses expression in a sequence-specific manner by degrading FAM83H mRNA.
  • RNAi RNA interference
  • RNA sequence containing 5'-ACACGAAGGCCAUUCUGGAGCAGAU-3 '(SEQ ID NO: 1) and its complementary sequence 3'-UGUGCUUCCGGUAAGACCUCGUCUA-5' (SEQ ID NO: 2).
  • FAM83H siRNA 5'-CAACGCCUUGUACAGCAGCAACCUU-3 '(SEQ ID NO: 3) and its complementary sequence 3'-GUUGCG
  • siRNA of FAM83H consisting of a double-stranded RNA sequence containing GAACAUGUCGUCGUUGGAA-5 ′ (SEQ ID NO: 4), preferably 5′-ACACGAAGGCCAUUCUGGAGCAGAU-3 ′ (SEQ ID NO: 1) and its complementary sequence 3 From FAM83H siRNAS1 consisting of '-UGUGCUUCCGGUAAGACCUCGUCUA-5' (SEQ ID NO: 2), 5'-CAACGCCUUGUACAGCAGCAACCUU-3 '(SEQ ID NO: 3) and its complementary sequence 3'-GUUGCGGAACAUGUCGUCGUUGGAA-5' (SEQ ID NO: 4)
  • SiRNAS2 of FAM83H can be mentioned, and siRNAS1 of FAM83H can be particularly preferably exemplified. Moreover,
  • the FAM83H siRNA may include a FAM83H siRNA derivative or a FAM83H siRNA precursor, and the FAM83H siRNA precursor may include a FAM83H shRNA (short hairpin RNA).
  • RNA having a double-stranded structure in the molecule by partially including a palindromic base sequence and a structure like a short hairpin having a protruding portion at the 3 ′ end
  • shRNA after being introduced into the cell, is decomposed into double-stranded RNA having a length of, for example, 21 to 23 bases by Dicer, and can cause RNAi in the same manner as the above siRNA.
  • RNA having a length of 21 to 23 bases 5′-ACACGAAGGCCAUUCUGGAGCAGAU-3 ′ (SEQ ID NO: 1) and its complementary sequence 3′-UGUGCUUCCGGUAAGACCUCGUCUA-5 ′ (SEQ ID NO: 2), or 5 Examples include '-CAACGCCUUGUACAGCAGCAACCUU-3' (SEQ ID NO: 3) and its complementary sequence, 3'-GUUGCGGAACAUGUCGUCGUUGGAA-5 '(SEQ ID NO: 4).
  • FAM83H siRNA derivatives examples include derivatives that have been modified to enhance the RNAi effect and improve the stability of RNA so that they are not easily degraded by intracellular RNase.
  • 3 ′ overhang type derivatives in which several U, preferably 2 to 4, more preferably 2 or 3, most preferably 2 are added on the 3 ′ side, polyethylene glycol, cholesterol, or 2
  • examples thereof include derivatives appropriately modified by anti-RNase treatment such as methylation treatment such as' -o-methyl and thiophosphorylation treatment.
  • the siRNA of FAM83H can be designed based on known sequence information about FAM83H (for example, NCBI Reference Sequence: NM_198488.3). Specifically, it can be designed based on the sequence shown in SEQ ID NO: 9. It can be produced by using a known production method such as a synthetic production method or a production method using a gene recombination technique.
  • Examples of the production method by the synthesis include a method of synthesizing double-stranded RNA by a conventional method based on the sequence information. That is, a sense strand oligoribonucleotide and an antisense strand oligoribonucleotide are protected with a protecting group.
  • SiRNA which is a double-stranded oligoribonucleotide, can be synthesized by an organic synthesis method using a synthesizer using four kinds of ribonucleotides with a (adenosine, guanosine, cytidine, uridine).
  • Examples of the production method using the above-described gene recombination technique include a method of expressing FAM83H siRNA by incorporating it into an expression vector. For example, inserting a FAM83H siRNA expression cassette downstream of an appropriate promoter in the vector.
  • an siRNA expression vector can be constructed.
  • siRNA expression vectors known ones including commercially available vectors for expression of double-stranded RNA can be used, but when they are introduced into mammals, they are preferably viral vectors.
  • a mouse leukemia retrovirus vector, an adeno-associated virus vector, an adenovirus vector, a lentivirus vector, and the like can be mentioned.
  • Adenovirus vectors are preferred, and expression is performed when constructing an expression system using a vector.
  • regulatory sequences that regulate expression such as the U6 promoter, can also be included.
  • FAM83H siRNA can be introduced into colon cancer cells by infecting the cells with the above recombinant virus vector.
  • the period in which it can be present in the cell becomes longer and the efficiency of gene expression suppression is higher than when double-stranded siRNA is directly introduced into the cell.
  • FAM83H siRNA can also be introduced into colon cancer cells by the lipofection method or the like. Specifically, a liposome composed of phosphatidylserine (PS) having a negative charge can be used, but N- [1- (2,3-dioleyloxy) which is a cationic lipid that forms a more stable liposome.
  • PS phosphatidylserine
  • N- [1- (2,3-dioleyloxy) which is a cationic lipid that forms a more stable liposome.
  • DOTMA 2,3-dioleyloxy-N- [2 (sperminecarboxamido) ethyl] -N, N- dimethyl-1-propanaminium trifluoroacetate
  • DOSPA 2,3-dioleyloxy-N- [2 (sperminecarboxamido) ethyl] -N, N- dimethyl-1-propanaminium trifluoroacetate
  • DOPE functional lipid dioleoylphosphatidyl ethanolamine
  • Examples of the antisense RNA and antisense DNA include RNA and DNA having a base sequence complementary to the sequence of FAM83H mRNA, which suppresses the synthesis of FAM83H protein by forming a hybrid with FAM83H mRNA.
  • examples of the ribozyme include RNA molecules having catalytic activity, which exhibit an effect as a therapeutic agent for colorectal cancer by cleaving FAM83H mRNA.
  • Examples of the miRNA include RNA having a base sequence complementary to the sequence of FAM83H mRNA, which causes transcription and translational inhibition and suppresses the expression of FAM83H protein.
  • Examples of the FAM83H protein function inhibitor in the present invention include an anti-FAM83H protein antibody and a peptide aptamer for the FAM83H protein.
  • the anti-FAM83H protein antibody specifically binds to the FAM83H protein and interacts with the functions of the FAM83H protein (for example, keratin proteins such as keratin 8 and keratin 18 and casein kinase-1 ⁇ [Casein kinase 1, CK-1 ⁇ ].
  • the antibody can be exemplified by any of polyclonal antibodies and monoclonal antibodies, antibody fragments (eg, Fab, F (ab ′) 2 ) and recombinant antibodies (eg, scFv) It may be.
  • the anti-FAM83H protein antibody can be prepared by an appropriate method known to those skilled in the art using the FAM83H protein or an appropriate peptide fragment thereof, or various derivatives or complexes thereof as an immunogen.
  • polyclonal antibodies can be prepared by administering to appropriate animals such as mice, rats, rabbits, goats, chickens, etc., and preparing them from the antiserum.
  • Monoclonal antibodies can be prepared according to “Clone antibodies”, Kamei Nagamune, Hiroaki Terada, Yodogawa Shoten, 1990; “Monoclonal Antibody” James W. Goding, third edition, Academic Press, 1996)
  • colon cancer cells are in which FAM83H [FAM83H gene mRNA or FAM83H protein] is overexpressed [highly expressed]
  • colon cancer Induces apoptosis in cells, reduces the normal formation rate of spindles during cell division of colon cancer cells, suppresses cell motility of colon cancer cells, and metastasizes colon cancer cells to other organs Suppresses, inhibits the localization (binding) of casein kinase-1 ⁇ (Casein kinase 1, CK-1 ⁇ ) to keratin filaments in colon cancer cells, inhibits the depolymerization of keratin filaments in colon cancer cells, Inhibits phosphorylation of ⁇ -catenin (Ser45) in colon cancer cells and ⁇ -catenin in colon cancer cells It can inhibit nuclear translocation or inhibit activation of Wnt / ⁇ -catenin signal in
  • the colorectal cancer therapeutic agent of the present invention is a growth inhibitor of colorectal cancer cells, colorectal cancer Apoptosis-inducing agent for cancer cells, agent for lowering the normal formation rate of spindles during cell division of colon cancer cells (cell division inhibitor), cell motility function inhibitor for colon cancer cells, colon cancer metastasis inhibitor, colon cancer cells Inhibitors of localization (binding) of CK-1 ⁇ to keratin filaments in rats, inhibitors of keratin filament depolymerization in colon cancer cells, inhibitors of phosphorylation of ⁇ -catenin (Ser45) in colon cancer cells, ⁇ in colon cancer cells It can be referred to as -catenin nuclear translocation inhibitor and Wnt / ⁇ -catenin signal activation inhibitor in colon cancer cells.
  • the colon cancer therapeutic agent of the present invention When the colon cancer therapeutic agent of the present invention is administered as an agent for lowering the normal formation rate of the spindle in the cell division phase of the colon cancer cells, lamin B2 aggregates at the cell periphery during the cell division phase, resulting in colon cancer cells. Alternatively, spindle matrix formation is inhibited during cell division in colorectal cancer cell lines. Thus, when spindle formation is inhibited, it is considered that the growth of colon cancer cells is suppressed.
  • an apoptosis marker is significantly expressed in colorectal cancer cells or colorectal cancer cell lines, and an apoptosis-inducing action occurs.
  • the apoptosis marker include fragmented PARP and fragmented caspase-3.
  • the therapeutic agent for colorectal cancer of the present invention is administered as the above-mentioned inhibitor of cell motility function of colon cancer cells, the motility function of cells in colorectal cancer cells or colorectal cancer cell lines is inhibited.
  • the motor function of colon cancer cells is inhibited, it is considered that colon cancer metastasis is suppressed.
  • the therapeutic agent for colorectal cancer of the present invention can be made into an appropriate preparation by a conventional method, and is an auxiliary component consisting of a known pharmacologically acceptable carrier or diluent, and other agents for the treatment and prevention of cancer.
  • a physiologically active substance can be further contained.
  • the therapeutic agent for colorectal cancer of the present invention is not particularly limited as long as the desired therapeutic effect for colorectal cancer is obtained, and examples thereof include intravenous administration, subcutaneous administration, transdermal administration, enema administration, and the like. Is preferred.
  • the dose of the therapeutic agent for colorectal cancer of the present invention depending on the type of active ingredient, the severity of the disease state, the treatment policy, the patient's age, weight, sex, general health condition, and the genetic background of the patient, Those skilled in the art can appropriately select, for example, when administering FAM83H siRNAS1, 0.1 to 100 mg / day / kgbw, preferably 0.5 to 50 mg / day / kgbw Preferably, it can be 1 to 10 mg / day / kg bw, more preferably 3 to 7 mg / day / kg bw.
  • the biological sample derived from a person without colorectal cancer is a negative control
  • the biological sample derived from a person with colorectal cancer is a positive control.
