CN112147331B - 基于DDX24及其上下游分子RFX8和Lamb1对肝细胞性肝癌诊断和治疗的应用 - Google Patents

基于DDX24及其上下游分子RFX8和Lamb1对肝细胞性肝癌诊断和治疗的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药产品技术领域，具体涉及基于DDX24及其上下游分子RFX8和Lamb1对肝细胞性肝癌诊断和治疗的应用。本发明研究发现与癌旁正常组织相比，原发性肝癌组织中DDX24表达水平升高，且升高水平与肿瘤大小相关。生存分析显示，RFX8可在转录水平上调DDX24表达，miR‑526a‑5p可直接结合DDX24的mRNA并对其进行降解。DDX24可通过下游LAMB1通路促进了HCC的发展，该通路的研究有望为HCC的诊疗提供理论基础及实验依据。

Description

基于DDX24及其上下游分子RFX8和Lamb1对肝细胞性肝癌诊断 和治疗的应用
技术领域
本发明涉及医药产品技术领域，更具体地，涉及基于DDX24及其上下游分子RFX8和Lamb1对肝细胞性肝癌诊断和治疗的应用。
背景技术
肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是恶性原发性肝癌中最常见且侵袭性极高的一类肿瘤。尽管近年来HCC的治疗取得了进展，但HCC的复发和转移仍然不可避免，且晚期HCC患者的5年生存率只有25％。因此，研究HCC的发病机制，实现HCC的精准靶向治疗，提高HCC临床预后预测的准确性，改善患者的生存质量是一个巨大的挑战。
DEAD-box家族以保守的Asp-Glu-Ala-Asp(DEAD)基序为特征，是在人类中发现的最大的RNA解旋酶家族，它共包含37个成员。DEAD-box蛋白在包括RNA输出、pre-mRNA剪接、RNA凝结、核糖体生物形成、转录调控和翻译起始等RNA代谢的过程中必不可少，因此DEAD-box蛋白在胚胎形成、精子形成、细胞生长和肿瘤形成等多种生物过程中发挥基本功能。目前的研究表明DEAD-box家族蛋白在癌症中起着重要但不一致的作用。例如，DDX21、DDX31和DDX46在多个的癌症中起促癌作用，而DDX3、DDX10和DDX47则被证明有抑癌作用，这表明DEAD-box家族蛋白在肿瘤的发生发展中表现出复杂的生物学效应，通过研究RNA解旋酶在肿瘤中的作用机制，可为肿瘤的治疗提供新的分子靶点。
作为DEAD-box家族中独特的成员，DDX24蛋白包含有一个氨基酸序列(257-385)，该序列在人类DEAD-box家族的其他成员中并不存在。我们之前的研究发现，DDX24的突变(271位谷氨酸突变为赖氨酸)与“多器官静脉淋巴缺损综合征”(MOVLD)有关，该疾病累及多个器官；现有技术已有披露，DDX24可能通过多种途径参与癌症的发生，在人类多种癌细胞中过表达，这提示人们DDX24可能具有促癌功能，然而现有技术对于DDX24在肿瘤发生发展中的精确作用机制还不明确，以至于缺乏与DDX24可能相关的疾病的研究治疗手段。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术没有明确DDX24在肿瘤发生发展中的精确作用机制，通过研究HCC和DDX24的关系，明确了DDX24在细胞迁徙中起到作用，且其在HCC中表达上调，推测DDX24可能在HCC进展中发挥重要作用，以期为HCC的早期检测、诊断、治疗及预后提供新方法。
本发明的首要目的是提供DDX24基因或其表达产物在开发、筛选肝细胞癌功能产品方面的应用，所述功能产品对DDX24基因或其表达产物具有抑制作用。
本发明的第二个目的是提供对DDX24基因或其表达产物具有抑制作用的功能产品在制备预防或/和缓解或/和治疗肝细胞癌的产品方面的应用。
本发明的第三个目的是提供一种提高肝细胞癌患者临床预后准确率的药盒或试剂盒。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
本发明首先提供DDX24基因或其表达产物在开发、筛选肝细胞癌功能产品方面的应用，所述功能产品对DDX24基因或其表达产物具有抑制作用。
本发明还提供对DDX24基因或其表达产物具有抑制作用的功能产品在制备预防或/和缓解或/和治疗肝细胞癌的产品方面的应用。
本发明鉴定了DDX24是一种促进HCC的发生发展的蛋白。在HCC组织中DDX24高表达与预后不良相关。在体内外抑制DDX24的表达均能抑制肝癌的生长和转移。我们还发现，DDX24蛋白与LAMB1的mRNA结合并使其稳定，LAMB1的mRNA可通过ERK/AKT和EMT信号通路促进HCC的生长和转移。另还还进一步发现DDX24是RFX8的下游靶点，RFX8与DDX24启动子结合，增强了DDX24的转录活性，导致DDX24在HCC中的表达上调。总之，我们的结果表明DDX24在HCC中是促瘤因子，是HCC潜在的预后指标和治疗靶点。
优选的，所述功能产品为能够对肝细胞癌的发生、发展产生治疗、缓解、抑制、调节的有益作用的产品。
更优选的，所述功能产品具有下调DDX24基因的表达、转录、或其表达产物的功能。
另外，本发明研究还发现高表达DDX24的患者更容易合并肿瘤复发和肝硬化结节，因此，优选的，所述功能产品还能够用于降低肝细胞癌的合并疾病的发生率；所述肝细胞癌的合并疾病包括肿瘤复发和肝硬化结节。
本发明通过研究发现：与DDX24表达相关的细胞功能改变包括细胞的生长和运动，本发明还运用DDX24特异性短发夹结构RNAs分别在肝癌细胞中瞬时敲除DDX24并进行了体外细胞迁移和侵袭实验，结果显示敲低DDX24可以抑制肝癌细胞的迁移和侵袭；因此，优选的，利用对DDX24基因或其表达产物具有抑制作用的功能产品，可以抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。
本发明另外通过构建异种移植小鼠模型，观察发现，降低DDX24的表达可以显著抑制皮下肿瘤的大小和重量。因此，优选的，所述功能产品用于抑制肝细胞癌的生长和转移。
更优选的，所述功能产品包括：DDX24核酸抑制剂，DDX24蛋白抑制剂，DDX24基因缺陷或沉默的免疫相关细胞、其分化细胞或者基因重组构建体中的一种或多种。
