CN114790457B - circB3GALNT2在结直肠癌转移预测和治疗的产品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，尤其是circB3GALNT2在结直肠癌转移预测和治疗的产品中的应用，现提出如下方案,所述非编码RNA为circB3GALNT2，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述circB3GALNT2充当miR‑3174的海绵，miR‑3174和circB3GALNT2在结直肠癌组织中的表达呈显著负相关,所述circB3GALNT2竞争性结合miR‑3174上调RBFOX2表达，RBFOX2的表达水平与circB3GALNT2之间呈正相关。在本发明中circB3GALNT2在结直肠癌的发生发展中起关键作用，是调控结直肠癌细胞增殖和转移的重要调节因子，有望成为结直肠癌的潜在治疗靶点。

Description

circB3GALNT2在结直肠癌转移预测和治疗的产品中的应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及circB3GALNT2在结直肠癌转移预测和治疗的产品中的应用。
背景技术
根据国际癌症研究机构(IARC)2020年最新统计，结直肠癌(CRC)发病率已达10.0％，仅次于乳腺癌和肺癌，已成为全球第三大恶性肿瘤。随着医疗水平的不断提高，结直肠癌患者的5年生存率有所提高，但复发转移仍是结直肠癌患者死亡的主要原因。虽然我们在结直肠癌的研究方面取得了一些进展，但对于复发和转移仍然缺乏有效的治疗方法。因此，迫切需要进一步研究结直肠癌的发病机制以及与肿瘤复发和转移有关的分子机制；
环状RNA(circRNAs)，由共价键形成的闭环，没有5'帽和3'多聚(A)尾。此外，circRNA对核酸外切酶具有抗性，并且比线性剪接产物更稳定。随着高通量测序技术的不断发展，非编码RNA的功能被重新认识，现在非编码RNA与人类疾病的关系逐渐成为研究热点。人们普遍认为，circRNAs广泛参与人体的病理和生理活动，包括调节各种肿瘤的发生和发展。并能通过多种方式调控肿瘤的发生和发展。例如，circRNA充当miRNA海绵来调节miRNA相关靶基因的活性，或在两个基因的转录和剪接水平上调节表达，或与RBPs相互作用。所有关于circRNA和肿瘤的研究表明，一些异常表达的circRNA可能成为肿瘤的诊断标志物和潜在的分子治疗靶点；
为此我们需要对结直肠癌的增殖和转移的作用机制、预测和治疗价值进行研究，为此提出一种circB3GALNT2在结直肠癌转移预测和治疗的产品中的应用。
发明内容
本发明提出的circB3GALNT2在结直肠癌转移预测和治疗的产品中的应用，解决了现有技术中存在的问题。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种非编码RNA在调控结直肠癌细胞增殖和迁移中的应用。
优选的，所述非编码RNA为circB3GALNT2,又名为circ-0017065，其核酸序列如SEQID NO.1所示。
优选的，所述circB3GALNT2充当miR-3174的海绵，miR-3174和circB3GALNT2在结直肠癌组织中的表达呈显著负相关。
优选的，所述circB3GALNT2竞争性结合miR-3174上调RBFOX2表达，RBFOX2的表达水平与circB3GALNT2之间呈正相关。
优选的，所述circB3GALNT2至少具有以下功用：circB3GALNT2通过miR-3171/RBFOX2途径调节结直肠癌细胞的增殖和迁移。
一种诊断或治疗结直肠癌的生物制品，其特征在于，包括所述circB3GALNT2。
优选的，生物制品包括：试剂、试剂盒、芯片。
本申请人通过高通量测序获得circRNAs表达谱，筛选出新的结直肠癌转移相关circB3GALNT2；分别敲低和过表达circB3GALNT2，通过体内和体外功能实验研究了circB3GALNT2在结直肠癌增殖和转移中的生物学功能；随后，通过数据库和基因芯片筛选出潜在的下游靶基因；与邻近正常组织相比，肿瘤组织中circB3GALNT2的表达水平显着上调；体外和体内功能实验表明，敲低circB3GALNT2后，结直肠癌细胞的增殖、迁移和凋亡抑制明显减弱；circB3GALNT2过表达后结直肠癌细胞的增殖、迁移和凋亡促进作用显着增强；机制研究表明，circB3GALNT2可以充当miR-3174的海绵，并通过miR-3174/RBFOX2轴促进结直肠癌进展。
综上所述，circB3GALNT2在结直肠癌的发生发展中起关键作用，是调控结直肠癌细胞增殖和迁移的重要调节因子，有望成为治疗结直肠癌转移的潜在分子靶点。
附图说明
图1为CRC组织中与胃泌素相关的差异性circRNAs的RNA测序分析谱；其中：
图1A为高胃泌素表达的肿瘤组织与邻近正常组织之间的circRNAs差异表达的热图；
图1B为高胃泌素表达的肿瘤组织与邻近正常组织之间的circRNAs差异表达的火山图；
图1C为高胃泌素表达的肿瘤组织与邻近正常组织之间的circRNAs差异表达的统计图；
图1D为高胃泌素表达的肿瘤组织与低胃泌素表达的肿瘤组织之间circRNAs的差异表达的热图；