  • the biological sample derived from the subject is preferably stool, blood, or a biopsy specimen
  • FAM83H can be quantified by any method known to those skilled in the art. For example, ELISA using an anti-FAM83H protein antibody And methods utilizing various immunological specific reactions such as Western blotting and immunostaining can be used.
  • the amount of FAM83H protein in the biological sample derived from the subject is equal to or greater than the amount of FAM83H protein in the biological sample derived from a colorectal cancer patient, It can be judged that the risk of cancer onset / recurrence is high, and the amount of FAM83H protein in the biological sample derived from the subject is significant compared to the amount of FAM83H protein in the biological sample derived from a person not affected by colorectal cancer If the risk is high, it can be determined that the risk of colorectal cancer onset / recurrence is high.
  • HCT116 cells and DLD-1 cells purchased from ATCC were used. Each cell was cultured in IMDM medium (Invitrogen) supplemented with 10% fetal calf serum (Invitrogen) in a 5% CO 2 atmosphere.
  • IMDM medium Invitrogen
  • 10% fetal calf serum Invitrogen
  • Example 1 [Analysis of gene expression in human colon cancer tissue 1] At the Chiba University Hospital, a colon cancer tissue extracted from 13 colorectal cancer patients and the surrounding non-cancerous tissue were collected as specimens. Total RNA was extracted from each tissue using RNeasy Plus kit (Qiagen).
  • ARNA was prepared from TotalRNA using Gene Chip (R) 3 'IVT Express Kit (Affymetrix), all-genotype microarray (Gene Chip Human Genome U133 Plus 2.0 Array) (Affimetrix) and probe set Were used for microarray analysis.
  • the expression values of all genes obtained by such microarray analysis were normalized by the median value using GeneSpringGX software (Agilent Technology), and the expression ratio of FAM83H having a high expression level was determined for each patient in colorectal cancer.
  • Tissue Calculated as a non-cancerous tissue and the log 2 values plotted are shown in FIG. Significant difference test was performed by Student's t test (corresponding). The results are shown in FIG.
  • FAM83H mRNA The expression of FAM83H mRNA was identified by microarray analysis using the 226129_at probe set. In order to examine the reproducibility, the FAM83H gene was newly added to 10 samples among the samples used in the microarray analysis. Eleven colorectal cancer tissues plus one specimen and the surrounding non-cancerous tissues were used as specimens, and Power CYBR (R) Green reagent and Applied Biosystems 7900HT Fast Real Time PCR System (manufactured by Applied Biosystems) was analyzed by qPCR. The primer sequences used were forward primer 5′-CGACAAGTGCCGTGTCAACC-3 ′ (SEQ ID NO: 5) and reverse primer 5′-ACTTCCCAGTGCGGCAGTAG-3 ′ (SEQ ID NO: 6).
  • forward primer 5′-AGAAAATCTGGCACCACACC-3 ′ SEQ ID NO: 7
  • reverse primer 5′-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3 ′ SEQ ID NO: 8
  • the expression ratio of FAM83H for each patient was calculated as colon cancer tissue: non-cancerous tissue, and the log 2 values were plotted.
  • FIG. 1 (b) shows the result.
  • FIG. 1 (a) it was suggested by microarray analysis that the FAM83H mRNA expression level was significantly increased in the colon cancer tissue as compared with the non-cancerous tissue. Further, as is clear from FIG. 1 (b), it is shown by qPCR analysis that the FAM83H mRNA expression level is significantly increased in the colon cancer tissue as compared with the non-cancerous tissue, and the expression of the FAM83H gene is It was confirmed to be specific.
  • FIG. 2 it was shown by immunohistochemical staining that the expression level of FAM83H protein was increased in colorectal cancer tissue as compared with normal colorectal epithelial tissue. Further, as is clear from FIG. 3 (a), it was shown that FAM83H is overexpressed (highly expressed) in colorectal cancer tissues with large disturbance of epithelial cell polarity. Further, as is clear from FIG. 3 (b), it was shown that FAM83 is highly expressed in the colon cancer tissue in which the expression level of E-cadherin is reduced. It is known that both disturbance of epithelial cell polarity and decreased expression of E-cadherin are characteristic of highly invasive cancer cells, so the above results indicate that FAM83H protein is highly expressed in highly invasive colorectal cancer cells Is shown.
  • Example 2 [Colon cancer cell proliferation test] In order to examine the effect of suppressing the expression of mRNA of the FAM83H gene, examination was performed using siRNA of FAM83H.
  • the details of the FAM83H siRNA sequence (sense strand and antisense strand) used are as follows.
  • FAM83H knockdown HCT116 cells A cell proliferation test of FAM83H knockdown colon cancer cells (hereinafter sometimes referred to as “FAM83H knockdown HCT116 cells”) was performed by introducing FAM83H siRNA into the HCT116 cells. Ten thousand HCT116 cells were seeded in a 12-well dish and cultured for 2 days. The two types of FAM83H siRNAS1 and siRNAS2 were transfected into HCT116 cells using lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen), respectively, and FAM83H knockdown HCT116 cells into which FAM83H siRNAS1 was introduced (hereinafter referred to as “S1 cells”).
  • S1 cells FAM83H knockdown HCT116 cells into which FAM83H siRNAS1 was introduced
  • S2 cells FAM83H knockdown HCT116 cells
  • siRNAMS2 of FAM83H was introduced.
  • a control siRNA Medium GC Duplex # 2 (manufactured by Invitrogen) was used and similarly introduced into HCT116 cells as control cells.
  • the viable cell counts of S1, S2 and control cells were counted using a trypan blue staining method every 24, 48 and 72 hours after introduction of siRNA. The same experiment was performed three times, and the average number of live cells and the standard deviation were calculated from the results of the three experiments and plotted. The results are shown in FIG.
  • Example 3 Western blot analysis of the above S1 cells was carried out 2 days after siRNA introduction. Extraction of HCT116 cell total protein was performed by the Laemmli method using an SDS sample buffer. Proteins were separated by 5-20% gradient polyacrylamide gel electrophoresis (DRC) (SDS-PAGE) and transferred to polyvinylidene fluoride (PVDF) membranes (Milipore, Bedford, Mass.). The membrane was blocked using Blocking One (Nacalai Tesque).
  • DRC gradient polyacrylamide gel electrophoresis
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • An anti-PARP degradation product antibody (# 5625, manufactured by Cell Signaling Technology), an anti-caspase-3 degradation product antibody (# 9664, manufactured by Cell Signaling Technology), an anti-FAM83H antibody (HPA024604, manufactured by Sigma)
  • an anti-actin antibody (sc-1615, manufactured by Santa Cruz Biotechnology) was added as a primary antibody, incubated, washed, and then HRP-labeled anti-goat IgG antibody (sc-2020, manufactured by Santa Cruz Biotechnology) ) And HRP-labeled anti-rabbit IgG antibody (NA934, manufactured by GE Healthcare) were added as a labeled secondary antibody, incubated, and then washed.
  • Light was emitted by chemiluminescence using an ECL reagent (manufactured by GE Healthcare), and detected with a LAS-4000 image analyzer (manufactured by GE Healthcare). The results are shown in FIG.
  • fragmented PARP cleaved PARP
  • fragmented caspase-3 cleaved caspase 3
  • Example 4 [Immunostaining 1] Cells in which siRNA S1 of FAM83H has been introduced into the above S1 cells and S2 cells, and DLD1 cells using lipofectamine RNAiMAX (manufactured by Invitrogen) (hereinafter also referred to as “DS1 cells”), and Medium to DLD1 cells The function of FAM83H was further examined by introducing GC Duplex # 2 and immunostaining cells (hereinafter also referred to as “D-control cells”). In the immunostaining, each of the above cells was fixed by immersing in 100% methanol cooled to ⁇ 20 ° C.
  • Example 5 [Immunostaining 2] In the same manner as in Example 4 except that anti-lamin B2 antibody (10895-1-AP, manufactured by ProteinTech Group) and anti- ⁇ -tubulin antibody (DM1A, manufactured by Sigma) were used as primary antibodies. Immunostaining was performed on S1, S2 and control cells. The cells were observed using a confocal microscope. Two days after siRNA introduction, the same experiment was performed three times, and the average value and standard deviation of the proportion of mitotic cells in which lamin B2 formed a normal matrix were calculated from the results of the three experiments and graphed. . The results are shown in FIGS. 7 (a) and (b).
  • lamin B2 forms a matrix outside the spindle and the spindle is normally formed.
  • lamin B2 Were observed to aggregate at the periphery of the cell, inhibiting the formation of the spindle matrix of lamin.
  • FAM83H is thought to promote cancer cell division through the formation of a lamin spindle matrix.
  • Spindle dysplasia induces cell death through the cessation of cell division and abnormal chromosome distribution, and is considered to be one of the mechanisms that induce cell growth inhibition.
  • Example 9 As the FAM83H siRNAS3, the same experiment as in each of the above examples was performed using the following sequences. As a result, a colon cancer cell growth inhibitory effect, an apoptosis inducing effect, and a motor function inhibitory effect were observed.
  • the sequences (sense strand and antisense strand) of the double-stranded DNA constituting FAM83H siRNAS3 are as follows.
  • Antisense strand 3'-AGGUGAGCUUCUCCUUCAGGUUGAU-5 '(SEQ ID NO: 11)
  • cDNA was prepared from HCT116 cells by a conventional method, and PCR was performed using primer 1 (DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 12) and primer 2 (DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 13).
  • primer 1 DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 12
  • primer 2 DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 13
  • FAM83H gene NM_198488.3
  • was amplified and isolated it was inserted into the restriction enzyme EcoRI-BamHI site of p3XFLAG-CMV-14 vector (manufactured by Sigma-Aldrich) and 3 ⁇ at the amino (N) terminus of full-length FAM83H.
  • a protein (“Full-FLAG”) expression vector fused with a FLAG tag was constructed.
  • cDNA was prepared from HCT116 cells by a conventional method, and PCR was performed using primer 3 (DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 14) and primer 4 (DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 15).
  • a DNA region encoding 1-286 amino acid of FAM83H was amplified and isolated, inserted into the restriction enzyme EcoRI-BamHI site of p3XFLAG-CMV-14 vector (Sigma-Aldrich), and N of the 1-286 amino acid fragment of FAM83H A protein (“286N-FLAG”) expression vector in which a 3 ⁇ FLAG tag was fused at the end was constructed.
  • cDNA was prepared from HCT116 cells by a conventional method, and PCR was performed using primer 5 (DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 16) and primer 6 (DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 17).
  • a DNA region encoding 294-1179 amino acids of FAM83H was amplified and isolated, inserted into the restriction enzyme EcoRI-BamHI site of p3XFLAG-CMV-14 vector (Sigma-Aldrich), and the 294-1179 amino acid expression vector of FAM83H ( “294C-FLAG”) was constructed.