本发明通过研究DDX24与HCC的发生发展的关系，明确了DDX24对HCC的作用机制，具体的，研究发现：DDX24蛋白与LAMB1的mRNA结合并能增加其稳定性进而影响HCC细胞的增殖、迁移和侵袭作用，即LAMB1是DDX24的下游靶点，且LAMB1的表达与DDX24正相关，功能研究发现，通过下调DDX24对HCC细胞迁移、侵袭和生长的抑制作用可部分被LAMB1过表达挽救。
对DDX24上游调节机制研究发现RFX8可结合在DDX24启动子并在转录水平上调DDX24的表达，即RFX8是DDX24的下游靶点，且RFX8的表达与DDX24的启动子的活性正相关，功能研究发现，敲低RFX8抑制了HCC细胞的迁移、侵袭和增殖，另一方面，过表达DDX24在很大程度上挽救了RFX8敲低引起的细胞功能抑制。
因此，通过抑制DDX24/LAMB1/RFX8，可以实现对DDX24基因或其表达产物的抑制作用。
因此，更优选的，所述功能产品包括以下任一种：
(i)以DDX24/LAMB1/RFX8或DDX24/LAMB1/RFX8转录本为靶序列，且能够抑制DDX24/LAMB1/RFX8基因表达产物的表达或基因转录的小干扰RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸；
(ii)能表达或形成(i)中所述小干扰RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸构建体；
(iii)含有DDX24/LAMB1/RFX8或DDX24/LAMB1/RFX8互补序列，且能够在转入体内后形成抑制DDX24/LAMB1/RFX8基因表达产物的表达或基因转录的干扰分子的构建体；
(iv)抑制或敲除DDX24/LAMB1/RFX8基因序列后的免疫相关细胞、其分化细胞或构建体。
另外，本发明还对DDX24转录后调控机制进行了研究，发现：只有miR-526a-5p可参与调控HCC细胞的增殖、迁移和增殖；同时，DDX24的下调并不影响miR-526a-5p的表达水平，上述结果说明DDX24基因是miR-526a-5p的新型作用靶点，同时，通过功能研究表明miR-526a-5p可直接靶向结合DDX24并沉默其转录后表达。
因此，优选的，所述功能产品包括：DDX24特异性短发夹结构RNAs、RFX8特异性小干扰RNA、miR-526a-5p。
本发明还验证了RFX8、LAMB1和DDX24在临床转化中的应用，以及它们在预测HCC患者生存率方面的协同作用，统计发现：RFX8、LAMB1、DDX24单因素虽能在一定程度上区分生存曲线，但联合多因素分析可进一步提高预后判断的准确性。同时，RFX8和DDX24共同低表达组，或LAMB1和DDX24共同低表达组的总生存率较共同高表达组更长。更重要的是，三种蛋白(RFX8、DDX24、LAMB1)共同低表达的患者5年生存率是最高的。这些结果表明RFX8、DDX24和LAMB1的联合多因素分析明显提高了检测HCC患者临床预后的准确性。
因此，本发明还提供一种提高肝细胞癌患者临床预后准确率的药盒或试剂盒，所述药盒或试剂盒包括：用于检测RFX8或/和LAMB1或/和DDX24表达水平的物质。
具体的，上述药盒或者试剂盒至少包括以下成分：
(i)用于检测RFX8表达水平的物质；
(ii)用于检测LAMB1表达水平的物质；
(iii)用于检测DDX24表达水平的物质；
(iv)用于检测RFX8和LAMB1表达水平的物质；
(v)用于检测RFX8和DDX24表达水平的物质；
(vi)用于检测LAMB1和DDX24表达水平的物质；
(vii)用于检测RFX8，和LAMB1，和DDX24表达水平的物质。
具体的，上述药盒或者试剂盒的使用过程或者方法为：
(1)获取患者的待测样本；
(2)检测待测样本RFX8或/和LAMB1或/和DDX24的表达水平；
(3)结果判定：将待测样本与正常样本比较，判断RFX8或/和LAMB1或/和DDX24的表达量，当RFX8或/和LAMB1或/和DDX24为低表达时，即明确患者的总生存率比RFX8或/和LAMB1或/和DDX24为高表达时的总生存率长。
优选的，步骤(1)中的待测样本是肝癌患者血液或者穿刺活检组织。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过研究发现与癌旁正常组织相比，原发性肝癌组织中DDX24表达水平升高，且升高水平与肿瘤大小相关。生存分析显示，RFX8可在转录水平上调DDX24表达，miR-526a-5p可直接结合DDX24的mRNA并对其进行降解。DDX24可通过下游LAMB1通路促进了HCC的发展，该通路的研究有望为HCC的诊疗提供理论基础及实验依据。
附图说明
图1为DDX24在肝癌患者中基因表达热图和火山图；1a(热图)和1b(火山图)显示了来自癌症基因组图谱(TCGA)数据库的374个肝细胞患者组织和50个正常肝脏组织的基因表达；1c为差异表达的DEAD-box解旋酶家族基因的基因表达热图；
图2显示DDX24在肝细胞癌组织中表达上调；其中，2a为在癌症基因组图谱(TCGA)数据库中，374例肝细胞癌患者组织和50例正常肝组织中DDX24的表达量；2b为人肝细胞癌组织和相应的非肿瘤肝组织中DDX24免疫组织化学染色的代表性图像(左)、DDX24在11种人类肝细胞癌组织和相应的非肿瘤组织中表达量的统计分析(右)；2c为通过蛋白质印迹检测DDX24蛋白在人肝细胞癌细胞系和人永生化肝细胞系(L02)中的表达量；2d为肝癌细胞中DDX24表达的代表性免疫荧光图像(左；绿色代表DDX24；蓝色代表细胞核)和蛋白质印迹(右)；
图3显示DDX24在肝细胞癌组织中表达与肝细胞癌患者的预后不良有关，3a为DDX24在肝细胞癌组织和相应的非肿瘤组织中的表达量的免疫组织化学结果分析；3b为在有或没有门静脉肿瘤血栓(PVTT)的肝细胞癌组织中DDX24表达量分析；3c-3f分别来自队列d第一组患者，第二组患者，第三组患者和三组患者之和的患者的DDX24表达相关的Kaplan-Meier生存曲线；结果显示为平均值±标准差(SD)；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；配对t检验(3a，3b)和时序检验(3c-3f)；