图1E为高胃泌素表达的肿瘤组织与低胃泌素表达的肿瘤组织之间circRNAs的差异表达的火山图；
图1F为高胃泌素表达的肿瘤组织与低胃泌素表达的肿瘤组织之间circRNAs的的统计图；
图1G为高胃泌素水平患者的肿瘤组织和低胃泌素水平患者的肿瘤组织之间的circRNAs差异表达谱；
图1H为高胃泌素水平患者的肿瘤组织和低胃泌素水平患者的肿瘤组织之间的circRNAs的统计图。
图2为circB3GALNT2表达分析图谱；其中：
图2A为3个明显上调的circRNAs表达差异统计图，其中circB3GALNT2的表达差异最为明显；
图2B为结直肠癌患者的肿瘤组织和邻近正常组织中circB3GALNT2的表达分析图谱；
图2C为circB3GALNT2在直肠癌细胞和正常结肠粘膜上皮细胞中的表达分析图谱；
图2D为Sanger测序证实了cirCB3GALNT2的环形结构示意图；
图2E为用RNase R测试了circB3GALNT2的稳定性的示意图，结果显示它对RNase R具有抗性；
图2F为通过第一种琼脂糖凝胶电泳方法验证了circB3GALNT2的环形结构；
图2G为通过第二种琼脂糖凝胶电泳方法验证了circB3GALNT2的环形结构；
图2H为对胃泌素和circB3GALNT2进行了过表达统计图，其中，过表达胃泌素后circB3GALNT2的水平明显增加；但过表达circB3GALNT2后胃泌素的水平并没有明显变化；
图2I为荧光原位杂交确定circB3GALNT2在细胞质中的定位示意图。
图3为敲低circB3GALNT2表达进行功能缺失实验图谱，其中：
图3A为三种siRNA在结直肠癌细胞中的转染效率的统计图；
图3B为CCK-8实验证实circB3GALNT2的下调显著抑制了SW480和HCT116细胞的增殖活性的统计图；
图3C为EdU实验证实circB3GALNT2的下调显著抑制了SW480和HCT116细胞的增殖活性的统计图；
图3D为Transwell实验以及细胞划痕实验检测了siRNAs转染后的细胞迁移统计图；
图3E为细胞划痕实验检测了siRNAs转染后的细胞迁移统计图，结果表明在细胞中敲除cirCB3GALNT2后，明显抑制了SW480和HCT116细胞的迁移能力；
图3F为circB3GALNT2对结直肠癌细胞的凋亡的统计图，其中抑制circB3GALNT2的表达明显增加了结直肠癌细胞的凋亡率。
图4为敲除、过表达cirB3GALNT2的SW480细胞及其阴性对照的细胞，于BALB/C裸鼠的右腹股沟区域进行皮下注射实验的统计图，其中：
图4A为三组实验组肿瘤实物大小实物图；
图4B为三组实验组肿瘤生长阶段体积统计图；
图4C为三组实验组肿瘤生长阶段重量统计图；
图4D为三组实验组免疫组织化学染色检测裸鼠肿瘤中相关增殖指标的变化。
图5为circB3GALNT2在结直肠癌细胞增殖和迁移中的潜在机制实验的统计图，其中：
图5A为与circB3GALNT2结合的下游miRNA与基因芯片筛选的胃泌素相关性的统计图；
图5B为使用Cytoscape软件进行生物信息学分析，基于circB3GALNT2构建了circRNA-miRNA-mRNA的相互作用图；
图5C为RIP实验中抗AGO2的统计图，其中AGO2组的circB3GALNT2的富集率明显高于IgG组；
图5D为靶向circB3GALNT2的生物素标记探针进行miRNA下拉实验的统计图，其中，在SW480细胞中，miR-3174与其他miRNA相比具有更为显著的下拉水平；
图5E为circB3GALNT2和miR-3174之间的潜在结合位点的示意图；
图5F为在SW480细胞中进行了双荧光素酶报告基因实验的统计图，其中，miR-3174模拟物明显降低了circB3GALNT2-WT组的荧光素酶活性，但对circB3GALNT2-MUT组没有影响；
图5G为结直肠癌患者标本中miR-3174的表达水平统计图，其中，miR-3174在肿瘤组织中的表达明显低于癌旁正常组织；
图5H为Spearman相关系数分析统计图，其中，miR-3174和circB3GALNT2在结直肠癌组织中的表达呈显著负相关。
图6为miR-3174功能验证实验的统计图，其中：
图6A为miR-3174在SW480细胞组进行增值验证实验与NC组对比的对比图；
图6B为miR-3174在SW480细胞组和HCT116细胞组进行增值验证实验与NC组对比的统计图；
图6C为miR-3174在HCT116细胞组进行增值验证实验与NC组对比的对比图；
图6D为miR-3174在SW480细胞组和HCT116细胞组进行增值验证实验与NC组对比的分析图；
图6E为过表达miR-3174在SW480细胞组和HCT116细胞组以及NC组Transwell实验的对比图；
图6F为过表达miR-3174在HCT116细胞组以及NC组细胞划痕实验的对比图；
图6G为过表达miR-3174在SW480细胞组和HCT116细胞组以及NC组Transwell实验的统计图；
图6H为过表达miR-3174在SW480细胞组以及NC组细胞划痕实验的对比图；
图6I为采用流式细胞术检测过表达miR-3174在SW480细胞组以及NC组实验的火山图；
图6J为采用流式细胞术检测过表达miR-3174在SW480细胞组和HCT116细胞组以及NC组实验的统计图；