  • Primer 1 5'-ATAGAATTCAACATGGCCCGTCGCTCTCAGAG-3 '(SEQ ID NO: 12)
  • Primer 2 5'-ACGGGATCCTCCCTTCTTGCTTTTGAACG-3 '(SEQ ID NO: 13)
  • Primer 3 5'-ATAGAATTCAACATGGCCCGTCGCTCTCAGAG-3 '(SEQ ID NO: 14)
  • Primer 4 5'-ATAGGATCCGGGCACAAGCGGCTCGGACTG-3 '(SEQ ID NO: 15)
  • Primer 5 5'-ATAGAATTCACCATGGACGCCTATGCCCTG-3 '(SEQ ID NO: 16)
  • Primer 6 5′-TCCAGCAGGCAGCTCTCGAGGCTG-3 ′ (SEQ ID NO: 17)
  • FLAG tag-fused FAM83H (“Full-FLAG”, “286N-FLAG”, and “294C-FLAG”) expression vectors were introduced into HCT116 cells, and after 24 hours, the cells were collected and 1% NP40 / PBS Proteins were extracted by treatment with buffer.
  • FLAG antibody beads Protein-G Dynabeads Protein-G Dynabeads in which FLAG antibody is cross-linked to Protein-G Dynabeads (Invitrogen) using Dimethyl Pimelimidate (MP Biochemicals)
  • the FLAG antibody beads Protein-G Dynabeads and the above protein extract are prepared. And immunoprecipitation was performed according to a conventional method.
  • FAM83H (detected with anti-FLAG antibody) binds to CK-1 ⁇ on the amino (N) terminal side (at least 1-286 amino acid region) and carboxy (C) terminal side (at least 294-1179). It was shown to bind to keratin 8 (keratin protein) at the amino acid). Further, as is apparent from FIG. 12, FAM83H (detected with anti-FLAG antibody) was co-localized with CK-1 ⁇ and keratin 18 (keratin protein) on the keratin skeleton. Furthermore, as is clear from FIG.
  • CK-1 ⁇ siRNA Sense strand 5'-CAGAAUUUGCGAUGUACUUTT-3 '(only T represents deoxyribonucleic acid) (SEQ ID NO: 18)
  • Antisense strand 3'-GUCUUAAACGCUACAUGAA-5 '(SEQ ID NO: 19)
  • CK-1 ⁇ is a kinase that phosphorylates and modifies ⁇ -catenin in the cytoplasm, and phosphorylation of ⁇ -catenin by CK-1 ⁇ is known to control the intracellular protein content and subcellular localization of ⁇ -catenin.
  • FAM83H FAM83H
  • Example 13 In Examples 10 to 12, HCT116 cells were overexpressed with FLAG tag-fused FAM83H, and analysis was performed using a colon cancer tissue in which FAM83H was highly expressed. Similar results were obtained. That is, FAM83H co-localizes on keratin 18 (keratin protein) and CK-1 ⁇ and keratin filaments (see FIGS. 15 (a) and (b))), and high expression of FAM83H causes keratin filaments in colon cancer tissues. Was depolymerized (see FIG. 15 (b)), and ⁇ -catenin was transferred from the cytoplasm into the nucleus due to high expression of FAM83H (see FIG. 15 (c)).

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Abstract

　本発明は、効果的な大腸癌治療剤を提供することを課題とする。　本発明は、歯のエナメル形成に関与するタンパク質として知られているＦＡＭ８３Ｈに対するｓｉＲＮＡ等のＦＡＭ８３Ｈタンパク質の発現抑制物質や、抗ＦＡＭ８３Ｈタンパク質抗体等のＦＡＭ８３Ｈタンパク質の機能阻害物質を投与することにより、（１）大腸癌細胞株の増殖が抑制されること（２）大腸癌細胞株のアポトーシスが誘導されること、（３）大腸癌細胞の運動機能を抑制することを特徴とする。かかる本発明を用いると、大腸癌治療剤、又は大腸癌発症・再発のリスクを評価するためのデータを収集することができる。

Description

大腸癌治療剤
　本発明は、ＦＡＭ８３Ｈタンパク質の発現抑制物質又は機能阻害物質を有効成分として含有する大腸癌治療剤や、大腸癌発症・再発のリスクを評価するためのデータを収集する方法に関する。
　ＦＡＭ８３Ｈタンパク質は歯のエナメル形成に関与するタンパク質として知られており、その遺伝子変異はエナメル形成不全を引き起こすことが報告されている（例えば、非特許文献１参照）ため、ＦＡＭ８３Ｈタンパク質は歯の発生段階でのみ重要な機能を有すると考えられていた。
　近年、ＦＡＭ８３Ｈ遺伝子が子宮癌の新生血管マーカーの候補として報告されている論文が発表された（例えば、非特許文献２参照）。したがって、ＦＡＭ８３Ｈタンパク質は、歯のエナメル形成においてのみならず、他の組織においても所定の役割を果たしている可能性があるといえるが、大腸癌の阻害効果を有することについては、なんら報告がない。
Int J Paediatr Dent 21 (6), 407-412 (2011) Cancer Biology & Therapy 12:3, 1-12; August 1, 2011
　本発明の課題は、より効果的で副作用の少ない大腸癌治療剤を提供することにある。
　本発明者らは、大腸癌組織の遺伝子発現解析を行い、大腸癌において発現が転写レベルで上昇している遺伝子やその産物であるタンパク質を同定することにより、大腸癌の増殖・転移を抑制する機構について検討を続けていたが、大腸癌患者の癌組織において、歯のエナメル形成に関与するタンパク質として知られていたＦＡＭ８３Ｈタンパク質の発現が転写レベルで上昇することをたまたま確認した。発明者らは、ＦＡＭ８３Ｈタンパク質の大腸癌細胞における機能と癌治療への応用についてさらに検討を続け、ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡの投与により、（１）大腸癌細胞株の増殖が抑制されること（２）大腸癌細胞株のアポトーシスが誘導されること、（３）大腸癌細胞株の運動機能を抑制することを見い出した。本発明は上記の知見に基づき完成されるに至ったものである。
　すなわち、本発明は、［１］ＦＡＭ８３Ｈタンパク質の発現抑制物質又は機能阻害物質を有効成分として含有する大腸癌治療剤や、［２］ＦＡＭ８３Ｈタンパク質の発現抑制物質が、ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡであることを特徴とする上記［１］記載の大腸癌治療剤や、［３］ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡが、配列番号１に示されるＲＮＡ配列及びその相補的配列を含む二本鎖ＲＮＡ配列からなるｓｉＲＮＡ、又は配列番号３に示されるＲＮＡ配列及びその相補的配列を含む二本鎖ＲＮＡ配列からなるｓｉＲＮＡであることを特徴とする上記［２］記載の大腸癌治療剤や、［４］ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡが、ベクターに組み込まれていることを特徴とする上記［２］又は［３］に記載の大腸癌治療剤に関する。
　また、本発明は、［５］（ａ）被検者由来の生体試料中の、ＦＡＭ８３Ｈタンパク質を定量する工程；（ｂ）前記生体試料中のＦＡＭ８３Ｈタンパク質量と、大腸癌非罹患者又は大腸癌罹患者由来の生体試料中のＦＡＭ８３Ｈタンパク質量とを比較・評価する工程；を備える大腸癌発症・再発のリスクを評価するためのデータを収集する方法に関する。
　本発明の大腸癌治療剤によれば、投与方法を工夫することにより、歯のエナメル形成不全等の副作用なく大腸癌を治療することができる。