图4显示DDX24在肝细胞癌中通过EMT信号传导调节细胞迁移，侵袭和肿瘤转移；4a热图显示RNA测序(RNA-seq)的差异表达基因(DEG)；4b为DDX24稳定敲低细胞系(Hep3B)与对照中差异表达基因(DEG)的KEGG通路分析；4c，4d为肝癌细胞用DDX24靶向shRNA(shDDX24-1，shDDX24-2)或对照shRNA(shNC)转染，并进行细胞迁移(4c)和侵袭(4d)实验结构；4e-4g分别使用shRNA(shDDX24-1，shDDX24-2)或对照shRNA(shNC)转染Hep3B细胞，并评估肿瘤转移；使用生物素荧光成像(4e)显示了裸鼠的肺转移；裸鼠的肺组织的代表性图像(4f，左)以及肺组织和肿瘤的HE染色(4f，右)；转移瘤结节的数量在显微镜下计数(4g)；4h免疫荧光法显示DDX24靶向shRNA(shDDX24-1，shDDX24-2)或对照shRNA(shNC)瞬时转染的Hep3B细胞中的细胞骨架蛋白，鬼笔环肽(红色)，DAPI复染(蓝色)。4i为使用蛋白质印迹法分析EMT相关蛋白质分子；结果使用Student’s t检验分析，显示为平均值±标准差，***p<0.001；
图5显示DDX24靶向shRNA使DDX24表达沉默；其中，5a，5b在用DDX24靶向shRNA(shDDX24-1，shDDX24-2)或对照shRNA(shNC)瞬时转染的Hep3B(5a)and SMMC-7721(5b)细胞中，通过qPCR(左)和蛋白质印记(右)检测LAMB1表达水平。***p<0.001，Student’s t检验；
图6显示在肝癌细胞中，DDX24通过ERK/AKT信号传导调节细胞增殖和肿瘤发生；6a，6b用DDX24靶向shRNA(shDDX24-1，shDDX24-2)或对照shRNA(shNC)转染肝癌细胞，并进行细胞存活实验(6a)和菌落形成(6b)；6c-6f分别用shRNA(shDDX24-1，shDDX24-2)或对照shRNA(shNC)转染的Hep3B细胞来源的肿瘤，并皮下注射到BALB/c裸鼠中(6c，6d)，体积(6e)和重量(6f)；6g蛋白质印迹检测敲低DDX24的肝癌细胞中AKT，ERK，p-AKT和p-ERK的表达量；Student’s t检验，结果为平均值±标准差，**p<0.01，***p<0.001；
图7显示DDX24结合并稳定LAMB1以促进肝细胞癌进展；7a为RNA免疫沉淀测序(RIP-seq)的流程图；7b显示RIP-seq富集通路的前20名；7c通过RIP-qPCR验证RIP-seq富集的癌症相关基因(Basemean≥500，IP/input≥2，*p<0.05)；7d-7f为候选基因使用qPCR(7d，7e)和蛋白质印迹(7f)评估DDX24敲低后的表达量；
图8显示DDX24结合并稳定LAMB1以促进肝癌细胞的生长和迁移；8a饼图显示了使用DDX24抗体进行RIP-seq得到的RNA分布；8b，8c在DDX24敲低SMMC-7721细胞中LAMB1的mRNA(8b)和蛋白质(8c)水平；
图9显示DDX24结合并稳定LAMB1以促进肝细胞癌进展；9a，9b为来自TCGA数据库(9a)或HCC组织微阵列(9b)的LAMB1的表达分析；9c为93例患者肝癌组织微阵列中LAMB1和DDX24之间的表达相关性；9d-9f为有或无过表达LAMB1的DDX24敲低Hep3B细胞的细胞迁移(9d)，侵袭(9e)和生存力(9f)分析；9g显示加入放线菌素D后检测LAMB1 mRNA的稳定性；9h蛋白质印迹检测LAMB1敲低肝癌细胞中EMT相关蛋白分子的表达；9i蛋白质印迹检测LAMB1敲低肝癌细胞中AKT，ERK，p-AKT和p-ERK的表达，结果显示为平均值±标准差，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001(Student's t检验)；NS，不显著；
图10显示DDX24结合并稳定LAMB1以促进肝癌细胞的生长和迁移；10a-10c为LAMB1敲低Hep3B细胞迁移(10a)，侵袭(10b)和细胞活力(10c)；10d为有或无过表达LAMB1的DDX24敲低肝癌细胞中LAMB1的表达水平；结果用Student’s t检验，显示为平均值±标准差，***p<0.001；
图11显示肝细胞癌中未发现DDX24基因突变；11a为TCGA数据库中DDX24的突变谱；11b，11c为在四种不同的肝癌细胞系(11b)和七个肝细胞癌患者组织(11c)中对DDX24基因的Sanger测序，显示了部分DDX24 DNA序列；
图12显示在肝癌细胞中RFX8可使DDX24转录上调；12a为5'-生物素标记的DDX24启动子探针(-745至+61)的结构示意图；12b为通过琼脂糖凝胶电泳检测5’-生物素标记的DDX24启动子探针；12c为在三种不同的肝癌细胞系(Hep3B，SUN449和Bel-7402)和人类永生化肝细胞系(L02)中，5’-生物素标记的DDX24启动子探针结合沉淀的靶向蛋白(箭头)SDS-page凝胶检测；12d为MALDI-TOF/TOF质谱法鉴定了DDX24启动子的靶向结合蛋白；质谱上指定的b和y离子峰用相应的m/z值标记；12e为免疫荧光检测RFX8蛋白(绿色)的亚细胞定位；DAPI标记细胞核，鬼笔环肽标记细胞骨架；12f为链霉亲和素-琼脂糖磁珠下拉实验检测肝癌细胞(Hep3B，Bel-7402，SUN449和HepG2)中，与DDX24启动子结合的核蛋白；NSP，非特异性探针；12g为双荧光素酶法检测RFX8敲低肝癌细胞中DDX24启动子的相对活性；12h为DDX24启动子5’端截短报告基因载体构建示意图；12i为双荧光素酶报告基因检测，确定RFX8结合区；12j肝癌细胞抗RFX8抗体或IgG抗体染色质免疫沉淀(ChIP)；结果为平均值±标准差，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001(Student's t检验)；NS，不显著；
图13为MALDI-TOF/TOF质谱确定了DDX24启动子靶向的蛋白序列；13a为MALDI-TOF/TOF质谱DDX24启动子结合蛋白的峰图；13b为MALDI-TOF/TOF质谱的b和y值；