图6K采用流式细胞术检测过表达miR-3174在HCT116细胞组以及NC组实验的火山图。
图7为miR-3174的下游靶基因验证实验统计图，其中：
图7A为miR-3174下游靶基因进行预测分布图；
图7B为在SW480细胞组和NC组下调circB3GALNT2的表达，miR-3174下游靶基因表达图，其中，RBFOX2的水平显著下调，而其他三个靶蛋白没有显著变化；
图7C为在HCT116细胞组和NC组下调circB3GALNT2的表达，miR-3174下游靶基因表达图，其中，RBFOX2的水平显著下调，而其他三个靶蛋白没有显著变化；
图7D为miR-3174和下游靶基因RBFOX2的预测结合位点显示图；
图7E为双荧光素酶报告实验团统计图，其中，miR-3174模拟物显著降低了RBFOX23‘UTR WT质粒的荧光素酶活性，但对MUP质粒的相对荧光素酶活性没有明显影响；
图7F为qRT-PCR实验团统计图，其中，miR-3174的表达与RBFOX2的表达呈明显负相关；
图7G为结直肠癌患者组织中的RBFOX2的表达水平的统计图，其中，RBFOX2在肿瘤组织中的表达水平明显高于正常组织；
图7H为结直肠癌患者组织中的RBFOX2的表达水平的分析图，其中，且RBFOX2的表达水平与circB3GALNT2之间呈显著正相关。
图8为验证circB3GALNT2/miR-3174/RBFOX2轴的回复实验图谱，其中：
图8A为在SW480细胞中使用miR-3174抑制剂逆转了circB3GALNT2的抑制作用的表达的分析图；
图8B为在SW480细胞中使用miR-3174抑制剂逆转了circB3GALNT2的抑制作用的表达图；
图8C为在SW480细胞中使用miR-3174抑制剂逆转了circB3GALNT2的抑制作用的表达的统计图；
图8D为细胞划痕实验的表达图，其中，miR-3174抑制剂可以回复circB3GALNT2敲除后结直肠癌細胞的迁移能力；
图8E为Western Blotting验证实验的表达图，其中，circB3GALNT2基因敲除后miR-3174抑制剂对结直肠癌细胞相关蛋白的抑制作用；
图8F为细胞Transwell的表达图，其中，结直肠癌细胞中circB3GALNT2基因敲除后，RBFOX2蛋白、凋亡相关蛋白Bax、Casepase3、CyclinD1和MMP2的表达水平降低，而miR-3174则可以逆转这一影响；
图8G为细胞流式细胞术的表达图，其中，miR-3174抑制剂可以减弱circB3GALNT2敲除后结直肠癌细胞的凋亡效应。
图9为过表达RBFOX2可以回复circB3GALNT2基因敲除后对结直肠癌细胞的抑制作用验证实验图谱，其中：
图9A为在SW480细胞中还进行了RBFOX2对circB3GALNT2的回复实验的EdU检测图，其中，过表达RBFOX2可以恢复circB3GALNT2基因敲除对结直肠癌细胞增殖活性的抑制作用；
图9B为为在SW480细胞中还进行了RBFOX2对circB3GALNT2的回复实验的CCK-8检测图，其中，过表达RBFOX2可以恢复circB3GALNT2基因敲除对结直肠癌细胞增殖活性的抑制作用；
图9C为细胞划痕实验的表达图，其中，过表达RBFOX2可以回复circB3GALNT2基因敲除后结直肠癌细胞的迁移能；
图9D为Western blotting实验的表达图，其中，circB3GALNT2基因敲除后，结直肠癌细胞中RBFOX2蛋白、凋亡相关蛋白Bax、Casepase3、CyclinD1和MMP2的表达水平降低，而这一效应可以通过过表达RBFOX2；
图9E为细胞Transwell的表达图，其中，过表达RBFOX2可以回复circB3GALNT2基因敲除后结直肠癌细胞的迁移能；
图9F为细胞凋亡实验的表达图，其中，过表达RBFOX2可以削弱circB3GALNT2基因敲除后结直肠癌细胞的凋亡效应。
图10为circB3GALNT2成环接头图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例一：
进行RNA测序分析结直肠癌组织中与侵袭转移相关的差异性circRNAs谱；为获得与高胃泌素表达和侵袭转移相关circRNAs的表达谱，并确定CRC中差异表达的circRNAs，我们用qRT-PCR检测了我院接受手术治疗的40例CRC患者的胃泌素表达水平。
我们分别选择了3名胃泌素水平高的患者的肿瘤组织和邻近的正常组织以及3名胃泌素水平低的患者的肿瘤组织；
如图1G，通过高通量测序检测出高胃泌素水平表达患者的肿瘤组织和邻近正常组织之间的circRNAs差异表达谱group1，高胃泌素水平患者的肿瘤组织和低胃泌素水平患者的肿瘤组织之间的circRNAs差异表达谱group2。
首先，热图和火山图提示了高胃泌素表达的肿瘤组织与邻近正常组织之间的circRNAs差异表达,如图1A和B所示，以及高胃泌素表达的肿瘤组织与低胃泌素表达的肿瘤组织之间circRNAs的差异表达，如图1D和E所示。
第一组包含544个差异表达的circRNAs，包括118个明显上调的基因和426个下调的基因，如图1C所示，第二组则有356个差异表达的circRNAs，其中283个明显上调，73个明显下调,如图1F所示。
两组测序结果的交集显示，有62个基因在两组测序结果中存在差异表达，其中只有3个circRNAs在两组中都显著上调，21个基因在两组中都下调，如图1G和H所示。