（ａ）は、非癌部組織と大腸癌組織とにおけるＦＡＭ８３Ｈのマイクロアレイ解析によるｍＲＮＡ発現量をプロットした結果を示すグラフである。（ｂ）は、非癌部組織と大腸癌組織とにおけるＦＡＭ８３ＨのｑＰＣＲによるｍＲＮＡ発現量をプロットした結果を示すグラフである。 抗ＦＡＭ８３Ｈ抗体で免疫組織化学染色した大腸組織の画像を示す。左図の「Non-tumor」は、正常大腸上皮組織を示し、「Tumor」は、大腸癌組織を示す。左図の画像におけるスケールは１ｍｍを示す。右図の横軸の「Ｎ＞Ｔ」は、大腸癌組織試料（Ｔ）における抗ＦＡＭ８３Ｈ抗体による染色レベルが、正常大腸上皮組織試料（Ｎ）と比べ、低い試料を示し、「Ｎ＝Ｔ」は、大腸癌組織試料（Ｔ）における抗ＦＡＭ８３Ｈ抗体による染色レベルが、正常大腸上皮組織試料（Ｎ）と等しい試料を示し、「Ｎ＜Ｔ」は、大腸癌組織試料（Ｔ）における抗ＦＡＭ８３Ｈ抗体による染色レベルが、正常大腸上皮組織試料（Ｎ）と比べ、高い試料を示す。右図の縦軸は、試料の数を示す。 （ａ）は、抗ＦＡＭ８３Ｈ抗体で免疫組織化学染色した大腸癌組織の画像を示す。画像におけるスケールは１ｍｍを示す。上段の画像において、実線で囲った２つの領域（１［抗ＦＡＭ８３Ｈ抗体による染色レベルが高い領域］及び２［抗ＦＡＭ８３Ｈ抗体による染色レベルが低い領域］）の拡大画像を、それぞれ下段に示す（「FAM83H high」及び「FAM83H low」）。（ｂ）は、ＦＡＭ８３Ｈが低発現（図中の「FAM83H low」）又は高発現（図中の「FAM83H high」）した大腸癌組織を抗ＦＡＭ８３Ｈ抗体及び抗Ｅ－カドヘリン抗体を用いた免疫蛍光染色法により観察した画像を示す。画像におけるスケールは１０μｍを示す。 ｓｉＲＮＡ導入後２４、４８、７２時間経過毎のＳ１細胞、Ｓ２細胞、及びコントロール細胞の生細胞数を示すグラフである（「Ｓ１細胞」、「Ｓ２細胞」、及び「コントロール細胞」の詳細については、実施例２参照）。 ｓｉＲＮＡ導入後２日経過時のＳ１細胞とコントロール細胞のウェスタンブロット解析の結果を示す図である。 （ａ）は、一次抗体として抗ケラチン１８抗体と、抗α－チューブリン抗体とを使用して、共焦点顕微鏡を用いて観察した画像を示す。画像におけるスケールは１０μｍである。（ｂ）は、Ｓ１細胞、Ｓ２細胞、及びそれらのコントロール細胞、並びにＤ－Ｓ１細胞及びＤ－コントロール細胞における細胞分裂期における紡錘体の正常形成率を示すグラフである。 （ａ）は、一次抗体として抗ラミンＢ２抗体と、抗α－チューブリン抗体とを使用して、共焦点顕微鏡を用いて観察したＳ１細胞の画像を示す。画像におけるスケールは５００μｍである。（ｂ）は、Ｓ１細胞、Ｓ２細胞及びコントロール細胞における細胞分裂期におけるラミンＢ紡錘体マトリクスの正常形成率を示すグラフである。 （ａ）は、Wound healing 解析における創傷直後と２４時間後の細胞シートの画像を示す図である。（ｂ）は、無細胞面の先端に位置する細胞の移動距離を示すグラフである。 （ａ）は、Wound healing 解析における創傷直後と６時間後の細胞シートの画像を示す図である。画像におけるスケールは１０μｍである。（ｂ）は、無細胞面の先端に位置する細胞の細胞突起の長さを示すグラフである。 Wound healing 解析における創傷直後と６時間後の細胞シートの画像を示す図である。 ＦＬＡＧタグが融合した３種類のＦＡＭ８３Ｈ（全長[Full-FLAG]、１－２８６アミノ酸［286N-FLAG］、及び２９４－１１７９アミノ酸［294C-FLAG］）と、ＣＫ－１αやケラチン８との相互作用を、免疫沈降法及びウェスタンブロット法を用いて解析した結果を示す図である。矢頭は、３種類のＦＬＡＧタグ融合ＦＡＭ８３Ｈ（「Full-FLAG」、「286N-FLAG」、又は「294C-FLAG」）タンパク質を示し、「＊」は、前記３種類のＦＬＡＧタグ融合ＦＡＭ８３Ｈの分解物又は非特異的に検出されたものと考えられる。 （ａ）は、ＦＬＡＧタグ融合ＦＡＭ８３Ｈ（「Full-FLAG」）が発現したＨＣＴ１１６細胞を抗ＦＬＡＧ抗体及び抗ケラチン１８抗体を用いた免疫蛍光染色法により観察した画像を示す。上段の画像におけるスケールは１０μｍを示す。上段の画像において、四角で囲った２つの領域（１［抗ＦＡＭ８３Ｈ抗体による染色レベルが高い領域］及び２［抗ＦＡＭ８３Ｈ抗体による染色レベルが低い領域］）の拡大画像を、それぞれ下段に示す（「Region 1」及び「Region 2」）。（ｂ）の上段は、ＦＬＡＧタグ融合ＦＡＭ８３Ｈ（「Full-FLAG」）が発現したＨＣＴ１１６細胞を抗ＦＬＡＧ抗体及び抗ＣＫ－１α抗体を用いた免疫蛍光染色法により観察した画像を示し、（ｂ）の下段は、ＦＬＡＧタグ融合ＦＡＭ８３Ｈ（「Full-FLAG」）が発現したＨＣＴ１１６細胞を抗ケラチン１８抗体及び抗ＣＫ－１α抗体を用いた免疫蛍光染色法により観察した画像を示す。それぞれの画像における点線で囲った領域の拡大図は、それぞれの画像の右上又は左下に示す。 ＦＬＡＧタグ融合ＦＡＭ８３Ｈ（「Full-FLAG」）が発現したＨＣＴ１１６細胞をＣＫ－１αのｓｉＲＮＡで処理し、抗ＦＬＡＧ抗体及び抗ケラチン８抗体を用いた免疫蛍光染色法により観察した画像を示す（「si CK-1α」）。画像におけるスケールは１０μｍを示す。 （ａ）は、ＦＬＡＧタグ融合ＦＡＭ８３Ｈ（「Full-FLAG」）が発現したＨＣＴ１１６細胞を抗ＦＬＡＧ抗体及び抗β‐カテニン抗体を用いた免疫蛍光染色法により観察した画像を示す。画像におけるスケールは１０μｍを示す。（ｂ）は、ＦＬＡＧタグ融合ＦＡＭ８３Ｈ（「Full-FLAG」）が発現したＨＣＴ１１６細胞を４種類の抗体（抗ＦＬＡＧ抗体、抗β－カテニン抗体、抗リン酸化[Ｓｅｒ４５]β‐カテニン抗体、及び抗アクチン抗体）を用いたウェスタンブロット法により解析した結果を示す図である。 （ａ）は、ＦＡＭ８３Ｈが低発現（図中の「Low」）又は高発現（図中の「High」）した大腸癌組織を抗ＦＡＭ８３Ｈ抗体及び抗ケラチン１８抗体を用いた免疫蛍光染色法により観察した画像を示す。画像におけるスケールは１０μｍを示す。それぞれの画像における点線で囲った領域の拡大図は、それぞれの画像の右上に示す。（ｂ）は、ＦＡＭ８３Ｈが高発現した大腸癌組織を抗ＦＡＭ８３Ｈ抗体及び抗ＣＫ－１α抗体を用いた免疫蛍光染色法により観察した画像を示す。画像におけるスケールは１０μｍを示す。（ｃ）は、ＦＡＭ８３Ｈが低発現（図中の「FAM83H low」）又は高発現（図中の「FAM83H high」）した大腸癌組織を抗ＦＡＭ８３Ｈ抗体及び抗β‐カテニン抗体を用いた免疫蛍光染色法により観察した画像を示す。画像におけるスケールは１０μｍを示す。
　本発明の大腸癌治療剤は、ＦＡＭ８３Ｈタンパク質の発現抑制物質又は機能阻害物質を有効成分として含有している限り特に制限されず、本発明の大腸癌発症・再発のリスクを評価するためのデータを収集する方法（大腸癌発症・再発のリスクの評価を補助する方法）としては、（ａ）被検者由来の生体試料中の、ＦＡＭ８３Ｈタンパク質を定量する工程；と（ｂ）前記生体試料中のＦＡＭ８３Ｈタンパク質量と、大腸癌非罹患者由来の生体試料及び／又は大腸癌罹患者由来の生体試料中のＦＡＭ８３Ｈタンパク質量とを比較・評価する工程；とを備える方法であれば特に制限されず、本発明における大腸癌としては、上行結腸癌、横行結腸癌、下行結腸癌、Ｓ状結腸癌、直腸癌、又は盲腸癌を挙げることができ、また、本発明の大腸癌治療剤の投与対象としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等の哺乳動物を例示することができる。
　本発明におけるＦＡＭ８３Ｈタンパク質の発現抑制物質としては、ＦＡＭ８３Ｈ遺伝子の転写レベルや翻訳レベル等において、ＦＡＭ８３Ｈタンパク質の発現を完全に又は有意に抑制する物質であればよく、ＦＡＭ８３Ｈ遺伝子の転写レベルや翻訳レベルの抑制物質としては、ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ等の他、ＦＡＭ８３ＨｍＲＮＡの切断活性を有するリボザイムや、ＦＡＭ８３ＨのｍｉＲＮＡを挙げることができる。
　上記ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡとしては、ＦＡＭ８３ＨｍＲＮＡを分解することで配列特異的に発現を抑制するＲＮＡｉ（RNA interference；ＲＮＡ干渉）において用いることができる、ＦＡＭ８３ＨｍＲＮＡ配列の一部配列と相同の配列であるセンスＲＮＡと、該当センスＲＮＡと相補的な配列であるアンチセンスＲＮＡとを含む１８～２６塩基、好ましくは１９～２５塩基、より好ましくは２０～２４塩基、特に好ましくは２１～２３塩基の二本鎖ＲＮＡを挙げることができ、具体的には、5’-ACACGAAGGCCAUUCUGGAGCAGAU-3’（配列番号１）及びその相補的配列である3’-UGUGCUUCCGGUAAGACCUCGUCUA-5’（配列番号２）を含む二本鎖ＲＮＡ配列からなるＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡや、5’-CAACGCCUUGUACAGCAGCAACCUU-3’（配列番号３）及びその相補的配列である3’-GUUGCGGAACAUGUCGUCGUUGGAA-5’（配列番号４）を含む二本鎖ＲＮＡ配列からなるＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡを挙げることができ、好ましくは、5’-ACACGAAGGCCAUUCUGGAGCAGAU-3’（配列番号１）及びその相補的配列である3’-UGUGCUUCCGGUAAGACCUCGUCUA-5’（配列番号２）からなるＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡＳ１や、5’-CAACGCCUUGUACAGCAGCAACCUU-3’（配列番号３）及びその相補的配列である3’-GUUGCGGAACAUGUCGUCGUUGGAA-5’（配列番号４）からなるＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡＳ２を挙げることができ、特にＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡＳ１を好適に例示することができる。また、上記ｓｉＲＮＡは１又は２種類以上用いることもできる。
　上記ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡには、ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡの誘導体や、ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡの前駆体を含めることができ、ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡの前駆体としては、ＦＡＭ８３Ｈ遺伝子のｓｈＲＮＡ（short hairpin RNA）を含めることができる。
　上記ＦＡＭ８３ＨのｓｈＲＮＡとしては、部分的に回文状の塩基配列を含むことにより分子内で二本鎖構造をとり、３'末端に突出部を有する短いヘアピンのような構造をとる一本鎖ＲＮＡを挙げることができ、かかるｓｈＲＮＡは、細胞内に導入された後、Ｄｉｃｅｒにより例えば２１～２３塩基の長さの二本鎖ＲＮＡに分解され、上記ｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡｉを引き起こすことができ、上記２１～２３塩基の長さの二本鎖ＲＮＡとしては、5’-ACACGAAGGCCAUUCUGGAGCAGAU-3’（配列番号１）及びその相補的配列である3’-UGUGCUUCCGGUAAGACCUCGUCUA-5’（配列番号２）、又は、5’-CAACGCCUUGUACAGCAGCAACCUU-3’（配列番号３）及びその相補的配列である3’-GUUGCGGAACAUGUCGUCGUUGGAA-5’（配列番号４）を例示することができる。
　上記ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡの誘導体としては、ＲＮＡｉ効果を高め、また細胞内のＲＮａｓｅに対して分解されにくいようにＲＮＡの安定性を向上させるための修飾が施された誘導体を挙げることができ、具体的には、３’側にＵを数個、好ましくは２～４個、より好ましくは２又は３個、最も好ましくは２個付加させた３’オーバーハング型誘導体や、ポリエチレングリコール、コレステロール、又は２’－ｏ－ｍｅｔｈｙｌ等メチル化処理やチオリン酸化処理などの抗ＲＮａｓｅ処理で適切に修飾した誘導体を挙げることができる。