图14显示RFX8通过DDX24信号传导调节肝癌细胞的生长，迁移和侵袭；14a，14b为qPCR(14a)和蛋白质印迹(14b)检测DDX24在RFX8敲低的Hep3B细胞中的表达；14c，14d来自TCGA数据库(14c)或HCC组织微阵列(14d)的RFX8的表达分析；14e为肝癌组织微阵列中RFX8和DDX24蛋白水平的免疫组织化学分析的代表性图像；其中，“Low”,“Medium”and“High”指示“低”，“中”，“高”表达水平；14f显示在93例患者的肝细胞癌组织微阵列中RFX8和DDX24之间的表达相关性；14g，14h显示在有或无过表达DDX24的RFX8敲低Hep3B细胞中检测了细胞活力(14g)，迁移和侵袭(14h)；结果为平均值±标准差，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001(Student's t检验)；
图15显示沉默RFX8可抑制肝癌细胞的生长，迁移和侵袭；15a-15c显示检测RFX8敲低的Hep3B细胞迁移(15a)，侵袭(15b)和细胞生存力(15c)；结果使用Student‘s t检验，显示为平均值±标准差，***p<0.001；
图16显示DDX24是miR-526a-5p的新发现的直接靶基因；16a，16b为通过qPCR(16a)和western blot(16b)Hep3B细胞瞬时转染不同miRNA 48小时后检测DDX24水平，GAPDH为对照；16c显示检测有或无miR-526a-5p转染的Hep3B和SMMC-7721细胞活力，CCK8实验通过在450nm的波长处的吸光度测量细胞活力，并利用对照组将吸光度值标准化；16d，16e为有或无miR-526a-5p转染的Hep3B和SMMC-7721细胞检测细胞迁移(16d)和侵袭(16e)；16f显示qPCR检测DDX24敲低Hep3B中miR-526a-5p的表达；16g显示DDX24 3’-UTR和miR-526a-5p之间的推定结合区域；16h为构建DDX24 3’-UTR野生型(WT)和突变体(Mut)荧光素酶报告载体；16i为用荧光素酶报告载体和miRNA转染Hep3B和SMMC-7721细胞，72h后测量萤火虫荧光素酶活性并利用海肾荧光素酶活性将其标准化；结果为平均值±标准差，*p<0.05，**p<0.01；NS，不显著。
图17显示综合RFX8，LAMB1和DDX24的表达量可更好地预测肝细胞癌患者的临床预后；17a，17b为RFX8(17a)和LAMB1(17b)表达低(蓝线)或高(红线)的肝细胞癌患者的Kaplan-Meier总生存曲线，使用了时序检验；17c-17e为表达高或低水平的RFX8(17c)或LAMB1(17d)和DDX24或所有三个因素组合的患者的Kaplan-Meier总生存曲线(17e)，使用了时序检验；17f显示了五年生存率和平均生存时间(月)；17g显示该模型说明RFX8/DDX24/LAMB1/SRC信号传导对肝癌细胞生长的调节。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料，该研究得到了中山大学附属第五医院伦理委员会的批准，且所有患者都签署了知情同意书。
临床样本：374例原发性肝癌组织样本、50例正常组织样本；11例HCC组织样本及对应的癌旁组织；均用福尔马林固定，石蜡包埋后进行检测定量分析。
细胞系：从美国模式培养物集存库(ATCC，马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国)购得Hep3B、HepG2、PLC/PRF/5、SNU398和SNU449细胞。Huh 7细胞是从JCRB购得。L02、SMMC-7721和Bel-7402细胞是来自中国科学院上海细胞库。使用前均已确认细胞不含支原体。
统计方法：至少三个独立实验的结果显示为平均值±标准偏差。使用GraphPadPrism软件(5.0版)进行统计分析。当仅分析两组时，使用两次Student t检验评估组之间的差异；当比较两组以上时，通过单因素方差分析。进行了Gehan-Breslow-Wilcoxon检验，以分析DDX24蛋白表达与总生存时间之间的相关性。
实施例1 DDX24在肝细胞肝癌组织中的表达与HCC进展的关联性
1、实验过程
1.1、免疫组织化学(IHC)染色
肝癌组织样品采集自中山大学附属第五医院。将组织在10％中性福尔马林中固定过夜，使用递增浓度梯度进行脱水，然后包埋在低熔点石蜡中。连续切下4微米厚的组织切片，并固定在硅化的玻片上。免疫组织化学染色使用抗生蛋白链菌素-过氧化物酶偶联方法。将每个组织切片去石蜡，再水化，浸入抗原修复溶液中，在100℃下煮沸10分钟，然后与过氧化物酶抑制剂一起孵育。用正常山羊血清阻断非特异性结合后，将组织切片与以下一抗在4℃孵育过夜：抗DDX24和抗HPA002554(Sigma，USA)；抗LAMB1和抗GTX100787(Genetex，USA)。所有抗体以1：50的稀释度使用。
1.2、实时定量PCR
使用
Figure BDA0002641020140000091
试剂盒提取了本研究中使用的细胞系总RNA，使用All-in-OneTMqPCRMix(GeneCopoeiaTM，Rockville，Maryland，USA)进行实时PCR分析基因表达。通过Bio-RadCFX96进行检测，并使用Bio-Rad管理软件(Bio-Rad，Hercules，CA)进行分析。将基因表达水平用管家基因GAPDH的表达水平进行标准化，并且每个样品评估了三次。miRNA引物(用于miR-526a-5p和miRA1001416)采购自Ribobio Biotechnology(中国广州)。DDX24(产品目录号Hs-QRP-23370)、GAPDH(产品目录号Hs-QRP-20169)，SRC(产品目录号Hs-QRP-23403)、RFX8(产品目录号Hs-QRP-23954)和LAMB1的引物购自GeneCopoeia Inc.(GeneCopoeiaTM，Rockville，Maryland，USA)。
1.3、免疫荧光染色
HCC细胞接种在腔室玻片上，培养24小时。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞，并在4℃下用预冷的多聚甲醛固定10分钟，然后用含有1％TritonX-100(Solarbio LifeScience，中国北京)的PBS透化15分钟，在室温下封闭1小时，然后与特定的一抗在4℃下孵育过夜。然后，用PBS洗涤三次，在室温下与二抗避光孵育1小时。然后用PBS洗涤三次，并在具有DAPI的Fluoroshield固定培养基(Abcam，美国)中避光孵育10分钟。使用荧光倒置电子显微镜(IX73，Olympus，日本)或共聚焦显微镜拍摄图像。