实施例二：
为了验证测序结果，我们选择了3个明显上调的circRNAs并通过qRT-PCR验证了它们在20对结直肠癌组织和邻近正常组织中的表达水平。
如图2A所示，结果显示，三个cirCRNAs在肿瘤组织中的表达水平明显高于邻近的正常组织，其中circB3GALNT2的表达差异最为明显。
因此，我们后续将着重研究circB3GALNT2。通过继续扩大样本量，如图2B所示,验证了40名结直肠癌患者的肿瘤组织和邻近正常组织中circB3GALNT2的表达水平，这与测序结果也是一致的。
为了验证circB3GALNT2在细胞中的表达水平，我们检测了circB3GALNT2在6个结直肠癌细胞和正常结肠粘膜上皮细胞中的表达水平，如图2C所示,结果显示，在SW480和HCT116细胞中表达水平最高。
如图2D所示,我们用Sanger测序证实了CirCB3GALNT2的圆形结构，并且用RNase R测试了circB3GALNT2的稳定性,如图2E所示，结果显示它对RNase R具有抗性。
如图2F、G所示,另外，我们还通过两种琼脂糖凝胶电泳方法验证了circB3GALNT2的环形结构。以上所有结果都证实了circB3GALNT2比B3GALNT2 mRNA更稳定。
随后我们分别对胃泌素和circB3GALNT2进行了过表达，并检测了胃泌素和circB3GALNT2的表达水平的变化，以验证胃泌素和circB3GALNT2之间的关系。
如图2H所示,结果显示，过表达胃泌素后circB3GALNT2的水平明显增加；但过表达circB3GALNT2后胃泌素的水平并没有明显变化。因此我们推测，胃沁素可以正向调节circB3GALNT2的表达。RNA荧光原位杂交(FISH)结果表明circB3GALNT2主要定位于细胞质中。故在本研究中，我们将重点研究circB3GALNT2在结直肠癌发展中的作用。
circB3GALNT2即circ0017065的序列如下：
ATCAGTTGGCCTTATTTCCTCAGTGGAAATCTACTCACTATGATGTGGTAGTTGGCGTGTTGTCAGCTCGCAATAACCATGAACTTCGAAACGTGATAAGAAGCACCTGGATGAGACATTTGCTACAGCATCCCACATTAAGTCAACGTGTGCTTGTGAAGTTCATAATAGGTGCTCATGGCTGTGAAGTGCCTGTGGAAGACAGGGAAGATCCTTATTCCTGTAAACTACTCAACATCACAAATCCAGTTTTGAATCAGGAAATTGAAGCGTTCAGTCTGTCCGAAGACACTTCATCGGGGCTGCCTGAGGATCGAGTTGTCAGCGTGAGTTTCCGAGTTCTCTACCCCATCGTTATTACCAGTCTTGGAGTGTTCTACGATGCCAATGATGTGGGTTTCCAGAGGAACATCACTGTCAAACTTTATCAGGCAGAACAAGAGGAGGCCCTCTTCATTGCTCGCTTCAGTCCTCCAAGCTGTGGTGTGCAGGTGAACAAGCTGTGGTACAAGCCCGTGGAACAATTCATCTTACCAGAGAGCTTTGAAGGTACAATCGTGTGGGAGAGCCAAGACCTCCACGGCCTTGTGTCAAGAAATCTCCACAAAGTGACAGTGAATGATGGAGGGGGAGTTCTCAGAGTCATTACAGCTGGGGAGGGTGCATTGCCTCATGAATTCTTGGAAGGTGTGGAGGGAGTTGCAGGTGGTTTTATATATACTA。
而circB3GALNT2成环接头处如图10所示。
实施例三：
为了探索circB3GALNT2在结直肠癌细胞中的功能，我们首先设计了三种类型的siRNAs靶向后拼接区。然后，在circB3GALNT2表达相对较高的SW480和HCT116细胞中进行功能缺失实验。
3个siRNA转染后，si-1显著降低了两个细胞系中cirCB3GALNT2的表达,如图3A所示。CCK-8和EdU实验证实circB3GALNT2的下调显著抑制了SW480和HCT116细胞的增殖活性,如图3B、C所示。
同时我们使用Transwell实验以及细胞划痕实验检测了siRNAs转染后的细胞迁移，结果表明在细胞中敲除cirCB3GALNT2后，明显抑制了SW480和HCT116细胞的迁移能力,如图3D、E所示。
我们进一步又通过流式細胞仪研究了circB3GALNT2对结直肠癌细胞的凋亡是否有影响。Annexin-V/PI双染结果显示，circB3GALNT2的下调显著促进了细胞的凋亡,如图3F所示。这些结果表明circB3GALNT2可以在体外影响结直肠癌细胞的增殖和迁移。
实施例四：
为了研究circB3GALNT2在体内的作用，我们分别选择了敲除、过表达cirB3GALNT2的SW480细胞及其阴性对照的细胞，于BALB/C裸鼠的右腹股沟区域进行皮下注射。每隔三天观察并记录裸鼠的移植瘤体积和重量的变化，在第30天处死裸鼠并取得肿瘤。
如图4A、B、C所示，实验结果显示，注射敲除circB3GALNT2细胞的裸鼠组肿瘤的体积和重量明显小于对照组；而注射过表达circ B3GALNT2细胞的裸鼠组肿瘤的体积和重量明显高于正常阴性对照组。