　上記ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡは、ＦＡＭ８３Ｈに関する公知の配列情報（例えばNCBI Reference Sequence: NM_198488.3）に基づいて設計することができ、具体的には、配列番号９に示される配列に基づいて設計することができ、合成による作製方法や遺伝子組換え技術を用いる作製方法等、公知の作製方法を用いることにより作製することができる。
　上記合成による作製方法としては、上記配列情報に基づき、常法により二本鎖ＲＮＡを合成する方法を例示することができ、すなわち、センス鎖オリゴリボヌクレオチド及びアンチセンス鎖オリゴリボヌクレオチドを、保護基のついた４種類（アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン）のリボヌクレオチドを用い、合成機を使用して２本鎖のオリゴリボヌクレオチドであるｓｉＲＮＡを、有機合成法により合成することができる。
　上記遺伝子組換え技術を用いる作製方法としては、ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡを発現ベクターに組み込むことで発現させる方法を挙げることができ、例えばベクター中の適当なプロモーターの下流にＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡ発現カセットを挿入することによりｓｉＲＮＡ発現ベクターを構築することができる。かかるｓｉＲＮＡ発現ベクターとしては、市販の二本鎖ＲＮＡ発現用のベクターを含め公知のものを用いることができるが、哺乳動物に導入する場合にはウイルスベクターであることが好ましく、ウイルスベクターとしては、例えば、マウス白血病レトロウイルスベクターや、アデノ随伴ウイルスベクターや、アデノウイルスベクターや、レンチウイルスベクターなどを挙げることができるが、アデノウイルスベクターが好ましく、ベクターによる発現系を構築する際には、発現を起こさせるだけでなく、Ｕ６プロモーター等発現を調節する制御配列を含めることもできる。
　ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡは、上記組換えウイルスベクターを細胞に感染させることにより、大腸癌細胞に導入することができる。組換えウイルスベクターを癌細胞に直接感染させることにより、二本鎖ｓｉＲＮＡを直接細胞内に導入する場合に比べて、細胞内に存在できる期間が長くなり、遺伝子発現抑制の効率が高くなる。
　ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡは、リポフェクション法等によっても、大腸癌細胞に導入することができる。具体的には、陰電荷を有するホスファチジルセリン（ＰＳ）からなるリポソームを用いることができるが、より安定したリポソームを形成する陽イオン性脂質であるＮ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリエチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）や、2,3-dioleyloxy-N-[2(sperminecarboxamido)ethyl]-N, N- dimethyl-1-propanaminium trifluoroacetate（ＤＯＳＰＡ）と、中性脂質 dioleoylphosphatidyl ethanolamine（ＤＯＰＥ）を混合した細胞内移行性及び核内移行性を有する人工リポソーム等を用いて導入することができる。
　前記アンチセンスＲＮＡやアンチセンスＤＮＡとしては、ＦＡＭ８３ＨｍＲＮＡの配列に対して相補的な塩基配列を有するＲＮＡやＤＮＡであって、ＦＡＭ８３ＨｍＲＮＡとハイブリッドを形成することによって、ＦＡＭ８３Ｈタンパク質の合成を抑制するものを挙げることができ、また、前記リボザイムとしては、触媒活性を有するＲＮＡ分子であって、ＦＡＭ８３ＨｍＲＮＡを切断することによって、大腸癌の治療剤としての効果を発揮するものを挙げることができる。
　前記ｍｉＲＮＡとしては、ＦＡＭ８３ＨｍＲＮＡの配列に対して相補的な塩基配列を有するＲＮＡであって、転写や翻訳阻害を引き起こし、ＦＡＭ８３Ｈタンパク質の発現を抑制するものを挙げることができる。
　本発明におけるＦＡＭ８３Ｈタンパク質の機能阻害物質としては、抗ＦＡＭ８３Ｈタンパク質抗体や、ＦＡＭ８３Ｈタンパク質に対するペプチドアプタマーを例示することができる。
　前記抗ＦＡＭ８３Ｈタンパク質抗体としては、ＦＡＭ８３Ｈタンパク質に特異的に結合し、ＦＡＭ８３Ｈタンパク質の機能（例えば、ケラチン８、ケラチン１８等のケラチンタンパク質やカゼインキナーゼ‐１α[Casein kinase 1、ＣＫ－１α]との相互作用）を阻害しうる抗体を例示することができ、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよく、また、抗体のフラグメント（例、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ’)２）や組換え抗体（例、ｓｃＦｖ）であってもよい。
　上記抗ＦＡＭ８３Ｈタンパク質抗体は、ＦＡＭ８３Ｈタンパク質若しくはその適当なペプチド断片、又はそれらの各種誘導体若しくは複合体等を免疫原として用いて、当業者に公知の適当な方法で調製することができる。例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ニワトリ等の適当な動物に投与し、その抗血清から調製することでポリクローナル抗体を調製することが可能であり、公知の細胞融合を用いる方法（例えば「単クローン抗体」、長宗香明、寺田弘共著、廣川書店、1990年；"Monoclonal Antibody" James W. Goding, third edition, Academic Press, 1996））によりモノクローナル抗体を調製することが可能である。
　本発明のＦＡＭ８３Ｈタンパク質の発現抑制物質又は機能阻害物質による効果により、大腸癌細胞（ＦＡＭ８３Ｈ[ＦＡＭ８３Ｈ遺伝子のｍＲＮＡやＦＡＭ８３Ｈタンパク質]が過剰発現[高発現]する細胞）の増殖を抑制したり、大腸癌細胞におけるアポトーシスを誘導したり、大腸癌細胞の細胞分裂期における紡錘体の正常形成率を低下したり、大腸癌細胞の細胞運動機能を抑制したり、大腸癌細胞の他の臓器への転移を抑制したり、大腸癌細胞におけるカゼインキナーゼ‐１α（Casein kinase 1、ＣＫ－１α）のケラチンフィラメントへの局在（結合）を阻害したり、大腸癌細胞におけるケラチンフィラメントの脱重合を阻害したり、大腸癌細胞におけるβ‐カテニン（Ｓｅｒ４５）のリン酸化を阻害したり、大腸癌細胞におけるβ‐カテニンの核内移行を阻害したり、大腸癌細胞におけるＷｎｔ／β‐カテニンシグナルの活性化を阻害することができ、この意味において、本発明の大腸癌治療剤は、大腸癌細胞の増殖抑制剤、大腸癌細胞におけるアポトーシス誘導剤、大腸癌細胞の細胞分裂期における紡錘体の正常形成率低下剤（細胞分裂阻害剤）、大腸癌細胞の細胞運動機能抑制剤、大腸癌の転移抑制剤、大腸癌細胞におけるＣＫ－１αのケラチンフィラメントへの局在（結合）阻害剤、大腸癌細胞におけるケラチンフィラメントの脱重合阻害剤、大腸癌細胞におけるβ‐カテニン（Ｓｅｒ４５）のリン酸化阻害剤、大腸癌細胞におけるβ‐カテニンの核内移行阻害剤、大腸癌細胞におけるＷｎｔ／β‐カテニンシグナルの活性化阻害剤ということができる。
　本発明の大腸癌治療剤を上記大腸癌細胞の細胞分裂期における紡錘体の正常形成率低下剤として投与した場合、細胞分裂期にラミンＢ２が細胞周辺部で凝集し、その結果、大腸癌細胞又は大腸癌細胞株における細胞分裂期に紡錘体マトリクス形成が阻害される。このように、紡錘体形成が阻害されると、大腸癌細胞の増殖が抑制されると考えられる。
　本発明の大腸癌治療剤を上記大腸癌細胞におけるアポトーシス誘導剤として投与した場合、大腸癌細胞又は大腸癌細胞株において、アポトーシスマーカーが有意に発現し、アポトーシス誘導作用が生じる。上記アポトーシスマーカーとしては、断片化ＰＡＲＰや断片化カスパーゼ３を例示することができる。このように、アポトーシスが誘導されると、大腸癌細胞が死滅すると考えられる。
　本発明の大腸癌治療剤を上記大腸癌細胞の細胞運動機能抑制剤として投与した場合、大腸癌細胞又は大腸癌細胞株における細胞の運動機能が阻害される。このように、大腸癌細胞の運動機能が阻害されると、大腸癌の転移が抑制されると考えられる。
　本発明の大腸癌治療剤は、常法によって適宜の製剤とすることができ、薬理学的に許容される公知の担体又は希釈剤等からなる補助成分や癌の治療及び予防のための他の生理活性物質をさらに含有することもできる。
　本発明の大腸癌治療剤は、所望の大腸癌治療効果が得られる限り特に制限されず、静脈内投与、皮下投与、経皮投与、注腸投与等を例示することができるが、静脈内投与が好ましい。
　本発明の大腸癌治療剤の投与量としては、有効成分の種類、病状の重さ、治療方針、患者の年齢、体重、性別、全般的な健康状態、及び患者の遺伝的背景に応じて、当業者が適宜選択することができるが、例えば、ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡＳ１を投与する場合、０．１～１００ｍｇ／日／ｋｇｂ.ｗ.、好ましくは０．５～５０ｍｇ／日／ｋｇｂ.ｗ.、より好ましくは、１～１０ｍｇ／日／ｋｇｂ.ｗ.、さらに好ましくは３～７ｍｇ／日／ｋｇｂ.ｗ.を挙げることができる。
　本発明の大腸癌発症・再発のリスクを評価するためのデータを収集する方法において、大腸癌非罹患者由来の生体試料はネガティブコントロールであり、大腸癌罹患者由来の生体試料はポジティブコントロールである。被検者由来の生体試料としては、糞便、血液、生検検体が好ましく、ＦＡＭ８３Ｈは、当業者に公知の任意の方法で定量することが可能であり、例えば、抗ＦＡＭ８３Ｈタンパク質抗体を用いたＥＬＩＳＡ法や、ウェスタンブロット法、免疫染色法等の各種の免疫学的特異反応を利用する方法を用いることができる。
　上記データを収集する方法において、例えば、大腸癌罹患者由来の生体試料中のＦＡＭ８３Ｈタンパク質量と比較して、上記被検者由来の生体試料中のＦＡＭ８３Ｈタンパク質量が同等以上である場合に、大腸癌発症・再発のリスクが高いと判断することができ、また、大腸癌非罹患者由来の生体試料中のＦＡＭ８３Ｈタンパク質量と比較して、被検者由来の生体試料中のＦＡＭ８３Ｈタンパク質量が有意に高い場合に、大腸癌発症・再発のリスクが高いと判定することができる。
　以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
（大腸癌培養細胞株）
　大腸癌培養細胞株として、ＡＴＣＣから購入したＨＣＴ１１６細胞とＤＬＤ－１細胞とを用いた。それぞれの細胞は５％ＣＯ２雰囲気下、１０％牛胎児血清（Invitrogen社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Invitrogen社製）で培養した。