2、实验结果
2.1、发明人首先通过搜索癌症基因组图谱数据库(The Cancer Genome Atlas，TCGA)来揭示DDX24在肝细胞肝癌(HCC)中的表达情况。即使用R language edgeR软件包对424个组织样本(包括374个HCC组织样本和50个正常肝组织样本)数据进行分析，并确定了一系列差异性表达的基因列表(DEGs)(图1a和图1b)，我们发现DEAD-box家族基因成员在DEGs中明显富集(图1c)，同时，DDX24在HCC组织中的表达显著升高(图2a)。
2.2、进一步收集来自中山大学附属第五医院11对HCC组织和对应的癌旁组织并检测DDX24的表达，同样得出上述结论(图2b)。在HCC细胞水平方面，为了确定DDX24的表达，我们对一系列细胞系进行检测发现DDX24在大部分HCC细胞系中表达均高于非恶性肝细胞L02(图2c)。另外，免疫荧光化学和免疫蛋白印迹实验均显示DDX24定位于细胞的核仁和胞浆区域(图2d)。
2.3、COX回归分析：从上海芯超生物科技有限公司采购了三张人类肝癌组织芯片样品，三张芯片的随访时间段分别在2007年至2009年、2006年至2007年和2007年至2008年。表1～6列出了HCC患者DDX24表达与HCC进展的关联性。
表1 270名HCC患者总生存率分析
Figure BDA0002641020140000101
注：ap值小于0.05具备统计学意义
表2 270HCC患者临床特征汇总
Figure BDA0002641020140000102
表3 270HCC患者DDX24表达量与患者临床病理特点之间的相关性分析
Figure BDA0002641020140000111
注：ap值小于0.05具备统计学意义
表4第一组患者DDX24表达量与患者临床病理特点之间的相关性分析
Figure BDA0002641020140000112
注：ap值小于0.05具备统计学意义
表5第二组患者DDX24表达量与患者临床病理特点之间的相关性分析
Figure BDA0002641020140000121
注：ap值小于0.05具备统计学意义
表6第三组患者DDX24表达量与患者临床病理特点之间的相关性分析
Figure BDA0002641020140000131
注：ap值小于0.05具备统计学意义
与前期研究结果一致，HCC组织中DDX24的表达与癌旁组织相比明显增加(图3a)。同时，DDX24在有门静脉癌栓(PVTT)的HCC组织中表达升高，PVTT而是肝癌转移的重要危险因素(图3b)。结合表1到表6，统计分析表明DDX24的表达与性别(p＝0.0463)、肿瘤大小(p＝0.0249)和T分期(p＝0.048)之间存在很强的关联性(表3)。此外，高表达DDX24的患者更容易合并肿瘤复发(表5：p<0.0001；表6：p<0.0001)和肝硬化结节(表6：p＝0.0297)。
为了评估DDX24对HCC患者预后的影响，我们以DDX24表达的中位数为标准将270例HCC患者分为高低表达组，高表达DDX24患者的总生存率(OS)明显低于低表达组(图3c-3f)。多因素Cox回归分析表明DDX24表达(95％confidence interval[CI]，2.724–5.596；p<.001)，AJCC等级(95％CI，0.585–0.873；p＝0.001)和肿瘤大小(95％CI，0.590–0.885；p＝0.002)是影响HCC患者OS的独立危险因素(表1)。
实施例2 DDX24调控HCC迁移和侵袭的EMT信号通路
1、实验过程
1.1、构建慢病毒和细胞感染
用购买自GeneCopoeia(Rockville，Maryland，USA)的慢病毒载体(U6-sh-DDX24-EGFP-IRES-puromycin)来感染细胞以建立DDX24敲低或稳定过表达细胞系。通过0.8μg/ml的聚乙烯用重组慢病毒转导单位感染HCC细胞，两周后使用1ug/ml嘌呤霉素选择稳定细胞，再通过qRT-PCR和蛋白质印迹评估RNA干扰的效率。
1.2、RNA测序(RNA-seq)
使用TRIzol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)提纯总细胞RNA。然后使用每组样品构建RNA-seq链特异性文库，并使用NuGEN Ovation RNA-Seq系统进行测序。将每个基因的计数标准化后导入FPKM(每百万碱基对转录片段的每千碱基碱基片段数)值。将log2FC≥2.3，倍数变化，*p<0.05被定义为有表达差异，并分别使用阴性和载体对照进行标准化。从KEGG通路数据库(https://david.ncifcrf.gov/)下载了生物过程基因本体的基因用于分析不同信号通路(包括凋亡、细胞增殖和死亡基因表达)。
1.3、细胞迁移和侵袭测定
用Transwell小室(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)进行细胞迁移实验。将含有3×104HCC细胞的200ul无血清DME细胞悬液接种在Transwell的上室中，并将400ul含有20％FBS的培养基添加到下室中。迁移穿过膜的细胞被固定并染色后，光学显微镜下随机计数三个视野。
用浸有基质胶(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)的BD BioCoat基质胶侵袭小室(BD Biosciences)进行细胞侵袭实验，将含有3×104HCC细胞的200ul无血清DME细胞悬液接种在Transwell的上室中，并将300ul含有20％FBS的培养基添加到下室中。孵育后，迁移穿过膜的细胞被固定并染色，在光学显微镜下随机计数三个视野。
1.4、动物实验
所有动物实验均按照《实验动物的护理和使用指南》(NIH出版物第80-23号，1996年修订)和中山大学制定的《动物实验机构伦理准则》进行。在广东省生物医学影像重点实验室，动物饲养在无病原体的条件下。将三组5只4至6周龄的BALB/c雌性裸鼠(Vital RiverLaboratory Animal Technology Co.，Ltd，Beijing，China)皮下注射0.1ml含有1×106个细胞的细胞悬液。用卡尺测量每个肿瘤的长度(L)，宽度(W)和高度(H)，并且按照如下公式计算肿瘤体积(V)：V＝πLWH/6。实验结束时，人道处死小鼠，切除肿瘤并拍照，测量不同组小鼠的肿瘤重量。对于肺转移模型鼠，给三组5只BALB/c雌性裸鼠分别进行静脉注射尾静脉注射1×106HCC细胞。注射后8周将所有小鼠处死，并收集其肺。对肺表面的肿瘤结节进行计数，并切除后包埋在石蜡中。