我们用免疫组化染色检测了两组肿瘤组织中PCNA和靶蛋白RBFOX2的表达水平。结果显示，与正常阴性对照组相比，circB3GALNT2过表达组的肿瘤组织中PCNA和RBFOX2的表达水平显著升高，而circB3GALNT2敲除组的肿瘤组织中PCNA和RBFOX2的表达水平则明显下降，如图4D所示。因此我们可以得出胃泌素相关的circB3GALNT2的表达水平下调可以显著抑制结直肠癌细胞在体内的生长。
实施例五：
大多数研究人员对circRNA作为miRNA海绵的生物学功能已经认识的很清楚了。为了探索circB3GALNT2在结直肠癌细胞增殖中的潜在机制，我们利用生物预测网站预测了6个可能与circB3GALNT2结合的下游miRNA，其中有5个与我们之前基因芯片筛选的胃泌素相关miRNA的结果一致,如图5A所示。我们使用Cytoscape软件进行生物信息学分析，基于circB3GALNT2构建了circRNA-miRNA-mRNA的相互作用图,如图5B所示。
为了验证circB3GALNT2是否可以作为miRNA海绵，我们进行了RIP实验。已经有大量研究表明，miRNA主要以依赖AGO2的方式抑制翻译以及降解mRNA。
因此，为了验证这一假设，我们在SW480和HCT116细胞中检测了抗AGO2。如图5C所示，AGO2组的circB3GALNT2的富集率明显高于IgG组。我们靶向circB3GALNT2的生物素标记探针进行miRNA下拉实验，以确定五个预测的miRNA与circB3GALNT2的结合能力。
结果表明在SW480细胞中，miR-3174与其他miRNA相比具有更为显著的下拉水平,如图5D所示。之后我们通过TargetScan网站(http:/www.targe scan.org/)的生物学分析，找到了circB3GALNT2和miR-3174之间的潜在结合位点,如图5E所示。
在此基础上，我们构建了一个荧光素酶载体，该载体含有一个潜在的位点和circB3GALNT2的miR-3174结合位点突变体。我们在SW480细胞中进行了双荧光素酶报告基因实验，结果表明miR-3174模拟物明显降低了circB3GALNT2-WT组的荧光素酶活性，但对circB3GALNT2-MUT组没有影响,如图5F所示。
在此基础上，我们检测了40对结直肠癌患者标本中miR-3174的表达水平，结果表明，miR-3174在肿瘤组织中的表达明显低于癌旁正常组织,如图5G所示。Spearman相关系数分析也显示，miR-3174和circB3GALNT2在结直肠癌组织中的表达呈显著负相关(R＝-0.3329，P＝0.0421),如图5H所示。综上所述，circB3GALNT2可作为miR-3174的海绵发挥生物学作用。
实施例六：
为了验证miR-3174在结直肠癌发生发展中的生物学功能，我们用miR-3174模拟物转染SW480和HCT116细胞，48小时后进行細胞功能实验。我们分别进行了EdU和CCK-8实验验证miR-3174对结直肠癌细胞的增殖作用。
实验表明，与NC组相比，转染miR-3174模拟物组的增殖细胞数量显著减少,如图6A、B、C、D所示。Transwell实验和细胞划痕实验显示，与NC组相比，过表达miR-3174显著降低了结直肠癌细胞的迁移能力，如图6E、F、G、H所示。此外，细凋亡实验也证实，过表达miR-3174可以促进细胞凋亡,如图6I、J、K所示。
实施例七：
为了确定和识别miR-3174的下游靶点，我们使用miRDB(http://mirdb.org/cgi-bin/search.cgi)和TargetScan(http://www.Targetscan.org/)对下游靶基因进行预测，共预测出四个靶点,如图7A所示。
随后我们下调了circB3GALNT2的表达，只有RBFOX2的水平显著下调，而其他三个靶蛋白没有显著变化,如图7B、C所示。基于此，我们推测RBFOX2是circB3GALNT2的下游靶基因。
如图7D所示，miR-3174和下游靶基因RBFOX2的预测结合位点。
为了证实我们的猜想，我们再次进行了双荧光素酶报告实验，结果表明，miR-3174模拟物显著降低了RBFOX23‘UTR WT质粒的荧光素酶活性，但对MUP质粒的相对荧光素酶活性没有明显影响,如图7E所示。
值得关注的是，我们之后通过qRT-PCR证实，miR-3174的表达与RBFOX2的表达呈明显负相关,如图7F所示。随后，我们再次检测了40对结直肠癌患者组织中的RBFOX2的表达水平，结果表明RBFOX2在肿瘤组织中的表达水平明显高于正常组织，且RBFOX2的表达水平与circB3GALNT2之间呈显著正相关,如图7G、H所示。
实施例八：
我们进行了回复实验以研究胃泌素相关的circB3GALNT2/miR-3174/RBFOX2在结直肠癌发生发展中的作用。