［実施例１］
［ヒト大腸癌組織の遺伝子発現解析１］
　千葉大学医学部附属病院において、１３名の大腸癌患者から摘出された大腸癌組織とその周辺の非癌部組織を検体として採取した。各組織からRNeasy Plus kit（Qiagen社製）を用いてtotalＲＮＡを抽出した。
　上記採取した検体のうち、１２名の検体を用いて、大腸癌組織と非癌部組織における遺伝子発現レベルの差異をマイクロアレイ解析によって網羅的に解析した。TotalＲＮＡからGene Chip(R) 3’ IVT Express Kit（Affymetrix社製）を用いてａＲＮＡを作製し、全遺伝子型マイクロアレイ（Gene Chip Human Genome U133 Plus 2.0 Array）（Affimetrix社製）と同社製のプローブセットとを用いてマイクロアレイ解析を行った。かかるマイクロアレイ解析により得られた全遺伝子の発現値を、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇＧＸソフトウェア（アジレントテクノロジー社）を用いて、中央値による正規化を行い、発現量の高かったＦＡＭ８３Ｈについて、一患者毎に発現比を大腸癌組織：非癌部組織として算出し、そのｌｏｇ２値をプロットした結果を図１（ａ）に示す。スチューデントのｔ検定法（対応有り）により有意差検定を行った。結果を図１（ａ）に示す。
　ＦＡＭ８３ＨのｍＲＮＡの発現は、２２６１２９＿ａｔプローブセットを用いたマイクロアレイ解析により同定されたが、その再現性を検討するために、ＦＡＭ８３Ｈ遺伝子について、上記マイクロアレイ解析に用いた検体のうち１０名の検体に新たに１名の検体を加えた１１名の大腸癌組織とその周辺の非癌部組織とを検体として、Power CYBR(R) Green試薬と、Applied Biosystems 7900HT Fast Real Time PCR System（Applied Biosystems社製）とを用いて、ｑＰＣＲによって解析した。使用したプライマー配列はフォワードプライマー5’-CGACAAGTGCCGTGTCAACC-3’（配列番号５）とリバースプライマー5’-ACTTCCCAGTGCGGCAGTAG-3’（配列番号６）であった。発現量補正用のアクチン遺伝子のプライマーとしては、フォワードプライマー5’-AGAAAATCTGGCACCACACC-3’（配列番号７）とリバースプライマー5’-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3’（配列番号８）とを使用した。一患者毎にＦＡＭ８３Ｈの発現比を大腸癌組織：非癌部組織として算出し、そのｌｏｇ２値をプロットした結果を図１（ｂ）に示す。
（結果）
　図１（ａ）より明らかなとおり、ＦＡＭ８３ＨｍＲＮＡ発現量は、非癌部組織と比較して大腸癌組織において有意に増加していることがマイクロアレイ解析によって示唆された。また、図１（ｂ）より明らかなとおり、ＦＡＭ８３ＨｍＲＮＡ発現量は、非癌部組織と比較して大腸癌組織において有意に増加していることがｑＰＣＲ解析により示され、ＦＡＭ８３Ｈ遺伝子の発現は大腸癌特異的であることが確認された。
［ヒト大腸癌組織の遺伝子発現解析２］
　千葉大学医学部附属病院で保存された１１１名の大腸癌患者の大腸癌組織パラフィンブロックを免疫組織化学染色解析に用いた。組織切片スライドを作製し、脱パラフィン処理した後、REAL Target Retrieval Solution（Dako社製）を用いて抗原賦活化を行った。REAL Perioxidase-Blocking Solution（Dako社製）でブロッキングを行った後、免疫組織化学染色試料を作製するために、抗ＦＡＭ８３Ｈ抗体（HPA024604、Sigma社製）とLSAB+System-HRP（Dako社製）で順に処理し、EnVision+キット/HRP(DAB)（Dako社製）で発色させた。なお、細胞核はマイヤー・ヘマトキシリンで染色し、染色画像はNanoZoomer RS（浜松ホトニクス社製）で取得した。また、免疫蛍光染色にはO.C.T.コンパウンド（ティッシュー・テック社製）に埋め込んだ大腸組織を用いた。大腸組織を薄切した後、３％牛胎児アルブミンでブロッキングした後、免疫蛍光染色試料を作製するために、抗ＦＡＭ８３Ｈ抗体（HPA024604、Sigma社製）と抗Ｅ－カドヘリン抗体（36B5、Thermo Scientific社製）との一次抗体で処理し、続いてAlexa488標識抗マウスＩｇＧ抗体とAlexa594標識抗ラットＩｇＧ抗体（ともにインビトロジェン社製）との二次抗体で処理した。なお、細胞核はＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）で染色し、細胞の観察は共焦点顕微鏡（ＬＳＭ７１０、Zeiss社製）を用いて行った。結果を図２及び３に示す。
（結果）
　図２より明らかなとおり、ＦＡＭ８３Ｈタンパク質の発現量は、正常大腸上皮組織と比較して、大腸癌組織において増加していることが免疫組織化学染色法により示された。また、図３（ａ）より明らかなとおり、上皮細胞極性の乱れが大きい大腸癌組織において、ＦＡＭ８３Ｈが過剰発現（高発現）していることが示された。また、図３（ｂ）より明らかなとおり、Ｅ－カドヘリンの発現量が低下した大腸癌組織において、ＦＡＭ８３が高発現していることが示された。上皮細胞極性の乱れとＥ－カドヘリンの発現低下は共に高浸潤性癌細胞の特徴であることが知られていることから、上記結果は、ＦＡＭ８３Ｈタンパク質は高浸潤性大腸癌細胞で高発現することを示している。
［実施例２］
［大腸癌細胞増殖試験］
　ＦＡＭ８３Ｈ遺伝子のｍＲＮＡの発現を抑制することによる影響を調べるために、ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡを用いて検討した。使用したＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡの配列（センス鎖及びアンチセンス鎖）の詳細は以下のとおりである。
ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡＳ１ 
センス鎖：　　　5’-ACACGAAGGCCAUUCUGGAGCAGAU-3’（配列番号１）
アンチセンス鎖：3’-UGUGCUUCCGGUAAGACCUCGUCUA-5’（配列番号２）
ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡＳ２ 
センス鎖：　　　5’-CAACGCCUUGUACAGCAGCAACCUU-3’（配列番号３）
アンチセンス鎖：3’-GUUGCGGAACAUGUCGUCGUUGGAA-5’（配列番号４）
　上記ＨＣＴ１１６細胞にＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡの導入を行うことでＦＡＭ８３Ｈノックダウン大腸癌細胞（以下、「ＦＡＭ８３ＨノックダウンＨＣＴ１１６細胞」ということもある）の細胞増殖試験を行った。一万個のＨＣＴ１１６細胞を１２ウェルディッシュに播種し、２日間培養した。上記２種類のＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡＳ１とｓｉＲＮＡＳ２とをＨＣＴ１１６細胞にリポフェクトアミンＲＮＡｉＭＡＸ（Invitrogen社製）を用いてそれぞれ導入（transfection）し、ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡＳ１を導入したＦＡＭ８３ＨノックダウンＨＣＴ１１６細胞（以下、「Ｓ１細胞」ともいう）と、ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡ Ｓ２を導入したＦＡＭ８３ＨノックダウンＨＣＴ１１６細胞（以下、「Ｓ２細胞」ともいう）とを作製した。コントロールｓｉＲＮＡとしては、Medium GC Duplex #2（Invitrogen社製）を用い、同様にＨＣＴ１１６細胞に導入してコントロール細胞とした。
　ｓｉＲＮＡ導入後それぞれ２４、４８、７２時間経過毎にＳ１細胞、Ｓ２細胞及びコントロール細胞の生細胞数を、トリパンブルー染色法を用いてそれぞれ計測した。同様の実験を３回行い、生細胞数平均値と標準偏差を３回の実験結果から算出し、グラフ化した。結果を図４に示す。
（結果）
　図４より明らかなとおり、コントロール細胞と比較して、Ｓ１細胞及びＳ２細胞の細胞数は、スチューデントのｔ検定（対応なし）により有意に減少したことが確認された （＊, ｐ＜０．００５； ＊＊， p＜０．００００５；＊＊＊, ｐ＜０．０００５）。具体的には、ｓｉＲＮＡを導入して７２時間後のＳ１細胞の細胞数は、コントロール細胞の５％程度であり、Ｓ２細胞の細胞数は、コントロール細胞の３０％であり、ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡ導入による顕著な細胞数減少効果があった。よって、ＦＡＭ８３Ｈは大腸癌細胞の増殖と生存に必要であることが示唆された。
［実施例３］
［ウェスタンブロット解析］
　上記Ｓ１細胞のウェスタンブロット解析をｓｉＲＮＡ導入後２日経過時に行った。ＨＣＴ１１６細胞トータルタンパク質の抽出はLaemmli法により、ＳＤＳサンプルバッファーを用いて行った。タンパク質を５－２０％勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＤＲＣ社製）（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）にかけて分離し、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（Milipore, Bedford, MA）にトランスファーした。かかる膜をブロッキングワン（ナカライテスク社製）を用いてブロッキングした。メンブレンに、抗ＰＡＲＰ分解物抗体（#5625、Cell Signaling Technology社製）と、抗カスパーゼ－３分解物抗体（#9664、Cell Signaling Technology社製）と、抗ＦＡＭ８３Ｈ抗体（HPA024604、Sigma社製）と、対照として抗アクチン抗体（sc-1615、Santa Cruz Biotechnology社製）とを一次抗体として添加してインキュベートしてから洗浄し、次いで、ＨＲＰ標識抗ヤギＩｇＧ抗体（sc-2020、Santa Cruz Biotechnology社製）とＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（NA934 、GEヘルスケア社製）とを標識した二次抗体として添加してインキュベートを行なった後、洗浄した。ＥＣＬ試薬（ＧＥヘルスケア社製）を用いた化学発光法で発光させ、ＬＡＳ－４０００イメージアナライザー（ＧＥヘルスケア社製）で検出した。結果を図５に示す。
（結果）