1.5、细胞活力和集落形成测定
使用细胞计数试剂盒-8(CCK-8；KeyGEN BioTECH，中国江苏)测定细胞活力。将HCC细胞以3×103个细胞每孔的密度接种在96孔板中，每孔使用100ul细胞悬液。培养72小时后，使用酶标仪在490nm处测量吸光度。每个试验进行六次重复，总共进行三个独立试验。然后计算细胞活力的平均百分比。为了进行集落形成实验，将HCC细胞以每孔500个细胞的密度接种在6孔板中，并培养在完全生长培养基中直至形成肉眼可见的菌落(约两周)。使用甲醇固定细胞集落，用1％的结晶紫染色并计数。所有实验均独立进行了三次。
2、实验结果
分别对DDX24敲低的Hep3B肝癌细胞株和对照组进行了RNA测序(RNA-seq)(图4a)。RNA-seq结果(GEO Submission：GSE145635)表明，与DDX24表达相关的细胞功能改变包括细胞的生长和运动(图4b)。
由于细胞的运动能力与其迁移功能相关，我们运用两种DDX24特异性短发夹结构RNAs(shDDX24-1和shDDX24-2)分别在Hep3B和SMMC7721肝癌细胞系中瞬时敲除DDX24(图5a和5b)并进行了体外细胞迁移和侵袭实验。我们的结果显示敲低DDX24可以抑制肝癌细胞的迁移和侵袭(图4c、图4d)。
为了验证DDX24在体内水平对迁移和侵袭功能的影响，我们将稳定敲低DDX24的Hep3B肝癌细胞株经尾静脉注射接种到4-6周BALB/c雌性裸鼠中，结果显示DDX24的缺乏能显著减少肺转移性结节的数量(图4e-4g)。此外，进一步的研究表明敲低DDX24减少了肝癌细胞边缘的伪足数量(图4h)，同时也下调了上皮-间充质转化(EMT)相关蛋白ZO-1、N-cadherin和β-Catenin的表达(图4i)。这些结果表明DDX24在HCC中通过EMT信号通路调控细胞迁移、侵袭和肿瘤转移。
实施例3 DDX24调控细胞增殖和肿瘤生长的ERK/AKT信号通路
1、实验过程：同实施例1或实施例2。
2、实验结果
通过CCK-8和克隆形成实验发现，降低DDX24的表达可在体外水平抑制肝癌细胞的增殖(图6a)和克隆形成(图6b)。我们还在异种移植小鼠模型中观察到，与对照组相比，DDX24缺乏显著抑制了皮下肿瘤的大小(图6c-6e)和重量(图6f)。此外，细胞增殖通路因子AKT和ERK的磷酸化水平在敲低DDX24细胞中也明显下调(图6g)。这些结果表明DDX24通过ERK/AKT信号通路调控HCC增殖和肿瘤生长。
实施例4 DDX24上游靶点探索
1、实验过程
1.1、RNA免疫沉淀测序(RIP-seq)
HCC细胞接种在15厘米的培养皿中，生长至90％的程度，然后使用细胞刮收集，然后用冷多聚体裂解缓冲液[10mM HEPES，pH 7.0，100mM氯化钾，5mM氯化镁，0.5％NP40，1mMDTT，100U/mL RNase抑制剂(Takara)，1×蛋白酶抑制剂(罗氏)和0.4mM RVC(NEB)]裂解收集后的细胞，并在冰上孵育15分钟。将裂解物以15000g离心15分钟后，将上清液用Dynabeads Protein G(Invitrogen)预先清洗。然后将每种裂解物用NT2缓冲液[50mMTris，pH 7.4；150mM氯化钠；1毫米氯化镁；0.05％NP40；1mM DTT；100U/mL RNase抑制剂(Takara)；1×蛋白酶抑制剂混合液(R oche)和20mM EDTA]稀释。保留上清液的百分之一作为输入组(Input)，并使用5μg DDX24抗体(15769-1-AP；Proteintech，中国)或相应的对照IgG(NI01-100UG；Rabbit IgG；EMD Millipore)将其余的裂解物在4℃下过夜进行RIP。第二天，添加Dynabeads Protein G，并将混合物在4℃孵育3小时，然后用NT2溶液洗涤5次。RIP的四分之一用于蛋白质印迹，其余的则用于使用TRIzol(Invitrogen，Carlsbad，CA)提取RNA。通过下一代测序或qPCR检测RNA的富集程度，确定目标基因为Basemean≥500，IP/输入组≥2，*p<0.05的RIP-seq基因。
1.2、蛋白质印迹
使用RIPA裂解缓冲液和蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物制备全细胞裂解液。使用核/细胞质分离试剂盒(BestBio，中国上海)提取并分离核和细胞质蛋白。使用BCA测定法(Beyotime Biotechnology，中国上海)测定蛋白质浓度。通过5-20％SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质，并转移到PVDF膜上进行检测。本研究使用了以下一抗：抗DDX24(A300-697A；Bethyl Laboratories，USA)、抗LAMB1(GTX100787；Genetex，USA)、抗RFX8(TA330886；OriGene Technologies，USA)、抗p-SRC(44660G；Invitrogen/Thermo Fisher Scientific，USA)。β-actin、GAPDH、histone H3、PARP、cleaved caspase-9、cleaved caspase-7、caspase-3、AKT、p-AKT、ERK、p-REK、ZO-1、N-cadherin、β-catenin和SRC的特异性抗体购自Cell Signaling Technology。
1.3、mRNA稳定性测定
在添加放线菌素-D(以100ug/mL作为最终浓度使用；TargetMol，Boston，USA)之前，用DDX24 shRNA或阴性对照shRNA预处理细胞。在0-10小时提取总mRNA，并通过实时RT-PCR检测。呈现的值是相对于放线菌素D处理过的对照组细胞获得的值。
2、实验结果