在SW480细胞中，使用miR-3174抑制剂逆转了circB3GALNT2的抑制作用。EdU实验和CCK-8实验表明，miR-3174抑制剂可以恢复circB3GALNT2敲除对结直肠癌细胞增殖活性的抑制作用，如图8A、B、C所示。细胞划痕实验和Transwell实验表明，miR-3174抑制剂可以回复circB3GALNT2敲除后结直肠癌細胞的迁移能力，如图8D、F所示。凋亡实验表明，miR-3174抑制剂可以减弱circB3GALNT2敲除后结直肠癌细胞的凋亡效应，如图8G所示。Westernblotting分析显示，结直肠癌细胞中circB3GALNT2基因敲除后，RBFOX2蛋白、凋亡相关蛋白Bax、Casepase3、CyclinD1和MMP2的表达水平降低，而miR-3174则可以逆转这一影响,如图8E所示。综上所述，胃泌素相关的circB3GALNT2基因可通过miR-3174介导RBFOX2促进结直肠癌的恶性行为。
实施例九：
综上，我们验证了miR-3174可以恢复circB3GALNT2基因敲除对细胞增殖、迁移和凋亡的影响。
随后，我们在SW480细胞中还进行了RBFOX2对circB3GALNT2的回复实验。EdU和CCK-8检测表明，过表达RBFOX2可以恢复circB3GALNT2基因敲除对结直肠癌细胞增殖活性的抑制作用,如图9A、B所示。细胞划痕实验和Transwell试验证实，过表达RBFOX2可以回复circB3GALNT2基因敲除后结直肠癌细胞的迁移能力,如图9C、E所示。Western blotting分析显示，circB3GALNT2基因敲除后，结直肠癌细胞中RBFOX2蛋白、凋亡相关蛋白Bax、Casepase3、CyclinD1和MMP2的表达水平降低，而这一效应可以通过过表达RBFOX2,如图9D所示来逆转。
此外，凋亡实验表明，过表达RBFOX2可以削弱circB3GALNT2基因敲除后结直肠癌细胞的凋亡效应,如图9F所示。上述实验均表明，胃泌素相关的circB3GALNT2可通过miR-3171/RBFOX2途径调节结直肠癌细胞的增殖。
实施例十：
患者群体及临床资料
2020年1月至2021年2月在皖南医学院第一附属医院胃肠外科接受根治性手术的患者共获得40例结直肠癌组织及正常癌旁组织。组织标本采集自我院接受结直肠手术的患者。将组织样本放入装有RNAlater的冻存管中，快速储存在液氮中，直至提取RNA。所有患者术前均未接受放疗或化疗，均签署了手术知情同意书。本标本的使用已告知患者及其家属，并已征得同意。本实验经皖南医学院伦理委员会批准。
实施例十一：
RNA提取和定量实时PCR(qRT-PCR)
根据制造商的说明，使用TRIzol试剂(Invitrogen，Thermo Fisher Scientific)从组织和细胞中提取总RNA。对于miRNA，通过SYBR Green定量实时PCR(qPCR)确定表达。对于circRNA和mRNA，将总RNA逆转录为cDNA(RT)，然后使用SYBR Green PCR Kit(Takara,Otsu,Japan)进行qPCR。所有引物序列均由RiboBio(Guangzhou，China)设计和合成(所有引物序列见附录)。选择GAPDH作为为circRNA和mRNA的内参基因。选择U6作为miRNA的interRNA对照。使用2–△△Ct对基因表达进行量化。每组数据设置三个复孔，取平均值。GAPDH、RBFOX2和circB3GALNT2引物设计如下：
h-GAST_F1 ATGCAGCGACTATGTGTGTATG
h-GAST_R1 GCCCCTGTACCTAAGGGTG
h-RBFOX2_qPCR_116bp_F1 ACCAGGAGCCGACAACAACT
h-RBFOX2_qPCR_116bp_R1 GTCTTGAGTGTGTGGCACCC
hsa_circB3GALNT2_qPCR_149bp_F1 TCTCCACAAAGTGACAGTGAATGA
hsa_circB3GALNT2_qPCR_149bp_R1 GAAATAAGGCCAACTGATCCTGA。
实施例十二：
RNA测序
根据制造商的说明,用Trizol法提取组织样品,用K5500和Agilent 2200TapeStation对样品进行检验。首先去除核糖体RNA和线性RNA，然后富集circRNA。样品被分割后，依次合成和纯化第一链和第二链cDNA，然后在修复端和5′端增加3′多聚(A)尾。上述过程完成后，用qRT-PCR进行扩增和纯化，Agilent 2200 TapeStation用于文库质量检验。按照用户指南中对应的Illumina平台仪器中描述的方法，将通过检查的文库使用计算机运行成对端标准测序程序。测序项目运行后,进行生物信息学分析获得的数据。
实施例十三：
细胞培养
四种人类结直肠癌细胞(HT29、HCT116、SW480、lovos)，以及从Genechem购买(ShangHai，China)的正常结肠黏膜上皮细胞系(NCM460)。这些细胞在包含100μg/ml链霉素，细胞在100U/ml青霉素和10％胎牛血清(FBS，Gibco，NY，USA)的DMEM培养基，37℃和5％CO2的潮湿环境中培养。
实施例十四：
Transwell实验
根据制造商的说明(BD Biosciences,Bedford,MA,USA)，将5×104单细胞悬液和200μL无血清培养基接种到上层小室，下层加入500μL含有10％FBS的培养基。孵育36小时后，用棉签擦去小室上表面的细胞，下表面的细胞用PBS清洗两次，4％多聚甲醛固定30分钟，室温下用结晶紫(Sigma，MO，USA)染色10分钟，在显微镜下对细胞拍照。每组设置3个子孔，通过计算至少5个随机细胞场来计算迁移率。