　図５より明らかなとおり、Ｓ１細胞ではアポトーシスマーカーとして知られている断片化ＰＡＲＰ（cleaved PARP）と断片化カスパーゼ－３（cleaved caspase 3）が検出され、ＦＡＭ８３Ｈタンパク質の産生が抑制されていた。したがって、ＦＡＭ８３Ｈは大腸癌細胞の増殖と生存に必要であり、ＦＡＭ８３Ｈが欠損すると大腸癌細胞がアポトーシスに導かれることが示された。
［実施例４］
［免疫染色１］
　上記Ｓ１細胞及びＳ２細胞、並びにＤＬＤ１細胞にＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡ Ｓ１をリポフェクトアミン ＲＮＡｉＭＡＸ（Invitrogen社製）を用いて導入した細胞（以下、「Ｄ－Ｓ１細胞」ともいう。）、及びＤＬＤ１細胞にMedium GC Duplex #2を導入して細胞（以下、「Ｄ－コントロール細胞」ともいう。）に免疫染色を行うことで、ＦＡＭ８３Ｈの機能をさらに検討した。免疫染色は、上記各細胞を、－２０℃に冷やした１００％メタノールに１分間浸して固定し、３％牛血清アルブミンを用いてブロッキングした後、一次抗体、二次抗体の順に反応させ、二次抗体溶液にＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）を混合してＤＮＡを共染色した。細胞の観察は共焦点顕微鏡（ＬＳＭ７１０、Zeiss社製）を用いて行った。一次抗体として、抗ケラチン１８抗体（MS-142-P0、Thermo Scientific社製）と、抗α－チューブリン抗体（YOL1/34、Santa Cruz Biotechnology社製）とを使用し、二次抗体としては、Alexa488標識抗マウスＩｇＧ抗体とAlexa594標識抗ラットＩｇＧ抗体（ともにインビトロジェン社製）とを使用した。同様の実験を３回行い、正常な紡錘体を形成している分裂期細胞の割合の平均値と標準偏差を３回の実験結果から算出し、グラフ化した。結果を図６（ａ）及び（ｂ）に示す。
（結果）
　図６（ｂ）より明らかなとおり、スチューデントのｔ検定（対応なし）によると、Ｓ１細胞、Ｓ２細胞、及びＤ－Ｓ１細胞における細胞分裂期における紡錘体の正常形成率が、コントロール細胞（Ｄ－コントロール細胞を含む）と比較して有意に低いことが確認された（＊，ｐ＜１×１０－６; ＊＊，ｐ＜０．０００５）。また、図６（ａ）より明らかなとおり、ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡＳ１を導入した細胞を、共焦点顕微鏡を用いて観察した画像においては、コントロール細胞では紡錘体が正常に形成していることが観察されるが、Ｓ１細胞ではケラチン１８とα－チューブリンの染色から明らかなとおり、ケラチン細胞骨格と紡錘体形成の異常が観察された。
［実施例５］
［免疫染色２］
　一次抗体として抗ラミンＢ２抗体（10895-1-AP、ProteinTech Group社製）と抗α－チューブリン抗体（DM1A、Sigma社製）とを使用したことのほかは、実施例４と同様の方法でＳ１細胞、Ｓ２細胞及びコントロール細胞について免疫染色を行った。細胞の観察は共焦点顕微鏡を用いて行った。ｓｉＲＮＡ導入後２日経過時に同様の実験を３回行い、ラミンＢ２が正常なマトリクスを形成している分裂期細胞の割合の平均値と標準偏差を３回の実験結果から算出し、グラフ化した。結果を図７（ａ）及び（ｂ）に示す。
（結果）
　図７（ｂ）より明らかなとおり、コントロール細胞と比較して、Ｓ１細胞及びＳ２細胞の細胞分裂期におけるラミンの紡錘体マトリックスの正常形成率は、スチューデントのｔ検定（対応なし）により有意差をもって低いことが確認された（＊，ｐ＜１×１０－５; ＊＊，ｐ＜０．０００５）。具体的には、ｓｉＲＮＡ導入後２日後のＳ１細胞の細胞分裂期における正常紡錘体形成細胞数は、コントロール細胞の５％程度であり、Ｓ２細胞の細胞分裂期における正常紡錘体形成細胞数は、コントロール細胞の２２％程度であり、ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡ導入による顕著な紡錘体形成阻害効果があった。また、図７（ａ）より明らかなとおり、コントロール細胞ではラミンＢ２が紡錘体の外側でマトリクスを形成し、紡錘体が正常に形成されていることが観察されるが、Ｓ１細胞では、ラミンＢ２が細胞周辺部で凝集し、ラミンの紡錘体マトリクス形成が阻害されていることが観察された。以上のとおり、ＦＡＭ８３Ｈは、ラミン紡錘体マトリックスの形成を介して、癌細胞の分裂を促進していると考えられる。紡錘体の形成異常は、細胞分裂の停止や染色体異常分配を介して細胞死を誘導するので、細胞増殖抑制を誘導するメカニズムの一つであると考えられる。
［実施例６］
［Wound healing 解析１］
　上記Ｓ１細胞とＳ２細胞の運動に関連する機能を調べるために、Wound healing 解析を行った。Ｓ１細胞とＳ２細胞それぞれについて、ｓｉＲＮＡ導入後２４時間経過時に細胞シートに創傷し、形成された無細胞面を細胞が遊走して埋めていく様子を、傷をつけた直後と２４時間後に光学顕微鏡下で観察した。同様の実験を３回行い、細胞シートの無細胞面の先端に位置する細胞の移動距離の平均値と標準偏差を３回の実験結果から算出し、グラフ化した。結果を図８（ａ）及び（ｂ）に示す。
（結果）
　図８（ｂ）より明らかなとおり、コントロール細胞に比べてＳ１細胞及びＳ２細胞は、細胞シート先端の移動距離が有意差をもって減少していることが示された（＊，ｐ＜０．００１; ＊＊，ｐ＜０．００５）。具体的には、Ｓ１細胞の移動距離は、コントロール細胞の約４分の１であり、Ｓ２細胞の移動距離は、コントロール細胞の約２分の１であった。また、図８（ａ）より明らかなとおり、コントロール細胞は、２４時間後には細胞が無細胞面を遊走してほぼ埋めているのに対し、Ｓ１細胞では、細胞シート先端の移動スピードが著しく減少し、細胞運動機能が抑制されていることが確認された。
［実施例７］
［Wound healing 解析２]
　上記Ｓ１細胞について、ｓｉＲＮＡ導入後３６時間経過時に細胞シートに創傷し、その６時間後に、α－チューブリンに対する抗体で免疫染色し共焦点顕微鏡で観察した。１回の実験ごとに約１００個の細胞について、α－チューブリンの染色から細胞シートの先端に位置する細胞の葉状仮足の長さを測定し、平均値と標準偏差を３回の実験結果から算出し、グラフ化した。結果を図９（ａ）及び（ｂ）に示す。
（結果）
　図９（ｂ）より明らかなとおり、コントロール細胞と比較してＳ１細胞は、細胞シート先端の葉状仮足の長さが有意差をもって減少していることが示された(＊，ｐ＜０．０５)。また、図９（ａ）より明らかなとおり、細胞シート先端部を上記共焦点顕微鏡下で観察したところ、Ｓ１細胞では細胞シート先端に位置する細胞の葉状仮足形成が抑制されることが示された。葉状仮足は細胞が移動する際に形成されるものであり、葉状仮足の形成抑制はすなわち大腸癌細胞の運動を抑制している事を示唆している。
［実施例８］
［Wound healing解析３］
　上記Ｓ１細胞について、ｓｉＲＮＡ導入後３６時間経過時に細胞シートに創傷し、その６時間後に細胞をα－チューブリンに対する抗体及びケラチン８に対する抗体で免疫染色し、上記共焦点顕微鏡で観察した。結果を図１０に示す。
（結果）
　図１０より明らかなとおり、コントロールの先端細胞では細胞移動に伴ったケラチンフィラメントの脱重合が誘導されていたが、Ｓ１細胞ではケラチン骨格の束化が促進され移動が抑制されていることが観察された。細胞移動時に必要なケラチン骨格の再構築を抑制することが癌細胞の移動能を抑制するメカニズムの一つであると考えられる。
［実施例９］ 
　ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡＳ３として、以下の配列を用いて上記各実施例と同様の実験を行ったところ、大腸癌細胞の増殖抑制効果、アポトーシス誘導効果、及び運動機能抑制効果が認められた。ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡＳ３を構成する二本鎖ＤＮＡの配列（センス鎖及びアンチセンス鎖）は以下のとおりである。
ＦＡＭ８３Ｈ ｓｉＲＮＡ Ｓ３
センス鎖：　　　5’-UCCACUCGAAGAGGAAGUCCAACUA-3’（配列番号１０）
アンチセンス鎖：3’-AGGUGAGCUUCUCCUUCAGGUUGAU-5’（配列番号１１）
［実施例１０］
　ＦＡＭ８３Ｈが大腸癌細胞の増殖や運動に必要であることが明らかとなったので、次にＦＡＭ８３Ｈがどのようなメカニズムでこれら機能に関与しているかについて解析を進めた。具体的には、ＦＡＭ８３Ｈの相互作用因子に着目して解析を進めたところ、２種類の因子（ＣＫ－１α及びケラチンタンパク質）を同定した。さらに、これら因子とＦＡＭ８３Ｈとの相互作用について詳細な解析を行った。
（方法）
〔FAM83H発現ベクターの構築と細胞導入法〕
１）ＨＣＴ１１６細胞から定法によりｃＤＮＡを調製し、プライマー１（配列番号１２に示される塩基配列からなるＤＮＡ）とプライマー２（配列番号１３に示される塩基配列からなるＤＮＡ）とを用いたＰＣＲ法によりＦＡＭ８３Ｈ遺伝子（NM_198488.3）を増幅・単離した後、p3XFLAG-CMV-14 vector（Sigma-Aldrich社製）の制限酵素EcoRI－BamHIサイトへ挿入し、全長ＦＡＭ８３Ｈのアミノ（Ｎ）末端に３×ＦＬＡＧタグが融合したタンパク質（「Full-FLAG」）発現ベクターを構築した。
２）ＨＣＴ１１６細胞から定法によりｃＤＮＡを調製し、プライマー３（配列番号１４に示される塩基配列からなるＤＮＡ）とプライマー４（配列番号１５に示される塩基配列からなるＤＮＡ）とを用いたＰＣＲ法によりＦＡＭ８３Ｈの１－２８６アミノ酸をコードするＤＮＡ領域を増幅・単離し、p3XFLAG-CMV-14 vector（Sigma-Aldrich社製）の制限酵素EcoRI－BamHIサイトへ挿入し、ＦＡＭ８３Ｈの１－２８６アミノ酸断片のＮ末端に３×ＦＬＡＧタグが融合したタンパク質（「286N-FLAG」）発現ベクターを構築した。
３）ＨＣＴ１１６細胞から定法によりｃＤＮＡを調製し、プライマー５（配列番号１６に示される塩基配列からなるＤＮＡ）とプライマー６（配列番号１７に示される塩基配列からなるＤＮＡ）とを用いたＰＣＲ法によりＦＡＭ８３Ｈの２９４－１１７９アミノ酸をコードするＤＮＡ領域を増幅・単離し、p3XFLAG-CMV-14 vector（Sigma-Aldrich社製）の制限酵素EcoRI－BamHIサイトへ挿入し、ＦＡＭ８３Ｈの２９４－１１７９アミノ酸発現ベクター（「294C-FLAG」）を構築した。
４）上記３種類のＦＬＡＧタグ融合ＦＡＭ８３Ｈ（「Full-FLAG」、「286N-FLAG」、及び「294C-FLAG」）発現ベクターは、Lipofectamine 2000 (Invitrogen)を用いてＨＣＴ１１６細胞へ細胞導入した。なお、コントロールとしてp3XFLAG-CMV-14 vectorを用いた。また、プライマー１～６の配列を以下に示す。
プライマー１：5’-ATAGAATTCAACATGGCCCGTCGCTCTCAGAG-3’（配列番号１２）
プライマー２：5’-ACGGGATCCTCCCTTCTTGCTTTTGAACG-3’（配列番号１３）
プライマー３：5’-ATAGAATTCAACATGGCCCGTCGCTCTCAGAG-3’（配列番号１４）