2.1、由于DDX24是一个RNA结合蛋白，首先进行了RNA免疫共沉淀测序(RIP-seq)(GEO Submission：GSE145632)来检测DDX24的下游靶点(图7a)。其中，编码蛋白质的mRNAs在DDX24结合的RNAs中占主导地位(图8a)，KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes andGenomes)富集分析显示排名前20位的信号通路如图7b所示，包括调控细胞形态和生长相关的信号通路。因此，6个与肿瘤生长和转移密切相关的基因被选出作为候选基因(图7c)。在这些基因中只有LAMB1在DDX24敲低后发生表达下调(图7d-7f，图8b-8c)，因此选择LAMB1进一步研究。
2.2、在TCGA数据库和实施例1的HCC组织芯片中，发现LAMB1在HCC组织中的表达明显高于癌旁组织(图9b)，且LAMB1的表达与DDX24的表达呈正相关(图9c)。同时，敲低LAMB1抑制了HCC细胞的迁移(图10a)、侵袭(图10b)和增殖(图10c)。而且，通过下调DDX24对HCC细胞迁移、侵袭和生长的抑制作用可部分被LAMB1过表达所挽救(图9d-9f)。
2.3、mRNA稳定性分析显示DDX24表达下降可同步引起LAMB1 mRNA稳定性明显下降(图9g)。有研究报道LAMB1通过SRC发挥功能，因此我们研究了LAMB1在HCC中对SRC信号通路的调控作用。敲低LAMB1可降低SRC的磷酸化水平(p-SRC)(图9h)，EMT相关蛋白ZO-1、N-cadherin和β-Catenin的表达(图9h)以及AKT和ERK的磷酸化(图9i)均发生下降。综上所述，此研究发现DDX24通过LAMB1/SRC介导的EMT和ERK/AKT信号通路调控HCC的转移和生长。
2.4、进一步探讨了HCC中DDX24的上调是否与基因突变相关
为了探索该DDX24基因的突变率，我们从现有数据库中分析了DDX24在不同组织中的基因突变谱，研究结果显示DDX24基因在肝癌组织中的总突变率小于2％(图11a)。同时，4种不同HCC细胞株(Hep3B、HepG2、Bel-7402和SMMC-7721)(图11b)以及7个HCC患者组织样本(图11c)的Sanger测序分析均未检测到DDX24基因的相关突变(包括p.Glu271Lys)。上述数据结果排除了DDX24基因突变导致其在HCC中表达上调的可能性。
实施例5 DDX24转录调控因子的探索
1、实验过程
1.1、荧光素酶报告基因实验
按照说明书操作，使用Lipofectamine 3000(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)将RFX8或miR-526a-5p或阴性对照与20ng萤火虫荧光素酶报告基因质粒共转染入96孔板的HCC细胞(5×103细胞/孔)。转染后72小时，根据试剂说明书，使用Dual-LuciferaseReporter Assay System(Promega，Madison，WI)对细胞裂解物进行分析。
1.2、链霉亲和素琼脂糖下拉实验
通过链霉亲和素-琼脂糖下拉测定法鉴定了DDX24启动子结合蛋白。是从不同的HCC细胞系中提取200ug核蛋白，并在4℃下与2μg生物素标记的双链DNA探针(对应于DDX24启动子区域的核苷酸-745至+61)和20μl链霉亲和素琼脂糖珠子(Sigma-Aldrich，StLouis，MO)一起孵育过夜。离心混合物以分离DNA-蛋白质复合物，然后使用SDS-PAGE凝胶分离蛋白质，并在电泳分离后使用银染检测蛋白质。然后用胰蛋白酶消化候选蛋白条带，并用MS级胰蛋白酶(Promega，Madison，WI，USA)消化。最后，通过MALDI-TOF/TOF质谱分析从候选蛋白消化下来的肽链。
1.3、染色质免疫沉淀(ChIP)
HCC细胞用1％甲醛固定，然后通过每毫升培养基添加100μl 1.375M甘氨酸终止交联反应。细胞样品在冰上超声处理以破碎DNA，细胞裂解物用抗RFX8抗体(GTX100787，Genetex，USA)或非免疫兔IgG(Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA)来进行免疫沉淀。使用旋转柱(Qiagen，Hilden，德国)纯化DNA片段，并使用以下引物对使用PCR评估DDX24启动子区域的富集情况，正向：5'-TGGCCCCTCCCTCGGG TTAC-3'，反向：5'-TGAAGGGGCAGGACG GGTGC-3'。PCR产物通过在2％琼脂糖凝胶中的电泳进行解析，并通过Gel-Red染色进行观察。
2、实验结果
2.1、探讨了DDX24的表达是否在转录水平受到调控以期阐明DDX24在HCC中的表达调控机制。为此我们合成了一个5’端生物素标记的长约806bp且定位于DDX24启动子-745-+61区域的DNA探针，并筛选正常肝细胞和HCC细胞中差异表达的DDX24启动子结合蛋白(如图12a和12b)。实验结果显示Hep3B、SNU449和Bel-7402三个不同细胞株均在55kDa至70kda处出现了相同的单一蛋白条带，且该条带比永生化肝细胞的蛋白条带显著增强(如图12c)。MALDI-TOF/TOF质谱分析表明该条带蛋白具有序列为DILRNVR的特异性肽段(如图12d、图13)。根据蛋白质组学数据库(https://blast.ncbi.ncbi.ncm.nih.Gov)，该序列属于DNA结合蛋白RFX8(64kDa)。免疫荧光化学分析进一步显示RFX8定位于细胞核区域(如图12e)。
2.2、为了明确RFX8是否为DDX24启动子结合蛋白，我们使用5’端生物素标记的DDX24启动子探针(DPP)或非特异性探针(NSP)进行核蛋白/DNA复合物共沉淀实验。如图12f所示，该实验使用DDX24启动子探针组可检测出RFX8，而非特异性探针组无法检出RFX8表达。此外，为了探讨RFX8是否直接调控DDX24基因的转录，我们构建了一个包括双荧光素酶基因及其上游含有DDX24基因核心启动子区域(-745-+61)的报告基因。荧光素酶报告基因实验表明与对照组相比，过表达RFX8显著增强了DDX24启动子的活性，而敲低RFX8则显著降低了DDX24启动子的活性(如图12g-12i)。