实施例十五：
划痕实验
划痕实验用于验证结直肠癌细胞的迁移能力。简而言之，转染的细胞和对照组在6孔板中培养，当细胞达到100％铺满时，随后用1000μL移液管尖端刮伤细胞单层。48小时后分别观察到转染细胞和对照的细胞划痕愈合情况。每组重复实验三次。
实施例十六：
细胞凋亡实验
按照厂家说明，使用Tandem Protein V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(KeyGenBiotech，NanJing，China)。转染48h后收集细胞，用75％冷乙醇固定，在4℃储存过夜。结直肠癌细胞用Tandem Protein V-FITC和PI染色。采用荧光激活细胞分选流式细胞仪(BDBiosciences)定量检测细胞凋亡率，并分析对照组和实验组细胞的凋亡率。实验重复3次。
实施例十七：
EdU
按照厂家说明，转染48h后，实验组和对照组细胞分别以8×103个细胞/孔接种于96孔板中，用EdU标记孵育2h，4％多聚甲醛固定30min，2mg/mL甘氨酸固定。添加渗透剂(0.5％TRiton X-100PBS)，摇床孵育10分钟。进行Apollo染色并在摇床上室温、避光孵育30min。DAPI染色，室温孵育30min，荧光显微镜观察。每组重复实验3次，随机拍摄5个视野。
实施例十八：
细胞周期检测
根据制造商的说明对结直肠癌细胞进行预处理，收集贴壁和漂浮的细胞，使用PIDNA染色分析对照细胞与实验细胞相比的细胞周期变化。
实施例十九：
CCK-8
根据制造商的说明，使用CCK-8试剂(Dojindo Laboratories，Kumamoto，Japan)检测细胞增殖。将共100μL含有2×103结直肠癌细胞的DMEM培养基接种到96孔板上。在24h，48h，72h，96h和118h，将10μLCCK-8溶液添加到96个空板中。在37℃下孵育2小时后，测量并记录在450nm处的吸光度。实验重复三次。
实施例二十：
RNA pull-down和RIP实验
在SW480和HCT116细胞中进行了RNA蛋白免疫沉淀(RIP)实验。首先，用RNA裂解物完全裂解1x107细胞，并用与AGO2抗体(ABCAM，#AB186733)结合的磁珠在免疫沉淀缓冲液(Millipore，USA)或阴性对照小鼠IgG(Millipore，USA)中孵育。RIP样品加入蛋白酶K，在55℃下孵育30分钟。获得免疫沉淀的RNA后，通过QRT-PCR分析circB3GALNT2的富集度。
实施例二十一：
荧光原位杂交(FISH)
使用荧光原位杂交试剂盒(Genepharma,Shanghai,China)测定RNA荧光原位杂交。circB3GALNT2和miR-3174探针由Genepharma公司设计和合成。circB3GALNT2探针用Cy3标记，miR-3174探针用Dig标记。按照荧光原位杂交试剂盒说明书完成实验步骤后，用共聚焦显微镜观察荧光并拍照。
实施例二十二：
荧光素酶报告基因检测
通过targetscan和PicTar位点对目的基因miR-3174进行预测和分析。由RiboBio(Guangzhou，China)设计和合成报告质粒。根据制造商的说明，首先将结直肠癌细胞(每孔5×105个细胞)接种到24孔板中，然后使用Lipofectamine 3000试剂将相应的报告质粒和miRNA模拟物或阴性对照加入到24孔板中。共转染48h后，使用双荧光素酶报告基因检测系统(Promega，Madison，MA，USA)检测荧光素酶活性。实验重复三次。
实施例二十三：
抗体和Western Blot
在RIPA和PMSF(100:1混合物)裂解缓冲液中裂解SW480和HCT116细胞。然后通过SDS-PAGE分析等量分离蛋白质并转移到PVDF膜上(Millipore，Schwalbach，Germany)，5％脱脂奶粉密封2小时，并在4℃下与一抗孵育过夜。RBFOX2(#AB57154,Abcam)，Caepese3(#AB39675,Abcam)，cyclinD1(#4267,Cell Signaling Technology)，anti-Bax(#66281-IG,Proteintech)，anti-GAPDH(#AB181602,Abcam)，然后将anti-MMP2(#40994,CST)与HRP标记的二抗在室温下孵育1h，并使用曝光试剂盒(Pierce,Waltham,MA,USA)观察印迹。
实施例二十四：
免疫组化
肿瘤标本用多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片脱蜡，并按说明染色。使用PANC的一抗(#GB11010,gibco)和抗FOX2/RBM9抗体(#AB57154,Abcam)。复合物用DAB染色，细胞核用苏木精染色。用苏木精染色的细胞核呈蓝色。DAB阳性表达呈棕黄色。所有切片均采用半定量H-score法评分，在显微镜下观察并拍照。
实施例二十五：
异种移植肿瘤模型
向BALB/C裸鼠(雌性，3-4周龄)皮下注射1×107SW480细胞。每3天用卡尺测量肿瘤体积，并使用以下公式从长度(a)和宽度(b)计算：体积(mm3)＝AB 2/2。注射后30d处死动物，取出肿瘤组织用于评估肿瘤重量和病理染色。