プライマー４：5’-ATAGGATCCGGGCACAAGCGGCTCGGACTG-3’（配列番号１５）
プライマー５：5’-ATAGAATTCACCATGGACGCCTATGCCCTG-3’（配列番号１６）
プライマー６：5’-TCCAGCAGGCAGCTCTCGAGGCTG-3’（配列番号１７）
〔免疫沈降法及びウェスタンブロット法〕
　上記３種類のＦＬＡＧタグ融合ＦＡＭ８３Ｈ（「Full-FLAG」、「286N-FLAG」、及び「294C-FLAG」）発現ベクターをＨＣＴ１１６細胞へ導入し、２４時間後に細胞を回収し、１％ＮＰ４０／ＰＢＳ緩衝液で処理することによりタンパク質を抽出した。Dimethyl Pimelimidate（MP Biochemicals社製）でＦＬＡＧ抗体をProtein- G Dynabeads（Invitrogen社製）にクロスリンクしたＦＬＡＧ抗体ビーズProtein-G Dynabeadsを作製した後、かかるＦＬＡＧ抗体ビーズProtein-G Dynabeadsと上記タンパク質抽出液とを混合し、定法に従って免疫沈降法を行った。免疫沈降物を用いて、３種類の抗体（抗ＦＬＡＧ抗体［Sigma社製］、抗ケラチン８抗体［EP1628Y、Epitomics社製］、及び抗ＣＫ－１α抗体［C-19、Santa Cruz Biotechnology社製］）を用いたウェスタンブロット解析は、実施例３に記載の方法に従って行った。結果を図１１に示す。
〔免疫蛍光染色法〕
　上記３種類のＦＬＡＧタグ融合ＦＡＭ８３Ｈ（「Full-FLAG」、「286N-FLAG」、及び「294C-FLAG」）発現ベクターをＨＣＴ１１６細胞へ導入し、２４時間後に細胞を回収し、３種類の抗体（抗ＦＬＡＧ抗体［Sigma社製］、抗ケラチン１８抗体［MS-142-P0、Thermo Scientific社製］、及び抗ＣＫ－１α抗体［C-19、Santa Cruz Biotechnology社製］）を用いた免疫蛍光染色法により解析した。免疫蛍光染色法は、実施例４に記載の方法に従って行った。結果を図１２に示す。
（結果）
　図１１より明らかなとおり、ＦＡＭ８３Ｈ（抗ＦＬＡＧ抗体で検出）は、アミノ（Ｎ）末端側（少なくとも１－２８６アミノ酸領域）でＣＫ－１αと結合し、カルボキシ（Ｃ）末端側（少なくとも２９４－１１７９アミノ酸）でケラチン８（ケラチンタンパク質）と結合することが示された。また、図１２により明らかなとおり、ＦＡＭ８３Ｈ（抗ＦＬＡＧ抗体で検出）は、ＣＫ－１αやケラチン１８（ケラチンタンパク質）とケラチン骨格上で共局在していることが示された。さらに、図１２より明らかなとおり、ＦＡＭ８３Ｈが過剰発現（高発現）した細胞では、ケラチンフィラメントが崩壊（脱重合）していることが示された。細胞骨格を構成するケラチンフィラメントは、上皮細胞極性の維持や細胞間接着に必要であることから、ＦＡＭ８３Ｈの高発現によるケラチンフィラメントの脱重合は、大腸癌細胞の遊走能の亢進に必要であると考えられる。
［実施例１１］
　ＦＡＭ８３Ｈの過剰発現によるケラチンフィラメントの脱重合に、ＣＫ－１αが関与しているかどうかを調べるために、ＣＫ－１αのｓｉＲＮＡを用いて検討した。使用したＣＫ－１αのｓｉＲＮＡの塩基配列（センス鎖及びアンチセンス鎖）は以下のとおりである。
ＣＫ－１αのｓｉＲＮＡ
センス鎖：　　　5’-CAGAAUUUGCGAUGUACUUTT-3’（Ｔのみデオキシリボ核酸を示す）（配列番号１８）
アンチセンス鎖：3’-GUCUUAAACGCUACAUGAA-5’（配列番号１９）
（方法）
〔免疫蛍光染色法及びＣＫ－１αのノックダウン〕
　上記実施例１０の〔FAM83H発現ベクターの構築と細胞導入法〕に記載の方法にしたがって、ＦＬＡＧタグ融合ＦＡＭ８３Ｈ（「Full-FLAG」）発現ベクターをＨＣＴ１１６細胞へ導入し、２４時間後に上記ＣＫ－１αのｓｉＲＮＡを、リポフェクトアミンＲＮＡｉＭＡＸ（Invitrogen社製）を用いて細胞導入し、２４時間後に細胞を回収し、２種類の抗体（抗ＦＬＡＧ抗体［Sigma社製］、及び抗ケラチン８抗体［EP1628Y、Epitomics社製］）を用いた免疫蛍光染色法により解析した。免疫蛍光染色法は、実施例４に記載の方法に従って行った。結果を図１３に示す。
（結果）
　図１３より明らかなとおり、コントロールｓｉＲＮＡを細胞導入した場合、ＦＡＭ８３Ｈの過剰発現（高発現）によりケラチンフィラメントが脱重合したのに対して、ＣＫ－１αのｓｉＲＮＡを細胞導入した場合、ＦＡＭ８３Ｈの高発現によるケラチンフィラメントの脱重合が阻害された。この結果は、大腸癌細胞における、ＦＡＭ８３Ｈの過剰発現によるケラチンフィラメントの脱重合には、ＣＫ－１αが必要であることを示している。
［実施例１２］
　ＣＫ－１αは細胞質でβ－カテニンをリン酸化修飾するキナーゼであり、ＣＫ－１αによるβ－カテニンのリン酸化はβ－カテニンの細胞内タンパク質量や細胞内局在を制御することが知られている。ＦＡＭ８３Ｈの高発現によるＣＫ－１αのケラチンフィラメントへの局在がβ－カテニンの細胞内局在に影響を与えるかどうかについて解析を行った。
（方法）
〔免疫蛍光染色法〕
　上記実施例１０の〔FAM83H発現ベクターの構築と細胞導入法〕に記載の方法にしたがって、ＦＬＡＧタグ融合ＦＡＭ８３Ｈ（「Full-FLAG」）発現ベクターをＨＣＴ１１６細胞へ導入し、２種類の抗体（抗ＦＬＡＧ抗体［Sigma社製］、及び抗β－カテニン抗体［12F7、医学生物学研究所製］）を用いた免疫蛍光染色法により解析した。免疫蛍光染色法は、実施例４に記載の方法に従って行った。結果を図１４（ａ）に示す。
〔ウェスタンブロット法〕
　上記実施例１０の〔FAM83H発現ベクターの構築と細胞導入法〕に記載の方法にしたがって、ＦＬＡＧタグ融合ＦＡＭ８３Ｈ（「Full-FLAG」）発現ベクターをＨＣＴ１１６細胞へ導入し、４種類の抗体（抗ＦＬＡＧ抗体［Sigma社製］、抗β－カテニン抗体［12F7、医学生物学研究所製］、抗リン酸化[Ｓｅｒ４５]β‐カテニン抗体[#9564、Cell Signaling Technology社製]、及び抗アクチン抗体［sc-1615、Santa Cruz Biotechnology社製］）を用いたウェスタンブロット法により解析した。ウェスタンブロット法は、実施例３に記載の方法に従って行った。結果を図１４（ｂ）に示す。
（結果）
　図１４（ａ）より明らかなとおり、ＦＡＭ８３Ｈが過剰発現（高発現）する細胞においてβ‐カテニンが細胞核内に局在することが示された。また、図１４（ｂ）より明らかなとおり、ＦＡＭ８３Ｈが高発現する細胞においてβ‐カテニン（Ｓｅｒ４５）のリン酸化レベルが低下することが示された。これらの結果から、大腸癌細胞においてＦＡＭ８３Ｈが高発現すると、β‐カテニンのリン酸化レベルが低下し、β‐カテニンが細胞質から細胞核内へ移行することが示された。β‐カテニンの核内移行はＷｎｔ／β‐カテニンシグナルの活性化の指標であることから、FAM83Hの高発現はＷｎｔ／β‐カテニンシグナルの活性化を引き起こすと考えられる。
［実施例１３］
　実施例１０～１２では、ＨＣＴ１１６細胞にＦＬＡＧタグ融合ＦＡＭ８３Ｈを過剰発現して解析を行ったが、ＦＡＭ８３Ｈが高発現した大腸癌組織を用いて解析したところ、同様の結果が得られた。すなわち、ＦＡＭ８３Ｈはケラチン１８（ケラチンタンパク質）やＣＫ－１αとケラチンフィラメント上で共局在すること（図１５（ａ）及び（ｂ）参照））や、ＦＡＭ８３Ｈの高発現により大腸癌組織のケラチンフィラメントが脱重合すること（図１５（ｂ）参照）や、ＦＡＭ８３Ｈの高発現によりβ‐カテニンが細胞質から細胞核内へ移行すること（図１５（ｃ）参照）が示された。

Claims (5)

  1. ＦＡＭ８３Ｈタンパク質の発現抑制物質又は機能阻害物質を有効成分として含有する大腸癌治療剤。
  2. ＦＡＭ８３Ｈタンパク質の発現抑制物質が、ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡであることを特徴とする請求項１記載の大腸癌治療剤。
  3. ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡが、配列番号１に示されるＲＮＡ配列及びその相補的配列を含む二本鎖ＲＮＡ配列からなるｓｉＲＮＡ、又は配列番号３に示されるＲＮＡ配列及びその相補的配列を含む二本鎖ＲＮＡ配列からなるｓｉＲＮＡであることを特徴とする請求項２記載の大腸癌治療剤。
  4. ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡが、ベクターに組み込まれていることを特徴とする請求項２又は３に記載の大腸癌治療剤。
  5. 以下の工程（ａ）及び（ｂ）を備える大腸癌発症・再発のリスクを評価するためのデータを収集する方法。
    （ａ）被検者由来の生体試料中の、ＦＡＭ８３Ｈタンパク質を定量する工程；
    （ｂ）前記生体試料中のＦＡＭ８３Ｈタンパク質量と、大腸癌非罹患者又は大腸癌罹患者由来の生体試料中のＦＡＭ８３Ｈタンパク質量とを比較・評価する工程；
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WO2016133059A1 (ja) * 2015-02-16 2016-08-25 株式会社ファーマフーズ Ｆｓｔｌ１を利用した抗がん剤・転移抑制剤およびその併用剤

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIANG,X.: "The initial analysis and expression validation in several kinds of tumor cell lines of breast cancer related unknown gene fam83h", XIANDAI ZHONGLIU YIXUE, vol. 16, no. 4, 2008, pages 503 - 506 *
SASAROLI,D. ET AL.: "Novel surface targets and serum biomarkers from the ovarian cancer vasculature.", CANCER BIOL THER, vol. 12, no. 3, 2011, pages 169 - 80 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016133059A1 (ja) * 2015-02-16 2016-08-25 株式会社ファーマフーズ Ｆｓｔｌ１を利用した抗がん剤・転移抑制剤およびその併用剤
JPWO2016133059A1 (ja) * 2015-02-16 2018-01-18 株式会社ファーマフーズ Ｆｓｔｌ１を利用した抗がん剤・転移抑制剤およびその併用剤
US10806787B2 (en) 2015-02-16 2020-10-20 Pharma Foods International Co., Ltd. Anticancer agents or antimetastatic agents using FSTL1 and combination drug thereof

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