2.3、为了进一步定位DDX24启动子上RFX8的特异性结合区域，我们在双荧光素酶基因上游克隆了一系列含有DDX24 5’端区域不同长度缺失的报告基因。我们的结果显示，当DDX24启动子区域的-335--135位点缺失时，RFX8不能增强报告基因的荧光素酶活性(如图12h-12i)。因此，DDX24转录调控元件的主要位置被缩小到包含其-335--135核苷酸的区域。为了验证这一结论我们对四种不同HCC细胞系进行了染色质免疫共沉淀实验(ChIP)，如图12j所示，RFX8蛋白与所有被测细胞系内源性的DDX24启动子区域(-335--135)结合。这些数据表明RFX8与DDX24启动子直接结合并促进其转录激活。
实施例6 RFX8在DDX24转录调控中的作用
RFX8作为RFX家族的一员，其功能目前尚未有相关报道。为了验证RFX8在转录调控中的作用，我们发现在Hep3B细胞中转染RFX8特异性小干扰siRNA后，在mRNA和蛋白水平均抑制了DDX24的表达(图14a-14b)。为了进一步探讨RFX8在HCC组织中的表达，我们通过组织芯片染色发现RFX8在HCC组织中的表达较癌旁组织明显增高(图14c)，同时对TCGA数据库进行分析同样得出上述结论(图14d)，更重要的是，RFX8的表达与DDX24的表达呈正相关(图14e-14f)。
功能研究方面，敲低RFX8抑制了HCC细胞的迁移、侵袭和增殖(图15)，另一方面，过表达DDX24在很大程度上挽救了RFX8敲低引起的细胞功能抑制。上述结果说明DDX24是RFX8的下游靶点(图14g-14h)，同时，我们展示了新的转录因子RFX8可通过DDX24信号通路调控HCC的生长、迁移和侵袭。
实施例7 DDX24是miR-526a-5p的新靶点
转录后调控是基因表达调控的另一重要途径，而microRNAs(miRNAs)被认为在其中发挥了重要作用。我们通过使用RNA22和miRanda软件筛选出9个可能与DDX24结合的miRNAs。然后我们分别进行瞬时转染上述miRNAs类似物后发现四种可抑制DDX24表达的miRNAs(图16a、16b)。我们接着研究了这四种miRNAs抑制DDX24表达后是否会影响HCC细胞的增殖、迁移和侵袭，结果显示只有miR-526a-5p可参与调控HCC细胞的增殖、迁移和侵袭(图16c-16e)。但是，DDX24的下调并不影响miR-526a-5p表达水平，上述结果说明DDX24基因是miR-526a-5p的新型作用靶点(图16f)。根据碱基互补配对，DDX24的3’非翻译编码区(3’-UTR)包含一个可能与miR-526a-5p具有显著互补性的结合区域(图16g)。
为了证明DDX24是miR-526a-5p的下游作用靶点，我们在萤火虫荧光素酶报告基因下游克隆了一个含有潜在结合区域的人DDX24 3’-UTR片段(图16h)。实验表明转染miR-526a-5p的细胞与对照组相比荧光素酶活性显著降低(图16i)。为了进一步明确这一结果，我们构建了另一个包含突变潜在结合区域的荧光素酶报告基因(图16h)，且该报告基因转染后并未影响荧光素酶的活性(图16i)。以上结果提示miR-526a-5p可直接靶向结合DDX24并沉默其转录后表达。
实施例8结合RFX8、LAMB1和DDX24表达的综合分析能更好地预测HCC患者的临床预后
为了验证RFX8、LAMB1和DDX24在临床转化中的应用，以及它们在预测HCC患者生存率方面的协同作用，我们运用这三种蛋白的表达水平绘制了Kaplan-Meier曲线。统计显示RFX8、LAMB1、DDX24单因素虽能在一定程度上区分生存曲线(图17a和17b)，但联合多因素分析可进一步提高预后判断的准确性。同时，RFX8和DDX24共同低表达组，或LAMB1和DDX24共同低表达组的总生存率较共同高表达组更长(图17c和17d)。更重要的是，三种蛋白(RFX8、DDX24、LAMB1)共同低表达的患者5年生存率为90.9％，在所有分组中是最高的(图17e和17f)。综上所述，这些结果表明RFX8、DDX24和LAMB1的联合多因素分析明显提高了检测HCC患者临床预后的准确性。

Claims (7)

1.DDX24基因或其表达产物在开发、筛选肝细胞癌功能产品方面的应用，所述功能产品对DDX24基因或其表达产物具有抑制作用；所述功能产品用于抑制肝细胞癌的癌细胞迁移和侵袭。
2.对DDX24基因或其表达产物具有抑制作用的功能产品在制备预防或/和治疗肝细胞癌的产品方面的应用；所述功能产品用于抑制肝细胞癌的癌细胞迁移和侵袭；所述功能产品为miR-526a-5p。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述功能产品用于降低肝细胞癌的合并疾病的发生率；所述肝细胞癌的合并疾病包括肿瘤复发和肝硬化结节。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述功能产品包括：DDX24核酸抑制剂，DDX24蛋白抑制剂，DDX24基因缺陷或沉默的免疫相关细胞、其分化细胞或者基因重组构建体中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述功能产品用于抑制肝细胞癌的转移。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述功能产品包括以下任一种：
（i）以DDX24或 LAMB1或 RFX8，或DDX24或LAMB1或 RFX8转录本为靶序列，且能够抑制DDX24或LAMB1或 RFX8基因表达产物的表达或基因转录的小干扰RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸；
（ii）能表达或形成（i）中所述小干扰RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸构建体；
（iii）含有DDX24或 LAMB1或RFX8，或DDX24或LAMB1或RFX8互补序列，且能够在转入体内后形成抑制DDX24或LAMB1或 RFX8基因表达产物的表达或基因转录的干扰分子的构建体；
（iv）抑制或敲除DDX24或LAMB1或RFX8基因序列后的免疫相关细胞、其分化细胞或构建体。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述功能产品包括：DDX24特异性短发夹结构RNAs、RFX8特异性小干扰RNA或miR-526a-5p。
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