实施例二十六：
统计分析
GraphPad Prism8.0(GraphPad Software Inc.,CA,USA)用于统计分析。采用t检验和单因素方差分析用于比较组间的差异。通过Pearson相关分析分析组间的相关性。数据以平均值±标准差(SD)表示，P<0.05被认为具有统计学意义。统计学意义表示如下：****p<0.0001,***p<0.001,**p<0.01,*p<0.05。
综上所述：
通过高通量测序获得circRNAs表达谱，筛选出新的结直肠癌转移相关circB3GALNT2；分别敲低和过表达circB3GALNT2，通过体内和体外功能实验研究了circB3GALNT2在结直肠癌进展中的生物学功能；随后，通过数据库和基因芯片筛选出潜在的下游靶基因；与邻近正常组织相比，肿瘤组织中circB3GALNT2的表达水平显着上调；体外和体内功能实验表明，敲低circB3GALNT2后，结直肠癌细胞的增殖、迁移和凋亡抑制明显减弱；circB3GALNT2过表达后结直肠癌细胞的增殖、迁移和凋亡促进作用显着增强；机制研究表明，circB3GALNT2可以充当miR-3174的海绵，并通过miR-3174/RBFOX2轴促进结直肠癌进展，circB3GALNT2在结直肠癌的发生发展中起关键作用，是调控结直肠癌细胞增殖和迁移的重要调节因子，有望成为治疗结直肠癌转移的潜在分子靶点。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的设备或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 皖南医学院第一附属医院（皖南医学院弋矶山医院）
<120> circB3GALNT2在结直肠癌转移预测和治疗中的应用
<130> 2010
<141> 2022-04-01
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 723
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
atcagttggc cttatttcct cagtggaaat ctactcacta tgatgtggta gttggcgtgt 60
tgtcagctcg caataaccat gaacttcgaa acgtgataag aagcacctgg atgagacatt 120
tgctacagca tcccacatta agtcaacgtg tgcttgtgaa gttcataata ggtgctcatg 180
gctgtgaagt gcctgtggaa gacagggaag atccttattc ctgtaaacta ctcaacatca 240
caaatccagt tttgaatcag gaaattgaag cgttcagtct gtccgaagac acttcatcgg 300
ggctgcctga ggatcgagtt gtcagcgtga gtttccgagt tctctacccc atcgttatta 360
ccagtcttgg agtgttctac gatgccaatg atgtgggttt ccagaggaac atcactgtca 420
aactttatca ggcagaacaa gaggaggccc tcttcattgc tcgcttcagt cctccaagct 480
gtggtgtgca ggtgaacaag ctgtggtaca agcccgtgga acaattcatc ttaccagaga 540
gctttgaagg tacaatcgtg tgggagagcc aagacctcca cggccttgtg tcaagaaatc 600
tccacaaagt gacagtgaat gatggagggg gagttctcag agtcattaca gctggggagg 660
gtgcattgcc tcatgaattc ttggaaggtg tggagggagt tgcaggtggt tttatatata 720
cta 723

Claims (1)

1.一种非编码RNA的抑制剂在制备治疗结直肠癌的药物中的应用,其特征在于，所述非编码RNA为circB3GALNT2，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述circB3GALNT2充当miR-3174的海绵，miR-3174和circB3GALNT2 在结直肠癌组织中的表达呈显著负相关；
所述circB3GALNT2竞争性结合miR-3174上调RBFOX2表达，RBFOX2的表达水平与circB3GALNT2之间呈正相关；
所述circB3GALNT2至少具有以下功用：circB3GALNT2通过miR-3171/RBFOX2途径调节结直肠癌细胞的增殖和迁移。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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GR01 Patent grant
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